Method Article

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

DOI:

10.3791/55813

⸱

August 4th, 2017

 ,  , 
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrożele są uznawane za obiecujące materiały do zastosowań w hodowlach komórkowych ze względu na ich zdolność do dostarczania wysoce nawodnionego środowiska komórkowego. Pole szablonów 3D rośnie ze względu na potencjalne podobieństwo tych materiałów do naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Hydrożele na bazie białek są szczególnie obiecujące, ponieważ można je łatwo funkcjonalizować i osiągać określone struktury o regulowanych właściwościach fizykochemicznych. Jednak produkcja makroporowatych szablonów 3D do zastosowań w hodowlach komórkowych przy użyciu materiałów naturalnych jest często ograniczona ze względu na ich słabsze właściwości mechaniczne w porównaniu z materiałami syntetycznymi. W tym przypadku oceniono różne metody wytwarzania makroporowatych systemów hydrożelowych opartych na albuminie surowicy bydlęcej (BSA), z regulowaną wielkością porów w zakresie od 10 do 70 μm w promieniu. Ponadto opracowano metodę generowania kanałów w tym materiale białkowym o długości kilkuset mikronów. Przeanalizowano różne metody wytwarzania porów, a także wpływ wielkości porów na właściwości materiału, takie jak współczynnik pęcznienia, pH, stabilność temperaturowa i degradacja enzymatyczna. Rozmiary porów badano w natywnym, spuchniętym stanie hydrożeli za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Wykonalność zastosowań w hodowlach komórkowych oceniono przy użyciu adhezyjnej peptydu RGD systemu białkowego i dwóch modelowych linii komórkowych: ludzkich komórek raka piersi (A549) i adenokracynomicznych ludzkich komórek podstawnego nabłonka pęcherzyków płucnych (MCF7).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrożele to materiały, które tworzą nierozpuszczalne sieci 3D zdolne do wiązania dużych ilości wody. Takie materiały mogą zapewnić doskonałe warunki środowiskowe dla żywych komórek. Obecnie obserwuje się coraz większe zainteresowanie wytwarzaniem trójwymiarowych struktur hydrożelowych oraz opracowywaniem procesów dostosowujących ich właściwości chemiczne i fizyczne. Gdy to zostanie osiągnięte, można wygenerować szablon do wzrostu komórek i manipulowania ich zachowaniem1,2,3,4. Te struktury 3D nie tylko tworzą bardziej naturalne i realistyczne środowisko niż konwencjonalne podejścia dwuwymiarowe, ale także ujawniają nowe możliwości wzrostu komórek macierzystych lub modeli nowotworowych5. Różne materiały mają szereg cech, które zależą głównie od wielkości porów żelu6. Pory odgrywają kluczową rolę w zastosowaniach związanych z hodowlą komórek, inżynierią tkankową i ukierunkowanym wzrostem komórek macierzystych. Na przykład tlen i składniki odżywcze dyfundują przez matrycę, a odpowiednie ilości muszą być w stanie dotrzeć do komórek7. Z drugiej strony, szkodliwe metabolity muszą być usuwane tak szybko, jak to możliwe, a do wzrostu komórek musi być dostępna wystarczająca ilość miejsca7. W związku z tym właściwości materiału, a tym samym wielkość porów, mają duży wpływ na potencjalne korzyści i możliwe zastosowania matrycy. W zależności od właściwości materiału, w hodowli komórkowej 3D mogą zachodzić różne procesy wzrostu komórek, w tym tworzenie struktur neuronalnych; wzrost i różnicowanie komórek skóry lub kości; oraz ukierunkowany wzrost specjalnych linii komórek macierzystych, takich jak hepatocyty lub fibroblasty2,3,8,9,10,11. Kolejnym istotnym punktem wpływającym na możliwe zastosowanie materiału jest jego stabilność na bodźce zewnętrzne12. Na przykład hydrożel musi zachować swoją integralność mechaniczną w pożywce do hodowli komórkowych lub w organizmie ludzkim.

