Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

DOI:

10.3791/55800

⸱

7 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood (COPSAC), Herlev and Gentofte Hospital, University of Copenhagen, 2Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nieinwazyjne pobieranie próbek nienaruszonego płynu błony śluzowej górnych dróg oddechowych. Szczegółowo opisano również procedurę ekstrakcji stosowaną przed analizą mediatorów immunologicznych w eluzatach płynnych w celu zbadania miejscowej sygnatury immunologicznej dróg oddechowych, bez konieczności stosowania procedur stymulacji (często stosowanych innymi technikami). Płyn z błony śluzowej pobiera się na pasku bibuły filtracyjnej umieszczonym w przedniej części małżowiny dolnej i pozostawianym na 2 minuty wchłaniania. Anality są eluowane z bibuły filtracyjnej, a wyekstrahowane eluaty na bazie białek są analizowane za pomocą testu immunologicznego opartego na elektrochemiluminescencji, co pozwala na kwantyfikację o wysokiej czułości analitów niskiego i wysokiego poziomu w tej samej próbce. Zmierzyliśmy poziomy in vivo 20 wstępnie wybranych mediatorów immunologicznych związanych ze specyficznymi szlakami sygnalizacji immunologicznej w błonie śluzowej górnych dróg oddechowych, ale technika ta nie jest ograniczona do tego konkretnego panelu lub miejsca pobierania próbek. Technika ta została po raz pierwszy zastosowana u 7-letnich dzieci z kohorty Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) z alergicznym nieżytem nosa. Następnie zastosowano go w podłużnej kohorcie urodzeniowej COPSAC2010, z której pobrano próbki w wieku 1 miesiąca, 2 lat i 6 lat oraz w przypadkach ostrych objawów ze strony układu oddechowego. Udało nam się uzyskać i przeanalizować próbki od 620 (89%) 700 1-miesięcznych dzieci; kilka próbek było poniżej granicy wykrywalności testu (podanej jako mediana (przedział międzykwartylowy (IQR)). Liczba próbek poniżej granicy wykrywalności (tj. od 0 do wartości zadanej dla dolnej granicy wykrywalności) dla każdego mediatora wynosiła 29 (7,25 - 119,5). Technika ta umożliwia ilościowe określenie profilu immunologicznego błony śluzowej dróg oddechowych in vivo od urodzenia, może być stosowana podłużnie i może być stosowana do badań nad wpływem genetyki i ekspozycji środowiskowej we wczesnym okresie życia, patofizjologią, endotypowaniem i monitorowaniem chorób układu oddechowego oraz opracowywaniem i oceną nowych środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płyn błony śluzowej nosa stanowi płynną część górnych dróg oddechowych. Składa się ze złożonej macierzy mediatorów pochodzących z wzajemnego oddziaływania między nabłonkiem a komórkami odpornościowymi, które stanowią pierwszą linię obrony przed inwazyjnymi mikroorganizmami. Błona śluzowa nosa jest łatwo dostępna, a między nosem a oskrzelami istnieje silny funkcjonalny i immunologiczny związek1. Przedział ten jest szczególnie interesujący w odniesieniu do chorób dróg oddechowych, które są powszechne w dzieciństwie, takich jak astma i alergiczny nieżyt nosa, ale także do szeregu innych zaburzeń układu oddechowego, które są bardziej rozpowszechnione w późniejszym życiu.

Tutaj opisujemy implementację metody pobierania niezakłóconego płynu z błony śluzowej z jamy nosowej za pomocą nieinwazyjnej techniki opartej na bibule filtracyjnej, a także późniejszą procedurę ekstrakcji, używaną do elucji analitów białkowych z bibuły filtracyjnej przed ich kwantyfikacją. Technika ta może być na przykład stosowana do uzyskiwania sygnatur immunologicznych in vivo zarówno osób zdrowych, jak i osób z różnymi chorobami układu oddechowego. Ponadto możliwe jest zbadanie ekspozycji istotnych dla określonej sygnatury immunologicznej i ocena, czy jest ona predyktorem lub mediatorem późniejszego rozwoju choroby.

