Artykuł metodologiczny

Przewidywanie wyciszania genów poprzez czasoprzestrzenną kontrolę uwalniania siRNA z reagujących na światło nanonośników polimerowych

DOI:

10.3791/55803

⸱

21 lipca 2017

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy nowatorską metodę, która wykorzystuje fotoczułe kopolimery blokowe do bardziej efektywnej czasoprzestrzennej kontroli wyciszania genów bez wykrywalnych efektów poza celem. Ponadto zmiany w ekspresji genów można przewidzieć za pomocą prostych testów uwalniania siRNA i prostego modelowania kinetycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potrzebne są nowe materiały i metody, aby lepiej kontrolować wiązanie i uwalnianie kwasów nukleinowych dla szerokiego zakresu zastosowań, które wymagają precyzyjnej regulacji aktywności genów. W szczególności nowatorskie materiały reagujące na bodźce, o ulepszonej czasoprzestrzennej kontroli ekspresji genów, odblokują translacyjne platformy w zakresie odkrywania leków i technologii medycyny regeneracyjnej. Co więcej, zwiększona zdolność do kontrolowania uwalniania kwasów nukleinowych z materiałów umożliwiłaby opracowanie uproszczonych metod przewidywania a priori skuteczności nanonośników, co doprowadziłoby do przyspieszonych badań przesiewowych pojazdów dostawczych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół przewidywania skuteczności wyciszania genów i osiągania czasoprzestrzennej kontroli nad ekspresją genów za pomocą modułowego systemu nanonośników reagującego na światło. Małe interferujące RNA (siRNA) są skompleksowane z polimerami mPEG-b-poli(5-(3-(amino)propoksy)-2-nitrobenzyl metakrylan) (mPEG-b-P(APNBMA)) w celu utworzenia stabilnych nanonośników, które można kontrolować za pomocą światła, aby ułatwić dostrajanie uwalniania siRNA w zależności od tego, co można dostroić. Przedstawiamy dwa uzupełniające się testy wykorzystujące spektroskopię korelacji fluorescencji i elektroforezę żelową w celu dokładnego określenia ilościowego uwalniania siRNA z roztworów naśladujących środowiska wewnątrzkomórkowe. Informacje uzyskane z tych testów zostały włączone do prostego modelu kinetycznego interferencji RNA (RNAi) w celu przewidzenia dynamicznych reakcji wyciszania na różne warunki fotobodźca. Z kolei te zoptymalizowane warunki napromieniania pozwoliły na udoskonalenie nowego protokołu czasoprzestrzennego wyciszania genów. Ta metoda może generować wzorce komórkowe w ekspresji genów z rozdzielczością komórka-komórka i bez wykrywalnych efektów poza celem. Podsumowując, nasze podejście oferuje łatwą w użyciu metodę przewidywania dynamicznych zmian w ekspresji genów i precyzyjnego kontrolowania aktywności siRNA w przestrzeni i czasie. Ten zestaw testów można łatwo dostosować do testowania szerokiej gamy innych systemów reagujących na bodźce w celu sprostania kluczowym wyzwaniom związanym z wieloma zastosowaniami w badaniach biomedycznych i medycynie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe interferujące RNA (siRNA) pośredniczą w potranskrypcyjnym wyciszaniu genów poprzez katalityczny szlak RNAi, który jest wysoce specyficzny, silny i możliwy do dostosowania do praktycznie każdego docelowego genu1. Te obiecujące cechy umożliwiły postęp terapii siRNA w badaniach klinicznych na ludziach w leczeniu wielu chorób, w tym czerniaka z przerzutami i hemofilii2,3. Nadal jednak występują poważne problemy z dostarczaniem, które utrudniają tłumaczenie4. W szczególności pojazdy dostawcze muszą pozostać stabilne i chronić siRNA przed degradacją zewnątrzkomórkową, a jednocześnie uwalniać ładunek do cytoplasm5. Co więcej, wiele zastosowań RNAi wymaga ulepszonych metod regulacji wyciszania genów w przestrzeni i czasie6, co zmniejszy skutki uboczne w terapiach siRNA7 i umożliwi transformacyjny postęp w zastosowaniach od mikromacierzy komórkowych do odkrywania leków8 do modulacji odpowiedzi komórek w rusztowaniach regeneracyjnych9. Wyzwania te podkreślają potrzebę opracowania nowych materiałów i metod, aby lepiej kontrolować wiązanie i uwalnianie w nanonośnikach siRNA.

