Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Streszczenie

Analiza interakcji białko-białko (PPI) stała się nieodzownym podejściem do badania procesów biologicznych i mechanizmów, takich jak sygnalizacja komórkowa, rozwój organizmu i choroby. Często pożądane jest uzyskanie informacji o IPP przy użyciu materiału in vivo, aby uzyskać najbardziej naturalny i bezstronny obraz sieci interakcji. Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest doskonałą platformą do badania IPP in vivo i nadaje się do prostego podejścia do izolowania materiału do eksperymentów biochemicznych. W szczególności zarodki muszek owocowych stanowią dogodny rodzaj tkanki do badania IPP, ze względu na łatwość pobierania zwierząt na tym etapie rozwoju oraz fakt, że większość białek ulega ekspresji w embriogenezie, zapewniając w ten sposób odpowiednie środowisko do ujawnienia większości IPP. Poniżej przedstawiamy protokół pobierania zarodków Drosophila w średniej skali (0,5-1 g), który jest idealną ilością do szerokiego zakresu zastosowań proteomicznych, w tym do analizy IPP metodą spektrometrii mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS). Opisujemy nasze projekty klatek o pojemności 1 l i 5 l do pobierania zarodków, które można łatwo i niedrogo ustawić w dowolnym laboratorium. Zapewniamy również ogólny protokół pobierania zarodków i ekstrakcji białek w celu wytworzenia lizatów, które mogą być bezpośrednio wykorzystane w dalszych zastosowaniach, takich jak AP-MS. Naszym celem jest zapewnienie wszystkim badaczom dostępnych środków do przeprowadzania analiz IPP in vivo.

Wprowadzenie

Badania genetyczne, a ostatnio także podejścia genomiczne zrewolucjonizowały badania nad funkcjami biologicznymi. Jednak ważne informacje komórkowe są kodowane w białkach i ich zespole oddziałujących partnerów. Podczas gdy tradycyjne badania przesiewowe modyfikatorów genetycznych mogą identyfikować składniki szlaku ograniczające szybkość i odzyskiwać interakcje pośrednie, siła podejść proteomicznych polega na ich zdolności do identyfikacji kompletnych sieci natychmiastowych interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania. Proteomika jest zatem cenną ortogonalną metodą badania systemów biologicznych i uzupełnia genomikę, transkryptomikę i tradycyjne genetyczne badania przesiewowe. Spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS) okazała się skutecznym podejściem do badania interakcji białko-białko (PPI) w ich naturalnym środowisku w komórkach i tkankach^1,2. Metoda ta pozwala na identyfikację bezpośrednich lub pośrednich interakcji na określonych etapach rozwoju lub w kontekstach tkankowych i została z powodzeniem wykorzystana do identyfikacji wielu nowych IPP w różnych ścieżkach rozwojowych (recenzja w reference¹). Pomimo niekwestionowanego sukcesu badań IPP, większość z nich przeprowadzono w hodowanych komórkach, w których interesujące nas białka "przynęty" wykazywały nadekspresję. Istnieją dwa problemy związane z badaniem IPP w hodowli komórkowej: po pierwsze, określona linia komórkowa może nie zapewniać pełnego zestawu interakcji z powodu braku ekspresji niektórych białek. Po drugie, wysoka nadekspresja zwykle stosowana w takich analizach może prowadzić do artefaktów, takich jak nieprawidłowe fałdowanie białek lub identyfikacja interakcji fałszywie dodatnich.

Oba te ograniczenia można przezwyciężyć poprzez analizę IPP in vivo. Ograniczeniem w takich eksperymentach jest dostępność materiału wyjściowego do oczyszczania kompleksów białkowych. Drosophila melanogaster od dawna jest wykorzystywana jako model do analizy funkcjonalnej, a ostatnio wykazano również, że jest doskonałym systemem do badania IPP in vivo. Embriogeneza Drosophila stanowi szczególnie atrakcyjny typ tkanki do badania IPP, ponieważ zarodki mogą być łatwo pobierane w dużych ilościach, a także dlatego, że większość genów (>88%) ulega ekspresji w trakcie embriogenezy, zapewniając w ten sposób bogate środowisko in vivo do wykrywania odpowiednich IPP³.

Tradycyjnie, badania biochemiczne na muszkach wykorzystywały bardzo duże zbiory zarodków (100-150 g), takie jak te niezbędne do oczyszczania funkcjonalnych lizatów transkrypcyjnych^4,5. Poprzednie badania AP-MS na Drosophila również wymagały dużych ilości zarodków (5-10 g), ponieważ opierały się na dwuetapowym podejściu do oczyszczania, takim jak tandemowe oczyszczanie powinowactwa (TAP), z towarzyszącą utratą materiału na każdym etapie⁶. Duże ilości materiału wyjściowego wymagały założenia kolekcji zarodków w klatkach dla dużych populacji, co może być zarówno kosztowne (przy zakupie komercyjnym), jak i czasochłonne w utrzymaniu i czyszczeniu7^,8,9.

Ostatnie postępy w rozwoju jednoetapowych metod oczyszczania powinowactwa, jak również rosnąca czułość spektrometrów masowych, zredukowały niezbędną ilość materiału wyjściowego o rząd wielkości. Korzystając z tagów, takich jak peptyd wiążący streptawidynę (SBP) lub białko zielonej fluorescencji (GFP) i zaczynając od mniej niż 1 g zarodków, możliwe jest wyizolowanie ilości białka przynęty i oddziałujących składników, które byłyby wystarczające do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas^10,11.

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest pomoc naukowcom w pokonaniu postrzeganej bariery dla biochemicznej analizy IPP in vivo. W tym celu zapewniamy prostą i niedrogą procedurę pobierania zarodków Drosophila w średniej skali (0,5-1 g), a następnie jednoetapowe przygotowanie ekstraktów białkowych z całych komórek, które nadają się do późniejszej analizy za pomocą AP-MS lub innych metod. Nasza metoda opiera się na wykorzystaniu niestandardowych klatek populacyjnych o pojemności 1 l lub 5 l, które mogą być łatwo wyprodukowane przez każde laboratorium. Co więcej, przedstawione tutaj warunki ekstrakcji zostały zweryfikowane w kilku badaniach, zarówno w hodowanych komórkach, jak i in vivo^{10,12,13,14,15,16,17}.

Protokół

1. Przygotowanie 5 L Fly Cages (pasujących do płyt 15 cm)

1. Zdobądź potrzebne materiały: 5-litrowy (4,7-litrowy) pojemnik z pokrywką (Rysunek 1A), nylonową siatkę i żyletkę.
2. Zaznacz okrąg o średnicy 12 cm i wytnij otwór w dnie pojemnika za pomocą żyletki (Rysunek 1B). Wytnij otwór o średnicy 15 cm w pokrywie (Rysunek 1C).
3. Pokrój nylonową siatkę na kwadraty o wymiarach 25 x 25 cm.
4. Umieść siatkę na górnej krawędzi pojemnika i dociśnij pokrywką ( Rysunek 1C). Upewnij się, że siatka jest szczelna, a pokrywa nie jest przechylona. Klatka jest gotowa do zasiedlenia muchami (patrz krok 5.3).

2. Przygotowanie 1 L Fly Cages (pasujących do 10 cm talerzy)

1. Zaopatrz się w potrzebne materiały: wiertarkę elektryczną, 3-calowe (76 mm) narzędzie tnące (Rysunek 1E i Rysunek 1F), prosty plastikowy słoik o pojemności 1 l z pokrywką, nylonową siatkę, żyletkę, papier ścierny, okulary ochronne i rękawice robocze.
2. Wytnij 3-calowe (76 mm) otwory w dnie i pokrywce plastikowego słoika (Rysunek 1G), z pokrywką mocno przykręconą do pojemnika podczas wiercenia. Umieść narzędzie tnące na środku koła, gdy zaczynasz robić otwór.
   Ostrzeżenie: Podczas tego kroku należy nosić okulary ochronne i rękawice robocze.
3. Wygładź krawędzie otworów żyletką i papierem ściernym.
4. Pokrój nylonową siatkę na kwadraty o wymiarach 18 x 18 cm.
5. Umieść siatkę na górnej krawędzi słoika i dokręć, przykręcając pokrywkę (Rysunek 1G). Upewnij się, że siatka jest szczelna, a pokrywa nie jest przechylona. Klatka jest gotowa do zasiedlenia muchami (patrz krok 5.3).