W ostatnich latach zintensyfikowano badania nad hydrożelami do hodowli komórkowych 3D i przeprowadzono wiele badań mających na celu rozwiązanie architektur 3D systemów13. Hydrożele złożone z chemicznie syntetyzowanych składników są najczęściej badane, ponieważ można je łatwo syntetyzować i modyfikować chemicznie oraz wykazują wysoką stabilność (patrz Zhu et al., 2011 w celu przeglądu)5. Białka mają jednak wiele korzystnych właściwości: jako tak zwane "polimery precyzyjne" są biokompatybilne; mają określoną długość; są stosunkowo łatwe do modyfikacji; i mają dużą liczbę stron docelowych14,15. W związku z tym można generować wysoce specyficzne, innowacyjne struktury do zastosowania w wielu dziedzinach. W tym badaniu wykorzystano hydrożel16 na bazie białka, aby zademonstrować zdolność dobrze znanych metod do wpływania na architekturę 3D materiału. Ponadto zbadano zdolność i zastosowanie do generowania porów.

Dostępnych jest wiele różnych technik modyfikacji struktur 3D, w tym zarówno proste metody, jak i wyrafinowane, wysoce specjalistyczne techniki z różnych dziedzin materiałoznawstwa. Szeroko rozpowszechnioną techniką jest wykorzystanie elektroprzędzenia do generowania dobrze zdefiniowanych struktur17. Naładowane włókna są wyciągane z roztworu przez pole elektryczne, a następnie krzepną pod wpływem tlenu. W ten sposób można wyprodukować włókna w zakresie od kilku nanometrów do kilku mikronów. Dodatkowe techniki dostrajania rozmiaru, struktury i rozmieszczenia porów w matrycy to litografia miękka, fotolitografia, ogniskowanie hydrodynamiczne, natryskiwanie elektronatryskowe i biodrukowanie18,19,20. Istotną wadą tych technik jest ich zależność od specyficznego, drogiego sprzętu i specjalnych chemikaliów lub materiałów. Co więcej, doświadczenia z tymi technikami często nie można bezpośrednio przenieść na materiały na bazie białek, a wiele substancji chemicznych i metod nie jest kompatybilnych z komórkami.

Z drugiej strony, wiele technik nie opiera się na specjalnym sprzęcie, co czyni je łatwiejszymi i tańszymi do zastosowania i odtworzenia. Szeroko rozpowszechnioną metodą manipulacji strukturą jest odlewanie rozpuszczalnikiem21,22,23. Cząstki są dodawane przed reakcją polimeryzacji i rozprowadzane jednorodnie w celu nasycenia roztworu. Po polimeryzacji zmiana warunków, taka jak rozcieńczenie lub zmiana pH, prowadzi do solwatacji cząstek, podczas gdy pory pozostają w materiale. Chemikalia używane w tych technikach, takie jak sól, cukier, parafina, żelatyna i kreda, są tanie i łatwo dostępne. Podczas liofilizacji spęczniałe hydrożele są zamrażane. Następnie przeprowadzana jest sublimacja faz ciekłych w próżni23,24,25. Sublimacja wody z sieci jest na tyle delikatna, że pozwala zachować specyficzne struktury 3D materiału. W przypadku spieniania gazowego roztwór jest strumieniowany gazem podczas polimeryzacji, pozostawiając pory w żelu21. Wielkość i rozmieszczenie porów można regulować w zależności od strumienia gazu.

Aby utworzyć hydrożel białkowy, BSA reaguje z tetrakis (hydroksymetylo)chlorkiem fosfoniowym (THPC) w reakcji typu Mannicha, aby umożliwić tworzenie wiązań kowalencyjnych między aminami pierwszorzędowymi a grupami hydroksylowymi czteroramiennej cząsteczki łącznika26. Ewentualne szkodliwe produkty pośrednie są usuwane przez nadmierne mycie materiału po zajściu reakcji.