Jedną z najbardziej obiecujących strategii kontrolowania uwalniania siRNA i poprawy regulacji czasoprzestrzennej jest wykorzystanie materiałów reagujących na bodźce10. Na przykład, szeroka gama biomateriałów została zaprojektowana ze zmiennym powinowactwem do wiązania kwasów nukleinowych w odpowiedzi na zmieniony potencjał redoks lub pH, lub zastosowane pola magnetyczne, ultradźwięki lub światło11. Chociaż wiele z tych systemów wykazuje lepszą kontrolę nad aktywnością kwasów nukleinowych, użycie światła jako wyzwalacza jest szczególnie korzystne ze względu na jego natychmiastową reakcję czasową, precyzyjną rozdzielczość przestrzenną i łatwość dostrajania12. Co więcej, wykazano potencjał technologii światłoczułych w zakresie regulacji ekspresji genów dzięki najnowocześniejszym indukowalnym systemom promotorów i regulatorów optogenetycznych; Jednak systemy te borykają się z licznymi wyzwaniami, w tym ograniczonymi możliwościami regulacji genów endogennych, obawami dotyczącymi bezpieczeństwa, takimi jak immunogenność, oraz trudnościami w dostarczaniu zestawów wieloskładnikowych13,14,15. Fotoczułe nanonośniki siRNA idealnie nadają się do przezwyciężenia tych wad i zapewniają prostsze i bardziej niezawodne podejście do czasoprzestrzennej modulacji ekspresji genów16,17,18. Niestety, metody pozwalające na dokładne przewidywanie wynikowej odpowiedzi na knockdown białek pozostają nieuchwytne.

Kluczowym wyzwaniem jest to, że ilościowe oceny uwalniania siRNA są rzadkie19,20, a nawet gdy te oceny są wykonywane, nie zostały one połączone z analizami dynamiki obrotu siRNA/białka. Zarówno ilość uwalnianego siRNA, jak i jego trwałość/czas życia są ważnymi determinantami wynikającej dynamiki wyciszania genów; w związku z tym brak takich informacji jest poważnym rozłączeniem, które uniemożliwia dokładne przewidzenie odpowiedzi na dawkę w RNAi21. Sprostanie temu wyzwaniu przyspieszyłoby formułowanie odpowiednich relacji struktura-funkcja w nanonośnikach i pozwoliłoby lepiej informować o projektach biomateriałów22. Co więcej, takie podejścia umożliwiłyby opracowanie skuteczniejszych protokołów dawkowania siRNA. Próbując zrozumieć dynamiczną reakcję wyciszania, kilka grup zbadało modele matematyczne RNAi23,24,25. Ramy te z powodzeniem dostarczyły informacji na temat zmian w ekspresji genów za pośrednictwem siRNA i zidentyfikowały kroki ograniczające szybkość26. Jednak modele te zostały zastosowane tylko do komercyjnych systemów dostarczania genów (np. Lipofektaminy i polietyleniminy (PEI)), które nie są zdolne do kontrolowanego uwalniania siRNA, a złożoność modeli poważnie ograniczyła ich użyteczność27. Niedociągnięcia te uwypuklają niezaspokojone zapotrzebowanie na nowe materiały zdolne do precyzyjnego uwalniania siRNA w połączeniu z usprawnionymi i łatwymi w użyciu predykcyjnymi modelami kinetycznymi.