3. Przygotowanie talerzy z sokiem jabłkowym (AJ)

1. Dodać 19 g agaru i 1 l wody o pojemności 18,2 MΩ·cm do kolby o pojemności 2 l. Dodaj mieszadło i krótko wymieszaj.
2. Autoklaw przez 30 min. W międzyczasie rozmrozić 100% koncentrat soku jabłkowego z zamrożonego wywaru i przygotować 10 ml 10% (wagowo/objętościowo) roztworu 4-hydroksybenzoesanu metylu w etanolu.
3. Po autoklawowaniu należy rozpocząć mieszanie agaru na płytce mieszającej i dodać do kolby 80 ml 100% koncentratu soku jabłkowego i 10 ml 10% (wagowo/objętościowo) roztworu 4-hydroksybenzoesanu metylu. Ostudzić w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu.
4. Wlać 15 cm szalki Petriego (dla klatek 5 l) lub 10 cm szalki Petriego (dla klatek 1 l) tak, aby poziom agaru w każdym naczyniu miał grubość około 5 mm. Pozostawić do zestalenia w temperaturze pokojowej i zawinąć w plastikowe torby. Płytki AJ można przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie.
   Uwaga: szalki Petriego można myć i używać ponownie.
5. Przygotuj mokrą pastę drożdżową: wlej trochę aktywnych suchych drożdży do pojemnika o pojemności 100 ml z pokrywką, która umożliwi łatwe mieszanie, i dodaj wodę w małych ilościach, mieszając, aby uzyskać gęstą, ale dokładnie wymieszaną pastę. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

4. Przygotowanie odczynników do lizy

1. Przygotuj 5x bufor do lizy: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glicerol, 1% oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl₂, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na₃VO₄.
   1. Aby przygotować 200 ml: całkowicie rozpuść 1 g proszku NaF i 184 mg proszku Na₃VO₄ w 71 ml wody, ciągle mieszając. Dodać 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl₂ i 25 ml 5 M NaCl. Następnie dodaj 50 ml glicerolu (dodaj na końcu) i kontynuuj mieszanie przez 1 godzinę.
   2. Sterylizacja filtra za pomocą jednostek filtrujących o pojemności 250 ml. Ten krok może być powolny, ale filtrowanie roztworu jest ważne, aby usunąć nierozpuszczalne cząstki. Porcję 10 ml rozlać do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Przygotować 1 M roztwór ditiotreitolu (DTT) w wodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
3. Zaopatrz się w tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Zaopatrzyć się w strzykawki o pojemności 10 ml i filtry strzykawkowe: membrana z octanu celulozy (SFCA) o średnicy 26 mm, wielkość porów 0,45 μm.

