Artykuł metodologiczny

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

DOI:

10.3791/55809

⸱

19 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolacji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci poprzez preparację i filtrację. Po amplifikacji próbki DNA nadają się do późniejszego sekwencjonowania i badania mutualizmu między endosymbiontami a mączlikiem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Symbionty bakteryjne tworzą bliskie relacje ze swoimi gospodarzami i w większości przypadków dają im przewagę. Informacje genomiczne mają kluczowe znaczenie dla badania funkcji i ewolucji symbiontów bakteryjnych w ich gospodarzu. Ponieważ większość symbiontów nie może być hodowana in vitro, bardzo ważne są metody izolowania odpowiedniej ilości bakterii do sekwencjonowania genomu. U mączlika Bemisia tabaci zidentyfikowano szereg endosymbiontów i przewiduje się, że będą miały znaczenie w rozwoju i rozmnażaniu szkodników na wiele sposobów. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych stowarzyszeń pozostaje w dużej mierze nieznany. Przeszkoda częściowo wynika z faktu, że endosymbionty mączlika, w większości ograniczone przez bakteriocyty, są trudne do oddzielenia od komórek gospodarza. Tutaj przedstawiamy krok po kroku protokół identyfikacji, ekstrakcji i oczyszczania endosymbiontów z mączlika B. tabaci, głównie poprzez rozbiór i filtrację. Próbki endosymbiontów przygotowane tą metodą, choć nadal stanowią mieszaninę różnych gatunków endosymbiontów, nadają się do późniejszego sekwencjonowania genomu i analizy możliwych ról endosymbiontów w B. tabaci. Metoda ta może być również stosowana do izolowania endosymbiontów od innych owadów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie tworzące bliski symbiotyczny związek z krewnymi gospodarzami są szeroko rozpowszechnione u stawonogów1. Wykazano, że endosymbionty wpływają na aspekty gospodarzy, takie jak odżywianie, metabolizm, rozmnażanie, reakcje na stresy środowiskowe2,3,4 itd., na prawie każdym etapie rozwoju5. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych stowarzyszeń nadal pozostaje w dużej mierze nieznany. Genomika ma priorytet i znaczenie przy badaniu potencjalnych funkcji i ról bakterii. Z sekwencji genomu można wywnioskować pewne podstawowe informacje, tj. status taksonomiczny genów, funkcjonalne geny, szlaki metaboliczne, systemy wydzielania, co rzuca światło na potencjalną rolę symbiontów w symbiozie. Wraz z rozwojem sekwencjonowania wysokoprzepustowego, ogromna liczba genomów bakteryjnych została zsekwencjonowana z różnymi funkcjami ujawnionymi6.

Endosymbionty mają kluczowe znaczenie u pluskwiaków, takich jak mszyce7, pluskwy8, psyllids9, brązowe skoczki roślinne10 i cykady11. Na przykład wykazano, że Buchnera u mszyc, jako obowiązkowy symbiont, bierze udział w biosyntezie aminokwasów egzogennych, wraz z genami genomu mszyc12. Co więcej, ujawniono również regulację transkrypcji Buchnera13. U psyllidów Carsonella jest sekwencjonowana i klasyfikowana jako najmniejszy genom bakteryjny, jaki kiedykolwiek znaleziono14. Wszystkie te cechy endosymbiontów są oparte i wywnioskowane z sekwencji genomu. Ponieważ te endosymbionty nie mogą być hodowane in vitro, zastosowano kilka podejść w celu wyizolowania odpowiednich bakterii do sekwencjonowania. U mszyc endosymbionty są ekstrahowane poprzez wirowanie i filtrację, a następnie poddawane dalszej analizie genomowej i transkryptomicznej5. U skoczków brunatnych endosymbionty są sekwencjonowane wraz z całym genomem owada10.

Mączlik B. tabaci to kompleks gatunkowy zawierający ponad 35 morfologicznie nierozróżnialnych gatunków (gatunków tajemniczych), wśród których dwa gatunki inwazyjne zaatakowały cały świat i spowodowały ogromne szkody w produkcji rolnej15. Warto zauważyć, że endosymbionty z gatunku B. tabaci wykazały znaczenie w rozwoju szkodników16. Do tej pory u mączlika zidentyfikowano osiem endosymbiontów, w tym symbiont obligatoryjny, Candidatus Portiera aleyrodidarum, oraz siedem symbiontów drugorzędowych Hamiltonella, Rickettsia, Arsenophonus, Cardinium, Wolbachia, Fritschea i Hemipteriphilus defin17,18.

