Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55795

⸱

3 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Streszczenie

Komórki śródbłonka (EC) są podstawowymi elementami budulcowymi architektury naczyniowej i pośredniczą we wzroście i przebudowie naczyń krwionośnych, zapewniając prawidłowy rozwój naczyń i homeostazę. Jednak badania nad hierarchią linii śródbłonka pozostają nieuchwytne ze względu na brak narzędzi do uzyskania dostępu, a także bezpośredniej oceny ich zachowania in vivo. Aby zaradzić temu brakowi, opracowano nowy model tkankowy do badania angiogenezy za pomocą poduszeczki tłuszczowej sutka. Gruczoł sutkowy rozwija się głównie w fazach poporodowych, w tym w okresie dojrzewania i ciąży, podczas których silnej proliferacji nabłonka towarzyszy rozległa przebudowa naczyń krwionośnych. Poduszeczki tłuszczowe sutka zapewniają przestrzeń, matrycę i bogate bodźce angiogenne z rosnącego nabłonka sutka. Ponadto poduszeczki tłuszczowe sutka znajdują się poza jamą otrzewnej, co czyni je łatwo dostępnym miejscem przeszczepu do oceny potencjału angiogennego komórek egzogennych. W pracy opisano również skuteczne podejście do śledzenia przy użyciu fluorescencyjnych myszy reporterowych do specyficznego znakowania docelowej populacji komórek macierzystych śródbłonka naczyniowego (VESC) in vivo. Ta metoda śledzenia linii, w połączeniu z późniejszą mikroskopią całych komórek, umożliwia bezpośrednią wizualizację docelowych komórek i ich potomków, dzięki czemu można określić ilościowo zdolność do proliferacji i zmapować zaangażowanie w różnicowanie. Korzystając z tych metod, zidentyfikowano ostatnio populację biopotencjalnego receptora białka C (Procr) eksprymującego VESCs w wielu układach naczyniowych. Procr+ VESCs, powodując powstawanie zarówno nowych EC, jak i perycytów, aktywnie przyczyniają się do angiogenezy podczas rozwoju, homeostazy i naprawy uszkodzeń. Ogólnie rzecz biorąc, manuskrypt ten opisuje nowy przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka i techniki śledzenia linii krwi in vivo, które można wykorzystać do oceny właściwości komórek macierzystych VESCs.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju i homeostazy, wzrost i przebudowa naczyń odbywa się wiernie zgodnie ze wzrostem i naprawą narządów. Angiogeneza opisuje tworzenie nowych naczyń z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych i jest uważana za główną siłę pośredniczącą w tych dynamicznych zmianach naczyniowych. Każde naczynie krwionośne jest wewnętrznie wyściełane warstwą komórek śródbłonka (EC) i wydają się one być podstawą architektury naczynia. Przez długi czas mechanizm, za pomocą którego pula EC jest uzupełniana podczas homeostazy, pozostawał niejasny i toczyły się spory o to, czy obrót naczyniowy jest wynikiem dojrzałej proliferacji EC, czy też jest wkładem aktywności naczyniowych komórek macierzystych/progenitorowych. Ze względu na brak bezpośrednich dowodów fizjologicznych, istnienie i tożsamość komórkowa komórek macierzystych śródbłonka naczyń krwionośnych (VESC) również pozostały kontrowersyjne.

Jednym z najczęstszych podejść stosowanych do weryfikacji zachowania komórek macierzystych jest przeszczepianie domniemanych komórek macierzystych myszom biorcom. Metoda ta mierzy potencjał macierzysty kandydujących komórek macierzystych in vivo. Transplantacja została po raz pierwszy zastosowana do badania komórek macierzystych szpiku kostnego1, co przyczyniło się do ustalenia hierarchicznej charakterystyki układu krwiotwórczego2. W polu śródbłonka zatyczka macierzy błony podstawnej (np. Matrigel) wprowadzana podskórnie pod skórę boku jest standardowym testem angiogenezy in vivo stosowanym w celu zbadania zdolności tworzenia naczyń przeszczepionych EC. Wiele metod eksperymentalnych, w tym tworzenie kolonii w systemach hodowli 3D i przeszczepianie, zasugerowało potencjalne populacje progenitorów EC/VESC3,4,5,6. Ponieważ jednak EC osadzone w macierzy błony podstawnej są stosunkowo oddzielone od otaczającej tkanki, nie zapewnia to optymalnego środowiska niszowego wymaganego do pełnego zbadania potencjału angiogennego przeszczepionych komórek. W rezultacie, naczynia utworzone w czopie matrycy są w przeważającej mierze kapilarne i są funkcjonalnie niemierzalne.

