Artykuł metodologiczny

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

DOI:

10.3791/55823

⸱

15 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność kinazy jest kluczowa dla wielu funkcji komórkowych, w tym proliferacji komórek, różnicowania, migracji i apoptozy. We wczesnym okresie rozwoju embrionalnego aktywność kinazy jest bardzo dynamiczna i szeroko rozpowszechniona w całym zarodku. Podejścia farmakologiczne i genetyczne są powszechnie stosowane do badania aktywności kinazy. Niestety, osiągnięcie doskonałej rozdzielczości przestrzennej i czasowej przy użyciu tych strategii jest trudne. Ponadto nie jest możliwe kontrolowanie aktywności kinazy w sposób odwracalny w żywych komórkach i organizmach wielokomórkowych. Takie ograniczenie pozostaje wąskim gardłem w osiągnięciu ilościowego zrozumienia aktywności kinazy podczas rozwoju i różnicowania. W niniejszej pracy przedstawiono strategię optogenetyczną, która wykorzystuje system bicystroniczny zawierający fotoaktywowane białka Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) oraz N-końcową domenę podstawowej helisy pętli oddziałującej z kryptochromem (CIBN). Odwracalna aktywacja szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) odbywa się poprzez translokację białek za pośrednictwem światła w żywych komórkach. Podejście to można zastosować do hodowli komórek ssaków i żywych zarodków kręgowców. Ten bicystroniczny system może być uogólniony w celu kontrolowania aktywności innych kinaz o podobnych mechanizmach aktywacji i może być stosowany do innych systemów modelowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynniki wzrostu są zaangażowane w szerokie spektrum funkcji komórek, w tym proliferację, różnicowanie, migrację i apoptozę, i odgrywają kluczową rolę w wielu zdarzeniach biologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, starzeniu się i regulacji stanu psychicznego1,2,3,4,5. Wiele czynników wzrostu sygnalizuje poprzez złożone wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne. Te zdarzenia sygnalizacyjne są często obsługiwane przez odwracalną fosforylację białek w precyzyjnie regulowany sposób6,7. W związku z tym zrozumienie wyników sygnalizacji kinaz białkowych, które są odpowiedzialne za fosforylację białek, ma fundamentalne znaczenie.

Różne czynniki wzrostu działają poprzez dość powszechną wewnątrzkomórkową sieć sygnalizacyjną, mimo że stymulują różne reakcje komórkowe8,9. Typowe wewnątrzkomórkowe mediatory receptorowych kinaz tyrozynowych obejmują Ras, Raf, kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK)/kinazę ERK (MEK), kinazę fosfoinozytolu 3 (PI3K), Akt i fosfolipazę C gamma (PLCγ)10,11. Coraz więcej dowodów sugeruje, że różnorodność i swoistość sygnalizacji zależą od przestrzennej i czasowej regulacji aktywności sygnalizacyjnej12. Na przykład w komórkach guza chromochłonnego szczura (PC12) stymulacja naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), która powoduje proliferację komórek, przejściowo aktywuje szlak ERK9. Z drugiej strony, stymulacja czynnikiem wzrostu nerwów (NGF), który prowadzi do różnicowania komórek, aktywuje szlak ERK w sposób trwały9,13. W hodowanych neuronach hipokampa szczurów przejściowa sygnalizacja przez neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) sprzyja pierwotnemu wzrostowi neurytów, podczas gdy trwała sygnalizacja prowadzi do zwiększonego rozgałęziania się neurytów14. Podczas wczesnego rozwoju embrionalizowanego aktywność fosforylowanego ERK jest dynamiczna czasowo i jest szeroko rozpowszechniona w całym embryo6. Niedawne genetyczne badanie przesiewowe przeprowadzone podczas wczesnej embriogenezy Xenopus wykazało, że kaskady sygnalizacyjne ERK i Akt, dwa dalsze szlaki głównego czynnika wzrostu, wykazują profile aktywacji specyficzne dla danego etapu7. W związku z tym zrozumienie wyników sygnalizacji kinazy wymaga narzędzi, które mogą badać przestrzenne i czasowe cechy aktywności kinazy z wystarczającą rozdzielczością.

