Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza interakcji białko-białko (PPI) stała się nieodzownym podejściem do badania procesów biologicznych i mechanizmów, takich jak sygnalizacja komórkowa, rozwój organizmu i choroby. Często pożądane jest uzyskanie informacji o IPP przy użyciu materiału in vivo, aby uzyskać najbardziej naturalny i bezstronny obraz sieci interakcji. Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest doskonałą platformą do badania IPP in vivo i nadaje się do prostego podejścia do izolowania materiału do eksperymentów biochemicznych. W szczególności zarodki muszek owocowych stanowią dogodny rodzaj tkanki do badania IPP, ze względu na łatwość pobierania zwierząt na tym etapie rozwoju oraz fakt, że większość białek ulega ekspresji w embriogenezie, zapewniając w ten sposób odpowiednie środowisko do ujawnienia większości IPP. Poniżej przedstawiamy protokół pobierania zarodków Drosophila w średniej skali (0,5-1 g), który jest idealną ilością do szerokiego zakresu zastosowań proteomicznych, w tym do analizy IPP metodą spektrometrii mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS). Opisujemy nasze projekty klatek o pojemności 1 l i 5 l do pobierania zarodków, które można łatwo i niedrogo ustawić w dowolnym laboratorium. Zapewniamy również ogólny protokół pobierania zarodków i ekstrakcji białek w celu wytworzenia lizatów, które mogą być bezpośrednio wykorzystane w dalszych zastosowaniach, takich jak AP-MS. Naszym celem jest zapewnienie wszystkim badaczom dostępnych środków do przeprowadzania analiz IPP in vivo.
Wprowadzenie
Badania genetyczne, a ostatnio także podejścia genomiczne zrewolucjonizowały badania nad funkcjami biologicznymi. Jednak ważne informacje komórkowe są kodowane w białkach i ich zespole oddziałujących partnerów. Podczas gdy tradycyjne badania przesiewowe modyfikatorów genetycznych mogą identyfikować składniki szlaku ograniczające szybkość i odzyskiwać interakcje pośrednie, siła podejść proteomicznych polega na ich zdolności do identyfikacji kompletnych sieci natychmiastowych interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania. Proteomika jest zatem cenną ortogonalną metodą badania systemów biologicznych i uzupełnia genomikę, transkryptomikę i tradycyjne genetyczne b....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie 5 L Fly Cages (pasujących do płyt 15 cm)
- Zdobądź potrzebne materiały: 5-litrowy (4,7-litrowy) pojemnik z pokrywką (Rysunek 1A), nylonową siatkę i żyletkę.
- Zaznacz okrąg o średnicy 12 cm i wytnij otwór w dnie pojemnika za pomocą żyletki (Rysunek 1B). Wytnij otwór o średnicy 15 cm w pokrywie (Rysunek 1C).
- Pokrój nylonową siatkę na kwadraty o wymiarach 25 x 25 cm.
- Umieść siatkę na górnej krawędzi pojemnika i dociśnij pokrywką ( Rysunek 1C). Upewnij się, że siatka jest szczelna, a pokrywa nie jest....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zilustrować zastosowanie niniejszego protokołu w eksperymencie dotyczącym oczyszczania kompleksu białkowego, wygenerowano homozygotyczną, żywotną linię much, arm-EGFP-ERK, wykazującą ekspresję białka z tagiem EGFP Muszka owocówka kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK, kodowana przez zwinięty gen) pod kontrolą powszechnie ekspresowanego pancernik (ramię) promotor18,19. T.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół jest prostą i ogólną procedurą tworzenia klatek dla populacji Drosophila na średnią skalę i wytwarzania ekstraktów białkowych z całych komórek z zarodków. Uzyskane ekstrakty mogą być wykorzystywane w różnych dalszych zastosowaniach, takich jak oczyszczanie kompleksów białkowych na żywicach o powinowactwie. Bardzo ważne jest, aby przeprowadzić etapy ekstrakcji na lodzie i zastosować silne hamowanie proteazy, aby zminimalizować degradację białek. Zgodnie z opisem, protokół jest odpowie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują członkom laboratorium Veraksa za pomocne komentarze na temat manuskryptu i sugestie dotyczące ulepszeń protokołu. A.V. było wspierane przez granty NIH GM105813, a NS096402. L.Y. było wspierane przez University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Leaktite 5-Qt. Naturalny pojemnik Multi Mix (zestaw 3 szt) | Home Depot | 209330 | Do produkcji klatek 5-L. |
| Leaktite 5-Qt. Naturalna pokrywa Multi Mix (zestaw 3 sztuk) | Home Depot | 209320 | Średnica 8.37 cala Pokrywy do klatek 5 L. |
| Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Materiał: polistyren. Do stosowania z klatkami o pojemności 1 l. |
| Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Materiał: polistyren. Do stosowania z klatkami 5-L. |
| Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Materiał: polistyren. Stosowany podczas dechorionacji zarodka. |
| Siatka nylonowa Sefar NITEX | Sefar | 03-180/44 | 180 mikronów, 44% otwarta przestrzeń, stosowana do klatek na muchy. |
| Milwaukee 3 w. Otwornica spycharka Otwornica z trzpieniem | Home Depot | 49-56-9670 | 3-calowe narzędzie tnące do wykonywania klatek 1-L. |
| Nalgene Słoiki PMP z szerokimi ustami i białym polipropylenowym zamknięciem | Fisher Scientific | 11-823-33 | Do produkcji klatek 1-L. Kot Thermo Scientific # 21171000. Można zastosować alternatywne pojemniki o pojemności 1 l. |
| Aktywne suche drożdże Red Star, woreczek 2 funty | Red Star | można kupić od Amazon.com lub od innych dostawców. | |
| Mrożony 100% koncentrat soku jabłkowego | można kupić w sklepie spożywczym. Na puszce musi być napisane "100% sok jabłkowy". | ||
| 4-hydroksybenzoesan metylu | Acros Organics | AC126965000 | znany również jako methylparaben lub Tegosept. Stosowany jako środek konserwujący w płytkach AJ. |
| IGEPAL CA-630 do biologii molekularnej, 100 ml | Sigma | I8896 | służy do przygotowania buforu do lizy. |
| Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące Nalgene o szybkim przepływie z membraną CN | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μ m wielkość porów. Służy do filtrowania 5x buforu do lizy. Kot Thermo Scientific # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | fiolka z 20 tabletkami. Służy do hamowania proteazy w buforze do lizy. |
| Filtry strzykawkowe Corning SFCA | Fisher Scientific | 09-754-21 | Membrana SFCA, średnica 26 mm, wielkość porów 0,45 μm. Służy do filtrowania końcowych próbek ekstraktu. |
| BD Jednorazowe strzykawki Luer-Lok bez igieł | Fisher Scientific | 14-823-2A | do filtrowania końcowych próbek ekstraktu. BD kot # 309604. |
| Wybielacz | Clorox | stosowany do dechorionacji zarodków w stężeniu 50% (vol/vol) w wodzie, można kupić w każdym supermarkecie. Ważne jest, aby używać marki Clorox, ponieważ inne marki mogą powodować niepełną dechorionację lub mogą być toksyczne dla zarodków. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | pojemniki siatkowe do pobierania zarodków. 74 μ m rozmiar oczek, 6-dołkowy. |
| Młynki do tkanek Wheaton Dounce, pojemność 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | , z luźnymi i szczelnymi tłuczkami. Kot Wheaton # 357544. |
Bibliografia
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances i....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