Gruczoł sutkowy rozwija się po urodzeniu, a najmocniejszy wzrost występuje w okresie dojrzewania i ciąży. W okresie dojrzewania nabłonek sutka ulega gwałtownemu rozszerzaniu, aby zająć całą poduszeczkę tłuszczową sutka, czemu towarzyszy sprawna przebudowa otaczających struktur naczyniowych. Tak więc gruczoł sutkowy stanowi doskonały model do badania angiogenezy. Zapewnia przestrzeń, matrycę i bogate bodźce angiogenne z rosnącego nabłonka sutka i dlatego jest idealnym miejscem przeszczepu do oceny potencjału angiogennego komórek egzogennych. Ponadto poduszeczka tłuszczowa sutka umożliwia utworzonym naczyniom egzogennym integrację z układem krążenia gospodarza, umożliwiając dalszą ocenę funkcjonalną i stanowiąc przewagę nad przeszczepem podskórnym.

Chociaż próby hodowli in vitro i transplantacji są równie skutecznym sposobem badania właściwości regeneracyjnych populacji komórek, wiadomo, że takie testy mogą stymulować plastyczność, gdy komórki są zabierane z ich naturalnego środowiska, a zmiany mogą być indukowane, gdy komórki są odłączone od swojego fizjologicznego otoczenia7. W związku z tym uzyskanie bezpośrednich dowodów in vivo na los komórek jest kluczowym podejściem do pogłębienia obecnego zrozumienia zachowania populacji śródbłonka.

Genetyczne mapowanie losu (tj. śledzenie linii in vivo) jest niezbędne do identyfikacji VESCs i badania ich właściwości w organizmie, ponieważ może ujawnić zachowanie komórek macierzystych in vivo w ich fizjologicznym kontekście, a rzeczywista tożsamość macierzysta może być oceniona. Śledzenie linii dostarcza bezpośrednich dowodów na długoterminową trwałość (tj. samoodnawianie) kandydatów na VESC i ich zdolność do wytwarzania typów komórek dla tkanki pochodzenia (tj. siłę różnicowania).

Ten protokół opisuje nowatorską technikę przeszczepiania poduszeczek tłuszczowych u sutków oraz metodę śledzenia linii w celu obserwacji zdolności generowania naczyń krwionośnych przez VESCs. Techniki te przezwyciężają niedociągnięcia obecnie dostępnych testów i zapewniają nowy sposób optymalnej oceny właściwości komórek macierzystych VESC. Podejścia te są skutecznymi narzędziami, które można wykorzystać do oceny zachowania i właściwości tworzenia naczyń krwionośnych w populacjach śródbłonka, a także do określenia zmiany siły działania komórek naczyniowych w środowisku patologicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Biochemii i Biologii Komórki w Szanghaju, Chińskiej Akademii Nauk zgodnie z zatwierdzonym protokołem SIBCB-NAF-15-002-S335-003.