To badanie pokazuje możliwość obróbki materiału opartego na BSA za pomocą różnych technik manipulowania i dostosowywania wielkości porów. Każda z technik może być stosowana w dowolnym laboratorium na całym świecie, ponieważ nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt. Ponadto zbadano i porównano ze sobą różne parametry, takie jak współczynnik pęcznienia, degradowalność enzymatyczna, stabilność pH i wrażliwość na temperaturę, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu różnych technik na generowanie architektur 3D. Na koniec materiały funkcjonalizowano peptydami adhezyjnymi w celu zbadania możliwego zastosowania materiałów w hodowli komórkowej. Wykorzystano dwie różne modelowe linie komórkowe: A549 i MCF7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie hydrożelu

  1. Zmieszać 200 mg BSA z 1 ml dejonizowanegoH2O, aby uzyskać 20% (w/v) wywaru BSA (roztwór podstawowy A).
  2. Wymieszaj 165 μl roztworu THPC (134 mg/ml) z 4,835 ml wody dejonizowanej, aby utworzyć roztwór podstawowy THPC (roztwór podstawowy B).
  3. Zważyć 1 mg peptydu KCSSGKSRGDS (1,111,1 g/mol) (lub równoważnego peptydu adhezyjnego) i rozcieńczyć go w 100 μl sterylnegoH2Ow celu otrzymania roztworu o stężeniu 10 mg/ml (roztwór podstawowy C).
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i należy go uwzględnić tylko wtedy, gdy hydrożel jest przeznaczony do aplikacji do hodowli komórkowych.
  4. Usuń spód płytki 96-dołkowej i zastąp ją usuwalną folią spożywczą.
    UWAGA: W przypadku zastosowanych tutaj płyt dno można łatwo usunąć, wywierając nacisk na dno każdej studzienki; Cienkie plastikowe dno po prostu wypadnie.
  5. Zmieszać 100 μl roztworu podstawowego BSA (A) i 100 μl roztworu podstawowego THPC (B) (opcjonalnie: 4 μl roztworu podstawowego C dla funkcjonalizowanych, adhezyjnych hydrożeli) na płytce 96-dołkowej, aby otrzymać 200 μl hydrożelu. Wymieszaj składniki, pipetując w górę i w dół co najmniej 5 razy, aby zagwarantować jednolity hydrożel po polimeryzacji.
  6. Umieść 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej (RT) na około 10 minut, aż wszystkie hydrożele zostaną odpowiednio spolimeryzowane.
  7. Ostrożnie i powoli zdejmij folię z dolnej części talerza.
  8. Wyciśnij hydrożele z płytki 96-dołkowej za pomocą małego stempla i przenieś je do probówek o pojemności 1,5 ml ze sterylnym PBS, pH 7,4,
    UWAGA: Hydrożele mają kształt cylindryczny, o średnicy około 4 mm i wysokości 8 mm.
  9. Przechowywać hydrożele w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy.

2. Liofilizacja hydrożeli

  1. Napełnij probówki o pojemności 1,5 ml 500 μl sterylnego dejonizowanegoH2Oi zdejmij nakrętkę. Przenieść hydrożele do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml za pomocą szpatułki.
  2. Owinąć probówki o pojemności 1,5 ml szczelnie folią parafinową - co najmniej trzy warstwy na każdą fiolkę. Za pomocą igły przebij małe otwory w folii, aby umożliwić uwolnienie gazu z rurki.
  3. Wykonaj jedną z następujących czynności:
    1. Przenieść fiolkę do ciekłego roztworu azotu na 5 minut, aby zagwarantować, że woda i hydrożel całkowicie zamarzną. Natychmiast po usunięciu z ciekłego azotu przenieść fiolki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału.
      UWAGA: W wyniku tej procedury powstają pory o promieniu około 10-15 μm.
    2. Przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C przez noc, aby powoli zamrozić hydrożele. Natychmiast po wyjęciu z temperatury -20 °C przenieść fiolki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału.
      UWAGA: W wyniku tej procedury powstają pory o promieniu około 50-60 μm.
  4. Po 24 godzinach (i całkowitym odparowaniu wody w hydrożelu i wokół niego) należy rozmrozić materiał, wyjmując go z liofilizatora.
    UWAGA: Rozmiary porów można analizować za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (krok 5, "Wizualizacja hydrożelu").