W przeciwieństwie do opisanych wcześniej pluskwiaków, mączlik B. tabaci jest niezwykle małym owadem o długości zaledwie 1 mm. Większość endosymbiontów jest ograniczona do bakteriocytów19 (wyspecjalizowane komórki zawierające symbionty, które dalej tworzą bakteriomę w B. tabaci). Ponadto tych endosymbiontów nie można hodować in vitro. Jedynym sposobem na uzyskanie endosymbiontów z B. tabaci jest wypreparowanie bakteriomu. Istnieje jednak trudność w sekcji. Po pierwsze, delikatna bakterioma zawsze łączy się z innymi tkankami mączlika, które są trudne do oddzielenia. Po drugie, niewielki rozmiar mączlika ogranicza izolację wystarczającej ilości bakteriomu. Po trzecie, endosymbionty skupiają się w bakteriomie, co sprawia, że uzyskanie jednego gatunku bakterii jest niezwykle skomplikowane.

Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół izolowania endosymbiontów mączlików do późniejszego sekwencjonowania metagenomu. Poprzez preparację, oczyszczanie i amplifikację można uzyskać odpowiednie endosymbiontyczne DNA i potwierdzić gatunek bakterii. Opisany protokół może być podobnie stosowany u innych stawonogów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla mączlików i identyfikacja gatunków tajemniczych

  1. Gatunki mączlików należy utrzymywać na bawełnie Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) w klatkach w standardowych warunkach 27 ± 1 °C, wilgotności 70 ± 10% i 14 godzin w reżimie jasnym: 10 godzin ciemności.
  2. Zebrać pojedynczego dorosłego mączlika i homogenizować w 30 μl buforu do lizy (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] żelatyna, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinaza K).
  3. Inkubować homogenat w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 100 °C przez 10 minut
    UWAGA: W razie potrzeby czas inkubacji w temperaturze 65 °C można wydłużyć. Czas inkubacji w temperaturze 100 °C powinien być krytycznie kontrolowany, aby w wystarczającym stopniu dezaktywować proteinazę K i uniknąć uszkodzenia DNA.
  4. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu DNA mączlika (uzyskanego w sekcji 1.3) na podstawie mitochondrialnych starterów oksydazy cytochromowej I.
    COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'
    COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'
    1. Przeprowadzić reakcje PCR w końcowej objętości 25 μl zawierającej 1 U polimerazy DNA Taq, 2,5 μl 10x buforu, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM każdego startera i 2 μL DNA mączlika.
    2. Stosować następujące warunki procedury PCR: początkowa denaturacja 95 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli 95 °C przez 45 s (denaturacja), 50 °C przez 45 s (wyżarzanie) i 72 °C przez 1 minutę (przedłużenie) i kolejne 10 minut w temperaturze 72 °C przez dalsze przedłużenie.
  5. Oczyść produkt amplifikowany PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z zalecanym protokołem.
  6. Sekwencjonować oczyszczone próbki DNA za pomocą systemu sekwencjonowania próbek DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Przeanalizuj sekwencje za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), aby zidentyfikować tajemnicze gatunki mączlika i uniknąć zanieczyszczenia innymi gatunkami.

2. Identyfikacja i lokalizacja endosymbiontów

  1. Przeprowadzić PCR na DNA mączlika (uzyskanym w kroku 1.3) w celu amplifikacji specyficznych genów każdego endosymbionta w obrębie mączlika (receptura PCR jest opisana w sekcji 1.4, a procedury PCR i startery są wymienione w Tabeli 1).
  2. Poddaj amplifikowaną próbkę elektroforezie w żelu agarozowym zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem20 (1% żel agarozowy, tris-acetate-EDTA jako bufor do biegania, napięcie 5 V/cm) w celu zidentyfikowania specyficznego genu każdej bakterii.
  3. Odzyskaj i zsekwencjonuj każde prążki, aby określić gatunki bakterii w mączliku (patrz punkty 1.5-1.7).
  4. Wykonaj fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) na mączlikach, aby zidentyfikować lokalizację endosymbiontów zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem19.
    UWAGA: W razie potrzeby zwiększ stężenie sond fluorescencyjnych.