1. Izolacja VESCs od gruczołu sutkowego myszy

  1. Pobieranie gruczołów sutkowych i trawienie tkanek.
    1. Jako dawców tkanek należy użyć 8-tygodniowych dojrzałych dziewiczych myszy reporterowych Actin-GFP o masie od 20 do 25 g.
      Uwaga: Komórki pochodzące od dawcy można łatwo śledzić za pomocą ekspresji GFP.
    2. Przygotować podłoże do trawienia tkanek składające się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% wstrzykiwacza/paciorkowca i 25 mM HEPES w RPMI1640. Przefiltruj mieszaninę przez filtr 0,22 μm w celu sterylizacji i wstępnego ogrzania do 37 °C w łaźni wodnej.
    3. Poświęć myszy w komorze CO2 . Wypreparuj czwartą parę pachwinowych gruczołów sutkowych, wykonując najpierw pionowe nacięcie skóry w dolnej linii środkowej brzucha za pomocą skalpela (lub nożyczek chirurgicznych). Delikatnie oderwij skórę na bok, aby odsłonić pachwinowy gruczoł sutkowy za pomocą kleszczy. Pobrać czwarte pachwinowe gruczoły sutkowe z obu stron i pokroić je nożyczkami na drobne kawałki na 6-centymetrowej szalce Petriego.
      1. Zmierz całkowitą masę zmielonej tkanki i umieść ją w probówce o pojemności 50 ml.
        Uwaga: Upewnij się, że powstałe mięso tkankowe jest mniejsze niż 1mm3 dla każdego kawałka. Typowy plon wynosi około 5 000 VESC na zwierzę.
    4. Przygotować podłoże bazowe do wytrawiania w zakrytej 50 ml probówce wirówkowej o objętości 10 ml na 1 g mielonej tkanki. Dodać kolagenazę typu 3 w stężeniu 300 jednostek na 10 ml podłoża bazowego do wytrawiania, aby utworzyć bufor do wytrawiania. Wymieszaj równomiernie i dodaj do zmielonej tkanki.
    5. Umieść poziomo probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na platformie kołyszącej i ustaw prędkość na 100 obr./min, a temperaturę na 37 °C. Mieszaj tkankę sutkową przez 2 godziny. Sprawdzaj i ręcznie potrząsaj probówką co 20 minut, aby zapewnić prawidłowe trawienie.
      Uwaga: Celem trawienia tkanek przed FACS jest przygotowanie roztworu jednokomórkowego z tkanki stałej. Dlatego pod koniec trawienia zawartość powinna być gęstym roztworem bez widocznych kawałków tkanki.
  2. Przygotowanie roztworu jednokomórkowego.
    1. Po roztrawieniu uzupełnij probówkę wirówkową o pojemności 50 ml wstępnie podgrzanym, sterylnym PBS i odwróć probówkę, aby równomiernie wymieszać. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
    2. Usunąć supernatant i przesunąć spód probówki, aby poluzować osad komórkowy. Dodać 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (patrz tabela materiałów) i inkubować w kapturze do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.
    3. Dodaj 10 ml sterylnego PBS i odwróć probówkę, aby równomiernie wymieszać. Odwirować zawartość tkanek o sile 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Dodać 3 ml podgrzanej 0,05% trypsyny i przechowywać probówkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby dalej trawić pozostałą tkankę.
    4. Dodać 3 ml wstępnie podgrzanego IMDM, a następnie dodać 100 μl roztworu DNazy I (0,25 mg DNazy I rozcieńczonej w 1 ml PBS). Przechowywać probówkę w temperaturze 37 °C w celu rozdrobnienia włókien DNA. Przepuść mieszaninę tkanek przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm, aby uzyskać roztwór komórkowy. Przepłucz sitko dwukrotnie 2 ml PBS + 5% FBS, aby zneutralizować trawienie enzymatyczne.
    5. Odwirować mieszaninę komórek przy 200 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 5% FBS w celu barwienia przeciwciał.
  3. Izolacja Procr+ VESC oparta na FACS.
    1. Mieszaninę komórek uzyskaną z tkanki sutka dawcy należy poddać barwieniu przeciwciałami zgodnie z opublikowanymi rutynowymi protokołami8.
      Uwaga: Zastosowano następujące przeciwciała: anty-mysia linia krwi-FITC, anty-mysia CD31(PECAM1)-PECY7, anty-mysia CD105-APC (wszystkie stosowane w stężeniu 1 μg/ml), anty-mysie CD201 (Procr)-biotyna (stosowana w stężeniu 2,5 μg/ml) i streptawidyna-v450 (stosowana w stężeniu 0,5 μg/ml).
      1. Po wybarwieniu przeciwciałami uzupełnić komórki PBS + 5% FBS, a następnie odwirować przy 200 g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki 1 ml PBS + 5% FBS. Przefiltrować przez sitko komórkowe o średnicy 40 μm. Umieść na lodzie do sortowania FACS.
    2. Kontynuuj sortowanie oparte na FACS, aby wyizolować Procr+ VESCs.
      1. Przeanalizuj niebarwioną próbkę i każdą jednokolorową kontrolę, aby określić napięcie dla każdego koloru. Oblicz parametry kompensacji, aby uniknąć autofluorescencji lub barwienia tła. Skonfiguruj szablon do prawidłowego bramkowania i sortowania dla żądanych populacji komórek.
      2. Aby ustalić hierarchię sortowania FACS, najpierw wyeliminuj zanieczyszczenia ze wszystkich zdarzeń, a następnie odrzuć dublety lub skupiska komórek adhezyjnych, wyzwalając za pomocą szerokości. Wyodrębnij komórki linii krwi, a następnie użyj CD31+ i CD105+ do zdefiniowania populacji śródbłonka.
        Uwaga: Komórki Procr+ wyizolowano z EC CD31+ CD105+ w porównaniu z kontrolą FMO. Reprezentatywny wykres analizy FACS jest pokazany na Rysunek 1. Izolowaną przez FACS populację VESC należy zawiesić w IMDM + 50% FBS i przechowywać na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.