Płyn z błony śluzowej został wcześniej uzyskany przez płukanie nosa2, co często poprzedza próba prowokacyjna nosa, gdzie alergen jest wprowadzany w wysokich stężeniach w celu stymulowania reakcji zapalnej3,4. Jednak technika płukania nosa nie jest możliwa do zastosowania u małych dzieci i wprowadza nieznany czynnik rozcieńczenia, co zakłóca wyniki, ponieważ rozcieńczone poziomy mediatorów mogą spaść poniżej granicy wykrywalności testu5. Ponadto, ze względu na nieznany czynnik rozcieńczenia, zmierzone odpowiedzi analitu z nosowych testów prowokacyjnych nie są porównywalne między osobami, co ogranicza przydatność techniki płukania nosa w warunkach kohortowych. Wreszcie, prowokacja alergenem ma zastosowanie tylko u osób uczulonych, a inne prowokacje, takie jak prowokacja histaminą, nie są fizjologicznie istotne, potencjalnie powodując efekt górnego pułapu uwalniania mediatora. Problemy te są omijane w przedstawionej technice bibuły filtracyjnej do zbierania płynu z błony śluzowej, gdzie indywidualne wydzielanie płynów i poziomy analitów są jedynymi czynnikami wpływającymi na wariancję międzyosobniczą.

Podczas procedury ekstrakcji, anality są eluowane z bibuły filtracyjnej po dodaniu identycznych objętości buforu do wszystkich próbek. Sprzyja to podobnemu rozcieńczeniu ex vivo wszystkich próbek. Do etapu ekstrakcji stosuje się bufor ekstrakcyjny roztworu soli izotonicznej na bazie albuminy; Umożliwia ekstrakcję mediatorów opartych na białkach i stabilizuje białka w celu ograniczenia denaturacji podczas późniejszego zamrażania eluowanych białek przed kwantyfikacją. Aby uniknąć degradacji białek podczas fazy ekstrakcji, do buforu ekstrakcyjnego dodaje się koktajl inhibitorów proteazy.

Implementacja technik, które pozwalają na ilościowe określenie niezakłóconych, generowanych in vivo mediatorów immunologicznych w miejscach błony śluzowej, ma ogromne znaczenie. Po pierwsze, błona śluzówkowa stanowi największy narząd immunologiczny w organizmie. Po drugie, lokalizacja nosa jest głównym miejscem narażenia drogą powietrzną i jest ściśle połączona z przedziałem immunologicznym układu oddechowego płuc 1. Po trzecie, możliwość zbadania tego ważnego narządu za pomocą techniki nieinwazyjnej otwiera możliwość dostarczenia mnóstwa informacji na temat ważnej osi interakcji mikroorganizm-układ odpornościowy w odniesieniu do zdrowia i choroby dróg oddechowych. Po czwarte, istnieje wiele innych możliwych zastosowań tej techniki, takich jak badanie lokalnych zmian immunologicznych w randomizowanych, kontrolowanych badaniach leków i mikroelementów.

Początkowo wdrożyliśmy tę technikę w kohorcie Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000), gdzie określiliśmy profil immunologiczny płynu wyściełającego błonę śluzową u 7-letnich dzieci z alergicznym nieżytem nosa w porównaniu ze zdrowymi kontrolami13. Następnie z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę do podłużnej kohorty COPSAC2010 i oceniliśmy profile immunologiczne dróg oddechowych w wieku 1 miesiąca, 2 lat i 6 lat oraz w przypadkach ostrych objawów oddechowych. Wyniki uzyskane od 1-miesięcznych noworodków wykazały ważne powiązania między sygnaturą immunologiczną a ekspozycją środowiskową we wczesnym okresie życia7,8,9,10,11,12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami przewodnimi Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano zgody Komitetu ds. Etyki w Kopenhadze (KF 01-289/96 dla COPSAC2000 i H-B-2008-093 dla COPSAC2010) i Duńskiej Agencji Ochrony Danych, a przed zapisaniem uzyskano pisemną świadomą zgodę od obojga rodziców każdego uczestnika.

1. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Użyj arkuszy bibuły filtracyjnej (włókniste arkusze hydroksylowanego poliestru, patrz Tabela materiałów)6,7.
    1. Wytnij paski o wymiarach 3 x 15 mm dla 1-miesięcznego dziecka i w kształcie litery L dla starszych dzieci i dorosłych (5 x 20 x 10 mm (krótkie ramię L)).
  2. Włóż jeden kawałek bibuły filtracyjnej do każdego nozdrza niemowlęcia za pomocą kleszczy. Umieść bibułę filtracyjną w przedniej części małżowiny usznej dolnej (około 1 cm wewnątrz nozdrza dla noworodków i 1,5 cm dla wszystkich innych grup wiekowych).
    1. Umieść noworodki na łóżku i daj im wodę z cukrem dla wygody.
      UWAGA: W przypadku dzieci w każdym innym wieku pobieranie próbek jest najłatwiejsze do wykonania, gdy badany siedzi na krześle.
    2. W przypadku starszych dzieci włóż długie ramię bibuły filtracyjnej w kształcie litery L do każdego nozdrza.
  3. Załóż klips na nos wokół nozdrzy, aby zminimalizować dyskomfort i uniknąć przypadkowej utraty bibuły filtracyjnej.
  4. Usuń bibuły filtracyjne po 2 minutach wchłaniania.
  5. Umieścić bibuły filtracyjne w oznakowanych probówkach i natychmiast zamrozić je w temperaturze -80 °C.
  6. Należy zanotować wszelkie objawy infekcji dróg oddechowych wykazywane przez dziecko w dniu pobrania próbki.
  7. Zapisz każde kichanie, uporczywy płacz lub krwawienie z nosa, które wystąpi w ciągu 2 minut pobierania próbek.

2. Kwantyfikacja mediatorów immunologicznych dróg oddechowych

  1. Pobranie do 10 losowych próbek z zamrażarki. Zapisz numery identyfikacyjne. Próbki należy przechowywać na lodzie przez cały czas trwania procesu roboczego.
  2. Po rozmrożeniu na lodzie zanurzyć bibuły filtracyjne (na badanego) z obu nozdrzy w 300 μl świeżo przygotowanego buforu (patrz Tabela Materiałów) zawierającego jedną kompletną tabletkę inhibitora proteazy (patrz Tabela Materiałów) na 25 ml buforu.
    1. Dostosuj objętość bufora zgodnie z rozmiarem bibuły filtracyjnej.
      1. Do bibuł filtracyjnych o wymiarach 3 x 15 mm należy użyć 300 μl buforu.
      2. Jeśli dostępna jest tylko jedna bibuła filtracyjna, należy użyć połowy objętości bufora (150 μl).
  3. Przenieść próbki do wytrząsarki płytkowej (400 obr./min) na 5 minut. Użyć timera.
  4. Przenieść wilgotną bibułę filtracyjną i bufor do oznaczania do kubka filtra z rurki z octanu celulozy (wielkość porów 0,22 μm) umieszczonego w probówce do mikrowirówki (patrz tabela materiałów).
  5. Wirować przy 16 000 x g przez 5 minut w schłodzonej wirówce (w temperaturze 4 °C) w celu uzyskania przefiltrowanego ekstraktu z nosa w probówce.
  6. Wyjmij kubek i trzymaj probówki na lodzie, jednocześnie porcjując ekstrakt z nosa do studzienek płytek spichrzających o niskiej zawartości wiązań białkowych (patrz Tabela Materiałów).
  7. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
  8. Oznaczyć stężenia cytokin i chemokin w ekstraktach do nosa za pomocą wysoce czułego, opartego na elektrochemiluminescencji systemu multipleksowanego (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Przeprowadzono tutaj ludzki test cytokin 10-plex TH1 / TH2, test chemokiny 9-plex oraz pojedynczy pleks IL-17A, TGF-β1 i TSLP.
    1. W przypadku testów należy inkubować ekstrakty z nosa przez noc w temperaturze 4 °C. Pomiary należy przeprowadzić zgodnie ze standardowym protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Testy immunologiczne (patrz Tabela materiałów) zazwyczaj mają wysoki zakres dynamiki pomiaru w zakresie od 1 do 10 000 pg/ml, ale w przypadku niektórych testów może to być 100 000 pg/ml. Oznacza to, że wszystkie próbki mogą być badane w tym samym rozcieńczeniu, co ogranicza wpływ różnych rozcieńczeń u osób zdrowych i chorych, jak ma to miejsce w przypadku innych podobnych testów immunologicznych. Dolna granica wykrywalności dla wszystkich cytokin wynosiła 1 pg/ml lub mniej, a dla chemokin wahała się od 1 do 50 pg/ml. TSLP nie był wykrywalny w 98% próbek w wieku 1 miesiąca.