Nasza metoda rozwiązuje wszystkie te wyzwania poprzez integrację światłoczułej platformy nanonośników z sprzężonymi metodami do ilościowego określania dynamiki wolnego siRNA i modelowej dynamiki RNAi. W szczególności precyzyjnie kontrolowane uwalnianie siRNA na naszej platformie28 jest monitorowane za pomocą dwóch uzupełniających się metod dokładnego ilościowego określania sherpsulowanego i niezwiązanego siRNA. Dane eksperymentalne z tych testów są wprowadzane do prostego modelu kinetycznego w celu przewidywania skuteczności wyciszania genów a priori29. Wreszcie, charakter włączania/wyłączania nanonośników można łatwo wykorzystać do generowania wzorców komórkowych w ekspresji genów z kontrolą przestrzenną na skali długości komórki. W związku z tym metoda ta zapewnia łatwą do dostosowania metodę kontrolowania i przewidywania wyciszania genów w różnych zastosowaniach, które skorzystałyby na czasoprzestrzennej regulacji zachowania komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Formułowanie nanonośników siRNA

  1. Przygotować oddzielne roztwory siRNA i mPEG-b-P(APNBMA) o równych objętościach rozcieńczone w 20 mM buforze kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES) o pH 6,0.
    1. Dodać siRNA w stężeniu 32 μg/ml do 20 mM roztworu HEPES.
      UWAGA: SiRNA było nieukierunkowaną, uniwersalną sekwencją kontroli negatywnej; jednak siRNA można zaprojektować tak, aby celował w dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.
    2. Rozpuść polimery mPEG-b-P(APNBMA) w 20 mM roztworze HEPES. Dodać odpowiednią ilość mPEG-b-P(APNBMA), aby uzyskać roztwór o stężeniu 220 μg/ml tak, aby stosunek N/P (N, grupy aminowe na mPEG-b-P(APNBMA); P, grupy fosforanowe na siRNA) wynosi 4,
      UWAGA: Protokół syntetyczny dla polimerów mPEG-b-P(APNBMA) jest opisany gdzie indziej30.
  2. Dodawać roztwór mPEG-b-P(APNBMA) kroplami do równej objętości roztworu siRNA, delikatnie mieszając na maszynie wirowej. Kontynuuj wirowanie przez 30 s po dodaniu polimeru. Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