2. Test tworzenia naczyń VESC in vivo przy użyciu poduszeczki tłuszczowej ssaka

  1. Przygotuj pierwotne EC do przeszczepu.
    1. Uzupełnij komórki posortowane przez FACS 10 ml PBS + 5% FBS, a następnie odwiruj przy 200 x g przez 5 minut, aby osadzić komórki na dnie.
    2. Ostrożnie odessać płyn, policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić osad komórkowy mieszaniną macierzy błony podstawnej (składającą się z 50% matrycy błony podstawnej i PBS z 20% FBS, uzupełnionego 100 ng/ml rmVEGF i 60 U/ml heparyny), aby osiągnąć stężenie robocze 15 000 komórek/15 μL.
      Uwaga: Mieszanina matrycy błony podstawnej powinna być zawsze przechowywana na lodzie.
    3. Seryjnie rozcieńczać posortowane i policzone komórki, aby osiągnąć wymagane stężenia wejściowe w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, upewniając się, że końcowe objętości iniekcji nie przekraczają łącznie 15 μl. Dodaj 0,1% błękitu trypanowego do każdej probówki, aby uzyskać lepszą wizualizację zawartości podczas przeszczepu. Dokładnie odpipetować do wymieszania. Przechowuj probówki na lodzie do czasu użycia.
      Uwaga: Pomyślne wygenerowanie statku można osiągnąć przy użyciu co najmniej 100 VESC.
  2. Przeszczep pierwotne EC do poduszeczki tłuszczowej sutka.
    1. Zdezynfekuj narzędzia chirurgiczne i blat stołu. W przypadku używania tych samych narzędzi na wielu zwierzętach, do dezynfekcji można użyć sterylizatora perełek.
    2. Znieczulenie 3-tygodniowych nagich myszy BALB/c przy użyciu protokołu znieczulającego zalecanego przez lekarza weterynarii Twojej instytucji i IACUC. Połóż każdą mysz w pozycji leżącej, plecami do stołu operacyjnego. Unieruchomić jego kończyny za pomocą taśmy klejącej.
    3. Zanurz bawełniany wacik w roztworze antyseptycznym na bazie jodu. Dokładnie wytrzyj cały obszar brzucha myszy, aby wysterylizować powierzchnię skóry przed zabiegiem.
    4. Przytrzymaj i unieś skórę brzucha myszy za pomocą kleszczy. Za pomocą skalpela chirurgicznego wykonaj małe, pionowe nacięcie o długości 1 cm. Wykonaj dwa nacięcia o długości około 0,5 - 1 cm, każde w kierunku tylnej nogi, aby uzyskać odwrócone nacięcie w kształcie litery Y.
      1. Użyj kleszczyków i bawełnianego wacika, aby delikatnie oddzielić skórę od brzucha i przypiąć skórę na boki, aby odsłonić pachwinowe gruczoły sutkowe. Umieść mysz pod stereoskopem i ustaw powiększenie na 2.0X. Upewnij się, że ustawiłeś ostrość tak, aby poduszeczka tłuszczowa sutka była wyraźnie widoczna i operowana.
    5. Umieść igłę 27G 1/2" na lodzie, aby wstępnie schłodzić. Zagruntować wcześniej strzykawkę o pojemności 1 ml mieszaniną macierzy membrany podstawnej, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza uwięzione w obszarze mocowania igły. Odpipetować 15 μl zmieszanego roztworu na nasadkę probówki do mikrowirówki, a następnie odessać całą objętość do zalanej strzykawki.
    6. Przytrzymaj poduszeczkę tłuszczową sutka przed pachwinowym węzłem chłonnym za pomocą cienkiej pęsety i lekko ją unieś, aby ułatwić wstrzyknięcie. Delikatnie włożyć około 1/4 igły strzykawki do poduszki tłuszczowej.
      1. Zwolnij pęsetę z podkładki do ssania, aby chwycić i ustabilizować igłę strzykawki. Wstrzykiwać roztwór powoli, aby zapobiec wyciekowi płynu. Przytrzymaj przez kilka sekund, aby upewnić się, że mieszanina komórek zestaliła się, aby zminimalizować wyciek podczas wyciągania igły.
    7. Zamknij płat skóry za pomocą wchłanialnych szwów. Zszyj płat skóry za pomocą niereaktywnego szwu monofilamentowego w rozmiarze 5-0 i zamknij rany węzłami chirurgicznymi, każdy węzeł jest oddalony od siebie o około 0,3 cm. Alternatywnie zamknij skórę zszywkami do ran.
    8. Umieść operowane myszy w osobnej klatce w celu odzyskania zdrowia. Umieść lampę grzewczą nad klatką, aby znieczulone myszy nie cierpiały z powodu hipotermii. Umieść miękki papier i bawełnę na dnie klatki, aby utrzymać myszy w cieple po operacji.
      1. Uważnie obserwuj myszy, aż wszyscy biorcy będą w pełni obudzeni. Przez kilka następnych dni należy zapobiegawczo stosować pooperacyjne leki przeciwbólowe u wszystkich zwierząt lub zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii placówki. Zastosuj antybiotyki zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt, jeśli dojdzie do zakażenia rany. Jeśli rana pooperacyjna została zamknięta zszywkami, należy zdjąć klipsy do rany 10 dni po zabiegu, gdy rana całkowicie się zamknie.

