Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.

Streszczenie

Ten protokół opisuje nieinwazyjne pobieranie próbek nienaruszonego płynu błony śluzowej górnych dróg oddechowych. Szczegółowo opisano również procedurę ekstrakcji stosowaną przed analizą mediatorów immunologicznych w eluzatach płynnych w celu zbadania miejscowej sygnatury immunologicznej dróg oddechowych, bez konieczności stosowania procedur stymulacji (często stosowanych innymi technikami). Płyn z błony śluzowej pobiera się na pasku bibuły filtracyjnej umieszczonym w przedniej części małżowiny dolnej i pozostawianym na 2 minuty wchłaniania. Anality są eluowane z bibuły filtracyjnej, a wyekstrahowane eluaty na bazie białek są analizowane za pomocą testu immunologicznego opartego na elektrochemiluminescencji, co pozwala na kwantyfikację o wysokiej czułości analitów niskiego i wysokiego poziomu w tej samej próbce. Zmierzyliśmy poziomy in vivo 20 wstępnie wybranych mediatorów immunologicznych związanych ze specyficznymi szlakami sygnalizacji immunologicznej w błonie śluzowej górnych dróg oddechowych, ale technika ta nie jest ograniczona do tego konkretnego panelu lub miejsca pobierania próbek. Technika ta została po raz pierwszy zastosowana u 7-letnich dzieci z kohorty Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) z alergicznym nieżytem nosa. Następnie zastosowano go w podłużnej kohorcie urodzeniowej COPSAC₂₀₁₀, z której pobrano próbki w wieku 1 miesiąca, 2 lat i 6 lat oraz w przypadkach ostrych objawów ze strony układu oddechowego. Udało nam się uzyskać i przeanalizować próbki od 620 (89%) 700 1-miesięcznych dzieci; kilka próbek było poniżej granicy wykrywalności testu (podanej jako mediana (przedział międzykwartylowy (IQR)). Liczba próbek poniżej granicy wykrywalności (tj. od 0 do wartości zadanej dla dolnej granicy wykrywalności) dla każdego mediatora wynosiła 29 (7,25 - 119,5). Technika ta umożliwia ilościowe określenie profilu immunologicznego błony śluzowej dróg oddechowych in vivo od urodzenia, może być stosowana podłużnie i może być stosowana do badań nad wpływem genetyki i ekspozycji środowiskowej we wczesnym okresie życia, patofizjologią, endotypowaniem i monitorowaniem chorób układu oddechowego oraz opracowywaniem i oceną nowych środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Płyn błony śluzowej nosa stanowi płynną część górnych dróg oddechowych. Składa się ze złożonej macierzy mediatorów pochodzących z wzajemnego oddziaływania między nabłonkiem a komórkami odpornościowymi, które stanowią pierwszą linię obrony przed inwazyjnymi mikroorganizmami. Błona śluzowa nosa jest łatwo dostępna, a między nosem a oskrzelami istnieje silny funkcjonalny i immunologiczny związek¹. Przedział ten jest szczególnie interesujący w odniesieniu do chorób dróg oddechowych, które są powszechne w dzieciństwie, takich jak astma i alergiczny nieżyt nosa, ale także do szeregu innych zaburzeń układu oddechowego, które są bardziej rozpowszechnio....

Protokół

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami przewodnimi Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano zgody Komitetu ds. Etyki w Kopenhadze (KF 01-289/96 dla COPSAC₂₀₀₀ i H-B-2008-093 dla COPSAC₂₀₁₀) i Duńskiej Agencji Ochrony Danych, a przed zapisaniem uzyskano pisemną świadomą zgodę od obojga rodziców każdego uczestnika.

1. Konfiguracja eksperymentalna

1. Użyj arkuszy bibuły filtracyjnej (włókniste arkusze hydroksylowanego poliestru, patrz Tabela materiałów)^6,7.
   1. Wytnij paski o wymiarach 3 x 15 mm dla 1-miesięcznego dziecka i w kształcie litery L dla....

Wyniki

Charakterystyka wyjściowa profili odpornościowych dróg oddechowych:
Pełne dane dotyczące poziomów mediatorów odpornościowych błony śluzowej górnych dróg oddechowych w 1. miesiącu życia uzyskano u 620 (89%) z 700 dzieci włączonych do kohorty COPSAC₂₀₁₀. Dziesięcioro noworodków zakwalifikowano przed opracowaniem techniki, a 19 osób nie pojawiło się na wizycie w 1. miesiącu. Dodatkowo wykluczono 47 próbek, ponieważ zostały one wyizolowane i zmierzone w innym l.......

Dyskusja

Dzięki przedstawionej tutaj technice udało nam się określić in vivo profil immunologiczny błony śluzowej górnych dróg oddechowych u dzieci już od 1 miesiąca życia, czego wcześniej nie robiono. Zaobserwowaliśmy, że obecność specyficznych bakterii dróg oddechowych i pikornawirusów ^7,11, a także inne ekspozycje przed- i okołoporodowe, znajdowały odzwierciedlenie w profilu immunologicznym dróg oddechowych noworodków. Ponadto wykorzystaliśmy te dane dotyczące.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Włókniste hydroksylowane arkusze poliestrowe	Accuwik Ultra	SPR0730	Bibuła filtracyjna
Bufor testowy Milliplex	Millipore	L-AB	Buffer
Płytki magazynujące o niskim poziomie wiązania białek	Thermo Scientific	CLS8161	Plates
Inhibitor proteazy	Roche	11873580001	kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA
Czytnik płytek wielopunktowych	Mezoskalowy		obrazownik sektora NA 6000
testów	Mezoskalowy		ludzki test cytokin 10-plex TH1 / TH2 i test chemokiny 9-plex oraz singleplex IL-17A, TGF-β 1 oraz TSLP. Opis można znaleźć w Internecie na stronie www.mesoscale.com