2. Pomiar uwalniania siRNA za pomocą elektroforezy żelowej

  1. Sformułuj nanonośniki zgodnie z krokami 1.1-1.2 i skaluj objętości, aby dostosować je do pożądanej liczby próbek.
  2. Wymieszać nanonośnik z dodecylosiarczanem sodu (SDS).
    1. Przygotować 1 mg/ml roztworu SDS w wodzie. Podzielić ilość roztworu SDS potrzebną do wytworzenia roztworów o stosunku S/P (S, grupy siarczanowe na SDS; P, grupy fosforanowe na siRNA) 15,
      UWAGA: Jeśli roztwór polipleksu zawiera 1 μg siRNA, należy dodać 13 μg SDS, aby uzyskać stosunek S/P 15.
    2. Dodaj roztwór SDS do każdego roztworu nanonośnika kroplami, delikatnie mieszając na maszynie wirowej. Kontynuuj wirowanie przez 30 sekund po dodaniu SDS.
    3. Odwirować próbki w temperaturze 3 000 x g przez 5 s. Próbki inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Skalibruj i ustaw laser UV z filtrem 365 nm na intensywność 200 W/m. Upewnij się, że natężenie światła jest mierzone od miejsca, w którym zostanie osadzone dno roztworu próbki.
  4. Załaduj roztwór nanonośnika/SDS do szklanej komory składającej się ze szklanych szkiełek oddzielonych gumową uszczelką.
    1. Umyj wstępnie szkiełka w roztworze etanol/woda w proporcji 7:3 (v/v) w wodzie i całkowicie wysusz. Wytnij otwór (prostokąt ~2 x 3 cm) w gumowej uszczelce. Umieść gumową uszczelkę na szklanym szkiełku.
    2. Odpipetować roztwór nanonośnika/SDS na szklane szkiełko wewnątrz otworu gumowej uszczelki. Załadować nadmiar roztworu (20 μl nadwyżki) na szkiełko podstawowe, unikając kontaktu z gumową uszczelką.
      UWAGA: Podczas kolejnych kroków zostanie utracona część płynu.
    3. Umieść drugi szkiełko na uszczelce prowadnicy. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, najpierw umieść jeden koniec zjeżdżalni w dół, a następnie powoli opuść drugi koniec.
    4. Przymocuj klipsy do segregatora z każdej strony szklanej komory, aby utrzymać ją zamkniętą.
  5. Naświetlać próbki przez żądany okres czasu (np. 0-60 min) za pomocą lasera UV z filtrem 365 nm o natężeniu 200 W/m. Zdjąć spinki do segregatora i otworzyć komorę.
  6. Pobrać pipetę 25 μl napromienionych próbek nanonośnika/SDS do probówki mikrowirówkowej. Roztwory inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  7. Przygotować 2% wagowy żel agarozowy wstępnie wybarwiony 0,5 μg/ml bromku etydyny w roztworze buforowanym Tris/Boran/EDTA (TBE) zgodnie ze standardowymi protokołami31. Przygotować bufor ładujący składający się z glicerolu w proporcji 3:7 (v/v) woda.
  8. Dodać 5 μl roztworu buforu ładującego do 25 μl każdej próbki nanonośnika/SDS. Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  9. Załadować 30 μl każdej próbki nanonośnika/SDS do 2% żelu agarozowego. Uruchom żel w ciemności pod napięciem 100 V przez 30 minut. Zobrazuj żel za pomocą systemu obrazowania żelu z filtrami bromku etydyny. Zapisz pliki obrazów żelu i przejdź do kroku 2.10, aby określić ilościowo intensywność pasma. Upewnij się, że natężenia pasma są wystarczająco jasne, aby wyraźnie je uwidocznić, ale nie za jasne, aby sygnały były nasycone.
  10. Określ ilościowo natężenia pasma za pomocą publicznie dostępnego oprogramowania ImageJ32.
    1. Korzystając z narzędzia ROI ImageJ, określ intensywność fluorescencji wolnych prążków siRNA na każdym pasie, rysując prostokąt wokół każdego pasma. Wykreśl krzywe intensywności każdego pasa ruchu i zintegruj obszar pod krzywymi, rysując poziomą linię w poprzek krzywych intensywności i klikając różdżkę śledzącą wewnątrz zamkniętych obszarów.
    2. Obliczyć względną intensywność każdego pasa ruchu, dzieląc obszar pod krzywą każdej próbki przez obszar pod krzywą kontroli pozytywnej siRNA (bez dodatku mPEG-b-P (APNBMA) i bez dodatku SDS). Podaj procent uwolnionego siRNA jako znormalizowane natężenie pasma każdej próbki.

3. Pomiar uwalniania siRNA za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS)

  1. Otrzymać siRNA znakowane pojedynczym fluoroforem na końcu 5' nici sensownej.
    UWAGA: SiRNA można kupić wstępnie wyżarzone z etykietami sprzężonymi w żądanym miejscu. Fluorofor powinien być fotostabilny i absorbować/emitować od 450 do 750 nm, aby uniknąć gaszenia światłem UV i transferu energii za pomocą mPEG-b-P(APNBMA).
  2. Sformułuj nanonośniki zgodnie z krokami 1.1-1.2 za pomocą znakowanego siRNA. Zwiększ objętości, aby dostosować je do żądanej liczby próbek.
  3. Inkubować roztwory w SDS i naświetlać przez żądany okres czasu zgodnie z krokami 2.2-2.6.
  4. Przygotowanie komory na próbki FCS.
    1. Umyj szkiełko roztworem etanolu/wody w proporcji 7:3 (v/v) i całkowicie osusz szkło za pomocą chusteczki i strumienia powietrza.
    2. Usuń kawałki papieru z dwustronnej podkładki dystansowej samoprzylepnej, aby odsłonić dwustronną przekładkę samoprzylepną. Przymocuj przekładkę do szklanego szkiełka nakrywkowego.
    3. Odpipetować roztwór nanonośnika/SDS na szkiełko nakrywkowe w środku otworu z przekładki samoprzylepnej.
    4. Umieść szkiełko podstawowe na szkiełku nakrywkowym. Dociśnij szkiełko podstawowe, aby upewnić się, że szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe są dobrze zamocowane i tworzą uszczelnienie.
  5. Użyj mikroskopu konfokalnego do pomiarów FCS33. Użyj 40-krotnego obiektywu apochromatycznego z zanurzeniem w wodzie i aperturze numerycznej 1,2. Użyj odpowiedniego kanału lasera wzbudzenia (488 nm), aby zebrać co najmniej 30 pomiarów po 10 s każdy na próbkę34. Upewnij się, że intensywność lasera i wyrównanie detektora pozostają takie same dla każdej próbki.
    1. Oprócz próbek eksperymentalnych, należy przeprowadzić kontrole pomiarowe, w tym: ślepą próbkę bez znakowanego siRNA oraz wolną próbkę siRNA ze znakowanym siRNA, ale bez mPEG-b-P (APNBMA).
  6. Analizuj dane za pomocą oprogramowania specyficznego dla FCS. Zidentyfikuj podstawową szybkość zliczania każdej próbki, określając stabilną szybkość zliczania w czasie, gdy żadne nanonośniki nie przechodzą przez objętość konfokalną29.
    1. Odejmij szybkość zliczania ślepej próbki od każdej wartości współczynnika zliczania próbki w linii bazowej. Znormalizuj wynikowe wartości do kontroli wolnego siRNA, aby obliczyć procent wolnego siRNA35.