3. Przygotowanie tkanek do obserwacji mikroskopowych w całości

  1. Pobieranie tkanek
    1. Po 2-4 tygodniach od implantacji należy znieczulić nagie myszy biorcy BALB/c wstrzyknięciem dootrzewnowym 2,5% środka znieczulającego w dawce 0,12 ml na 20 g masy ciała, jak w kroku 2.2.2.
      Uwaga: Dodatni wzrost naczyń można wykryć 2 - 4 tygodnie po przeszczepie komórek.
    2. Oznaczyć krążenie ogólnoustrojowe biorcy wstrzyknięciem do żyły ogonowej barwnika izollektyny-647 w dawce 50 μg/25 g masy ciała, zawieszonego w 50 μl sterylnego PBS. Odczekaj okres odpoczynku 5 - 10 minut. Poświęć myszy za pomocą CO2 .
    3. Wyciąć obszar tkanki sutka, w którym komórki zostały początkowo wstrzyknięte zgodnie z krokiem 2.2.4; użyj nożyczek chirurgicznych. Za pomocą ostrza chirurgicznego pokrój tkankę w około 3-milimetrową kostkę o grubości od3 do 4 mm na 6-centymetrowej szalce Petriego.
  2. Trawienie tkanek i przygotowanie do barwienia przeciwciał.
    1. Trawić fragmenty tkanek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki bazowej do wytrawiania (etap 1.1.2) uzupełnionej kolagenazą III (300 j. na 10 ml).
    2. Umieść probówkę wirówkową o pojemności 15 ml poziomo na platformie kołyszącej z prędkością ustawioną na 100 obr./min i temperaturą ustawioną na 37 °C na około 1 godzinę, aby rozluźnić strukturę tkanki i usunąć nadmiar tkanki adipocytów.
      Uwaga: Adipocyty mają tendencję do wytwarzania autofluorescencji, co może powodować głośne tło fluorescencyjne. Pod koniec trawienia kawałki tkanki powinny mieć miękki, mętny wygląd. Optymalny okres trawienia zależy od wielkości rozdrobnionych kawałków tkanek i dlatego powinien być odpowiednio dostosowany, aby uzyskać najlepsze wyniki. Ponieważ unaczynienie tkanek zostało już oznaczone znakowaną fluorescencyjnie izollektyną, wszystkie poniższe procedury należy przeprowadzać w celu ochrony przed światłem.
    3. Umyj kawałki chusteczki PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Utrwal całą zmontowaną chusteczkę, ostrożnie umieszczając kawałki na 6-centymetrowej szalce Petriego wypełnionej do połowy z 4% PFA (pH 7,2 - 7,4), aby zachować fluorescencję. Umieść szalkę Petriego na platformie kołyszącej i delikatnie mieszaj tkankę przez 30 minut w temperaturze RT.
      Uwaga: PFA jest substancją rakotwórczą i należy obchodzić się z nią ostrożnie.
    4. Usuń pozostały PFA i umyj utrwaloną chusteczkę trzykrotnie buforem do płukania w całości (0,1% w PBS), z 10-minutowym odstępem między każdym praniem.
  3. Barwienie przeciwciał tkankowych w całości.
    1. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze do barwienia przeciwciał w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Inkubować tkankę z pierwszorzędowym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Jako przeciwciała pierwszorzędowe zastosowano szczurzą anty-CD31 (stężenie: 10 μg/ml) lub szczurzą anty-VE-kadherynę (CD144/Cdh5; stężenie: 2,5 μg/ml). Zarówno CD31, jak i VE-kadheryna są markerami powierzchniowymi komórek używanymi do rozpoznawania śródbłonka. 5x bufor do barwienia przeciwciał przygotowuje się z 500 mM kwasu maleinowego o pH 7,5; 750 mM NaCl; i 0,5% (v/v) tween rozpuszcza się w PBS. Dodawaj tylko odpowiednią objętość surowicy (5%) podczas przygotowywania świeżego 1x roztworu roboczego9.
    2. Usunąć bufor do barwienia przeciwciał i przemyć całą tkankę trzykrotnie buforem do przemywania w odstępie 10 minut. Inkubować tkankę z przeciwciałem drugorzędowym (patrz tabela materiałów) oraz DAPI w temperaturze pokojowej przez 4 godziny na platformie kołyszącej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Użyj DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) w końcowym stężeniu 5 μg / ml do wizualizacji jąder.
    3. Przemyj całą chusteczkę buforem do płukania 3 razy po 10 minut. Inkubuj kawałki tkanek w 80% glicerolu lub 80% sacharozie przez noc, aby odwodnić tkankę dla lepszej konserwacji.
    4. Umieść poszczególne kawałki tkanki na szkiełku podstawowym i usuń nadmierny bufor odwodnieniowy. Przykryj chusteczkę podłożem montażowym, umieść szkiełko nakrywkowe i delikatnie ściśnij chusteczkę, aby ją utrwalić.
    5. Wykonaj konfokalną akwizycję obrazu mikroskopowego. W przypadku całych gruczołów sutkowych uzyskaj obrazy za pomocą obiektywu 40X z NAW = 1,3 oleju. Skany kafelków stosów Z w rozdzielczości optycznej 1 024 x 1 024 i separacji warstw 1,0 - 1,2 μm.
      Uwaga: Aby uchwycić prawidłowy sygnał świetlny fluorescencji, rozdzielacz wiązki filtra powinien być ustawiony na potrójny dichroiczny (TD) 488/553/638, z ustawieniem wzmocnienia na wzmocnienie PMT 600-800. Należy stosować następujące źródła wzbudzenia/emisji: mGFP, o maksimum wzbudzenia/emisji 488/509 nm; mTomato o maksimach wzbudzenia/emisji 532/588 nm; Alexa-647, z maksimum wzbudzenia/emisji 594/665; i DAPI, z maksimami wzbudzenia/emisji 350/470.