3. Statystyki

  1. Przekształć dane logarytmicznie przed analizą, aby uzyskać normalnie rozłożone resztki poziomów cytokin i chemokin.
  2. Jeśli próbki są analizowane w więcej niż jednej partii, należy skorygować dane dotyczące cytokin i chemokin, aby wyśrodkować partię na danych przekształconych w logarytm.
    1. Uwzględnij ogólną średnią i transformację antylogarytmiczną, aby uzyskać dane w oryginalnych jednostkach miary.
      UWAGA: Dla każdego zestawu wykonanych analiz należy rozważyć dostosowanie zmiennych, które wpływają na poziom cytokin i chemokin. Mogą to być wpływy matki (np. spożywanie alkoholu i palenie tytoniu w czasie ciąży), karmienie piersią, zdarzenia niepożądane podczas pobierania próbek, rodzeństwo, zwierzęta domowe w domu itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowe cechy profili immunologicznych dróg oddechowych:
Pełne dane dotyczące poziomu mediatora immunologicznego błony śluzowej górnych dróg oddechowych w wieku 1 miesiąca uzyskano u 620 (89%) z 700 dzieci włączonych do kohorty COPSAC2010. Dziesięć noworodków zostało zapisanych przed ustaleniem techniki, a 19 nie wzięło udziału w trwającej 1 miesiąc wizycie. Ponadto 47 próbek zostało wykluczonych, ponieważ zostały wyekstrahowane i zmierzone w innym labor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki przedstawionej tutaj technice udało nam się określić in vivo profil immunologiczny błony śluzowej górnych dróg oddechowych u dzieci już od 1 miesiąca życia, czego wcześniej nie robiono. Zaobserwowaliśmy, że obecność specyficznych bakterii dróg oddechowych i pikornawirusów 7,11, a także inne ekspozycje przed- i okołoporodowe, znajdowały odzwierciedlenie w profilu immunologicznym dróg oddechowych noworodków. Ponadto wykorzystaliśmy te dane dotyczące...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak potencjalnego, postrzeganego lub rzeczywistego konfliktu interesów w odniesieniu do treści tego manuskryptu. Agencje finansujące nie odegrały żadnej roli w opracowaniu i przeprowadzeniu badania; gromadzenie, zarządzanie i interpretacja danych; lub przygotowanie, recenzję i zatwierdzenie manuskryptu. W badaniu nie brała udziału żadna firma farmaceutyczna.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrażamy naszą wdzięczność dzieciom i rodzinom biorącym udział w badaniu kohortowym COPSAC2010 za całe ich wsparcie i zaangażowanie. Uznajemy i doceniamy wyjątkowe wysiłki zespołu badawczego COPSAC oraz pomoc techniczną technik Lisbeth Buus Rosholm z Duńskiego Uniwersytetu Technicznego w zakresie pomiaru cytokin i chemokin

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Włókniste hydroksylowane arkusze poliestroweAccuwik Ultra SPR0730Bibuła filtracyjna
Bufor testowy Milliplex MilliporeL-ABBuffer
Płytki magazynujące o niskim poziomie wiązania białek Thermo ScientificCLS8161Plates
Inhibitor proteazyRoche11873580001kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA
Czytnik płytek wielopunktowychMezoskalowyobrazownik sektora NA 6000
testów Mezoskalowyludzki test cytokin 10-plex TH1 / TH2 i test chemokiny 9-plex oraz singleplex IL-17A, TGF-β 1 oraz TSLP. Opis można znaleźć w Internecie na stronie www.mesoscale.com

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
  2. Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
  3. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  4. Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
  5. Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
  6. Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  7. Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  8. Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  9. Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
  10. Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700(2013).
  11. Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
  12. Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  13. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  14. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  15. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
  16. Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
  17. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  18. Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mucosal Lining FluidUpper AirwayImmune Mediator QuantificationNoninvasive SamplingFilter Paper AbsorptionElectrochemiluminescence ImmunoassayNasal Extract AnalysisProtease Inhibitor SupplementLow Protein Binding StoragePediatric Respiratory Diseases

Powiązane artykuły