5. Kolekcja zarodków much

1. Amplifikuj transgeniczne linie muchowe przenoszące oznaczone białko będące przedmiotem zainteresowania w butelkach (około 100 much na butelkę) i przenoś butelki co 2 dni, aż zgromadzi się 25-30 butelek na każdą linię muchową. W podobny sposób należy wzmocnić zapas kontrolny (np. linię y w).
2. Podgrzej talerze AJ do temperatury pokojowej (około 1-2 h, można to zrobić przez noc). Za pomocą palca w rękawiczce rozprowadź mokrą pastę drożdżową na środku talerzy AJ, aby uzyskać ok. 6-centymetrowe kółko na talerz 15 cm i kółko 4 cm na talerz 10 cm.
3. Znieczulenie muszek strumieniem dwutlenku węgla za pomocą standardowego zestawu Drosophila i przeniesienie do klatek (ok. 15 dobrze wyrośniętych butelek much na klatkę 5 L, 5 butelek na klatkę 1 L).
   1. Przykryj dno klatki przygotowanymi płytkami AJ z kroku 5.2 i przyklej płytkę AJ do klatki za pomocą dwóch pasków taśmy (rysunki 1D i 1H). Przydatne jest zagięcie końcówek taśmy, które przechodzą przez płytkę, aby ułatwić obieranie podczas wymiany płytek.
   2. Po tym, jak muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, trzymaj klatki z płytkami na dole i siatką na górze.
      Uwaga: Ważne jest, aby poczekać, aż muchy w pełni się zregenerują, ponieważ w przeciwnym razie przykleją się do talerza AJ i pasty drożdżowej.
   3. Pod koniec eksperymentu, aby przygotować klatkę do czyszczenia, umieść klatkę w zamrażarce na kilka godzin. Moczenie siatki w wodzie przez kilka godzin ułatwi czyszczenie.
4. Inkubuj klatki z muchami w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni i zmieniaj płytki AJ dwa razy dziennie. Aby zmienić talerze, odwróć klatkę do góry nogami, oderwij taśmę od płyty, ale przytrzymaj płytkę do klatki, delikatnie postukaj całą klatką o ławkę i szybko zamień starą płytkę na nową, starając się nie dopuścić do ucieczki much.
   Uwaga: Muchy muszą przyzwyczaić się do klatki i najlepiej leżą od 3 dnia. Będą nadal leżeć na najwyższym poziomie przez około 4-5 dni. Dwie klatki o pojemności 5 l przy maksymalnej zdolności nieśności mogą wyprodukować do 1 g zarodków w ciągu jednej nocy. Używaj klatek o pojemności 1 l do eksperymentów na mniejszą skalę.
5. Pozwól muszkom złożyć zarodki na świeżych płytkach AJ przez noc (ok. 16 godzin) lub przez dowolny inny pożądany okres czasu.
6. Następnego ranka oznacz i zważ pojemniki siatkowe do pobrania zarodków, po jednym na każdą użytą żyłkę muchową.
7. Przygotować 1x bufor do lizy, używając odczynników z sekcji 4 (Uwaga: gotowy do użycia 1x bufor do lizy musi być przygotowany tuż przed ekstrakcją): dodać 40 ml wody do 10 ml 5x stężonego buforu do lizy (przechowywanego w temperaturze -80 °C) w probówce o pojemności 50 ml.
   1. Dodać 50 μl 1 M DTT do końcowego stężenia 1 mM, dobrze wymieszać i rozdzielić na dwie probówki o pojemności 50 ml, po 25 ml w każdej. Do jednej z probówek dodać jedną tabletkę inhibitora proteazy i obracać w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Podczas rozpuszczania tabletki należy pobrać i usunąć zarodki z zarodków (etapy od 5.8 do 6.6). Sprawdź, czy tabletka całkowicie się rozpuściła i utrzymuj bufor na lodzie.
      Uwaga: Druga tuba bufora 1x z naziemną telewizją cyfrową może być przechowywana w temperaturze -80 °C i będzie wymagała jedynie dodania tabletki przed następnym eksperymentem. 25 ml buforu do lizy wystarcza na maksymalnie 2 próbki, biorąc pod uwagę kolejne płukania podczas etapów oczyszczania białka.
8. Oznacz płytki AJ na klatkach genotypami użytych linek muchowych i zamień płytki na świeże.
   Uwaga: Na tym etapie nadmiar pasty drożdżowej można zeskrobać z talerza. Zarodki mogą być leżakowane na płytkach w temperaturze 25 °C lub pokojowej, aby uzyskać pożądane okno rozwoju.
9. Dodaj tyle wody, aby przykryć każdą płytkę AJ. Delikatnie usuń zarodki z płytki miękkim pędzlem (płaska główka o szerokości ok. 10 mm dobrze sprawdza się w przypadku dużych płytek). Wlej zarodki do wcześniej zważonego i oznaczonego pojemnika siatkowego i spuść nadmiar wody.
   1. W razie potrzeby wykonaj drugie płukanie i szczotkowanie płytki, aby usunąć wszystkie zarodki. Połączyć zarodki z dodatkowej płytki (płytek) dla tej samej żyłki muchowej do tego samego pojemnika siatkowego.
10. Krótko osusz siatkę na ręcznikach papierowych, aby usunąć nadmiar wody.