4. Śledzenie linii przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy

  1. Wykrywanie Procr+ VESCs przy użyciu modelu myszy.
    1. Użyj szczepu myszy knock-in ProcrCreERT2-IRES-tdTomato/+ (określanego jako ProcrCreERT2).
      Uwaga: W tym modelu myszy po pierwszym kodonie ATG klasy Procr11 wstawia się CreERT2-IRES-tdTomato cassette10.
      1. Skrzyżowanie myszy Procr CreERT2 ze szczepem reporterowym Rosa26mTtomatomGFP (określanym jako R26mTmG) w celu prześledzenia losów endogennych EC Procr+ in vivo11. Zidentyfikuj wszystkie znakowane endogenne EC Procr+ i ich potomków za pomocą wyrażenia GFP.
    2. Podawać roztwór tamoksyfenu11 (10 mg tamoksyfenu rozpuszczone w 1 ml oleju arachidowego + 10% etanolu w celu uzupełnienia roztworu podstawowego 10 mg/ml) dootrzewnowo w dawce 4 mg/25 g masy ciała w okresie dojrzewania (5 tygodni) w celu śledzenia losów rozwojowych EC Procr+.
    3. Przeanalizuj skuteczność tworzenia klonów znakowanych komórek przez barwienie immunologiczne w całości, postępując zgodnie z krokami przygotowania opisanymi w kroku 3. Uzyskaj poduszeczki tłuszczowe sutka od leczonych myszy zarówno po krótkim okresie (2 dni), jak i dłuższym (do 10 miesięcy). Zobacz Rysunek 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja VESC z gruczołów mlekowych:

W celu wyizolowania populacji śródbłonka do następczego testu transplantacyjnego, jako materiał dawczy pobrano dojrzałe (8-tygodniowe) gruczoły mleczne dziewiczych myszy. Komórki śródbłonka wyizolowano za pomocą techniki sortowania komórek opartej na przeciwciałach. Reprezentatywne wykresy analizy FACS populacji VESC w komórkach śródbłonka gruczołów mlekowych 8-tygodniowych myszy C57BL/6 przedst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Testy angiogenezy stanowią dobre eksperymentalne podejście do badania dynamiki naczyń krwionośnych. Unaczynienie siatkówki myszy, które rozwija się po urodzeniu, okazało się atrakcyjnym modelem do badania angiogenezy12. Pomimo tego, że jest stosunkowo dostępna, rzeczywista manipulacja w łożysku naczyniowym siatkówki jest raczej trudna. Do tej pory najlepiej opisanym przeszczepem in vivo był test czopowy, który zamyka komórki w masie macierzy błony podstawnej i chirurgicznie wszczepia/wstr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31530045 i 31371500 do Y.A.Z., 31401245 do Q.C.Y.), Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (2014CB964800), Chińską Akademię Nauk (XDB19000000 do Y.A.Z.) oraz Chińskie Towarzystwo Biologii Komórki (stypendium Early Career Fellowship dla Q.C.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Kwas trypsynowo-etylenodiaminowy (EDTA) (1x)Gibco (Life Technologies)25300-0620,05% Trypsyna
0,22 i mikro; m Jednostka filtrującaMerck Millipore Ltd.SLGP033RB0,22 &mikro; m Filtr
2-metylobutanol-2, ReodagentPlus Sigma-Aldrich24, 048-6Alkohol tert amylowy
222, TribrometanolSigma-AldrichT48402-25g222, Tribrometanol
4',6-diamidyn-2-fenyloindol(DAPI)InvitrogenD1306DAPI
70 µ m Sitko do komórekBD FAL35235070 µ m Sitko
komórkowe Szkiełka mikroskopowe adhezyjneCITOGLAS 188105Szkiełka szklane
Anti-Mouse CD105 APCeBioscience17-1051-82, klon MJ7/18do stosowania w analusie FACS przy 1 &mikro; g / mL
Anti-mouse CD201 BiotynaeBioscience13-2012-82do stosowania w analizie FACS w 2,5 &mikro; g / mL
Anti-Mouse CD31 PE-Cyjanina 7eBioscience25-0311-82, klon 390do stosowania w analizie FACS w 1 &mikro; g/mL
BD FACSJazz Sorter komórekBD Biosciences655489FACS
Albumina surowicy bydlęcejSigma100190332BSA
WirówkaEppendorf5810R
Kolagenaza typ 3Worthington-Biochem#LS004183Kolagenaza III
Mikroskopia konfokalnaLeicasp8Konfokalna
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigmaD2463-5VLDnaza I
Osioł anty-Rat Cy3Jackson ImmunResearch712-165-150Przeciwciało wtórne, stosować w 0,5 &mikro; g / mL
Kleszcze DumontWPI500342Froceps
Kleszcze Dumont - Mikrostępione końcówkiFST11253-20Kleszcze
Hyklon do surowicy bydlęcejpłodu SH30396.03FBS
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119BioLegend78022Koktajl linii krwi do analizy FACS, stosować przy 25 &mikro; L na test
GlicerolSigmaG6279Glicerol