4. Modelowanie kinetyczne do przewidywania wyciszania genów

  1. Twórz skrypty w matematycznym języku programowania, korzystając z prostego zestawu zwykłych równań różniczkowych, aby przewidzieć wyciszanie genów29.
    UWAGA: Skrypty mogą być udostępniane na żądanie.
    1. Zapisz zestaw równań różniczkowych zwyczajnych jako:
      figure-protocol-1 (1)
      figure-protocol-2 (2)
      figure-protocol-3 (3)
      UWAGA: W przypadku równań 1−3 terminy kmRNA, ksiRNA i kprot są stałymi szybkości produkcji odpowiednio mRNA, siRNA i białka. Terminy km, deg, ks, deg i kp, deg są stałymi szybkości degradacji odpowiednio mRNA, siRNA i białka. Stałe szybkości degradacji są obliczane na podstawie okresów półtrwania składnika, a stałe szybkości produkcji są odpowiednie, aby zapewnić, że wartości mRNA i białka w stanie stacjonarnym zostaną osiągnięte przy braku siRNA.
      1. Określ okres półtrwania mRNA i białka dla interesującego genu (genów), albo eksperymentalnie, jak opisano w odnośniku 36, albo z literatury (patrz Dyskusja). Określ również czas podwojenia linii komórkowej. Wprowadź te wartości do odpowiednich wyrażeń współczynnika degradacji.
      2. Dostosuj stałe szybkości produkcji tak, aby poziomy ekspresji genów pozostawały stałe na znormalizowanej wartości 100, jeśli nie zostanie wprowadzone siRNA. W szczególności ustaw [siRNA] na zero i zmieniaj wartości stałych szybkości produkcji kmRNA, ksiRNA i kprot, aż [mRNA] i [białko] pozostaną w granicach 1% początkowej znormalizowanej wartości 100% na czas trwania symulacji.
      3. Wykorzystując względne ilości siRNA uwolnione z wcześniej opisanej elektroforezy żelowej i testów FCS jako szacunki, dostosuj początkowe względne stężenie siRNA w scenariuszu. W szczególności zróżnicuj [siRNA] tak, aby było proporcjonalne do względnej ilości uwolnionego siRNA, przy czym wartość 100 odpowiada maksymalnej ilości29.