6. Dechorionacja zarodka

1. Napełnij do połowy 6 cm szalkę Petriego 50% wybielaczem (roztwór obj. w wodzie).
   Uwaga: Zobacz ważny komentarz na temat marki wybielacza w Tabeli materiałów i odczynników.
   Uwaga: Noś rękawiczki i unikaj wybielania ubrań.
2. Przygotuj 2 większe szalki Petriego z wodą.
3. Zanurz siatkowy pojemnik z zarodkami w 50% wybielaczu na 90 s. Podczas inkubacji delikatnie postukaj w siatkę, aby zawiesić zarodki w roztworze wybielacza.
4. Pod koniec inkubacji 90 s myj pojemnik siatkowy w każdym z 2 naczyń wodą przez około 10 s.
5. Dokładnie wypłucz pojemnik siatkowy wodą o mocy 18,2 MΩ·cm za pomocą butelki ze spryskiwaczem. Umyj również boki i zewnętrzną stronę pojemnika siatkowego.
   Uwaga: Po dokładnym praniu nie powinien być wyczuwalny zapach wybielacza.
6. Osusz pojemnik siatkowy na ręcznikach papierowych. Zważyć pojemnik siatkowy z zarodkami i odjąć wagę pustego pojemnika otrzymaną w kroku 5.6. Zapisać uzyskaną masę zarodków. Dobra ilość zarodków, do których należy dążyć, to 0,5 - 1 g.

7. Przygotowanie ekstraktu z zarodka

1. Dodać 1 ml buforu do lizy z inhibitorami proteazy (z kroku 5.7) do homogenizatora ze szkła odbijanego i trzymać na lodzie. Przenieść zarodki z pojemnika siatkowego do homogenizatora.
   Uwaga: Zarodki można pobrać płaskim końcem metalowej szpatułki lub szczoteczki i przenieść bezpośrednio do bufora. Wykonaj wszystkie czynności opisane w tej sekcji na lodzie.
2. Pozostałe zarodki na siatce zmyć dodatkowym 1 ml buforu do lizy i dodać do materiału w homogenizatorze. Pozwól zarodkom osiądnąć na dnie homogenizatora i ostrożnie odessać supernatant.
3. Dodać bufor do lizy z inhibitorami proteazy (z kroku 5.7) do homogenizatora, dążąc do uzyskania 5-6 ml buforu do lizy na gram zarodków.
4. Homogenizować zarodki przez 4-6 pociągnięć luźnym tłuczkiem.
   Uwaga: Podczas pierwszych pociągnięć będzie większy opór. Staraj się przesuwać tłuczek w ciągłym ruchu, aby uniknąć rozpryskiwania roztworu.
5. Homogenizuj zarodki przez 8-10 uderzeń ciasno dopasowanym tłuczkiem.
6. Inkubować homogenat na lodzie przez 20 minut.
7. Przenieść homogenat do probówek do mikrowirówek i wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut z maksymalną prędkością (ok. 13 000 x g).
8. Unikając osadów i wierzchniej warstwy lipidowej, przenieść supernatanty do świeżych probówek do mikrowirówek i wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut z maksymalną prędkością (ok. 13 000 x g).
9. Ostrożnie zassać supernatanty końcówką o pojemności 1 ml i załadować do schłodzonych strzykawek o pojemności 10 ml z dołączonymi filtrami 0,45 μm (połączyć podwielokrotności tej samej próbki w jednej strzykawce). Wciśnij cały roztwór do oznaczonej 15 ml probówki na lodzie. Ekstrakt może być natychmiast wykorzystany do kolejnych eksperymentów z oczyszczaniem białka lub zamrożony w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
   Uwaga: Lepiej jest zamrozić ekstrakty niż zarodki, ponieważ podczas późniejszego rozmrażania zarodków proteazy mogą się aktywować i prowadzić do degradacji białek.