Zmodyfikowany Ilbecco's Medium firmy Dulbecco(Life Technologies)12440-053IMDM
Izolektyna GS-IB4 firmy Griffonia simplicifolia, Alexa Fluora  647InvitrogenZ32450Isolectin-647
Matrigel  Matrix (obniżony czynnik wzrostu)BD356231Matrigel
Szczep myszy (Actin-GFP)Jax Laboratories3773Actin-GFP
Szczep myszy (C57BL/6)SLACC57BL/6C57BL/6
Szczep myszy  (BALB/c nago)SLACBALB/c nagoNagie myszy
ParaformaldehydSigmaP6148PFA
Penicilin StreptomycynaGibco (Life Technologies)5140-122fosforanem długopisu/paciorkowca
(pH 7,2) 1xGibco (Life Technologies)c20012500BTPBS
PRIM1640Gibco (Life Technologies)c11875500CPPRIM1640
Odczynnik przeciwblaknięcie ProLong GoldLife TechnologiesP36934Medium montażowe Szczur
anty CD144BD Biosciences550548do analizy całego montażu, anty-VE-Kadheryna / Cdh5 antybdy do ścisłego połączenia śródbłonka, stosowanie przy 2,5 i mikro; g / mL
Szczur anty CD31-biotynaBD Biosciences553371do analusy całomocnej, przeciwciało anty-CD31 / PECAM1 dla cząsteczki adhezji powierzchni śródbłonka, stosować przy 10 i mikro; g / ml
Bufor do lizy czerwonych krwinekSigmaR7767-100MLBufor do lizy czerwonych krwinek
Prosty / Ostry-/ 10 cmFST14028-10Cienkie nożyczki
Streptawidyna eFluor 450eBioscience48-4317-82do analizy FACS przy 0,5 i mikro; g/ml
TamoksyfenSigma101551374TAM
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-250MLTritonX
Pleciony jedwab powlekany woskiem (rozmiar 5-0 USP (1 metryczny), 18 cali (45 cm) na igle C-1)Szew COVIDIENS1173 
Sterylne jednorazowe łopatkiSwann Morton#10Skalpel
BetadineYifeng Medyczny20160101Roztwór antyseptyczny
Sól fizjologiczna buforowana

Bibliografia

  1. Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
  2. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  3. Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
  4. Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407(2012).
  5. Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
  6. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  7. Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
  8. Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
  9. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
  10. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  11. Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
  12. Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  13. Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012(2014).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  15. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  16. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  17. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transplantacja tkanekmikroskopia całych preparatówsortowanie FACSmikroskopia konfokalnareceptor białka Cznakowanie izolektynąśrodowisko angiogenneśledzenie linii komórkowych
Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.