5. Hodowla komórkowa i dostarczanie siRNA in vitro

  1. Hodowla mysich fibroblastów embrionalnych NIH/3T3 zgodnie z protokołami dostawcy.
    1. Hoduj komórki w pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną). Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2 .
  2. Wysiewaj komórki na 6-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych.
    1. Postępuj zgodnie z zalecaną przez dostawcę procedurą subkulturacji. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki w uzupełnionej pożywce wzrostowej do stężenia 75 000 komórek/ml.
    2. Dodaj 2 ml zawiesiny komórkowej (75 000 komórek/ml) do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Pozwól komórkom przylegać i regenerować się przez 24 godziny w inkubatorze.
  3. Przygotować komórki do transfekcji, przemłukując je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodając 1,5 ml pożywki do transfekcji wolnej od surowicy i antybiotyków (patrz Tabela Materiałów) do każdej studzienki.
  4. Sformułuj nanonośniki siRNA zgodnie z krokami 1.1-1.2. Do każdej studzienki dodać 25 μl roztworu nanonośnika zawierającego 30 pmol siRNA. Delikatnie odpipetuj media w górę i w dół, aby wymieszać. Umieść komórki w inkubatorze na 3 godziny.
  5. Usuń pożywkę transfekcyjną i umyj każdą studzienkę PBS. Dodać 1 ml uzupełnionej pożywki wzrostowej i umieścić komórki w inkubatorze, aby doszły do siebie przez 30 minut.
  6. Aby przygotować komórki do leczenia bodźcem fotograficznym, należy usunąć uzupełnioną pożywkę wzrostową. Dodać 1 ml pożywki do transfekcji (bez czerwieni fenolowej) do każdego dołka.
    UWAGA: Upewnij się, że podłoże do transfekcji nie zawiera czerwieni fenolowej.
  7. Skalibruj i ustaw laser UV z filtrem 365 nm na intensywność 200 W/m. Upewnij się, że natężenie światła jest mierzone od miejsca, w którym zostanie osadzona dolna część płytki ogniwa.
  8. Umieść ogniwa na płycie grzejnej ustawionej na 37 °C. Zdejmij pokrywę płytek z komórek. Naświetlać ogniwa znad płytki przez żądany czas (do 20 min) za pomocą lasera UV z filtrem 365 nm o natężeniu 200 W m-2.
  9. Usunąć pożywkę do transfekcji i dodać 2 ml uzupełnionej pożywki wzrostowej. Umieścić w inkubatorze do czasu dalszej analizy (np. 24 godziny w przypadku qPCR i 48 godzin w przypadku Western blot).
    1. Mierz zmiany w ekspresji genów za pomocą różnych technik, takich jak Western blotting37 i qPCR. 38 Dla genów z widocznymi sygnałami, takich jak GFP, użyj mikroskopii fluorescencyjnej29.
      UWAGA: Techniki te są sugerowane ze względu na ich łatwość użycia i dokładność w ilościowym określaniu ekspresji genów

