Artykuł metodologiczny

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

DOI:

10.3791/55809

⸱

19 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolacji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci poprzez preparację i filtrację. Po amplifikacji próbki DNA nadają się do późniejszego sekwencjonowania i badania mutualizmu między endosymbiontami a mączlikiem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Symbionty bakteryjne tworzą bliskie relacje ze swoimi gospodarzami i w większości przypadków dają im przewagę. Informacje genomiczne mają kluczowe znaczenie dla badania funkcji i ewolucji symbiontów bakteryjnych w ich gospodarzu. Ponieważ większość symbiontów nie może być hodowana in vitro, bardzo ważne są metody izolowania odpowiedniej ilości bakterii do sekwencjonowania genomu. U mączlika Bemisia tabaci zidentyfikowano szereg endosymbiontów i przewiduje się, że będą miały znaczenie w rozwoju i rozmnażaniu szkodników na wiele sposobów. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych stowarzyszeń pozostaje w dużej mierze nieznany. Przeszkoda częściowo wynika z faktu, że endosymbionty mączlika, w większości ograniczone przez bakteriocyty, są trudne do oddzielenia od komórek gospodarza. Tutaj przedstawiamy krok po kroku protokół identyfikacji, ekstrakcji i oczyszczania endosymbiontów z mączlika B. tabaci, głównie poprzez rozbiór i filtrację. Próbki endosymbiontów przygotowane tą metodą, choć nadal stanowią mieszaninę różnych gatunków endosymbiontów, nadają się do późniejszego sekwencjonowania genomu i analizy możliwych ról endosymbiontów w B. tabaci. Metoda ta może być również stosowana do izolowania endosymbiontów od innych owadów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie tworzące bliski symbiotyczny związek z krewnymi gospodarzami są szeroko rozpowszechnione u stawonogów1. Wykazano, że endosymbionty wpływają na aspekty gospodarzy, takie jak odżywianie, metabolizm, rozmnażanie, reakcje na stresy środowiskowe2,3,4 itd., na prawie każdym etapie rozwoju5. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych stowarzyszeń nadal pozostaje w dużej mierze nieznany. Genomika ma priorytet i znaczenie przy badaniu potencjalnych funkcji i ról bakterii. Z sekwencji genomu można wywnioskować pewne podstawo....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla mączlików i identyfikacja gatunków tajemniczych

  1. Gatunki mączlików należy utrzymywać na bawełnie Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) w klatkach w standardowych warunkach 27 ± 1 °C, wilgotności 70 ± 10% i 14 godzin w reżimie jasnym: 10 godzin ciemności.
  2. Zebrać pojedynczego dorosłego mączlika i homogenizować w 30 μl buforu do lizy (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] żelatyna, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinaza K).
  3. Inkubować homogenat w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 100 °C przez 10 minut
    UWAGA: W razie potrzeby czas in....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gatunek Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) kompleksu B. tabaci został tutaj wzięty jako przykład do opisu. Bawełna do hodowli mączlików i kilka etapów rozwojowych mączlików są pokazane na Rysunek 1 obejmuje roślinę bawełny, dorosłego mączlika i 1, 2 i 4 nimfę mączlika wstadium rozwojowym (nimfa w trzecim stadium wygląda podobnie do nimfyw czwartym stadium). Było oczywiste, że4-ta nimfa w.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ endosymbionty w mączlikach nie mogą być hodowane in vitro, sekcja i składanie bakteriocytów jest skutecznym sposobem na uzyskanie wystarczającej ilości materiału genetycznego endosymbiontów. Przed sekcją należy wyraźnie potwierdzić gatunki mączlika i endosymbionty, których to dotyczy. Mączlik B. tabaci jest kompleksem gatunkowym składającym się z ponad 35 morfologicznie nierozróżnialnych gatunków, a różne gatunki kryptyczne mogą zawierać różne endosymbionty. Portiera jest jednolicie ho.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla tego badania zostało zapewnione przez National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) oraz National Natural Science Foundation of China (31390421).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taq< / em> Polimeraza DNATakaraR001A, w tym rTaq, 10 i razy; Zestaw do ekstrakcji DNA w postaci buforu i żelu dNTP
Qiagen28704
System sekwencjonowania próbek DNAABIABI-3730XL
MikrotomLeicaEM UC7
Transmisyjna mikroskopia elektronowaHitachiH-7650 TEM
Mikroskop stereoskopowyZeissStemi 2000-C
20 μ L mikroładowarkaEppendorfF2771951
Uchwyt filtraMilliporeSX0001300
Filtr membranowyMilliporeSMWP0013005.0 μ m SMWP
REPLI-g UltraFast Mini KitQiagen150033do amlizacji DNA
NanoDropThermo ScientificNanoDrop 2000
Fluorometr kubitowyThermo Fisher ScientificQ33216
Sekwencer genomuIlluminaHiseq 2000
zestaw

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
  2. Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
  3. Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja endosymbiont wsekcja m czlikaizolacja bakteriomumetoda filtracjiamplifikacja DNAanaliza PCRelektroforeza w elusekwencjonowanie genomuanaliza FISHtransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły