Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aktywność kinazy jest kluczowa dla wielu funkcji komórkowych, w tym proliferacji komórek, różnicowania, migracji i apoptozy. We wczesnym okresie rozwoju embrionalnego aktywność kinazy jest bardzo dynamiczna i szeroko rozpowszechniona w całym zarodku. Podejścia farmakologiczne i genetyczne są powszechnie stosowane do badania aktywności kinazy. Niestety, osiągnięcie doskonałej rozdzielczości przestrzennej i czasowej przy użyciu tych strategii jest trudne. Ponadto nie jest możliwe kontrolowanie aktywności kinazy w sposób odwracalny w żywych komórkach i organizmach wielokomórkowych. Takie ograniczenie pozostaje wąskim gardłem w osiągnięciu ilościowego zrozumienia aktywności kinazy podczas rozwoju i różnicowania. W niniejszej pracy przedstawiono strategię optogenetyczną, która wykorzystuje system bicystroniczny zawierający fotoaktywowane białka Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) oraz N-końcową domenę podstawowej helisy pętli oddziałującej z kryptochromem (CIBN). Odwracalna aktywacja szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) odbywa się poprzez translokację białek za pośrednictwem światła w żywych komórkach. Podejście to można zastosować do hodowli komórek ssaków i żywych zarodków kręgowców. Ten bicystroniczny system może być uogólniony w celu kontrolowania aktywności innych kinaz o podobnych mechanizmach aktywacji i może być stosowany do innych systemów modelowych.
Wprowadzenie
Czynniki wzrostu są zaangażowane w szerokie spektrum funkcji komórek, w tym proliferację, różnicowanie, migrację i apoptozę, i odgrywają kluczową rolę w wielu zdarzeniach biologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, starzeniu się i regulacji stanu psychicznego1,2,3,4,5. Wiele czynników wzrostu sygnalizuje poprzez złożone wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne. Te zdarzenia sygnalizacyjne są często obsługiwane przez odwracalną fosforylację białek w precyzyjnie regulowany sposób6
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz University of Illinois Department of Animal Resources (DAR).
1. Optogenetyczna indukcja lokalizacji białek w hodowli ssaczych komórek BHK21
UWAGA: Kroki 1.1-1.3 opisują metodę przygotowania komory do hodowli komórek przeznaczonej do obrazowania z użyciem obiektywów o dużym powiększeniu (np. 63X lub 100X), które zazwyczaj charakteryzują się krótką odległością roboczą. Obiektywy te wymagają zastosowania cienkiej szklanej lamielki (np. #1.5, grubość 170....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosunkowa ekspresja par białek fotoaktywacyjnych: Rysunek 1A przedstawia projekt bicistronowego konstruktu optogenetycznego CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (oznaczanego jako CRY2-2A-2CIBN), opartego na peptydzie 2A teschowirusa świńskiego-1 (P2A), który wykazuje najwyższą wydajność pomijania rybosomu spośród linii komórkowych ssaków42. W poprzednich badaniach ustalono, że optymalny stosunek CIBN-GFP-CaaX:CRY2-mCherry-Raf1 wyn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas budowy kasetonu należy zmierzyć moc poszczególnych diod LED. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, moc wyjściowa może się różnić między poszczególnymi diodami LED ze względu na różnice produkcyjne. Wybierz zestaw diod LED, które mają moc wyjściową w granicach 10% od siebie. Liczba diod LED, rezystor ograniczający prąd i pobór mocy mogą być modyfikowane dla różnych typów pojemników do hodowli komórkowych (np. płytka 6-dołkowa lub 24-dołkowa). 24 godziny oświetlenia światłem o mocy 0,2 mW/c.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez University of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC) oraz National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełko nakrywkowe | VWR | 48393 230 | Podłoże do obrazowania żywych komórek |
| Uchwyt szkiełka nakrywkowego | Nowości Dostawa | 6817B | Uchwyt do szkiełek nakrywkowych |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych |
| Kwas borowy | Sigma-Aldrich | B6768-500G | Do wytwarzania buforu PLL |
| Tetraboran disodowy | Sigma-Aldrich | 71996-250G | Do wytwarzania Bufor PLL |
| Zlewka plastikowa | Nalgene | 1201-1000 | Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | Do regulacji pH |
| Bromek poli-L-lizyny | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | Do powlekania szkiełka nakrywkowego |
| Woda uzdatniona dietylopirowęglanem (DEPC) | ThermoFisher Scientific | 750024 | Do przygotowania DNA |
| Kleszcze do szkła nakrywkowego | Ted Pella | 5645 | Obsługa szkła nakrywkowego |
| Naczynie na sztućce Thermofisher | 12565321 | Naczynie do hodowli komórkowych | |
| Sterylne probówki wirówkowe | ThermoFisher | 12-565-271 | Przechowywanie buforowe |
| Odczynnik do transfekcji | ThermoFisher | R0534 | Transfekcja |
| CO2-independent ThermoFisher | 18045088 | Do obrazowania żywych komórek | |
| Polidimetylosiloksan (PDMS) | Ellsworth Kleje | 184 SIL ELAST KIT 0,5 kg | Forma komory komórkowej |
| Zestaw plazmidowy Maxiprep | Qiagen | 12965 | Preparat plazmidowy |
| Pożywka DMEM | ThermoFisher | 11965-084 | Pożywka do hodowli komórek |
| Składnik F12K ThermoFisher | 21127022 | Składnik pożywki do hodowli komórek | |
| Surowica dla koni | ThermoFisher | 16050122 | Składnik pożywki do hodowli komórek |
| Płodowa surowica bydlęca | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Pożywka do hodowli komórek Składnik |
| Penicylina-Streptomycyna-Glutamina | ThermoFisher | 10378016 | Pożywka do hodowli komórek |
| Trypsyna (0,25%), czerwień fenolowa | ThermoFisher Scientific | 15050065 | Do dysocjacji komórek ssaków |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Do przygotowania DNA |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | Do buforu zarodkowego |
| Monohydrat chlorowodorku L-cysteiny | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Preparat oocytów |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | Do linearyzacji plazmidów |
| Dnaza I | ThermoFisher | AM2222 | Do usuwania matrycy DNA w teście transkrypcyjnym in vitro |
| Materiały o dopasowanym indeksie (olejek immersyjny) | Thorlabs | MOIL-20LN | Do dopasowania indeksu między substratem próbki a obiektywem |
| Niebieska dioda LED | Adafruit | 301 | Źródło światła do stymulacji optogenetycznej |
| Zestaw rezystorów | Amazon | EPC-103 | Rezystor ograniczający prąd |
| Skrzynki aluminiowe | Kaseton świetlny BUD Industries | AC-401 | |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | Do wykonania tablicy LED |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | Do wykonania |
| modułu przekaźnika | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | Do przerywanego sterowania oświetleniem |
| Zasilacz prądu stałego | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Zasilacz do LED |
| Silicon Moc Głowica | Thorlabs | S121C | Do pomiaru natężenia światła |
| Miernik mocy | Thorlabs | PM100D | Do pomiaru natężenia światła |
| Mikroskop | Leica Biosystems | DMI8 | Do obrazowania żywych komórek |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | ThermoFisher | 1300 Series A2 | Do obsługi komórek ssaków |
| Inkubator CO2 | ThermoFisher | Isotemp | Do hodowli komórek ssaków |
| Mikroskop stereoskopowy | Leica | M60 | Do mikromanipulacji zarodkami |
| Mikrowtryskiwacz | Narishige | IM300 | Do mikroiniekcji zarodków Ściągacz |
| do mikropipet | Sutter Instruments | P87 | Ściągacz igieł |
| in vitro zestaw do transkrypcji | ThermoFisher | AM1340 | Do transkrypcji in vitro. W skład zestawu wchodzi woda wolna od nukleaz, SP6 RNA Polimeraza, mieszanina rybonukleotydów, analog kapu, roztwór do wytrącania chorydu litu i kolumna wirowa |
| Zestaw do oczyszczania RNA | Qiagen | 74104 | Kolumna wirowa z membraną krzemionkową do oczyszczania zsyntetyzowanego RNA |
| Piec konwekcyjny | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | Utwardzanie PDMS |
| Mieszalnik odśrodkowy i pojemnik teflonowy | THINKY | AR310 | Do mieszania PDMS |
| Wafel | krzemowy UniversityWafer | 452 | Baza do wykonywania urządzeń PDMS |
| Ostrze | Techni Edge | 01-801 | Do cięcia PDMS |
| Szkło kapilarne | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Do produkcji igieł iniekcyjnych. nbsp; |
Bibliografia
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 39....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
