Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55813

⸱

4 sierpnia 2017

 ,  , 
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

W tym artykule

Podsumowanie

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Streszczenie

Hydrożele są uznawane za obiecujące materiały do zastosowań w hodowlach komórkowych ze względu na ich zdolność do dostarczania wysoce nawodnionego środowiska komórkowego. Pole szablonów 3D rośnie ze względu na potencjalne podobieństwo tych materiałów do naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Hydrożele na bazie białek są szczególnie obiecujące, ponieważ można je łatwo funkcjonalizować i osiągać określone struktury o regulowanych właściwościach fizykochemicznych. Jednak produkcja makroporowatych szablonów 3D do zastosowań w hodowlach komórkowych przy użyciu materiałów naturalnych jest często ograniczona ze względu na ich słabsze właściwości mechaniczne w porównaniu z materiałami syntetycznymi. W tym przypadku oceniono różne metody wytwarzania makroporowatych systemów hydrożelowych opartych na albuminie surowicy bydlęcej (BSA), z regulowaną wielkością porów w zakresie od 10 do 70 μm w promieniu. Ponadto opracowano metodę generowania kanałów w tym materiale białkowym o długości kilkuset mikronów. Przeanalizowano różne metody wytwarzania porów, a także wpływ wielkości porów na właściwości materiału, takie jak współczynnik pęcznienia, pH, stabilność temperaturowa i degradacja enzymatyczna. Rozmiary porów badano w natywnym, spuchniętym stanie hydrożeli za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Wykonalność zastosowań w hodowlach komórkowych oceniono przy użyciu adhezyjnej peptydu RGD systemu białkowego i dwóch modelowych linii komórkowych: ludzkich komórek raka piersi (A549) i adenokracynomicznych ludzkich komórek podstawnego nabłonka pęcherzyków płucnych (MCF7).

Wprowadzenie

Hydrożele to materiały, które tworzą nierozpuszczalne sieci 3D zdolne do wiązania dużych ilości wody. Takie materiały mogą zapewnić doskonałe warunki środowiskowe dla żywych komórek. Obecnie obserwuje się coraz większe zainteresowanie wytwarzaniem trójwymiarowych struktur hydrożelowych oraz opracowywaniem procesów dostosowujących ich właściwości chemiczne i fizyczne. Gdy to zostanie osiągnięte, można wygenerować szablon do wzrostu komórek i manipulowania ich zachowaniem1,2,3,4. Te struktury 3D nie tylko tworzą bardziej naturalne i realistyczne środowisko niż konwencjonalne podejścia dwuwymiarowe, ale także ujawniają nowe możliwości wzrostu komórek macierzystych lub modeli nowotworowych5. Różne materiały mają szereg cech, które zależą głównie od wielkości porów żelu6. Pory odgrywają kluczową rolę w zastosowaniach związanych z hodowlą komórek, inżynierią tkankową i ukierunkowanym wzrostem komórek macierzystych. Na przykład tlen i składniki odżywcze dyfundują przez matrycę, a odpowiednie ilości muszą być w stanie dotrzeć do komórek7. Z drugiej strony, szkodliwe metabolity muszą być usuwane tak szybko, jak to możliwe, a do wzrostu komórek musi być dostępna wystarczająca ilość miejsca7. W związku z tym właściwości materiału, a tym samym wielkość porów, mają duży wpływ na potencjalne korzyści i możliwe zastosowania matrycy. W zależności od właściwości materiału, w hodowli komórkowej 3D mogą zachodzić różne procesy wzrostu komórek, w tym tworzenie struktur neuronalnych; wzrost i różnicowanie komórek skóry lub kości; oraz ukierunkowany wzrost specjalnych linii komórek macierzystych, takich jak hepatocyty lub fibroblasty2,3,8,9,10,11. Kolejnym istotnym punktem wpływającym na możliwe zastosowanie materiału jest jego stabilność na bodźce zewnętrzne12. Na przykład hydrożel musi zachować swoją integralność mechaniczną w pożywce do hodowli komórkowych lub w organizmie ludzkim.

