Artykuł metodologiczny

Określanie optymalnej częstości hamowania dla komórek nowotworowych za pomocą pól TTFields (Tumor Treating Fields)

DOI:

10.3791/55820

⸱

4 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Preclinical Research Department, Novocure Ltd., Haifa, Israel, 2Novocure Ltd., Haifa, Israel, 3Novocure GmbH, Lucerne, Switzerland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pola do leczenia nowotworów (TTFields) są skuteczną metodą leczenia przeciwnowotworowego dostarczaną poprzez ciągłą, nieinwazyjną aplikację zmiennych pól elektrycznych o niskiej intensywności i częstotliwości pośredniej. Stosowanie pól elektrycznych TTFields na liniach komórkowych za pomocą systemu do nawożenia polami TTFields in vitro pozwala na określenie optymalnej częstotliwości, która prowadzi do największego zmniejszenia liczby komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pola do leczenia nowotworów (TTFields) są skuteczną metodą leczenia dostarczaną poprzez ciągłą, nieinwazyjną aplikację naprzemiennych pól elektrycznych o niskiej intensywności (1-3 V/cm) w zakresie częstotliwości kilkuset kHz. Badanie pól TTFields w hodowli tkankowej przeprowadza się przy użyciu systemu aplikacji pola TTFields do diagnostyki in vitro, który umożliwia zastosowanie pól elektrycznych o różnych częstotliwościach i natężeniach do ceramicznych szalek Petriego o wysokiej stałej dielektrycznej (Ɛ > 5 000). Linie komórek nowotworowych umieszczone na szkiełkach nakrywkowych na dnie ceramicznych szalek Petriego są poddawane działaniu pól elektrycznych TTFields podawanych w dwóch prostopadłych kierunkach z różną częstotliwością, aby ułatwić przeprowadzenie testów wyników leczenia, takich jak liczba komórek i testy klonogenne. Wyniki przedstawione w niniejszym raporcie pokazują, że optymalna częstość stosowania pól elektrycznych TTFields zarówno w odniesieniu do liczby komórek, jak i testów klonogennych wynosi 200 kHz zarówno dla komórek jajnika, jak i glejaka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pola do leczenia nowotworów (TTFields) są antymitotyczną metodą leczenia glejaka wielopostaciowego i potencjalnie innych typów raka. Pola są dostarczane poprzez ciągłe stosowanie pól elektrycznych o niskiej intensywności (1-3 V/cm), średniej częstotliwości (100-500 kHz), naprzemiennych do obszaru guza1,2. Wykazano, że stosowanie pól TTFields in vitro i in vivo hamuje zarówno wzrost różnych linii komórek nowotworowych, jak i progresję nowotworów w kilku modelach nowotworów zwierzęcych1,2,3,4,5,6,7. Pilotażowe badania kliniczne i większe badania randomizowane u pacjentów z guzami litymi, w tym glejakiem i niedrobnokomórkowym rakiem płuca, wykazały bezpieczeństwo i skuteczność ciągłego stosowania pól TTFields8,9,10. Stwierdzono, że skuteczność pól elektrycznych TTFields jest: (1) zależna od częstotliwości, z określonymi optymalnymi częstotliwościami prowadzącymi do największego zmniejszenia liczby komórek linii komórkowych o różnym pochodzeniu1,2,4,5,6,7; (2) zależne od natężenia pola elektrycznego, z minimalnym progiem aktywności na poziomie około 1 V/cm i silniejszymi wyższymi intensywnościami1,2,7,11; (3) wzmocnione, gdy czas trwania leczenia był dłuższy5; oraz (4) wyższe, gdy 2 kierunkowe pola TTFields zostały zastosowane prostopadle do siebie, w porównaniu z polami elektrycznymi przyłożonymi z jednego kierunku1. Na podstawie powyższych ustaleń pola TTFields mogą być stosowane u pacjentów przez długi czas przy użyciu 2 zestawów matryc przetworników zlokalizowanych na skórze pacjenta, aby zmaksymalizować natężenie pola elektrycznego w łożysku guza12,13.

Badanie wpływu pól TTFields na komórki nowotworowe in vitro obecnie dostarcza obecnie jedynego sposobu na określenie optymalnej częstotliwości do zastosowania dla określonego typu nowotworu. Testowanie optymalnej częstotliwości wymaga urządzenia, które pozwala na zastosowanie różnych częstotliwości w zakresie 100-500 kHz i przy natężeniach do 3 V/cm średniej kwadratowej (RMS) do hodowli komórkowej. Ponieważ pola elektryczne TTFields wytwarzają ciepło, system aplikacyjny wymaga zdolności do odprowadzania nadmiaru ciepła przy jednoczesnym zachowaniu ścisłej kontroli nad temperaturą.

Na przestrzeni lat opracowano kilka urządzeń, które umożliwiają zastosowanie pól TTFields w hodowlach komórkowych1,2,5,14,15,16. We wszystkich tych urządzeniach zastosowane elektrody zostały zaizolowane, aby uniknąć zastrzeżeń związanych z użyciem elektrod przewodzących, takich jak wymiana elektronów na powierzchni elektrody i uwalnianie toksycznych jonów metali do medium1. Główną różnicą między różnymi testowanymi systemami aplikacji TTFields jest rodzaj zastosowanej izolacji elektrod, przy czym elektrody wykonane są z drutów metalowych izolowanych cienką warstwą izolatora2,14,15,16 lub z materiałem o wysokiej stałej dielektrycznej (np. niobian ołowiu-tytanianu ołowiu (PMN-PT))6 . Podczas gdy elektrody z drutem izolowanym stanowią stosunkowo proste i ekonomiczne rozwiązanie do zastosowań w polach TTFields, często są one ograniczone przez wysokie napięcie wymagane do osiągnięcia efektywnego natężenia pola elektrycznego powyżej progu 1 V/cm oraz przez powierzchnię dostępną do powlekania ogniw, ponieważ odległość między elektrodami jest stosunkowo niewielka. Systemy oparte na elektrodach izolowanych materiałem o wysokiej stałej dielektrycznej wymagają specjalnych możliwości projektowych i produkcyjnych, ale nie wymagają wysokiego napięcia i mogą oferować większą powierzchnię do wzrostu komórek między elektrodami.

System aplikacji in vitro TTFields używany w tej pracy należy do drugiej klasy systemów, przy czym jednostką rdzeniową jest szalka Petriego (płytka TTFields, zobacz Rysunek 1) składa się z ceramiki o wysokiej stałej dielektrycznej (np. PMN-PT). Dwie pary elektrod są drukowane prostopadle na zewnętrznych ściankach czaszy pola TTFields, aby umożliwić zastosowanie pól elektrycznych z 2 kierunków. Elektrody są podłączone do generatora przebiegów sinusoidalnych i wzmacniacza, co pozwala na zastosowanie pól TTFields w zakresie częstotliwości 50-500 kHz. W celu rozproszenia nadmiernego ciepła, naczynia TTFields są przechowywane w inkubatorze z chłodzeniem, a kontrola temperatury medium odbywa się poprzez ciągłe monitorowanie temperatury naczynia i regulację napięcia podawanego przez system. W praktyce ustawienie inkubatora na niższą temperaturę doprowadziłoby do większego natężenia pola elektrycznego, ponieważ system zwiększa napięcie, aż do osiągnięcia docelowej temperatury wewnątrz naczynia. Różnica między temperaturą wewnątrz naczynia a temperaturą inkubatora może prowadzić do pewnego parowania, w zależności od gradientów temperatury; W związku z tym pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 24 godziny, aby utrzymać odpowiednie warunki wzrostu.

Poniższy protokół opisuje procedurę eksperymentalną mającą na celu optymalizację stosowania częstotliwości pól TTFields do komórek nowotworowych, tak aby osiągnąć maksymalne zmniejszenie liczby komórek i zmniejszenie potencjału komórek, które przeżyły, do tworzenia kolonii.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. System aplikacji pól TTFields in vitro — konserwacja płyty bazowej i naczynia

  1. Opłucz naczynia i pokrywki naczyń pod bieżącą bieżącą wodą. Następnie spłucz wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu twarzą w dół.
  2. Jeśli w poprzednim eksperymencie do potraw dodano chemioterapeutyk/lek, napełnij każde naczynie 5% lekkim roztworem detergentu i pozostaw na noc.
    1. Dokładnie opłucz naczynia pod bieżącą bieżącą wodą, aby uniknąć śladów detergentu wewnątrz naczynia. Opłucz naczynia i pokrywki naczyń wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu twarzą w dół.
  3. Włóż czyste i suche naczynia wraz z pokrywkami do worków sterylizacyjnych. Zamknij i umieść worki w autoklawie, naczyniami skierowanymi do dołu. Autoklaw przez 30 minut w temperaturze nie wyższej niż 121 °C.
  4. Ustaw autoklaw na program suszenia, częściowo otwórz drzwiczki autoklawu i susz naczynia przez 30 minut.
  5. Przetrzyj płytę podstawy szmatką lekko zwilżoną 70% etanolem.

2. Konfiguracja eksperymentu

UWAGA: Wszystkie urządzenia i materiały użyte w tym protokole są opisane na Liście Materiałów. Wszystkie poniższe czynności należy wykonywać w komorze z przepływem laminarnym, przy zachowaniu sterylnych warunków.

  1. Należy przygotować czyste i sterylne naczynia i pokrywki pól TTFields, zgodnie z opisem w punkcie 1. Przetrzyj płytę podstawy szmatką lekko zwilżoną 70% etanolem.
  2. Zamontuj naczynia TTFields z pokrywami na płycie podstawy, delikatnie dociskając naczynie i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara o około 5 mm, aż krawędź naczynia zablokuje się na trzech kołkach na płycie podstawy. Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm (plastik lub szkło poddane obróbce) na dnie każdego naczynia.
  3. Przygotować zawiesinę komórkową w kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco dla U-87 MG i F98; RPMI dla A2780 i OVCAR-3; uzupełnione zgodnie z opisem w Wykazie materiałów).
    nuta: Koncentracje komórek zależą od typów komórek i czasu trwania eksperymentu, 80%-90% zlewającego się wzrostu komórek nie powinno zostać przekroczone do końca eksperymentu.
    ostrożność: Ludzkie linie komórkowe mogą stanowić zagrożenie biologiczne i powinny być traktowane z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa.
  4. Umieść 200 μl zawiesiny komórek (zwykle 5 000-20 000 komórek w 200 μl na 72-godzinny eksperyment, w zależności od czasu podwojenia) jako kroplę na środku każdego szkiełka nakrywkowego i przykryj pokrywkami naczynia.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 do momentu, gdy komórki się zgrzebią; na tym etapie możliwa jest inkubacja przez noc.
  6. Odessać płyny z kropli za pomocą pipety o pojemności 200 lub 1 000 μl.
  7. Delikatnie odpipetuj 2 ml kompletnego podłoża wzrostowego, aby napełnić każde naczynie. Użyj sterylnej końcówki do pipetowania i delikatnie postukaj w krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić pęcherzyki powietrza, które od czasu do czasu wpadają pod szkiełko.
  8. Przykryć naczynia pokrywkami i umieścić je w inkubatorze wykorzystującym CO2 w temperaturze 37 °C do czasu rozpoczęcia leczenia polami TTFields.

3. Aplikacja pól TTFields

  1. Przenieść płytki podstawy z dołączonymi szalkami TTFields do inkubatoraCO2 z chłodzeniem.
    UWAGA: Stosowanie pól elektrycznych TTFields in vitro powoduje wytwarzanie ciepła; Dlatego wymagany jest inkubator z chłodzeniem, aby skompensować nagrzewanie się potraw. Wyższe intensywności pól TTFields będą wytwarzać więcej ciepła i będą wymagały niższych temperatur otoczenia w inkubatorze (patrz Tabela 1). Klinicznie istotne natężenia pól TTFields uzyskuje się, gdy temperatura w inkubatorze do stosowania pól TTFields mieści się w zakresie 18–30 °C.
  2. Podłącz złącze żeńskie płaskiego do płyty podstawy. Włączyć generator pól TTFields.
  3. Uruchomić oprogramowanie systemowe do stosowania pól TTFields do stosowania in vitro i wybrać ustawienia eksperymentu.
    1. Zdefiniuj nowy eksperyment. Wpisz nazwę eksperymentu i właściciela eksperymentu w interfejsie użytkownika oprogramowania na ekranie komputera. Dostosuj częstotliwość i temperaturę docelową dla każdego naczynia lub płyty podstawy.
  4. Uruchom aplikację TTFields za pomocą oprogramowania.
  5. Sprawdź, czy wszystkie naczynia są prawidłowo podłączone i są wyświetlane na niebiesko na monitorze. Jeśli antena jest otoczona czerwoną ramką (co oznacza, że nie jest prawidłowo podłączona), delikatnie ją dociśnij i powoli obracaj w przód iw tył, aż styki zostaną przywrócone, a antena zmieni kolor na jasnoniebieski.
  6. Pozostawić uruchomione pola elektryczne TTFields do stosowania in vitro na okres do 24 godzin.
  7. Jeśli eksperyment osiągnie punkt końcowy, przerwij go, klikając przycisk ZAKOŃCZ EKSPERYMENT w oprogramowaniu i przejdź do kroku 5. Jeśli nie, kliknij PAUZA eksperyment.
  8. Odłącz złącze płaskiego od płyty podstawy. Wyjmij płytę podstawy z naczyniami z inkubatora do komory z przepływem laminarnym.
  9. Wymieniaj pożywkę we wszystkich naczyniach co 24 godziny i włóż płytę podstawy z powrotem do inkubatora z chłodzeniem. Podłącz płytę podstawy do generatora za pomocą płaskiego. Kontynuuj eksperyment, klikając przycisk KONTYNUUJ.

4. Próbki kontrolne

Uwaga: Hoduj komórki kontrolne w podobnych warunkach do komórek poddanych działaniu pól TTFields, z wyłączeniem stosowania pól TTFields.

  1. Płytki kontrolne próbek z tą samą zawiesiną i na podobnej powierzchni, używane do powlekania próbek poddanych działaniu pól TTFields.
  2. Umieścić szalki kontrolne w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  3. Pożywkę należy wymieniać w naczyniach co 24 godziny, aby dopasować ją do warunków podłoża poddanego działaniu pól TTFields.

5. Koniec eksperymentu

  1. Po kliknięciu na ZAKOŃCZ EKSPERYMENT poczekaj, aż oprogramowanie pobierze wszystkie rekordy z systemu i zapisze je na komputerze.
  2. Użyj przycisku RAPORTY, aby przejrzeć pliki dziennika temperatury, prądu i rezystancji każdej płytki podstawowej, aby sprawdzić, czy wszystkie naczynia zostały potraktowane zgodnie z planem eksperymentalnym.
    nuta: Wszystkie raporty i dzienniki są zapisywane na komputerze po zakończeniu eksperymentu i można je przejrzeć w dowolnym momencie.
  3. Wyłączyć generator pól TTFields.
  4. Odłącz płaski od płyty podstawy i wyjmij go z inkubatora.
  5. Aby wyjąć naczynie ceramiczne, naciśnij i obróć naczynie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby odblokować je z podstawy.
  6. Umieść naczynia w komorze z przepływem laminarnym i aseptycznie usuń szkiełka nakrywkowe. Przenieść je na sterylne szalki Petriego zawierające świeżą pożywkę lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu dalszej kontroli i oceny.

6. Ocena wpływu pól TTFields

UWAGA: Efekty pól TTFields można określić na kilka sposobów. Należy użyć jednej lub więcej z następujących metod, aby porównać komórki poddane działaniu substancji z komórkami kontrolnymi niepoddanymi działaniu środka:

  1. Liczba komórek
    1. Usunąć pożywkę/PBS z każdego naczynia zawierającego szkiełko nakrywkowe.
    2. Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej szalki i inkubować przez maksymalnie 10 minut (tj. do momentu, gdy komórki zaczną odrywać się od powierzchni szkiełka nakrywkowego) w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
    3. Dodaj 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej, aby zneutralizować trypsynę i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.
    4. Policz komórki przy użyciu dowolnej standardowej techniki liczenia komórek, która jest kompatybilna z liczeniem niskich stężeń komórek (tj. około 20 000 komórek/ml).
  2. Test klonogenny
    1. Umieść podobną liczbę komórek (100-500 komórek na szalkę) z każdej szalki na nowych, sterylnych szalkach Petriego lub 6-dołkowych płytkach zawierających 2 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.
    2. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 1-3 tygodnie (w zależności od właściwości każdej linii komórkowej), aż do utworzenia kolonii składających się z ~50 komórek. Oceń liczbę komórek w kolonii za pomocą mikroskopii świetlnej.
    3. Usuń pożywkę i spłucz PBS.
    4. Usuń PBS i dodaj lodowaty metanol (1 ml). Inkubować w temperaturze -20 °C przez 10 minut lub dłużej.
    5. Usuń metanol.
    6. Dodać roztwór fioletu krystalicznego (0,1% m/v w 25% metanolu v/v w wodzie) i inkubować przez 20 min.
      ostrożność: Fiolet krystaliczny jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym; Używaj rękawiczek podczas pracy z kryształowym fioletem.
    7. Usuń fiolet krystaliczny, umyj 3 razy wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu.
    8. Policz kolonie utworzone w każdym naczyniu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki po zastosowaniu pól TTFields podczas skanowania różnych częstotliwości mogą być określone ilościowo na podstawie różnych testów, takich jak liczba komórek, testy kolorymetryczne, testy klonogenne oraz badania zmian w liczbie inwazyjnych komórek za pomocą komory Boydena umieszczonej w specjalnym wysokościennym naczyniu do hodowli komórkowych TTFields. Staranne planowanie eksperymentalne oparte na z góry ustalonych czasach podwajania komórek pozwoli komórkom osiągnąć maksymalną liczbę zdarzeń mitotycznych w czasie trwania leczenia, maksymalizując w ten sposób wyniki leczenia.

Rysunek 2 ilustruje typowy wynik skanowania częstotliwości dla średniej liczby komórek (tj. liczby komórek) i testu klonogennego A2780 (tj. komórek ludzkiego raka jajnika; Rysunek 2A)7 i F-98 (tj. komórki glejaka szczura; Rysunek 2B)1 potraktowany dwukierunkowymi polami TTFields (zakres częstotliwości: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V/cm, temperatura inkubatora: 18 °C). Wyniki wskazują na znaczne zmniejszenie liczby komórek przy wszystkich stosowanych częstotliwościach, z maksymalną redukcją przy 200 kHz dla wszystkich badanych linii komórkowych (jednokierunkowa ANOVA z wielokrotnym porównaniem). Optymalna częstość prowadząca do najwyższego obniżenia potencjału klonogennego była taka sama zarówno dla komórek A2780, jak i F98 (ryc. 2B i C). Współczynnik korelacji Pearsona między liczbą komórek a efektem klonogennym przy każdej częstości wynosił 0,967 (p = 0,002) i 0,755 (p = 0,083) odpowiednio dla A2780 i F98.

Rysunek 3 przedstawia wyniki skanowania częstotliwości dla średniej liczby komórek dla OVCAR-3 (tj. komórek ludzkiego raka jajnika; Rysunek 3A) i U-87 MG (tj. ludzkie komórki glejaka; Rysunek 3B) komórki poddane działaniu pól elektrycznych TTFields w dwóch kierunkach o różnym natężeniu (RMS: odpowiednio 1,7, 1,3 i 1,0 V/cm oraz temperatura inkubatora: odpowiednio 18 °C, 24 °C i 28 °C). Wyniki pokazują, że chociaż po leczeniu polami TTFields 1,3 V/cm (temperatura inkubatora: 24 °C) nadal występuje znaczne zmniejszenie liczby komórek OVCAR-3, efekt ten jest stosunkowo niewielki w porównaniu z wynikami uzyskanymi, gdy komórki były traktowane 1,7 V/cm (temperatura inkubatora: 18 °C). Komórki U-87 MG leczone polami TTFields 1,0 V/cm (temperatura inkubatora: 28 °C) również wykazują podobną tendencję w zmniejszaniu liczby komórek, jak w przypadku leczenia 1,7 V/cm, jednak efekt ten nie był istotny przy niższych intensywnościach.

figure-results-1
Rysunek 1. Anteny TTFields zostały zainstalowane na płycie podstawy i podłączone do płaskiego przewodu sterującego pola TTFields. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Skanowanie częstotliwości w celu określenia optymalnej częstości hamowania pól elektrycznych TTFields dla komórek (A) A2780 i (B) F98. Komórki leczono przez 72 godziny polami TTFields o różnych częstotliwościach (1,7 V/cm i 100-500 kHz). Efekt leczenia polami TTFields oszacowano na podstawie testów liczby komórek i klonogenności. Strzałka wskazuje optymalną częstotliwość. Wyniki reprezentują średnie ± SD oparte na co najmniej 6 powtórzeniach dla każdej badanej częstotliwości. (C) Reprezentatywne obrazy przeżycia klonogennego komórek A2780 po leczeniu polami TTFields z różną częstością. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Skanowanie częstości występowania w celu określenia optymalnej częstości hamowania pól elektrycznych TTFields dla komórek (A) OVCAR-3 i (B) U-87 MG. Komórki leczono przez 72 godziny polami TTFields o różnych częstotliwościach (100-500 kHz) i intensywnościach (OVCAR-3: 1,3 i 1,7 V/cm; U-87 MG: 1,0 i 1,7 V/cm). Wpływ leczenia polami TTFields oceniano na podstawie liczby komórek. Strzałka wskazuje optymalną częstotliwość. Wyniki reprezentują średnie ± SD oparte na co najmniej 6 powtórzeniach w każdej badanej częstotliwości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Temperatura otoczenia inkubatora Oczekiwana intensywność pól TTFields
(°C)(V/cm RMS)
Rozdział 181,62
Rozdział 191,55
20Godzina 1,48
21Rozdział 1,41
22 Rozdział 221,33
23Pytanie 1,26
24Pytanie 1,19
25Pytanie 1,12
26Klasa 1,04
27 Rozdział 270,97
280,9
290,83
Rozdział 300,76

Tabela 1. Temperatura otoczenia inkubatora i oczekiwane natężenie pól TTFields wewnątrz naczynia pola TTFields.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pola elektryczne TTFields to nowa metoda przeciwnowotworowa oparta na ciągłym stosowaniu odpowiednio dostrojonych zmiennych pól elektrycznych 1,2,8,9,10,17. Maksymalizacja skuteczności przeciwnowotworowej jest pożądanym wynikiem dla wszystkich metod leczenia. Tak więc "walka" o każdy dodatkowy procent zahamowania wzrostu komórek nowotworowych może mieć znaczący wpływ na długoterminowe wyniki kliniczne dla pacjentów. Wynika to z wymaganej ciągłości stosowania pól TTFields i wynikającego z tego skumulowanego efektu. Maksymalizację zastosowania pól elektrycznych TTFields można osiągnąć na kilka sposobów: (1) zwiększenie natężenia pola elektrycznego 1,7, (2) wydłużenie czasu leczenia5, (3) znalezienie najskuteczniejszej kombinacji z innymi metodami leczenia18,19 oraz (4) określenie optymalnej częstotliwości 1,2,4,6,7. Maksymalizację natężenia pola elektrycznego w miejscu guza uzyskuje się poprzez optymalizację lokalizacji matryc na skórze pacjenta; Pozwala to na dostarczenie maksymalnego natężenia pola do guza w oparciu o indywidualną anatomię pacjenta20. Wydłużenie czasu leczenia zależy głównie od przestrzegania przez pacjenta zaleceń lekarskich (przez co najmniej 18 godzin dziennie)17. Znalezienie właściwej kombinacji z innymi terapiami i określenie optymalnej częstości leczenia zależy w dużej mierze od wyników badań in vitro, ponieważ obecnie nie są dostępne żadne zwalidowane markery wyników leczenia polami TTFields. W niniejszej pracy przedstawiono procedury eksperymentalne wymagane do określenia optymalnej częstości stosowania pól TTFields dla linii komórek nowotworowych przy użyciu systemu do stosowania pól elektrycznych TTFields in vitro. Opisane tutaj metody mogą być potencjalnie wykorzystane do badania przesiewowego skojarzenia innych metod leczenia nowotworów (np. chemioterapii lub napromieniania) z polami TTFields oraz do określenia optymalnej częstości podawania pól TTFields dla każdego konkretnego leczenia skojarzonego.

Zgodnie z wcześniejszymi publikacjami, przedstawione wyniki pokazują, że optymalna częstość leczenia zarówno komórek glejaka, jak i komórek raka jajnika wynosi 200 kHz 1,7. W niniejszej pracy po raz pierwszy wykazaliśmy, że optymalna częstość stosowania pól elektrycznych TTFields w celu zmniejszenia potencjału klonogennego jest związana z częstością, która prowadzi do maksymalnego efektu cytotoksycznego. Metody zastosowane w niniejszej pracy do ilościowego określenia skutków pól elektrycznych TTFields (tj. cytotoksycznych i klonogennych) to tylko dwie z wielu możliwych standardowych testów końcowych służących do oceny wyników leczenia. Dodatkowe testy wyników leczenia obejmują: (1) mocowanie, barwienie i mocowanie szkiełek nakrywkowych, na których komórki są platerowane pod mikroskopem w celu wizualizacji struktur wewnątrzkomórkowych; (2) przeprowadzanie testów ekstraktów białkowych i RNA z samych pól TTFields lub po przeniesieniu szkiełka nakrywkowego do nowego naczynia jednorazowego użytku; oraz (3) trypsynizowanie komórek barwionych do analizy cytometrii przepływowej.

Staranne planowanie eksperymentów będzie miało wpływ na wyniki leczenia po podaniu pól elektrycznych TTFields. Kluczowe kroki obejmują zapewnienie, że proliferacja komórek przez cały czas trwania eksperymentu nie prowadzi do przerostu i stosowanie odpowiedniego natężenia pola elektrycznego, ponieważ natężenia, które są zbyt wysokie w przypadku zastosowania do wrażliwych linii komórkowych, spowodują, że liczba komórek będzie zbyt mała dla wymaganych testów w celu określenia optymalnej częstotliwości. I odwrotnie, pola TTFields stosowane z bardzo niską intensywnością na mniej czułych liniach komórkowych powodują niewielkie efekty, które mogą być maskowane przez wrodzoną zmienność. Dzienniki leczenia powinny być badane w celu uzyskania cennych informacji na temat stabilności temperatury, prądów elektrycznych i rezystancji dla każdej potrawy podczas eksperymentu. Wymiana wadliwych naczyń na początku leczenia i wykluczenie danych z naczynia, które nie spełniało pożądanych parametrów leczenia, zminimalizuje zmienność między powtórzeniami.

Podsumowując, pola elektryczne TTFields są nową metodą leczenia przeciwnowotworowego, która wykazała już skuteczność i bezpieczeństwo w warunkach klinicznych 8,9,10. Badanie pól elektrycznych TTFields w warunkach in vitro z wykorzystaniem opisanych tutaj protokołów może pozwolić na optymalizację parametrów leczenia polami TTFields w warunkach klinicznych i może poszerzyć naszą wiedzę na temat mechanizmu działania leżącego u podstaw tego procesu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna i Kirson D. Eilon D są płatnymi pracownikami w Novocure Ltd w Izraelu. Weinberg Uri jest płatnym pracownikiem firmy Novocure GmbH, Lucerna. Yoram Palti jest udziałowcem Novocure Ltd w Nowym Jorku.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System i oprogramowanie inovitroITG1000 i IBP1000NovocureKażde urządzenie zawiera 1 generator pól TTFields, 1 płytę podstawy, 8 naczyń pola TTFields z pokrywami i 1 płaski.
Worki do sterylizacjiWestfield medical24882
Prowadnice z tworzywa sztucznegoThermo Scientific (NUNC)174977Wstępnie obrobione i wysterylizowane
Szkiełka osłonoweThermo Scientific (Menzel-Glä ser)CB00220RA1W razie potrzeby wysterylizować
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średniPrzemysł biologiczny (Izrael)01-055-1ACiepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem
RPMI 1640Gibco21875-034Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Biological Industries (Izrael)04-007-1ACiepła w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-029
Pen/Strep (10 000 U/ml Penicyliny, 10 000 &mikro; g/ml Streptomycyny)Gibco15140-122
Roztwór pirogronianu sodu 100 mM Przemysł biologiczny (Izrael)03-042-1B
Bufor Hepes 1 MPrzemysł biologiczny (Izrael)03-025-1B
Roztwór insuliny z trzustki bydlęcejSigma-Aldrich10516-5ML
0,25% trypsyna/EDTABiological Industries (Izrael)03-050-1BCiepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem
MetanolMerck1.06009.2511Schłodzić do -20 & deg; C w zamrażarce przed użyciem
Kryształowy fioletSigma-Aldrich120M1445Szkodliwy. Przygotować 0,1% m/v roztwór fioletu krystalicznego w 25% metanolu 75% wodzie.
Lekki detergentAlcononx242985Przygotować 5% roztwór w wodzie lub zgodnie z instrukcją producenta.
PBSBiological Industries (Izrael)02-023-1ABez wapnia i magnezu
A2780ECACC93112519Grow in RPMI 1640 uzupełniony FBS (10%), pióro/paciorkowiec (100  U/ml / 100  &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1  mM) i bufor Hepes (12  mM).
F98ATCCCRL-2397Rośnie w Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka uzupełniona FBS (10%), wstrzykiwacz/paciorkowiec (100  U/ml / 100  &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1  mM) i glutaminy (2  mM).
Ovcar-3ATCCHTB-161Rośnie w RPMI 1640 uzupełniony o FBS (20%), długopis/paciorkowiec (100  U/ml / 100  &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1  mM), bufor Hepes (12  mM) i insuliny (10  &mikro; g/ml).
U-87 MGATCCHTB-14Rośnie w Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka uzupełniona FBS (10%), wstrzykiwacz/paciorkowiec (100  U/ml / 100  &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1 mM) i glutamina (2  mM).
Inkubator chłodniczy CO2CARON7404-10-3
Komora z przepływem laminarnymADS LaminairBio12 i VSM12

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirson, E. D., et al. Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).
  2. Kirson, E. D., et al. Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields. Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).
  3. Gera, N., et al. Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit. PLoS One. 10 (5), (2015).
  4. Giladi, M., et al. Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields. Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).
  5. Giladi, M., et al. Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells. Sci Rep. 5, 18046(2015).
  6. Giladi, M., et al. Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo. Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).
  7. Voloshin, T., et al. Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo. Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).
  8. Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &, D. A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).
  9. Stupp, R., et al. Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).
  10. Stupp, R., et al. NovoTTF-100A versus physician's choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality. Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).
  11. Kanner, A. A., et al. Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician's choice chemotherapy. Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).
  12. Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &, J. P. Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma. Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).
  13. Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas. Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).
  14. Kim, E. H., et al. Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation. Oncotarget. , (2016).
  15. Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &, M. Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis. Oncotarget. , (2016).
  16. Pavesi, A., et al. Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application. Sci Rep. 6, 26584(2016).
  17. Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation. Cancer Med. , (2015).
  18. Kirson, E. D., et al. Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields). BMC Med Phys. 9, (2009).
  19. Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &, Y. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters. BMC Cancer. 10, 229(2010).
  20. Connelly, J., et al. Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement. BMC Cancer. 16 (1), (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

TTFields in vitrooptymalna cz stotliwolinie kom rkowe nowotworuaplikacja pola elektrycznegocytometria przep ywowatesty kolonogenneceramiczne p ytki Petriegoskanowanie cz stotliwo ciwynik leczenia

Powiązane artykuły