3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

  1. Zanurzyć i utrwalić mączliki w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) zawierającym 2,5% [vol/vol] glutaraldehydu przez 4 godziny.
  2. Przemyć próbki w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) trzy razy, za każdym razem po 15 minut.
  3. Zanurzyć i ponownie utrwalić próbki w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) zawierającym 1% [wag./obj.] OsO4 przez 2 godziny.
  4. Odwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii etanolu (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% i 100%), za każdym razem przez 15 minut.
  5. Przenieść próbki i zanurzyć je w 100% acetonie na 20 minut.
  6. Umieścić próbki w mieszaninie 100% acetonu i 100% żywicy Spurr (1:1) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Przenieść próbki do mieszaniny 100% acetonu i 100% żywicy Spurr (1:3) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Przenieść próbki i zanurzyć je w 100% żywicy Spurr (inkubowanej w temperaturze 70 °C) na ponad 9 godzin.
  9. Próbki mączlika należy podzielić na sekcje za pomocą mikrotomu.
  10. Zabarwić ultracienkie warstwy (uzyskane w sekcji 3.9) przez zanurzenie w absolutnym octanie uranylu na 5-10 minut, a następnie zanurzenie w 50% alkalicznym roztworze cytrynianu ołowiu na kolejne 5-10 min.
    UWAGA: Objętości odczynników użytych w sekcji 3.1-3.10 zależą od próbek. Upewnij się, że próbki są zanurzone w odczynnikach.
  11. Obserwuj próbki pod transmisyjną mikroskopią elektronową (15 000 razy) w celu określenia lokalizacji, kształtu i wielkości bakterii do dalszego wykorzystania (patrz sekcja 4.6).

4. Sekcja i oczyszczanie bakteriomu mączlika

  1. Dodać 100 μl 1x roztworu PBS na szkiełko mikroskopowe. Zbierz kilka nimf w 3. lub 4. stadium z liści bawełny i zanurz je w roztworze PBS.
  2. Użyj cienkich igieł entomologicznych pod mikroskopem stereoskopowym i wyciągnij bakteriomy z ciała mączlika.
    1. Delikatnie wytnij otwór po jednej stronie nimfy i lekko dociśnij drugą stronę, aby wypuścić bakteriomy.
  3. Zamontuj mikroładowarkę o pojemności 20 μl (z końcówką prowadzącą naciętą tak, aby odpowiadała rozmiarowi bakteriomu) na pipecie o pojemności 0,5-10 μl. Wyekstrahuj pojedynczy bakteriom z roztworu PBS do mikroładowarki.
  4. Przemyć bakteriom, aby wyeliminować zanieczyszczenie innych tkanek mączlika, pipetując bakteriom do roztworu PBS i ekstrahując bakteriom. Powtórz trzy razy.
  5. Natychmiast odpipetować przemyty bakteriom do probówki wirówkowej zawierającej 60 μl 1x PBS roztworu.
  6. Przefiltruj strzykawką zmontowany bakteriom przez membranę filtracyjną o wielkości 5 μm (określoną na podstawie wielkości bakterii i jądra bakteriocytów u mączlika). Powtórz wiele razy, aby dokładnie przesunąć zmieszaną ciecz przez membranę filtracyjną.
    UWAGA: Aby osiągnąć lepszy wynik amplifikacji i sekwencjonowania, zbierz ponad 100 bakteriomów. Najpierw zwilż membranę filtracyjną za pomocą 1x roztworu PBS, aby zmniejszyć utratę bakterii wiążących się z membraną.