Wyniki

Aby zilustrować użycie tego protokołu w eksperymencie oczyszczania kompleksu białek, stworzyliśmy homozygotyczną żywotną linię much, arm-EGFP-ERK, wyrażającą znakowaną przez EGFP zewnątrzkomórkową kinazę regulowaną sygnałem Drosophila (ERK, kodowaną przez zrolowany gen) pod kontrolą powszechnie wyrażanego promotora pancernika (ramienia)^18,19. Promotor ramienia jest aktywny na w...

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół jest prostą i ogólną procedurą tworzenia klatek dla populacji Drosophila na średnią skalę i wytwarzania ekstraktów białkowych z całych komórek z zarodków. Uzyskane ekstrakty mogą być wykorzystywane w różnych dalszych zastosowaniach, takich jak oczyszczanie kompleksów białkowych na żywicach o powinowactwie. Bardzo ważne jest, aby przeprowadzić etapy ekstrakcji na lodzie i zastosować silne hamowanie proteazy, aby zminimalizować degradację białek. Zgodnie z opisem, protokół jest odpowie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Leaktite 5-Qt. Naturalny pojemnik Multi Mix (zestaw 3 szt)	Home Depot	209330	Do produkcji klatek 5-L.
Leaktite 5-Qt. Naturalna pokrywa Multi Mix (zestaw 3 sztuk)	Home Depot	209320	Średnica 8.37 cala Pokrywy do klatek 5 L.
Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	Materiał: polistyren. Do stosowania z klatkami o pojemności 1 l.
Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 150 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Materiał: polistyren. Do stosowania z klatkami 5-L.
Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 60 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Materiał: polistyren. Stosowany podczas dechorionacji zarodka.
Siatka nylonowa Sefar NITEX	Sefar	03-180/44	180 mikronów, 44% otwarta przestrzeń, stosowana do klatek na muchy.
Milwaukee 3 w. Otwornica spycharka Otwornica z trzpieniem	Home Depot	49-56-9670	3-calowe narzędzie tnące do wykonywania klatek 1-L.
Nalgene Słoiki PMP z szerokimi ustami i białym polipropylenowym zamknięciem	Fisher Scientific	11-823-33	Do produkcji klatek 1-L. Kot Thermo Scientific # 21171000. Można zastosować alternatywne pojemniki o pojemności 1 l.
Aktywne suche drożdże Red Star, woreczek 2 funty	Red Star		można kupić od Amazon.com lub od innych dostawców.
Mrożony 100% koncentrat soku jabłkowego			można kupić w sklepie spożywczym. Na puszce musi być napisane "100% sok jabłkowy".
4-hydroksybenzoesan metylu	Acros Organics	AC126965000	znany również jako methylparaben lub Tegosept. Stosowany jako środek konserwujący w płytkach AJ.
IGEPAL CA-630 do biologii molekularnej, 100 ml	Sigma	I8896	służy do przygotowania buforu do lizy.
Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące Nalgene o szybkim przepływie z membraną CN	Fisher Scientific	09-740-2A	0.2 μ m wielkość porów. Służy do filtrowania 5x buforu do lizy. Kot Thermo Scientific # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	fiolka z 20 tabletkami. Służy do hamowania proteazy w buforze do lizy.
Filtry strzykawkowe Corning SFCA	Fisher Scientific	09-754-21	Membrana SFCA, średnica 26 mm, wielkość porów 0,45 μm. Służy do filtrowania końcowych próbek ekstraktu.
BD  Jednorazowe strzykawki Luer-Lok bez igieł	Fisher Scientific	14-823-2A	do filtrowania końcowych próbek ekstraktu. BD kot # 309604.
Wybielacz	Clorox		stosowany do dechorionacji zarodków w stężeniu 50% (vol/vol) w wodzie, można kupić w każdym supermarkecie. Ważne jest, aby używać marki Clorox, ponieważ inne marki mogą powodować niepełną dechorionację lub mogą być toksyczne dla zarodków.
Corning Costar Netwell Plates	Fisher Scientific	07-200-213	pojemniki siatkowe do pobierania zarodków. 74 μ m rozmiar oczek, 6-dołkowy.
Młynki do tkanek Wheaton Dounce, pojemność 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	, z luźnymi i szczelnymi tłuczkami. Kot Wheaton # 357544.