6. Kontrolowanie wyciszania genów w sposób czasoprzestrzenny

  1. Hodowla, nasiona i transfekcja komórek zgodnie z krokami 5.1-5.7.
  2. Przygotuj fotomaskę, która całkowicie blokuje światło 365 nm i minimalizuje odbicia.
    UWAGA: W tym przypadku użyto kawałków folii aluminiowej o wymiarach 10 x 10 cm i czarnego papieru budowlanego, aby odpowiednio zablokować światło i zredukować odbicia. Folia aluminiowa i papier budowlany zostały sklejone ze sobą, tworząc jedną całość.
    1. Wytnij/przedziurkaj/obrabij żądany kształt w fotomasce. Na przykład użyj ostrza o ostrych krawędziach i dziurkacza, aby utworzyć odpowiednio wzór w linii prostej (~5 cm długości) i okrągły wzór (o średnicy ~7 mm) w fotomasce.
  3. Przyklej fotomaskę do dolnej części płytki 6-dołkowej ze wzorem wyśrodkowanym pod studzienką zawierającą komórki, stroną antyrefleksyjną (np. papier budowlany) skierowaną w stronę płytki. Upewnij się, że klej nie jest umieszczony w pobliżu krawędzi (w promieniu ~3 mm) od wzoru.
  4. Ustaw dwa stojaki pierścieniowe w odległości około 25 cm od siebie i przymocuj platformę do każdego stojaka pierścieniowego tak, aby platformy były równej wysokości. Zawieś płytkę ogniwa między dwoma stojakami, opierając płytkę na platformach. Upewnij się, że płyta jest wypoziomowana.
  5. Naświetlać komórki od dołu próbki przez żądany czas (do 20 min) za pomocą lasera UV z filtrem 365 nm o natężeniu 200 W/m2.
  6. Usunąć pożywkę do transfekcji i dodać 2 ml uzupełnionej pożywki wzrostowej. Umieścić w inkubatorze w celu rekonwalescencji przez co najmniej 24 godziny. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zgodnie z opisem29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po sformułowaniu nanonośników, przeprowadzono testy uwalniania siRNA, aby określić warunki napromieniania, które mają być stosowane w transfekcjach in vitro. Zastosowano różne dawki światła, aby określić procent siRNA, który został uwolniony. W pierwszym teście wykorzystano elektroforezę żelową w celu oddzielenia wolnych cząsteczek siRNA od cząsteczek siRNA nadal skompleksowanych/związanych z polimerem. Nanonośniki, które nie zostały poddane działaniu światła, pozostały stabilne ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jest kilka kroków w metodzie, które są szczególnie krytyczne. Przy formułowaniu nanonośników, kolejność dodawania składników i szybkość mieszania to dwa ważne parametry wpływające na skuteczność39. Protokół ten wymaga, aby składnik kationowy, mPEG-b-P (APNBMA), był dodawany do składnika anionowego, siRNA, w sposób kroplowy podczas wirowania. W zależności od całkowitej objętości preparatu, proces mieszania trwa 3-6 sekund. Aby sprawdzić, czy nanonośniki zostały prawidłowo uformowane, zmier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Narodowemu Instytutowi Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) za wsparcie finansowe poprzez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) w ramach grantu numer P20GM103541 oraz grant numer P20GM10344615. Oświadczenia zawarte w niniejszym dokumencie nie odzwierciedlają poglądów NIH. Dziękujemy również Delaware Biotechnology Institute (DBI) i Delaware Economic Development Office (DEDO) za wsparcie finansowe w postaci nagrody Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) (12A00448).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
siRNASigma-AldrichSIC001niecelowana, uniwersalna kontrola ujemna
mPEG-b-P(APNBMA)zsyntetyzowany w naszym laboratoriumN/Aświatłoczuły polimer
HEPESFisher ScientificBP310-100
dodecylosiarczan sodu Uszczelka gumowa Sigma-Aldrich436143
McMaster-Carr3788T21o grubości 0,5 mL
 Excelitas TechnologiesOmnicure S2000i filtrze 365 nm zastosowano
bromek etydyny
na zamówieniefluorofor sprzężony z 5' szkiełkiem mikroskopowym końca pasma zmysłu
Fisher Scientific12-550-A3wstępnie oczyszczone szkło
Secure-Seal SpacerLife TechnologiesS24735dwustronny klej
LSM 780 Mikroskop konfokalnyCarl ZeissN/A
ZEN 2010Carl ZeissN/AFCS oprogramowanie
MATLABMathWorksN/Ajęzyk programowania
NIH/3T3 komórki ATCCATCC CRL-1658
DMEMMediatech10-013-CVpożywka wzrostowa
płodowa surowica bydlęcaMediatech35-011-CVinaktywowana termicznie
penicylina-streptomycynaMediatech  30-002-CI
Płytki 6-dołkoweFisher Scientific08-772-1B
Opti-MEMLife Technologies11058021podłoża transfekcyjne
Laser UV W soczewce kolimacyjnej Fisher Scientific BP160-100 siRNA Fisher Scientific BP1302-10 oznaczony Dy547 GE Healthcare Dharmacon, Inc. analityczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
  2. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
  3. Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
  4. Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
  5. Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
  6. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  7. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  8. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
  9. Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
  10. Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
  11. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
  12. Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
  13. Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
  14. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
  17. Li, H. -J., Wang, H. -X., Sun, C. -Y., Du, J. -Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
  18. Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
  21. Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
  22. Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
  23. Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
  24. Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1(2011).
  25. Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
  26. Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
  27. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
  28. Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
  29. Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
  30. Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
  31. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756(2017).
  35. Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
  36. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
  39. Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
  40. Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
  41. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  42. Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fotoreaktywne nanono nikiprzewidywanie wyciszania gen wspektroskopia korelacyjna fluorescencjielektroforeza w elukinetyczny model interferencji RNAspatiotemporalna kontrola gen wna wietlanie laserem UVkonfokalna mikroskopia FCSbadanie skuteczno ci nanono nik w

Powiązane artykuły