W ostatnich latach zintensyfikowano badania nad hydrożelami do hodowli komórkowych 3D i przeprowadzono wiele badań mających na celu rozwiązanie architektur 3D systemów13. Hydrożele złożone z chemicznie syntetyzowanych składników są najczęściej badane, ponieważ można je łatwo syntetyzować i modyfikować chemicznie oraz wykazują wysoką stabilność (patrz Zhu et al., 2011 w celu przeglądu)5. Białka mają jednak wiele korzystnych właściwości: jako tak zwane "polimery precyzyjne" są biokompatybilne; mają określoną długość; są stosunkowo łatwe do modyfikacji; i mają dużą liczbę stron docelowych14,15. W związku z tym można generować wysoce specyficzne, innowacyjne struktury do zastosowania w wielu dziedzinach. W tym badaniu wykorzystano hydrożel16 na bazie białka, aby zademonstrować zdolność dobrze znanych metod do wpływania na architekturę 3D materiału. Ponadto zbadano zdolność i zastosowanie do generowania porów.

Dostępnych jest wiele różnych technik modyfikacji struktur 3D, w tym zarówno proste metody, jak i wyrafinowane, wysoce specjalistyczne techniki z różnych dziedzin materiałoznawstwa. Szeroko rozpowszechnioną techniką jest wykorzystanie elektroprzędzenia do generowania dobrze zdefiniowanych struktur17. Naładowane włókna są wyciągane z roztworu przez pole elektryczne, a następnie krzepną pod wpływem tlenu. W ten sposób można wyprodukować włókna w zakresie od kilku nanometrów do kilku mikronów. Dodatkowe techniki dostrajania rozmiaru, struktury i rozmieszczenia porów w matrycy to litografia miękka, fotolitografia, ogniskowanie hydrodynamiczne, natryskiwanie elektronatryskowe i biodrukowanie18,19,20. Istotną wadą tych technik jest ich zależność od specyficznego, drogiego sprzętu i specjalnych chemikaliów lub materiałów. Co więcej, doświadczenia z tymi technikami często nie można bezpośrednio przenieść na materiały na bazie białek, a wiele substancji chemicznych i metod nie jest kompatybilnych z komórkami.

Z drugiej strony, wiele technik nie opiera się na specjalnym sprzęcie, co czyni je łatwiejszymi i tańszymi do zastosowania i odtworzenia. Szeroko rozpowszechnioną metodą manipulacji strukturą jest odlewanie rozpuszczalnikiem21,22,23. Cząstki są dodawane przed reakcją polimeryzacji i rozprowadzane jednorodnie w celu nasycenia roztworu. Po polimeryzacji zmiana warunków, taka jak rozcieńczenie lub zmiana pH, prowadzi do solwatacji cząstek, podczas gdy pory pozostają w materiale. Chemikalia używane w tych technikach, takie jak sól, cukier, parafina, żelatyna i kreda, są tanie i łatwo dostępne. Podczas liofilizacji spęczniałe hydrożele są zamrażane. Następnie przeprowadzana jest sublimacja faz ciekłych w próżni23,24,25. Sublimacja wody z sieci jest na tyle delikatna, że pozwala zachować specyficzne struktury 3D materiału. W przypadku spieniania gazowego roztwór jest strumieniowany gazem podczas polimeryzacji, pozostawiając pory w żelu21. Wielkość i rozmieszczenie porów można regulować w zależności od strumienia gazu.

Aby utworzyć hydrożel białkowy, BSA reaguje z tetrakis (hydroksymetylo)chlorkiem fosfoniowym (THPC) w reakcji typu Mannicha, aby umożliwić tworzenie wiązań kowalencyjnych między aminami pierwszorzędowymi a grupami hydroksylowymi czteroramiennej cząsteczki łącznika26. Ewentualne szkodliwe produkty pośrednie są usuwane przez nadmierne mycie materiału po zajściu reakcji.

To badanie pokazuje możliwość obróbki materiału opartego na BSA za pomocą różnych technik manipulowania i dostosowywania wielkości porów. Każda z technik może być stosowana w dowolnym laboratorium na całym świecie, ponieważ nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt. Ponadto zbadano i porównano ze sobą różne parametry, takie jak współczynnik pęcznienia, degradowalność enzymatyczna, stabilność pH i wrażliwość na temperaturę, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu różnych technik na generowanie architektur 3D. Na koniec materiały funkcjonalizowano peptydami adhezyjnymi w celu zbadania możliwego zastosowania materiałów w hodowli komórkowej. Wykorzystano dwie różne modelowe linie komórkowe: A549 i MCF7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie hydrożelu

  1. Wymieszać 200 mg BSA z 1 mL dejonizowanej H2O, aby przygotować 20% (w/v) roztwór zapasowy BSA (roztwór zapasowy A).
  2. Wymieszać 165 µL roztworu THPC (134 mg/mL) z 4,835 mL dejonizowanej wody, aby przygotować roztwór zapasowy THPC (roztwór zapasowy B).
  3. Odważyć 1 mg peptydy KCSSGKSRGDS (1 111,1 g/mol) (lub równoważnego peptydy adhezyjnego dla komórek) i rozpuścić w 100 µL sterylnej H2O, aby otrzymać roztwór o stężeniu 10 mg/mL (roztwór zapasowy C).
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i należy go wykonać tylko wtedy, gdy hydrożel jest przeznaczony do hodowli komórkowych.
  4. Usunąć dno płytki 96-dołkowej i zastąpić je zdejmowalną folią plastikową.
    UWAGA: W przypadku płytek użytych w tej procedurze dno można łatwo usunąć, wywierając nacisk na spód każdego dołka; cienkie plastikowe dno po prostu wypadnie.
  5. Wymieszać 100 µL roztworu zapasowego BSA (A) i 100 µL roztworu zapasowego THPC (B) (opcjonalnie: 4 µL roztworu zapasowego C w przypadku funkcjonalizowanych, adhezyjnych dla komórek hydrożeli) w płytce 96-dołkowej, aby otrzymać 200 µL hydrożelu. Składniki wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół co najmniej 5 razy, aby zagwarantować jednorodność hydrożelu po polimeryzacji.
  6. Pozostawić płytkę 96-dołkową w temperaturze pokojowej (RT) przez około 10 min, aż wszystkie hydrożele ulegną prawidłowej polimeryzacji.
  7. Ostrożnie i powoli usunąć folię plastikową z dna płytki.
  8. Wypchnąć hydrożele z płytki 96-dołkowej za pomocą małej stempla i przenieść je do probówek 1,5 mL z sterylnym PBS, pH 7,4.
    UWAGA: Hydrożele mają kształt cylindryczny o średnicy około 4 mm i wysokości 8 mm.
  9. Przechowywać hydrożele w roztworze soli fosforanowej (PBS) w temperaturze 4 °C przez maksymalnie kilka miesięcy.

2. Liofilizacja hydrożeli

  1. Napełnić probówki 1,5 mL ilością 500 µL sterylnej wody dejonizowanej H2O i zdjąć nakrętki. Przenieść hydrożele do probówek reakcyjnych 1,5 mL za pomocą szpatułki.
  2. Szczelnie owinąć probówki 1,5 mL folią parafinową – przynajmniej trzy warstwy dla każdej probówki. Za pomocą igły wykonać małe otwory w folii, aby umożliwić uwalnianie gazów z probówki.
  3. Przejść do jednego z poniższych kroków:
    1. Przenieść probówki do ciekłego azotu na 5 min, aby zapewnić całkowite zamrożenie wody i hydrożelu. Natychmiast po wyjęciu z ciekłego azotu przenieść probówki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału.
      UWAGA: Ta procedura pozwala uzyskać pory o promieniu około 10-15 µm.
    2. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C przez noc, aby powoli zamrozić hydrożele. Natychmiast po wyjęciu z temperatury -20 °C przenieść probówki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału.
      UWAGA: Ta procedura pozwala uzyskać pory o promieniu około 50-60 µm.
  4. Po 24 h (i całkowitym odparowaniu wody wewnątrz i wokół hydrożelu) rozmrozić materiał, wyjmując go z liofilizatora.
    UWAGA: Wielkość porów można przeanalizować za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (krok 5, „Wizualizacja hydrożelu”).

3. Ługowanie cząstek

  1. Przygotować hydrożel zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.5.
  2. Bezpośrednio po wymieszaniu składników dodać NaCl aż do uzyskania stanu nasycenia (36 mg/mL). Dodać sól do momentu, gdy w roztworze pojawi się biały osad w postaci kryształków soli.
  3. Przenieść płytkę 96-dołkową na wytrząsarkę i wytrząsać do czasu zajścia polimeryzacji (około 10 min). Usunąć hydrożele z płytki zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.8.
  4. Inkubować hydrożele przez co najmniej 24 h w RT w sterylnej wodzie na wytrząsarce (20 rpm), aby wymyć całą sól z matrycy hydrożelu. Przechowywać hydrożele w 4 °C w PBS przez okres do kilku miesięcy.

4. Formowanie kanału

  1. Przygotować hydrożele zgodnie z opisem w kroku 1. Wyjąć hydrożel z roztworu za pomocą pęsety, usunąć nadmiar wody za pomocą wysoce chłonnego papieru i umieścić go na bloku suchego lodu.
  2. Zamrozić hydrożel przez 30 s i ostrożnie zdjąć go z bloku. Należy uważać, aby nie uszkodzić hydrożelu; do jego zdrapywania z bloku należy ostrożnie użyć szpatułki. Przenieść hydrożel do probówki 1.5 mL i suszyć go przez noc w temperaturze 37 °C.

5. Wizualizacja hydrożelu

  1. Przygotować roztwór zapasowy rodaminy B, rozpuszczając 1 mg rodaminy B w 10 mL PBS. Przygotować rozcieńczenia seryjne, rozcieńczając roztwór zapasowy rodaminy w PBS, aż do uzyskania stężenia 0,001 mg/mL (czynnik rozcieńczenia: 100)
  2. Wyjąć hydrożel z roztworu do przechowywania (np. z kroku 2.4.) i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 1 mL roztworu rodaminy B o stężeniu 0,01 mg/mL. Barwić hydrożel w roztworze rodaminy B przez noc w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Następnego dnia przenieść hydrożel przeznaczony do wizualizacji do 10 mL PBS (pH 7,4) i płukać przez co najmniej 3 h.
  4. Przenieść hydrożel do dołka płytki µ-slide 8 i przykryć go PBS.
  5. Za pomocą ostrza wyciąć z hydrożelu cienkie plastry (o wysokości około 0,5 mm).
  6. Przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego zwizualizować hydrożel przy długości fali 514 nm (obiektyw: EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27, tryb skanowania płaszczyzny: 514 nm, powiększenie: 1X).

6. Wykonalność hodowli komórkowych

  1. Przefiltruj sterylnie wszystkie roztwory zapasowe (A, B i C) za pomocą filtra 0,45 µm.
  2. Przygotuj hydrożel zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.4, dodając peptyd adhezyjny dla komórek przed polimeryzacją hydrożelu.
  3. Po zmieszaniu składników natychmiast nanieś pipetą mieszaninę do dołka µ-slide 8, aż dno zostanie całkowicie pokryte.
    UWAGA: Krok ten należy wykonać szybko i bezpośrednio po zmieszaniu składników, ponieważ polimeryzacja w szkiełku zachodzi w ciągu kilku minut.
  4. Hoduj komórki adhezyjne i pasażuj je w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, stosując standardowe techniki hodowli komórkowych. Przenieś komórki do uprzednio ogrzanej, sterylnej pożywki DMEM uzupełnionej o płodową surowicę bydlęcą (FBS, 10% (w/v)), penicylinę-streptomycynę (1% (w/v)) oraz roztwór niezasadniczych aminokwasów (MEM, 1% (w/v)).
  5. Policz komórki za pomocą komory Neubauera i ostrożnie nanieś pipetą 200 µL pożądanej liczby komórek (2 x 105 komórek/cm2) na powierzchnię hydrożelu.
  6. Przykryj dołek µ-slide 8 pokrywką i przenieś do inkubatora (37 °C, 5% CO2). Inkubuj przez co najmniej 4 h w temperaturze 37 °C.
  7. Po co najmniej 4 h przylegania komórek przemyj je dwukrotnie 200 µL sterylnego PBS do hodowli komórkowych.
  8. Utrwal komórki za pomocą 200 µL 3,7% (v/v) formaldehydu przez 10 min w RT i przemyj dwukrotnie PBS-em (~200 µL).
    UWAGA: Podczas pracy z formaldehydem należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
  9. Permeabilizuj komórki za pomocą 200 µL 0,1% Triton X przez 5 min. Przemyj dwukrotnie PBS-em.
  10. Przebarw komórki faloidyną z rhodaminą, mieszając 5 µL roztworu zapasowego w metanolu z 195 µL PBS i dodając mieszaninę do komórek w RT. Barw komórki przez 20 min w ciemności. Przemyj dwukrotnie PBS-em.
  11. Zbadaj właściwości adhezji komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego przy 514 nm (obiektyw: EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27, tryb skanowania płaszczyzny: 514 nm, powiększenie: 1X). Przeanalizuj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).

7. Właściwości hydrożelu

  1. Stopień pęcznienia.
    1. Całkowicie wysuszyć hydrożele w temperaturze 37 °C przez co najmniej jeden dzień.
    2. Zważyć każdy hydrożel i zapisać dokładną masę.
    3. Napełnić probówkę reakcyjną o objętości 2 mL ilością 1,5 mL PBS.
    4. Przenieść hydrożel do tej probówki reakcyjnej 2 mL i całkowicie zanurzyć go w PBS.
    5. Pozostawić hydrożel w PBS w RT przez co najmniej dwa dni, aby osiągnął stan równowagi z PBS.
    6. Po trzech dniach wyjąć hydrożel z roztworu i osuszyć go ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody z powierzchni hydrożelu.
    7. Zważyć hydrożel.
    8. Obliczyć stopień pęcznienia, korzystając z następującego wzoru:
      Wzór na obliczenie stopnia pęcznienia, Ws-Wd/Wd, równanie analizy rozszerzenia materiału.
      gdzie Wd to masa wysuszonego żelu (krok 7.1.2.), a Ws to masa mokrego żelu (krok 7.1.7). Pomnożyć wynik przez 100, aby otrzymać procentowy stopień pęcznienia.
  2. Stabilność pH i temperatury.
    1. Przenieść 5 mL PBS do probówki reakcyjnej o objętości 15 mL.
    2. Dostosować pH roztworu do odpowiedniej wartości (np. pH 2, 7 lub 10) za pomocą NaOH i HCl. Doprowadzić roztwór do odpowiedniej temperatury (np. RT, 37 °C lub 80 °C).
    3. Przenieść hydrożel, którego stabilność ma zostać zbadana, do odpowiedniego roztworu. W razie potrzeby ponownie skorygować pH.
      UWAGA: Na tym etapie wszystkie hydrożele powinny być całkowicie spęczniałe (patrz: stopień pęcznienia), aby zapobiec błędnej interpretacji masy wynikającej z pęcznienia materiału.
    4. Po określonych odstępach czasu wyjąć hydrożel z roztworu (np. co godzinę przez maksymalnie 2 dni), osuszyć go bardzo chłonnym ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody, a następnie zważyć.
  3. Degradacja enzymatyczna.
    1. Przygotować roztwór zapasowy enzymów o stężeniu 300 U trypsyny i pepsyny, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przenieść hydrożel (np. z kroku 1.8) do odpowiedniego roztworu.
      UWAGA: Na tym etapie wszystkie hydrożele powinny być całkowicie spęczniałe, aby zapobiec błędnej interpretacji masy.
    3. Po określonych odstępach czasu wyjąć hydrożel z roztworu (np. co godzinę), osuszyć go bardzo chłonnym ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody, a następnie zważyć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowywanie hydrożeli stało się jedną z najważniejszych dziedzin badań biologicznych związanych z inżynierią materiałową, z tysiącami wpisów w archiwach badań naukowych. Choć zachowanie wielu systemów jest dobrze przebadane, manipulowanie sieciami 3D, zwłaszcza w przypadku wrażliwych materiałów białkowych, często stanowi istotny problem w nauce o materiałach. Kolenym często niedocenianym wyzwaniem jest prawidłowy pomiar natywnej struktury materiału przy użyciu kriomikroskopii elektronow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Produkcja matryc makroporowatych może być korzystna dla wielu różnych dziedzin. Posiada duży potencjał techniczny i ekonomiczny ze względu na zdefiniowaną strukturę hydrożelu oraz możliwość kontrolowania i dostrajania określonych właściwości materiału. Jednak wprowadzenie supramolekularnych elementów strukturalnych, takich jak pory lub kanały, do szablonu 3D może wpłynąć na ogólne właściwości materiału, takie jak współczynnik pęcznienia lub sztywność. Może to spowodować niepożądany rozkład, degradację lub awarię sieci, c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Baden-Württemberg za wsparcie finansowe w ramach "Bioinspired Material Synthesis" (BioMatS-14).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (wysoka glukoza)Life Technologies / Thermo Fisher 11140-050
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies / Thermo Fisher 10270-106
Penicylina-StreptomycynaTechnologie życia / Thermo Fisher 
MEM Nieistotny roztwór aminokwasówSigma AldrichM7145-100ML
Trypsyna EDTA 0,05% Fenol RedThermo Scientific25300062
Etanol 99,8%, vergä lltÖ lfabrik Schmidt2133
NaCl Carl Roth 9265.1
Frakcja albuminy VCarl Roth 3854.2
THPCSigma Aldrich404861-100MLToksyczny
0,1% Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLLekko toksyczny
falloidyna-rodamina Technologie życia / Thermo Fisher R415
3,7% Formaldehyd Technologie życia / Thermo Fisher F8775-25MLToksyczna
rodamina BSigma Aldrich81-88-9
Filtropur S 0,2 Sarsted Ag und Co.2 83.1826.001     
µ slide 8 wellIbidi GmbH80826
KCSSGKSRGDS peptydUPEP UlmNiestandardowy sysnthesis
Etanol 99,8%, vergä lltCarl Roth K928.5
Falcon 5 ml Polistynowa tuba okrągłodenna Sarsted Ag und Co.62.547.254     
Probówki 50 ml Sarsted Ag und Co.62.547.254     
Probówki 1,5 ml   Sarsted Ag und Co.72,690,001
Probówki 2 ml   Sarsted Ag und Co.72,691
MIKROPŁYTKA DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH, 96 DOŁKÓW, PS, F-BOTTOMGreiner655073
Liofilizator Epsilon 1-6D, Christ, Osterode am Harz, Niemcy
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7GSA GmbH
15140122

Bibliografia

  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
  3. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  4. Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
  5. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
  6. Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
  7. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
  8. Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
  9. Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
  10. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
  11. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  12. Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
  13. Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728(2013).
  14. Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
  15. Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
  16. Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
  17. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  18. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001(2010).
  19. Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
  20. Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
  21. Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
  22. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  23. Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
  24. Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977(2015).
  25. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
  26. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
  27. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
  28. Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
  29. Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
  30. Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
  31. Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
  32. Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
  33. Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763(2011).
  34. Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hydrożele makroporowateregulacja wielkości porówmetoda wymywania solizamrażanie gradientowemikroskopia konfokalnamodyfikacja peptydem RGDanaliza adhezji komórekliofilizacja hydrożelusystem hydrożelowy BSA
Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.