Pokazano kompaktowy system tomografii fotoakustycznej oparty na diodach impulsowych (PLD-PAT) do szybkiego obrazowania mózgu in vivo u małych zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pokazano kompaktowy system tomografii fotoakustycznej oparty na diodach impulsowych (PLD-PAT) do szybkiego obrazowania mózgu in vivo u małych zwierząt.
Obrazowanie in vivo małych zwierząt ma ważną rolę do odegrania w badaniach przedklinicznych. Tomografia fotoakustyczna (PAT) to rozwijająca się hybrydowa metoda obrazowania, która wykazuje ogromny potencjał zarówno w zastosowaniach przedklinicznych, jak i klinicznych. Konwencjonalne systemy optyczne oparte na oscylatorach parametrycznych PAT (OPO-PAT) są nieporęczne i drogie oraz nie są w stanie zapewnić szybkiego obrazowania. Ostatnio udało się zademonstrować obecność diod laserowych (PLD) jako alternatywnego źródła wzbudzenia PAT. Dioda z impulsowym laserem PAT (PLD-PAT) została z powodzeniem zademonstrowana w szybkim obrazowaniu fantomów fotoakustycznych i tkanek biologicznych. Praca ta dostarcza wizualizowanego protokołu eksperymentalnego do obrazowania mózgu in vivo przy użyciu PLD-PAT. Protokół zawiera kompaktową konfigurację systemu PLD-PAT i jego opis, przygotowanie zwierząt do obrazowania mózgu oraz typową procedurę eksperymentalną dla przekrojowego obrazowania mózgu szczura w 2D. System PLD-PAT jest kompaktowy i ekonomiczny oraz może zapewnić szybkie obrazowanie o wysokiej jakości. Przedstawiono obrazy mózgu zebrane in vivo przy różnych prędkościach skanowania.
Tomografia fotoakustyczna (PAT) to hybrydowa metoda obrazowania, która ma wiele zastosowań zarówno w badaniach klinicznych, jak i przedklinicznych1,2,3,4,5. W PAT nanosekundowe impulsy laserowe napromieniowują tkankę biologiczną. Absorpcja padającego światła przez chromofory tkankowe prowadzi do lokalnego wzrostu temperatury, co z kolei powoduje powstawanie fal ciśnienia emitowanych w postaci fal dźwiękowych. Detektor ultradźwiękowy zbiera sygnały fotoakustyczne w różnych miejscach wokół próbki. Sygnały fotoakustyczne (PA) są rekonstruowane przy użyciu różnych algorytmów (takich jak algorytm opóźnienia i sumy)6 w celu wygenerowania obrazu fotoakustycznego.
Ta hybrydowa metoda obrazowania oferuje obrazowanie głębokich tkanek o wysokiej rozdzielczości i wysoki kontrast absorpcji optycznej7,8. Ostatnio osiągnięto ~12-centymetrową głębokość obrazowania9 w tkance piersi kurczaka za pomocą większej długości fali (~1,064 nm) i egzogennego środka kontrastowego o nazwie ftalocyjanina fosforu. Ta czułość głębi jest znacznie wyższa niż czułość głębi innych metod optycznych, takich jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna, dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna, optyczna tomografia koherentna 10, 11itp. Wykorzystując więcej niż jedną długość fali, PAT może wykazać zmiany strukturalne i funkcjonalne w narządach. W przypadku wielu chorób u ludzi modele małych zwierząt są dobrze ugruntowane12,13,14,15. W przypadku obrazowania małych zwierząt zademonstrowano kilka modalności. Spośród wszystkich tych podejść, obrazowanie PA dość szybko zyskało uwagę ze względu na zalety wymienione powyżej. PAT wykazał swój potencjał do obrazowania naczyń krwionośnych w tkankach i narządach (tj. sercu, płucach, wątrobie, oczach, śledzionie, mózgu, skórze, rdzeniu kręgowym, nerkach itp.) małych zwierząt4,16,17,18. PAT jest dobrze znaną metodą obrazowania mózgu małych zwierząt. Fale PA są wytwarzane w wyniku absorpcji światła przez chromofory, więc PAT o wielu długościach fal pozwala na mapowanie całkowitego stężenia hemoglobiny (HbT) i nasycenia tlenem (SO2)19,20,21,22. Obrazowanie nerwowo-naczyniowe mózgu uzyskano za pomocą egzogennych środków kontrastowych12,23,24. Modalność PA może pomóc w lepszym zrozumieniu zdrowia mózgu poprzez dostarczanie informacji na poziomie molekularnym i genetycznym.
Do obrazowania małych zwierząt, lasery Nd : YAG/OPO są powszechnie używane jako źródła wzbudzenia PAT. Lasery te dostarczają impulsy bliskiej podczerwieni ~5 ns z energią (~100 mJ w oknie wyjściowym OPO) z częstotliwością powtarzania ~10 Hz25. System PA wyposażony w takie lasery jest kosztowny i nieporęczny oraz pozwala na obrazowanie z małą prędkością za pomocą jednoelementowych przetworników ultradźwiękowych (UST) ze względu na niską częstotliwość powtarzania źródła lasera. Typowy czas akwizycji linii A w takich systemach PA wynosi ~5 min na przekrój25. System obrazowania o tak długim czasie pomiaru nie jest idealny do obrazowania małych zwierząt, ponieważ trudno jest kontrolować parametry fizjologiczne dla obrazowania całego ciała, obrazowania funkcjonalnego z rozdzielczością czasową itp. Poprzez zastosowanie wielu jednoelementowych UST, UST opartych na matrycach lub lasera o wysokiej częstotliwości powtarzania, możliwe jest zwiększenie prędkości obrazowania systemów PA. Użycie tylko jednego jednoelementowego UST do zebrania wszystkich sygnałów PA wokół próbki ograniczy prędkość obrazowania systemu. Wiele jednoelementowych UST ułożonych w geometrii kołowej lub półkolistej jest demonstrowanych dla szybkich i bardzo czułych technik obrazowania. Tablice USTs26, takie jak tablice liniowe, półkołowe, kołowe i wolumetryczne, zostały z powodzeniem wykorzystane do obrazowania w czasie rzeczywistym1. Te oparte na macierzyach UST zwiększą prędkość obrazowania i zmniejszą czułość pomiaru, ale są drogie. Jednak szybkość obrazowania systemów PA, które wykorzystują UST oparte na matrycy, jest nadal ograniczona przez częstotliwość powtarzania lasera.
Technologia lasera pulsacyjnego zaawansowana do produkcji diod laserowych impulsowych (PLD) o wysokiej częstotliwości powtarzania. Obrazowanie fotoakustyczne B-scan z prędkością 7 000 klatek/s zostało zademonstrowane za pomocą PLD przy użyciu klinicznej platformy ultrasonograficznej27. Takie PLD mogą poprawić szybkość obrazowania systemu PAT, nawet przy jednoelementowej geometrii skanowania kołowego UST. Jednoelementowe UST są tańsze i bardzo czułe, w przeciwieństwie do UST opartych na tablicach. W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono niewiele badań nad wykorzystaniem PLD o wysokiej częstotliwości powtórzeń jako źródła wzbudzenia w obrazowaniu PA. Światłowodowy PLD w bliskiej podczerwieni został zademonstrowany do obrazowania PA fantomów28. Obrazowanie in vivo naczyń krwionośnych na głębokości ~1 mm pod ludzką skórą zademonstrowano przy użyciu niskoenergetycznych PLDs29. Zgłoszono wyniki badań mikroskopu fotoakustycznego o rozdzielczości optycznej (ORPAM) opartego na PLD. Za pomocą PLD zademonstrowano obrazowanie o głębokości ~1,5 cm z częstotliwością odświeżania 0,43 Hz30. Całkiem niedawno zgłoszono system PLD-PAT, który dostarczał obrazy w czasie zaledwie ~3 s i na głębokości obrazowania ~2 cm w tkankach biologicznych25,31. Badanie to dowiodło, że tak tani, kompaktowy system może zapewnić wysokiej jakości obrazy, nawet przy dużych prędkościach. System PLD-PAT może być używany do obrazowania fotoakustycznego z dużą liczbą klatek na sekundę (7 000 kl./s), obrazowania powierzchniowych naczyń krwionośnych, obrazowania stawów palców, obrazowania tkanek o głębokości 2 cm, obrazowania mózgu małych zwierząt itp. Impulsy o pojedynczej długości fali i niskiej energii impulsu z PLD ograniczają jego zastosowanie do obrazowania wielospektralnego i głębokich tkanek. Eksperymenty przeprowadzono na małych zwierzętach przy użyciu tego samego systemu PLD-PAT, który jest używany do zastosowań przedklinicznych. Celem niniejszej pracy jest dostarczenie wizualizowanej demonstracji eksperymentalnej systemu PLD-PAT do przekrojowego obrazowania 2D mózgu in vivo małych zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Nanyang Technological w Singapurze (numer protokołu dla zwierząt ARF-SBS/NIE-A0263).
1. Opis systemu
2. Przygotowanie zwierząt do obrazowania mózgu szczura
UWAGA: Opisany powyżej system PLD-PAT został zademonstrowany w obrazowaniu mózgów małych zwierząt. W tych eksperymentach wykorzystano zdrowe samice szczurów (patrz Tabela materiałów).
3. Obrazowanie mózgu szczura in vivo

Rysunek 1: Schematy systemu PLD-PAT. (a) Schemat PLD-PAT. PLD: impulsowa dioda laserowa, CSP: okrągła płyta skanująca, AM: aparat do znieczulania, M: silnik, MPU: zespół koła pasowego silnika, LDU: jednostka sterownika lasera, PRU: jednostka nadawczo-odbiorcza, UST: przetwornik ultradźwiękowy, WT: zbiornik z wodą, PF: folia polimerowa oraz DAQ: karta akwizycji danych. (b) Schemat zbiornika z wodą, widok z góry (1) i widok w przekroju (2) dla obrazowania mózgu małych zwierząt in vivo. A: śruba metryczna, B: akrylowa płyta pierścieniowa, C: silikonowy pierścień uszczelniający „O”, D: przezroczysta pokrywa z polietylenu o grubości 100 µm. Zbiornik posiadał otwór o średnicy 9 cm na dnie i był uszczelniony ultradźwiękowo i optycznie przezroczystą membraną polietylenową o grubości 100 µm. (c) Schemat oświetlenia impulsami laserowymi z PLD oraz linii A, zbieranych w czasie ciągłego skanowania wynoszącym 5 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W tej sekcji zaprezentowano wyniki obrazowania mózgu in vivo, które demonstrują możliwości opisanego systemu PLD-PAT. Aby wykazać zdolność systemu PLD-PAT do obrazowania z wysoką prędkością, przeprowadzono obrazowanie in vivo mózgów dwóch różnych zdrowych szczurów. Rysunek 2 przedstawia obrazy mózgu samicy szczura (93 g) przy różnych prędkościach skanowania. Rysunek 2a i b przedstawiają zdjęcia mózgu szczura prz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W pracy przedstawiono protokół wykonywania obrazowania mózgu in vivo na szczurach przy użyciu systemu PLD-PAT. Protokół zawiera szczegółowy opis systemu obrazowania i jego ustawienia, a także ilustrację obrazowania mózgu u szczurów. Istniejące systemy PAT oparte na OPO są drogie i nieporęczne i mogą dostarczyć jeden obraz przekrojowy w ciągu 5-10 minut. System PLD-PAT jest kompaktowy, przenośny i tani oraz może zapewnić dobrej jakości obrazy w ciągu 3 sekund. Wydajność systemu była wcześniej badana na fantomach ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych w manuskrypcie ani żadnych innych potencjalnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Badania są wspierane przez grant Tier 2 finansowany przez Ministerstwo Edukacji w Singapurze (ARC2/15: M4020238) oraz Narodową Radę Badań Medycznych Ministerstwa Zdrowia Singapuru (NMRC/OFIRG/0005/2016: M4062012). Autorzy pragną podziękować Panu Chow Wai Hoong Bobby'emu za pomoc w warsztacie mechanicznym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Impulsowa dioda laserowa | Quantel, Francja | QD-Q1910-SA-TEC | Jest to źródło lasera wzbudzającego o specyfikacji 803 nm, 1,4 mJ na impuls, 136 ns impuls, maksymalnie 7 kHz, wymiary: 11,0 x 6,0 x 3,6 cm, waga: ~150 gm |
| Silnik krokowy ze skrzynią biegów | LIN Engineering (Servo Dynamics) | Silnik: CO-5718-01P, Skrzynia biegów: DPL64/1, I = 10 dla NEMA 23; zasilacz PW100-48 | Aby przesunąć uchwyt detektora w geometrii kołowej. Moment obrotowy: 2,08 N-m, Bezwładność wirnika: 2,6 kg-cm2 |
| Ultradźwiękowy impulsator/odbiornik | Olympus | 5072PR | Do odbioru, filtrowania i wzmacniania sygnału PA z UST. Jego pasmo wynosi 35 MHz, a zysk wynosi ± 59 dB. |
| Przetwornik ultradźwiękowy | Olympus | V306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069 | Czujniki ultradźwiękowe służące do detekcji fotoakustycznej. Częstotliwość centralna 2,25 MHz, 0,5 cala, cylindryczna ostrość 1,9 cala |
| PCIe DAQ (Data acquisition) Karta | GaGe | CSE4227/ A6000610/B0E00610 | 12 bitów, 100 Ms/s, 2 kanały, 1 Gs pamięć wbudowana, interfejs PCIe x16 |
| Rats | In Vivos Pte Ltd, Singapur | NTac:SD, Sprague Dawley / SD | Female, waga 100 ± 10g |
| Akrylowy zbiornik na wodę | Warsztat NTU | Wykonane na zamówienie | Zawiera wodę, która działa jak akustyczne medium sprzęgające między mózgiem a detektorem |
| Skaner okrągły | Skaner na zamówienie warsztatowy NTU | wykonany jest z aluminium | |
| Maszyna anestezjologiczna | medical plus pte ltd | Aparat do znieczulenia bez oddychania z koncentratorem tlenu. | Dostarcza tlen i izofluran zwierzętom |
| Pulsoksymetr przenośny | Medtronic | PM10N z czujnikiem weterynaryjnym | Monitoruje pulsoksymetrię zwierzęcia |
| Żel do ultradźwięków | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Przezroczysty żel ultrasonograficzny |
| Oprogramowanie do gromadzenia danych | National Instruments Corporation, Austin, TX, USA) | NI LabVIEW 2015 SP1 | W naszym laboratorium został opracowany program oparty na LabVIEW do sterowania silnikiem krokowym i pobierania sygnałów PA z detektora |
| Oprogramowanie do przetwarzania danych | Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA) | Matlab R2012b | Kod Matlab do rekonstrukcji obrazów PA został opracowany w naszym laboratorium |
| Regulator temperatury | LaridTech, MO,USA | MTTC1410 | Będzie stale kontrolować temperaturę PLD |
| Zasilanie 12 V | Voltcraft | PPS-11810 | Do dostarczania napięcia roboczego dla PLD |
| Zasilacz zmienny | BASETech | BT-153 | Aby zmienić moc wyjściową lasera |
| Generator funkcji | Funktionsgenerator | FG250D | Aby zmienić częstotliwość powtarzania PLD. Zapewni sygnał TTL do synchronizacji DAQ ze wzbudzeniem lasera. |
| Dystrybutor zwierząt | In Vivos Pte Ltd, Singapur | Dystrybutor zwierząt, który dostarcza małe zwierzęta do celów badawczych. | |
| Uchwyt na zwierzę | Warsztat NTU | Wykonany na zamówienie | Służy do trzymania zwierzęcia na brzuchu |
| Maska oddechowa | Warsztat NTU | Wykonany | na zamówienie Używany wraz z uchwytem na zwierzę do dostarczania zwierzęciu mieszaniny znieczulającej |
| Pentobarbital sodu | Valabarb | Służy do eutanazji zwierzęcia po wygaśnięciu. | |
| Dyfuzor optyczny | Thorlabs | DG10-1500 | Służy do ujednolicenia wiązki laserowej |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.