3. Wymywanie cząstek

  1. Przygotuj hydrożel zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.5.
  2. Bezpośrednio po wymieszaniu składników dodawać NaCl aż do wysycenia (36 mg/ml). Dodaj sól, aż w roztworze będzie widoczny kryształ soli w postaci białego osadu.
  3. Przenieść 96-dołkową płytkę do wytrząsarki i wstrząsać aż do polimeryzacji (około 10 min). Usuń hydrożele z płytki, jak opisano w krokach 1.7-1.8.
  4. Inkubować hydrożele przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnej wodzie na wytrząsarce (20 obr./min), aby wymyć całą sól z matrycy hydrożelu. Przechowywać hydrożele w temperaturze 4 °C w PBS przez okres do kilku miesięcy.

4. Tworzenie kanałów

  1. Przygotuj hydrożele zgodnie z opisem w kroku 1. Usuń hydrożel z roztworu za pomocą szczypiec, usuń nadmiar wody wysoce chłonnym papierem i umieść go na bloku suchego lodu.
  2. Zamroź hydrożel na 30 s i ostrożnie wyjmij go z bloku. Nie uszkadzaj hydrożelu; Ostrożnie użyj szpatułki, aby zeskrobać go z bloku. Przenieść hydrożel do probówki o pojemności 1,5 ml i wysuszyć przez noc w temperaturze 37 °C.

5. Wizualizacja hydrożelu

  1. Przygotować roztwór podstawowy rodaminy B, rozcieńczając 1 mg rodaminy B w 10 ml PBS. Przygotować seryjne rozcieńczenie, rozcieńczając roztwór podstawowy rodaminy w PBS aż do osiągnięcia stężenia 0,001 mg/ml (współczynnik rozcieńczenia: 100)
  2. Usunąć hydrożel z roztworu do przechowywania (np. z kroku 2.4) i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml 0,01 mg/ml roztworu rodaminy B. Zabarwić hydrożel przez noc w roztworze rodaminy B w temperaturze pokojowej.
  3. Następnego dnia przenieś hydrożel, który ma być uwidoczniony, do 10 ml PBS (pH 7,4) i myj przez co najmniej 3 godziny.
  4. Przenieś hydrożel na μ-szkiełkowy dołek 8 i przykryj go PBS.
  5. Z hydrożelu wytnij małe plasterki (o wysokości około 0,5 mm) za pomocą ostrza.
  6. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego zobrazuj hydrożel o długości fali 514 nm (obiektyw: EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27, tryb skanowania płaskiego: 514 nm i zoom: 1X).

6. Wykonalność hodowli komórkowej

  1. Sterylnie przefiltruj wszystkie roztwory podstawowe (A, B i C) za pomocą filtra 0,45 μm.
  2. Przygotować hydrożel zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.4, łącznie z peptydem adhezyjnym przed polimeryzacją hydrożelu.
  3. Po wymieszaniu składników natychmiast odpipetować mieszaninę do dołka μ-slide 8, aż dno zostanie całkowicie pokryte.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać szybko i bezpośrednio po wymieszaniu składników, ponieważ polimeryzacja zachodzi w ciągu kilku minut w szkiełku.
  4. Hodowla komórek adhezyjnych i pasaż w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych. Przenieść komórki do wstępnie ogrzanej, sterylnej pożywki do hodowli komórek DMEM uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS, 10% (w/v)), penicyliną-streptomycyną (1% (w/v)) i nieistotnym roztworem aminokwasów (MEM, 1% (w/v)).
  5. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera i ostrożnie odpipetuj 200 μl żądanej liczby komórek (2 x 10 5 komórek/cm2) na powierzchnię hydrożelu.
  6. Przykryj μ-szkiełko 8 pokrywką i przenieś do inkubatora (37 °C, 5% CO2 ). Inkubować przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  7. Po co najmniej 4 godzinach przyłączenia komórek należy dwukrotnie przemyć komórki 200 μl sterylnej hodowli komórkowej PBS.
  8. Utrwalić komórki 200 μl 3,7% (v/v) formaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przemyć dwukrotnie PBS (~200 μL).
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z formaldehydem należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  9. Przepuszczać zawartość komórek za pomocą 200 μl 0,1 % Triton X przez 5 min. Przemyć dwukrotnie PBS.
  10. Wybarwić komórki falloidyną-rodaminą, mieszając 5 μl bulionu metanolowego ze 195 μl PBS i dodając go do komórek w temperaturze RT. Barwić komórki przez 20 minut w ciemności. Umyć dwukrotnie PBS.
  11. Zbadaj właściwości adhezyjne komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego przy 514 nm (obiektyw: EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27, tryb skanowania płaskiego: 514 nm i zoom: 1X). Przeanalizuj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów).

7. Właściwości hydrożelu

  1. Współczynnik pęcznienia.
    1. Całkowicie wysuszyć hydrożele w temperaturze 37 °C przez co najmniej jeden dzień.
    2. Zważ każdy hydrożel i zanotuj dokładną wagę.
    3. Napełnij probówkę reakcyjną o pojemności 2 ml 1,5 ml PBS.
    4. Przenieś hydrożel do tej probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml i całkowicie zanurz go w PBS.
    5. Pozostaw hydrożel na co najmniej dwa dni w PBS w temperaturze pokojowej, aby osiągnąć równowagę z PBS.
    6. Po trzech dniach usuń hydrożel z roztworu i osusz go chusteczką papierową, aby usunąć nadmiar wody z powierzchni hydrożelu.
    7. Zważ hydrożel.
    8. Oblicz współczynnik pęcznienia, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-1
      gdzie Wd jest wagą wysuszonego żelu (etap 7.1.2), a Ws jest wagą mokrego żelu (etap 7.1.7). Pomnóż przez 100, aby uzyskać procent współczynnika pęcznienia.
  2. Stabilność pH i temperatury.
    1. Przenieść 5 ml PBS do 15 ml probówki reakcyjnej.
    2. Dostosować roztwór do odpowiedniego pH (np. pH 2, 7 lub 10) za pomocą NaOH i HCl. Doprowadzić roztwór do odpowiedniej temperatury (np. RT, 37 °C lub 80 °C).
    3. Przenieść hydrożel, który ma być badany pod kątem jego stabilności, do odpowiedniego roztworu. W razie potrzeby dostosuj pH.
      UWAGA: Wszystkie hydrożele powinny być w tym momencie całkowicie spuchnięte (patrz współczynnik pęcznienia), aby zapobiec nieprawidłowej interpretacji masy z powodu pęcznienia materiału.
    4. Po upływie określonego czasu należy wyjąć hydrożel z roztworu (np. co godzinę przez okres do 2 dni), wysuszyć go bardzo chłonną chusteczką papierową w celu usunięcia nadmiaru wody i zważyć.
  3. Degradacja enzymatyczna.
    1. Przygotuj podstawowy roztwór enzymatyczny składający się z 300 U trypsyny i pepsyny, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przenieść hydrożel (np. z kroku 1.8) do odpowiedniego roztworu.
      UWAGA: Wszystkie hydrożele powinny być w tym momencie całkowicie spuchnięte, aby zapobiec nieprawidłowej interpretacji masy.
    3. Po upływie określonego czasu należy usunąć hydrożel z roztworu (np. co godzinę), osuszyć go bardzo chłonną chusteczką papierową w celu usunięcia nadmiaru wody i zważyć.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój hydrożelu stał się jedną z najważniejszych dziedzin w badaniach biologicznych związanych z badaniami materiałowymi, z tysiącami haseł indeksowanych w archiwach badań naukowych. Chociaż zachowanie wielu systemów jest dobrze zbadane, manipulacja sieciami 3D, zwłaszcza wrażliwymi materiałami na bazie białek, jest często poważnym problemem w materiałoznawstwie. Innym często niedocenianym wyzwaniem jest prawidłowy pomiar natywnej struktury materiału za pomocą kriomikroskopii elektronowe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja matryc makroporowatych może być korzystna dla wielu różnych dziedzin. Posiada duży potencjał techniczny i ekonomiczny ze względu na zdefiniowaną strukturę hydrożelu oraz możliwość kontrolowania i dostrajania określonych właściwości materiału. Jednak wprowadzenie supramolekularnych elementów strukturalnych, takich jak pory lub kanały, do szablonu 3D może wpłynąć na ogólne właściwości materiału, takie jak współczynnik pęcznienia lub sztywność. Może to spowodować niepożądany rozkład, degradację lub awarię sieci, c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Baden-Württemberg za wsparcie finansowe w ramach "Bioinspired Material Synthesis" (BioMatS-14).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (wysoka glukoza)Life Technologies / Thermo Fisher 11140-050
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies / Thermo Fisher 10270-106
Penicylina-StreptomycynaTechnologie życia / Thermo Fisher 
MEM Nieistotny roztwór aminokwasówSigma AldrichM7145-100ML
Trypsyna EDTA 0,05% Fenol RedThermo Scientific25300062
Etanol 99,8%, vergä lltÖ lfabrik Schmidt2133
NaCl Carl Roth 9265.1
Frakcja albuminy VCarl Roth 3854.2
THPCSigma Aldrich404861-100MLToksyczny
0,1% Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLLekko toksyczny
falloidyna-rodamina Technologie życia / Thermo Fisher R415
3,7% Formaldehyd Technologie życia / Thermo Fisher F8775-25MLToksyczna
rodamina BSigma Aldrich81-88-9
Filtropur S 0,2 Sarsted Ag und Co.2 83.1826.001     
µ slide 8 wellIbidi GmbH80826
KCSSGKSRGDS peptydUPEP UlmNiestandardowy sysnthesis
Etanol 99,8%, vergä lltCarl Roth K928.5
Falcon 5 ml Polistynowa tuba okrągłodenna Sarsted Ag und Co.62.547.254     
Probówki 50 ml Sarsted Ag und Co.62.547.254     
Probówki 1,5 ml   Sarsted Ag und Co.72,690,001
Probówki 2 ml   Sarsted Ag und Co.72,691
MIKROPŁYTKA DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH, 96 DOŁKÓW, PS, F-BOTTOMGreiner655073
Liofilizator Epsilon 1-6D, Christ, Osterode am Harz, Niemcy
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7GSA GmbH
15140122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
  3. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  4. Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
  5. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
  6. Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
  7. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
  8. Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
  9. Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
  10. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
  11. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  12. Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
  13. Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728(2013).
  14. Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
  15. Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
  16. Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
  17. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  18. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001(2010).
  19. Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
  20. Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
  21. Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
  22. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  23. Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
  24. Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977(2015).
  25. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
  26. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
  27. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
  28. Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
  29. Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
  30. Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
  31. Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
  32. Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
  33. Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763(2011).
  34. Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein based HydrogelsMacroporous HydrogelsPore Size AdjustmentSalt Leaching MethodGradient FreezingConfocal MicroscopyRGD Peptide ModificationCell Adhesion AnalysisHydrogel Freeze dryingBSA Hydrogel System

Related Articles