5. Amplifikacja genomów endosymbiontów

  1. Amplifikować filtrat (zawierający głównie endosymbionty mączlika) za pomocą zestawu do amplifikacji DNA zgodnie z zalecanym protokołem z pewnymi modyfikacjami.
    1. Wybierz zalecany protokół amplifikacji genomowego DNA z krwi lub komórek i przygotuj bufor D2 do kolejnego eksperymentu.
    2. Bezpośrednio dodać 1,5 μl filtratu (patrz sekcja 4.6) do probówki wirówkowej, a następnie 1,5 μl buforu D2 i dobrze wymieszać.
    3. Inkubować na lodzie przez 10 minut i dodać 1,5 μl roztworu zatrzymującego.
    4. Dodać 15 μl buforu reakcyjnego i 1 μl polimerazy DNA i delikatnie wymieszać.
    5. Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 16 godzin, a następnie przez 3 minuty w temperaturze 65 °C.
  2. Przeprowadzić PCR bezpośrednio na amplifikowanym filtracie (w razie potrzeby rozcieńczyć amplifikowane próbki), stosując specjalne startery przeznaczone dla bakterii w celu potwierdzenia gatunków bakterii (patrz sekcja 2.1).
  3. Przeprowadź PCR w celu potwierdzenia, czy doszło do zanieczyszczenia genomu gospodarza, używając genów mączlika beta-aktyny i starterów EF1 zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą21 (receptura PCR jest opisana w punkcie 1.4).

6. Sekwencjonowanie metagenomu endosymbiont

  1. Amplifikowany filtrat należy poddać działaniu spektrofotometru i fluorometru (zgodnie z instrukcjami producenta) przed sekwencjonowaniem w celu zbadania jakości próbek i sprawdzenia, czy próbki spełniają kryteria sekwencjonowania.
  2. Poddaj amplifikowany sekwenator genomu zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gatunek Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) kompleksu B. tabaci został tutaj wzięty jako przykład do opisu. Bawełna do hodowli mączlików i kilka etapów rozwojowych mączlików są pokazane na Rysunek 1 obejmuje roślinę bawełny, dorosłego mączlika i 1, 2 i 4 nimfę mączlika wstadium rozwojowym (nimfa w trzecim stadium wygląda podobnie do nimfyw czwartym stadium). Było oczywiste, że4-ta nimfa w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ endosymbionty w mączlikach nie mogą być hodowane in vitro, sekcja i składanie bakteriocytów jest skutecznym sposobem na uzyskanie wystarczającej ilości materiału genetycznego endosymbiontów. Przed sekcją należy wyraźnie potwierdzić gatunki mączlika i endosymbionty, których to dotyczy. Mączlik B. tabaci jest kompleksem gatunkowym składającym się z ponad 35 morfologicznie nierozróżnialnych gatunków, a różne gatunki kryptyczne mogą zawierać różne endosymbionty. Portiera jest jednolicie ho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla tego badania zostało zapewnione przez National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) oraz National Natural Science Foundation of China (31390421).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taq< / em> Polimeraza DNATakaraR001A, w tym rTaq, 10 i razy; Zestaw do ekstrakcji DNA w postaci buforu i żelu dNTP
Qiagen28704
System sekwencjonowania próbek DNAABIABI-3730XL
MikrotomLeicaEM UC7
Transmisyjna mikroskopia elektronowaHitachiH-7650 TEM
Mikroskop stereoskopowyZeissStemi 2000-C
20 μ L mikroładowarkaEppendorfF2771951
Uchwyt filtraMilliporeSX0001300
Filtr membranowyMilliporeSMWP0013005.0 μ m SMWP
REPLI-g UltraFast Mini KitQiagen150033do amlizacji DNA
NanoDropThermo ScientificNanoDrop 2000
Fluorometr kubitowyThermo Fisher ScientificQ33216
Sekwencer genomuIlluminaHiseq 2000
zestaw

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
  2. Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
  3. Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
  4. Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
  5. Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
  6. Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
  7. Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
  8. Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
  9. Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
  10. Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521(2014).
  11. Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
  12. Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
  13. Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252(2011).
  14. Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267(2006).
  15. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
  16. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  17. Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
  18. Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
  19. Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030(2014).
  20. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
  21. Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226(2015).
  22. Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
  23. Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
  24. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
  25. Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898(2015).
  26. Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
  27. Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
  28. Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
  29. Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
  30. O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
  31. Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
  32. Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja endosymbiont wsekcja m czlikaizolacja bakteriomumetoda filtracjiamplifikacja DNAanaliza PCRelektroforeza w elusekwencjonowanie genomuanaliza FISHtransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły