Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55823

⸱

15 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Streszczenie

Aktywność kinazy jest kluczowa dla wielu funkcji komórkowych, w tym proliferacji komórek, różnicowania, migracji i apoptozy. We wczesnym okresie rozwoju embrionalnego aktywność kinazy jest bardzo dynamiczna i szeroko rozpowszechniona w całym zarodku. Podejścia farmakologiczne i genetyczne są powszechnie stosowane do badania aktywności kinazy. Niestety, osiągnięcie doskonałej rozdzielczości przestrzennej i czasowej przy użyciu tych strategii jest trudne. Ponadto nie jest możliwe kontrolowanie aktywności kinazy w sposób odwracalny w żywych komórkach i organizmach wielokomórkowych. Takie ograniczenie pozostaje wąskim gardłem w osiągnięciu ilościowego zrozumienia aktywności kinazy podczas rozwoju i różnicowania. W niniejszej pracy przedstawiono strategię optogenetyczną, która wykorzystuje system bicystroniczny zawierający fotoaktywowane białka Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) oraz N-końcową domenę podstawowej helisy pętli oddziałującej z kryptochromem (CIBN). Odwracalna aktywacja szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) odbywa się poprzez translokację białek za pośrednictwem światła w żywych komórkach. Podejście to można zastosować do hodowli komórek ssaków i żywych zarodków kręgowców. Ten bicystroniczny system może być uogólniony w celu kontrolowania aktywności innych kinaz o podobnych mechanizmach aktywacji i może być stosowany do innych systemów modelowych.

Wprowadzenie

Czynniki wzrostu są zaangażowane w szerokie spektrum funkcji komórek, w tym proliferację, różnicowanie, migrację i apoptozę, i odgrywają kluczową rolę w wielu zdarzeniach biologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, starzeniu się i regulacji stanu psychicznego1,2,3,4,5. Wiele czynników wzrostu sygnalizuje poprzez złożone wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne. Te zdarzenia sygnalizacyjne są często obsługiwane przez odwracalną fosforylację białek w precyzyjnie regulowany sposób6,7. W związku z tym zrozumienie wyników sygnalizacji kinaz białkowych, które są odpowiedzialne za fosforylację białek, ma fundamentalne znaczenie.

Różne czynniki wzrostu działają poprzez dość powszechną wewnątrzkomórkową sieć sygnalizacyjną, mimo że stymulują różne reakcje komórkowe8,9. Typowe wewnątrzkomórkowe mediatory receptorowych kinaz tyrozynowych obejmują Ras, Raf, kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK)/kinazę ERK (MEK), kinazę fosfoinozytolu 3 (PI3K), Akt i fosfolipazę C gamma (PLCγ)10,11. Coraz więcej dowodów sugeruje, że różnorodność i swoistość sygnalizacji zależą od przestrzennej i czasowej regulacji aktywności sygnalizacyjnej12. Na przykład w komórkach guza chromochłonnego szczura (PC12) stymulacja naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), która powoduje proliferację komórek, przejściowo aktywuje szlak ERK9. Z drugiej strony, stymulacja czynnikiem wzrostu nerwów (NGF), który prowadzi do różnicowania komórek, aktywuje szlak ERK w sposób trwały9,13. W hodowanych neuronach hipokampa szczurów przejściowa sygnalizacja przez neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) sprzyja pierwotnemu wzrostowi neurytów, podczas gdy trwała sygnalizacja prowadzi do zwiększonego rozgałęziania się neurytów14. Podczas wczesnego rozwoju embrionalizowanego aktywność fosforylowanego ERK jest dynamiczna czasowo i jest szeroko rozpowszechniona w całym embryo6. Niedawne genetyczne badanie przesiewowe przeprowadzone podczas wczesnej embriogenezy Xenopus wykazało, że kaskady sygnalizacyjne ERK i Akt, dwa dalsze szlaki głównego czynnika wzrostu, wykazują profile aktywacji specyficzne dla danego etapu7. W związku z tym zrozumienie wyników sygnalizacji kinazy wymaga narzędzi, które mogą badać przestrzenne i czasowe cechy aktywności kinazy z wystarczającą rozdzielczością.

Konwencjonalne eksperymentalne podejścia do badania dynamicznej natury transdukcji sygnału podczas rozwoju nie mają pożądanej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Na przykład podejścia farmakologiczne wykorzystują małe cząsteczki chemiczne lub biologiczne do stymulowania lub tłumienia transdukcji sygnału w komórkach i tkankach. Dyfuzyjny charakter tych małych cząsteczek sprawia, że ograniczenie ich działania do określonego obszaru zainteresowania jest wyzwaniem15. Podejścia genetyczne (np. transgeneza, system Cre-Lox lub mutageneza) często prowadzą do nieodwracalnej aktywacji lub represji ekspresji docelowego genu lub aktywności białka16,17,18. System Tet-On/Tet-Off19 oferuje lepszą kontrolę czasową transkrypcji genów, ale brakuje mu ścisłej kontroli przestrzennej, ponieważ opiera się na dyfuzji tetracykliny. Ostatnie osiągnięcia w zakresie chemicznie indukowanej dimeryzacji białek20 lub foto-uncaging21,22,23,24 znacznie poprawiły czasową kontrolę sieci sygnalizacyjnych. Kontrola przestrzenna pozostaje jednak trudna ze względu na dyfuzyjny charakter chemikaliów przechowywanych w klatkach.

Ostatnio pojawiające się podejścia optogenetyczne, które wykorzystują moc światła do kontrolowania interakcji białko-białko, pozwalają na modulację szlaków sygnałowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną, jak również odwracalnością. Krótko po początkowym sukcesie w kontrolowaniu wypalania neuronów25,26,27, optogenetyka została rozszerzona o kontrolę innych procesów komórkowych, takich jak transkrypcja genów, translacja, migracja komórek, różnicowanie i apoptoza28,29,30,31,32,33,34. Niedawno opracowano strategię wykorzystującą fotoaktywowaną parę białek Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) i N-końcową domenę kryptochromowej helisy zasady interakcji kryptochromowej (CIBN) w celu kontrolowania aktywności kinazy Raf1 w komórkach ssaków i zarodkach Xenopus35. CRY2 wiąże się z CIBN po stymulacji światłem niebieskim, a kompleks białkowy CRY2/CIBN dysocjuje spontanicznie w ciemności34. Światło niebieskie wzbudza kofaktor CRY2, dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), co prowadzi do zmiany konformacyjnej CRY2, a następnie jego wiązania się z CIBN. Konsekwentnie aktywne (W374A) i ubogie w flawiny (D387A) mutanty CRY2 mogą być wytwarzane poprzez mutacje w kieszeni wiążącej FAD: mutantCRY2 W374A wiąże się z CIBN niezależnie od światła, podczas gdy mutant CRY2D387A nie wiąże się z CIBN pod wpływem stymulacji światłem niebieskim36,37. System optogenetyczny opisany w tym protokole wykorzystuje CRY2 i CIBN typu dzikiego do indukowania aktywacji Raf1 za pośrednictwem translokacji białek w żywych komórkach. Wiadomo, że rekrutacja Raf1 przez błonę zwiększa jego aktywność38. W tym systemie tandemowy moduł CIBN jest zakotwiczony w błonie plazmatycznej, a CRY2-mCherry jest połączony z N-końcem Raf135. Przy braku światła niebieskiego CRY2-mCherry-Raf1 pozostaje w cytoplazmie, a Raf1 jest nieaktywny. Stymulacja światłem niebieskim indukuje wiązanie CRY2-CIBN i rekrutuje Raf1 do błony komórkowej, gdzie Raf1 jest aktywowany. Aktywacja RAF stymuluje kaskadę sygnalizacyjną Raf/MEK/ERK. Zarówno białka fuzyjne CRY2, jak i CIBN są kodowane w bicystronicznym systemie genetycznym. Strategię tę można uogólnić w celu kontrolowania innych kinaz, takich jak Akt, których stan aktywacji może być również włączony przez translokację białek w komórkach39. W pracy przedstawiono szczegółowe protokoły realizacji tej strategii optogenetycznej w hodowlach komórek ssaków i organizmach wielokomórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz University of Illinois Department of Animal Resources (DAR).

1. Optogenetyczna indukcja lokalizacji białek w hodowli ssaczych komórek BHK21

UWAGA: Kroki 1.1-1.3 opisują metodę przygotowania komory do hodowli komórek przeznaczonej do obrazowania z użyciem obiektywów o dużym powiększeniu (np. 63X lub 100X), które zazwyczaj charakteryzują się krótką odległością roboczą. Obiektywy te wymagają zastosowania cienkiej szklanej lamielki (np. #1.5, grubość 170 µm) jako podłoża do obrazowania. Alternatywnie można zastosować szkiełko lub szalkę do hodowli komórek z szklanym dnem. W takim przypadku można pominąć kroki 1.1-1.3.

  1. Czyszczenie szkiełek podstawowych
    1. Umieścić 30 szkiełek podstawowych w uchwycie do szkiełek.
    2. Do plastikowego zlewki o pojemności 600 mL dodać 20 g detergentu i 400 mL ciepłej wody z kranu. Postawić zlewkę na mieszadle magnetycznym i mieszać do całkowitego rozpuszczenia detergentu. Pianę usunąć za pomocą ręcznika papierowego.
    3. Dno szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm wykorzystać jako dystans od mieszadła magnetycznego oraz jako podkładkę pod uchwyt do szkiełek. Aby zapewnić odpowiedni przepływ podczas procesu czyszczenia, wykonać w szalce Petriego 3-4 otwory odpływowe.
    4. W celu wykonania otworów odpływowych należy rozgrzać lutownicę i wypalić otwory w plastiku w dygestorium.
      OSTROŻNIE: Nie dotykać rozgrzanej lutownicy gołymi rękami.
    5. Umieścić uchwyt do szkiełek na szalce Petriego w zlewce. Mieszać przez 2 h lub przez noc w temperaturze pokojowej.
    6. Przepłukać trzy razy 500 mL wody DI w zlewce o pojemności 1 000 mL. Roztwór detergentu można wykorzystać ponownie.
    7. Pobierać poszczególne szkiełka za pomocą pęsety. Zanurzyć szkiełka w etanolu 95% (190-proof) na 1 min.
    8. Osuszyć szkiełka w sterylnej komorze z laminarem. Przechowywać szkiełka w sterylnym plastikowym pojemniku do momentu użycia.
  2. Przygotowanie szkiełek podstawowych powlekanych poli-L-lizyną (PLL)
    1. Przygotować 0,1 M bufor boranowy, rozpuszczając 1,24 g kwasu borowego i 1,9 g tetraboranu sodu w 400 mL wody. Dostosować pH do 8,5 za pomocą 10 M NaOH.
    2. Rozpuścić PLL w buforze boranowym do stężenia końcowego 1 mg/mL. Rozdzielić roztwór PLL do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL.
    3. Dodać 50 mL roztworu powlekającego PLL do 10-cm naczynia do hodowli tkanek. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby ogrzać roztwór PLL.
    4. Otworzyć pojemnik ze szkiełkami (krok 1.1.8) w sterylnej komorze z laminarem.
    5. Zanurzać oczyszczone szkiełka pojedynczo w uprzednio ogrzanym roztworze PLL w naczyniu do hodowli tkanek. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza, aby wszystkie powierzchnie zostały zanurzone.
    6. Umieścić naczynie ze szkiełkiem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na noc. Wyjąć każde szkiełko i umieścić je w sterylnym uchwycie do szkiełek. Przepłukać trzy razy autoklawowaną wodą ultrapure (rezystywność 18,2 MΩ·cm) w zlewce o pojemności 1 000 mL w sterylnej komorze z laminarem.
    7. Osuszyć szkiełka w uchwycie w sterylnej komorze z laminarem. Przechowywać szkiełka w sterylnym plastikowym pojemniku do momentu użycia.
  3. Montaż komór do hodowli komórkowych z polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. W plastikowym pojemniku odważyć 40 g bazy PDMS i dodać 4 g czynnika sieciującego, aby uzyskać stosunek wagowy PDMS do czynnika sieciującego 10:1 w/w. Wymieszać PDMS i czynnik sieciujący, mieszając końcówką pipety przez 2 min. Alternatywnie można użyć mieszalnika odśrodkowego.
    2. Używając zlewki o średnicy 4 cali jako szablonu, wykonać uchwyt z kawałka folii aluminiowej. Umieścić uchwyt z folii aluminiowej w szalce Petriego o średnicy 15 cm. Wewnątrz uchwytu z folii aluminiowej umieścić 4-calowy wafelek krzemowy.
    3. Wlać wymieszany roztwór PDMS do uchwytu. Używając cienkiej szklanej rurki, delikatnie dotknąć krawędzi wafla. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod waflem.
    4. Włożyć szalkę Petriego 15 cm do komory próżniowej, aby odgazować roztwór PDMS. Kontynuować odgazowywanie przez około 20 min, aż przestaną powstawać pęcherzyki. W tym czasie rozgrzać piec konwekcyjny do 65 °C.
    5. Ostrożnie umieścić szalkę Petriego 15 cm w piecu. Inkubować przez 2 h.
    6. Wyjąć płytkę z pieca. Używając szklanej rurki, delikatnie dotknąć krawędzi PDMS, aby upewnić się, że nastąpiło całkowite sieciowanie. Jeśli nie, inkubować dłużej, aż PDMS stanie się ciałem stałym i przestanie być lepki.
    7. Usunąć folię aluminiową z płytki i odkleić ją od wafla krzemowego. Zaczynając od krawędzi, ostrożnie odkleić utwardzony PDMS od wafla krzemowego.
      OSTROŻNIE: Unikać stosowania zbyt dużej siły, ponieważ może to doprowadzić do pęknięcia wafla.
    8. Przyciąć PDMS żyletką na prostokątne kawałki o wymiarach 20 mm x 30 mm, aby pasowały do szkiełka podstawowego 24 mm x 40 mm.
    9. Używając dłuta lub noża, wyciąć prostokątny otwór o wymiarach 10 mm x 20 mm ze środka każdego kawałka PDMS.
    10. Oczyścić komory PDMS zgodnie z protokołem czyszczenia detergentem opisanym w kroku 1.1.
    11. Osuszyć komory PDMS w czystej komorze z laminarem. Umieścić suche komory w autoklawowalnym pojemniku przykrytym folią aluminiową.
    12. Zautoklawować pojemnik w cyklu grawitacyjnym (121 °C, 15 psi) przez 30 min i przechowywać pojemnik w temperaturze pokojowej.
  4. Hodowla i transfekcja komórek BHK21
    1. Przygotować 500 mL pożywki do hodowli komórek BHK21, mieszając 445 mL DMEM z 50 mL FBS i 5 mL 100× Penn-Strep-Glutamine (10 000 U/mL penicyliny, 10 mg/mL streptomycyny i 29,2 mg/mL L-glutaminy). Upewnić się, że końcowe stężenie FBS wynosi 10%.
    2. Odlać 10 mL pożywki niezależnej od CO2 bez HEPES do obrazowania żywych komórek.
      UWAGA: Pożywka niezależna od CO2 wspomaga wzrost komórek bez użycia inkubatora CO2 i jest idealna do obrazowania komórek w warunkach atmosferycznych. Szczegółowe informacje znajdują się w Liście Materiałów. Podobnie jak w przypadku linii komórkowej BHK21, inne rodzaje komórek ssaków powinny również dawać podobne wyniki.
    3. Złożyć urządzenie do hodowli komórkowej, kładąc jedną autoklawowaną, sterylną komorę PDMS (krok 1.3) na sterylnym szkiełku powlekanym PLL (krok 1.2) w sterylnej komorze z laminarem.
    4. Umieścić każde urządzenie w sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm.
    5. Użyć 0,5 mL 0,25% trypsyny, aby odkleić komórki z jednej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli tkanek. Policzyć gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Wysiać 20 000 komórek BHK21 do komory (około 10 000 komórek/cm2) w 200 µL pożywki do hodowli komórkowych.
    6. Przygotować plazmid DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidów (patrz Lista Materiałów).
      UWAGA: Projekt i funkcjonalność CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX przedstawiono na Rysunku 1A-1B.
    7. Dwadzieścia cztery (24) godziny po wysianiu komórek, przeprowadzić transfekcję komórek 50-100 ng plazmidu CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX zgodnie z protokołem producenta.
    8. Trzy (3) godziny po transfekcji wymienić pożywkę na 200 µL świeżej pożywki hodowlanej (krok 1.4.1) i pozostawić komórki do regeneracji przez noc, inkubując hodowlę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
  5. Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek
    1. Włączyć komputer, źródło światła, mikroskop i kamerę. W dalszej części protokołu używać konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (wyposażonego w obiektyw imersyjny 100X).
      UWAGA: Można również użyć odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego.
    2. Zastąpić pożywkę do hodowli komórkowych 200 µL pożywki niezależnej od CO2.
    3. Skonfigurować protokół akwizycji danych przed umieszczeniem komórek w mikroskopie. Do stymulacji optogenetycznej używać kanału FITC z wzbudzeniem 488 nm. Do lokalizacji transfekowanych komórek i śledzenia lokalizacji komórkowej białka znakowanego mCherry używać kanału TRITC z wzbudzeniem 561 nm.
    4. Ustawić wzmocnienie (gain) dla kanałów FITC i TRITC odpowiednio na 120 i 200. Użyć czasu ekspozycji piksela 2,2 µs i rozmiaru 512 x 512 pikseli.
    5. Zmierzyć moc światła 488 nm, umieszczając miernik mocy blisko okna obiektywu. Całkowita moc 2 µW (około 10 000 W/cm2 w ognisku) jest wystarczająca do indukowania asocjacji CIBN-CRY2PHR.
    6. Ustawić akwizycję czasową z odstępem 5 s i całkowitym czasem akwizycji 2 min.
    7. Nanieść odpowiedni materiał dopasowujący współczynnik załamania (olej imersyjny) na okno obiektywu. Użyć trybu kontrastu fazowego, aby ustawić ostrość na komórkach na powierzchni szkiełka.
    8. Zlokalizować transfekowaną komórkę w świetle 561 nm, przesuwając stolik mikroskopu.
      OSTROŻNIE: Unikać używania niebieskiego światła na tym etapie, ponieważ aktywuje ono asocjację między białkami fotoaktywowalnymi.
    9. Po zlokalizowaniu transfekowanej komórki rozpocząć akwizycję danych.
      UWAGA: Pomyślnie transfekowane komórki powinny wykazywać fluorescencję w obu kanałach: FITC (od 2CIBN-GFP-CaaX) i TRITC (od CRY2-mCherry-Raf1) (Rysunek 1C-D).
    10. Nagrać serię obrazów z sygnaturą czasową w obu kanałach FITC i TRITC (Rysunek 1D).
    11. Aby zbadać spontaniczną dysocjację kompleksu białkowego CRY2-CIBN, nagrać kolejną serię czasową w samym kanale Txred przez 20 min, z odstępem 30 s.
    12. Zapisać obrazy z sygnaturą czasową do analizy danych.
  6. Analiza obrazów
    1. Otworzyć obrazy w oprogramowaniu do analizy obrazu, które pozwala na ekstrakcję intensywności z obrazu40.
    2. Wybrać dwa reprezentatywne migawki: jedną przed ekspozycją na niebieskie światło i drugą po ekspozycji na niebieskie światło.
    3. Narysować linię przez komórkę, obejmującą tło, błonę plazmatyczną i cytoplazmę. Wyznaczyć profil intensywności wzdłuż tej linii. Zapisać wartości i narysować wykres, aby porównać różnice przed i po ekspozycji na światło (Rysunek 1D).
    4. Aby przeanalizować kinetykę asocjacji białek, wybrać jeden reprezentatywny obszar zainteresowania (ROI) w błonie plazmatycznej, jeden ROI w cytoplazmie i jeden ROI w tle.
    5. Wyznaczyć średnie intensywności błony plazmatycznej (IPM), cytoplazmy (ICYT) i tła (IBKD) dla stosu obrazów.
    6. Obliczyć stosunek intensywności błonowej do cytozolowej dla każdego obrazu za pomocą następującego równania:
      Wzór na obliczenie stosunku, schemat pomiaru intensywności fluorescencji.
    7. Narysować wykres stosunku w funkcji czasu i określić kinetykę wiązania lub dysocjacji CRY2-CIBN (Rysunek 1E-F).

2. Konstrukcja macierzy LED do długotrwałej stymulacji światłem w inkubatorze CO2

UWAGA: Ogólny schemat układu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 2A.

  1. Przygotuj matrycę LED, wkładając 12 niebieskich diod LED do dwóch płytek stykowych i podłączając rezystory ograniczające prąd.
    UWAGA: Przy zasilaczu 30 V można połączyć szeregowo cztery diody LED, a ich jasność można regulować za pomocą rezystora ograniczającego prąd.
  2. Umieść płytki stykowe w aluminiowej obudowie.
    UWAGA: Wysokość aluminiowej obudowy powinna wynosić 2 in. Wysokość ta jest optymalna do naświetlania 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, ponieważ rozmiar rozproszonej plamy światła odpowiada rozmiarowi pojedynczego dołka.
  3. Użyj dwóch metalowych przewodów do podłączenia do zasilacza. Upewnij się, że długość przewodu jest wystarczająca, gdy pudełko świetlne znajduje się w inkubatorze CO2.
  4. Jako pokrywę pudełka świetlnego zastosuj przezroczysty dyfuzor światła (Rycyna 2C).
  5. Zkalibruj moc wyjściową każdej diody LED dla zakresu napięć wejściowych. Do testu różnicowania komórek PC12 trwającego 24 h zastosuj moc 0,2 mW/cm2. Do testów z żywymi embrionami Xenopus lub eksplantami zastosuj moc 5 mW/cm2.

3. Optogenetyczna indukcja różnicowania komórek PC12

  1. Hodowla i transfekcja komórek
    1. Przygotować 500 mL pożywki do hodowli komórek feochromocytomy szczura (PC12), mieszając 407,5 mL F12K z 75 mL surowicy konia + 12,5 mL FBS + 5 mL 100× Penn-Strep-Glutamine (stężenia końcowe surowicy konia i FBS: odpowiednio 15% i 2,5%). Przygotować pożywkę z niską zawartością surowicy, mieszając 1 objętość pożywki pełnej z 99 objętościami pożywki F12K.
    2. Wysiać komórki PC12 na płytkę 12-dołkową z gęstością 300 000 komórek/dołek lub 75 000 komórek/cm2.
    3. Wykonać transfekcję komórek konstruktem CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 h po wysianiu komórek (analogicznie do kroku 1.4.7). Użyć 1,2 µg DNA na każdy dołek. Pozostawić komórki do regeneracji przez noc w pożywce hodowlanej w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2. Sprawdzić wydajność transfekcji 16 h po procesie.
      UWAGA: Należy osiągnąć wydajność transfekcji na poziomie 30-50%, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek.
    4. Wymienić pożywkę na pożywkę z niską zawartością surowicy 24 h po transfekcji. Użyć 1 mL pożywki na dołek płytki 12-dołkowej.
  2. Indukowana światłem dyferencjacja komórek PC12
    1. Umieścić matrycę LED w inkubatorze CO2. Podłączyć ją do zasilacza za pomocą pary przewodów. Ustawić moc LED na 0,2 mW/cm2. Umieścić płytkę 12-dołkową zawierającą transfektowane komórki PC12 (krok 3.1.3) na oknie matrycy LED. Stosować ciągłe naświetlanie przez 24 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2.
  3. Obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek
    1. Postępować zgodnie z krokami 1.5.1-1.5.4 w celu przygotowania mikroskopu i próbek.
    2. Skonfigurować akwizycję danych w trybie pojedynczego zdjęcia. Ustawić czas 200 ms dla kanału GFP oraz Txred.
    3. Przechwycić obrazy transfektowanych komórek w kanałach GFP i Txred. Zarejestrować około 200 komórek dla każdego warunku. Zapisać pliki do analizy danych.
  4. Analiza obrazu
    1. Obliczyć procent zdyferencjowanych komórek w stosunku do całkowitej liczby komórek transfektowanych.
    2. Do zliczenia komórek użyć dowolnego modułu zliczania komórek w oprogramowaniu do analizy obrazu.
    3. Ręcznie zliczyć komórki zdyferencjowane.
      UWAGA: Komórki zdyferencjowane definiuje się jako takie, w których co najmniej jeden neuryt jest wyraźnie dłuższy niż ciało komórki (Rycina 3A-3B).
    4. Powtórzyć krok 3.4.3 dla komórek niezdyferencjowanych.
    5. Obliczyć współczynnik dyferencjacji za pomocą następującego równania:
      Formuła równowagi statycznej, Współczynnik = # zdyferencjowanych komórek / całkowita liczba, schemat równania.

4. Optogenetyczna kontrola aktywności kinazy w embrionach Xenopus

  1. Przygotowanie buforów
    1. Przygotować 1 L 1x zmodyfikowanego roztworu Ringera dla komórek Marca (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 oraz 5 mM HEPES; pH 7,5.
  2. Przygotowanie mRNA
    1. Przeprowadzić trawienie DNA plazmidu CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX (2 µg) za pomocą 1 µL enzymu ApaI (50 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 2 h.
    2. Wytrącić zlinearyzowane DNA w 60 µL 100% etanolu. Wirować przy 12 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu osadzenia DNA. Ostrożnie usunąć nadsącz i ponownie przemyć osad 60 µL 70% etanolu. Wirować przy 12 000 × g przez kolejne 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć nadsącz i resuspendować osad DNA w 6 µL wody H2O wolnej od RNaz.
    3. Przeprowadzić transkrypcję in vitro poprzez inkubację 1 µg zlinearyzowanego DNA z 2 µL dostarczonej polimerazy RNA SP6, mieszaniną rybonukleotydów (10 mM ATP, CTP i UTP; 2 mM GTP oraz 8 mM analogu czapeczki) i 20 µL wody wolnej od nukleaz w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    4. Usunąć matrycę DNA poprzez trawienie nukleazą DNase I w 37 °C przez co najmniej 15 min i oczyścić syntetyzowane RNA za pomocą kolumny wirówkowej z membraną krzemionkową.
    5. Zatrzymać reakcję i wytrącić RNA, dodając 30 µL wody wolnej od nukleaz i 30 µL roztworu wytrącanego LiCl. Dokładnie wymieszać i chłodzić przez 30 min w -20 °C.
    6. Wirować w 4 °C przez 15 min przy 12 000 × g w celu osadzenia RNA.
    7. Ostrożnie usunąć nadsącz. Przemyć RNA raz 1 mL 70% etanolu i resuspendować w 40 µL wody wolnej od nukleaz.
    8. Nanieść 40 µL RNA na kolumnę wirówkową. Wirować w 4 °C przez 1 min przy 12 000 × g, aby usunąć nieprzyłączone nukleotydy i czapeczki.
  3. Pozyskiwanie zarodków Xenopus
    1. Postępować zgodnie z protokołem opisanym przez Sive et al.41 w celu uzyskania zarodków Xenopus.
  4. Mikroiniekcja mRNA
    1. Wykonać igły do mikroiniekcji poprzez wyciąganie kapilar szklanych w wyciągaczu kapilar. Ustawić program wyciągania na: ciepło = 355, siła wyciągania = 80, prędkość = 50 oraz czas = 100.
    2. Usunąć otoczkę galaretową z zarodków, traktując je 3% cysteiną (rozcieńczoną w 0,2x MMR).
    3. Przenieść zarodki do roztworu 3% polisukrozy i 0,5x MMR w celu mikroiniekcji. Wstrzyknąć od 500 pg do 1 ng RNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX do każdego zarodka.
      UWAGA: Iniekcja dawki przekraczającej 1 ng prowadzi do aktywacji sygnalizacji MAPK niezależnej od światła niebieskiego.
  5. Optogenna stymulacja aktywności kinazy
    1. Hodować mikroiniekcyjne zarodki w roztworze 3% polisukrozy i 0,5x MMR w temperaturze pokojowej, aż osiągną stadium środkowej gastruli (stadium 12). Następnie hodować zarodki w roztworze 0,2x MMR.
    2. Przenieść zarodki lub eksplantaty do płytki 12-dołkowej. Umieścić płytkę 12-dołkową na własnej matrycy LED (krok 2.5) w celu naświetlania światłem niebieskim (475 nm).
    3. Umieścić lustro na górnej części płytki 12-dołkowej, aby zapewnić pełne oświetlenie zarodków lub eksplantatów światłem niebieskim.
    4. Ustawić moc światła niebieskiego na 5 mW/cm2.
      UWAGA: Naświetlanie światłem niebieskim można przeprowadzić w dowolnym wybranym czasie, w 3% polisukrozie, roztworze 0,5x MMR lub roztworze 0,2x MMR.
    5. Pozyskać zarodki w dowolnie wybranym czasie. Wykorzystać je do analizy histologicznej, Western-blot lub analizy ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ratiometryczna ekspresja par białek fotoaktywowalnych: Rycina 1A przedstawia konstrukcję bicistronowego konstruktu optogenetycznego CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (oznaczanego jako CRY2-2A-2CIBN), opartego na peptydzie 2A (P2A) z porcine teschovirum-1, który wykazuje najwyższą wydajność pomijania rybosomu wśród linii komórek ssaków42. W poprzednich badaniach ustalono, że optymalny stosunek CIBN-GFP-CaaX:CRY2-mCherry-Raf1 wyno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas budowy kasetonu należy zmierzyć moc poszczególnych diod LED. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, moc wyjściowa może się różnić między poszczególnymi diodami LED ze względu na różnice produkcyjne. Wybierz zestaw diod LED, które mają moc wyjściową w granicach 10% od siebie. Liczba diod LED, rezystor ograniczający prąd i pobór mocy mogą być modyfikowane dla różnych typów pojemników do hodowli komórkowych (np. płytka 6-dołkowa lub 24-dołkowa). 24 godziny oświetlenia światłem o mocy 0,2 mW/c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez University of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC) oraz National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkowe VWR48393 230Podłoże do obrazowania żywych komórek
Uchwyt szkiełka nakrywkowego Nowości Dostawa6817BUchwyt do szkiełek nakrywkowych
Detergent ThermoFisher16 000 104Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Kwas borowy Sigma-AldrichB6768-500GDo wytwarzania buforu PLL
Tetraboran disodowySigma-Aldrich71996-250GDo wytwarzania  Bufor PLL
Zlewka plastikowaNalgene1201-1000Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Wodorotlenek sodu Sigma-Aldrich221465-2.5KGDo regulacji pH
Bromek poli-L-lizynySigma-AldrichP1274-500MGDo powlekania szkiełka nakrywkowego
Woda uzdatniona dietylopirowęglanem (DEPC)ThermoFisher Scientific750024Do przygotowania DNA
Kleszcze do szkła nakrywkowegoTed Pella5645Obsługa szkła nakrywkowego
Naczynie na sztućce Thermofisher12565321Naczynie do hodowli komórkowych
Sterylne probówki wirówkoweThermoFisher12-565-271Przechowywanie buforowe
Odczynnik do transfekcjiThermoFisherR0534Transfekcja
CO2-independent ThermoFisher18045088Do obrazowania żywych komórek
Polidimetylosiloksan (PDMS)Ellsworth Kleje184 SIL ELAST KIT 0,5 kgForma komory komórkowej
Zestaw plazmidowy MaxiprepQiagen12965Preparat plazmidowy
Pożywka DMEMThermoFisher11965-084Pożywka do hodowli komórek
Składnik F12K ThermoFisher21127022Składnik pożywki do hodowli komórek
Surowica dla koniThermoFisher16050122Składnik pożywki do hodowli komórek
Płodowa surowica bydlęcaSigna-Aldrich12303C-500 mLPożywka do hodowli komórek Składnik
Penicylina-Streptomycyna-GlutaminaThermoFisher10378016Pożywka do hodowli komórek
Trypsyna (0,25%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific15050065 Do dysocjacji komórek ssaków
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Do przygotowania DNA
Ficoll PM400GE Heathcare Life Sciences17-5442-02Do buforu zarodkowego
Monohydrat chlorowodorku L-cysteinySigma-Aldrich1.02839.0025Preparat oocytów
ApaIThermoFisherFD1414Do linearyzacji plazmidów
Dnaza IThermoFisherAM2222Do usuwania matrycy DNA w teście transkrypcyjnym in vitro
Materiały o dopasowanym indeksie (olejek immersyjny)ThorlabsMOIL-20LNDo dopasowania indeksu między substratem próbki a obiektywem
Niebieska dioda LEDAdafruit301Źródło światła do stymulacji optogenetycznej
Zestaw rezystorówAmazonEPC-103Rezystor ograniczający prąd
Skrzynki aluminioweKaseton świetlny BUD IndustriesAC-401 
BreadBoardJekewin837654333686Do wykonania tablicy LED
Hook up WireElectronix Express27WK22SLD25Do wykonania
modułu przekaźnikaJbtekSRD-05VDC-SL-CDo przerywanego sterowania oświetleniem
Zasilacz prądu stałego TMSDCPowerSupply-LW-(PS-305D)Zasilacz do LED
Silicon  Moc  GłowicaThorlabsS121CDo pomiaru natężenia światła
Miernik mocyThorlabsPM100D Do pomiaru natężenia światła
MikroskopLeica BiosystemsDMI8Do obrazowania żywych komórek
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermoFisher1300 Series A2Do obsługi komórek ssaków
Inkubator CO2ThermoFisherIsotempDo hodowli komórek ssaków
Mikroskop stereoskopowyLeicaM60Do mikromanipulacji zarodkami
MikrowtryskiwaczNarishigeIM300Do mikroiniekcji zarodków Ściągacz
do mikropipetSutter InstrumentsP87Ściągacz igieł
in vitro zestaw do transkrypcjiThermoFisherAM1340Do transkrypcji in vitro. W skład zestawu wchodzi woda wolna od nukleaz, SP6 RNA  Polimeraza, mieszanina rybonukleotydów, analog kapu, roztwór do wytrącania chorydu litu i kolumna wirowa   
Zestaw do oczyszczania RNAQiagen74104Kolumna wirowa z membraną krzemionkową do oczyszczania zsyntetyzowanego RNA 
Piec konwekcyjnyMTI corporation  EQ-DHG-9015Utwardzanie PDMS
Mieszalnik odśrodkowy i pojemnik teflonowyTHINKYAR310Do mieszania PDMS
Wafelkrzemowy UniversityWafer452Baza do wykonywania urządzeń PDMS 
OstrzeTechni Edge01-801Do cięcia PDMS
Szkło kapilarneSutter InstrumentsBF100-58-10Do produkcji igieł iniekcyjnych. nbsp;
LED

Bibliografia

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975(2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469(2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917(2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256(2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057(2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Strategia optogenetycznasystem CRY2 CIBNtranslokacja bia ekmikroskopia fluorescencyjnamacierz LEDanaliza ekspresji gen w
Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.