Konwencjonalne eksperymentalne podejścia do badania dynamicznej natury transdukcji sygnału podczas rozwoju nie mają pożądanej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Na przykład podejścia farmakologiczne wykorzystują małe cząsteczki chemiczne lub biologiczne do stymulowania lub tłumienia transdukcji sygnału w komórkach i tkankach. Dyfuzyjny charakter tych małych cząsteczek sprawia, że ograniczenie ich działania do określonego obszaru zainteresowania jest wyzwaniem15. Podejścia genetyczne (np. transgeneza, system Cre-Lox lub mutageneza) często prowadzą do nieodwracalnej aktywacji lub represji ekspresji docelowego genu lub aktywności białka16,17,18. System Tet-On/Tet-Off19 oferuje lepszą kontrolę czasową transkrypcji genów, ale brakuje mu ścisłej kontroli przestrzennej, ponieważ opiera się na dyfuzji tetracykliny. Ostatnie osiągnięcia w zakresie chemicznie indukowanej dimeryzacji białek20 lub foto-uncaging21,22,23,24 znacznie poprawiły czasową kontrolę sieci sygnalizacyjnych. Kontrola przestrzenna pozostaje jednak trudna ze względu na dyfuzyjny charakter chemikaliów przechowywanych w klatkach.

Ostatnio pojawiające się podejścia optogenetyczne, które wykorzystują moc światła do kontrolowania interakcji białko-białko, pozwalają na modulację szlaków sygnałowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną, jak również odwracalnością. Krótko po początkowym sukcesie w kontrolowaniu wypalania neuronów25,26,27, optogenetyka została rozszerzona o kontrolę innych procesów komórkowych, takich jak transkrypcja genów, translacja, migracja komórek, różnicowanie i apoptoza28,29,30,31,32,33,34. Niedawno opracowano strategię wykorzystującą fotoaktywowaną parę białek Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) i N-końcową domenę kryptochromowej helisy zasady interakcji kryptochromowej (CIBN) w celu kontrolowania aktywności kinazy Raf1 w komórkach ssaków i zarodkach Xenopus35. CRY2 wiąże się z CIBN po stymulacji światłem niebieskim, a kompleks białkowy CRY2/CIBN dysocjuje spontanicznie w ciemności34. Światło niebieskie wzbudza kofaktor CRY2, dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), co prowadzi do zmiany konformacyjnej CRY2, a następnie jego wiązania się z CIBN. Konsekwentnie aktywne (W374A) i ubogie w flawiny (D387A) mutanty CRY2 mogą być wytwarzane poprzez mutacje w kieszeni wiążącej FAD: mutantCRY2 W374A wiąże się z CIBN niezależnie od światła, podczas gdy mutant CRY2D387A nie wiąże się z CIBN pod wpływem stymulacji światłem niebieskim36,37. System optogenetyczny opisany w tym protokole wykorzystuje CRY2 i CIBN typu dzikiego do indukowania aktywacji Raf1 za pośrednictwem translokacji białek w żywych komórkach. Wiadomo, że rekrutacja Raf1 przez błonę zwiększa jego aktywność38. W tym systemie tandemowy moduł CIBN jest zakotwiczony w błonie plazmatycznej, a CRY2-mCherry jest połączony z N-końcem Raf135. Przy braku światła niebieskiego CRY2-mCherry-Raf1 pozostaje w cytoplazmie, a Raf1 jest nieaktywny. Stymulacja światłem niebieskim indukuje wiązanie CRY2-CIBN i rekrutuje Raf1 do błony komórkowej, gdzie Raf1 jest aktywowany. Aktywacja RAF stymuluje kaskadę sygnalizacyjną Raf/MEK/ERK. Zarówno białka fuzyjne CRY2, jak i CIBN są kodowane w bicystronicznym systemie genetycznym. Strategię tę można uogólnić w celu kontrolowania innych kinaz, takich jak Akt, których stan aktywacji może być również włączony przez translokację białek w komórkach39. W pracy przedstawiono szczegółowe protokoły realizacji tej strategii optogenetycznej w hodowlach komórek ssaków i organizmach wielokomórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz University of Illinois Department of Animal Resources (DAR).

1. Optogenetyczna indukcja lokalizacji białek w hodowli komórek ssaków BHK21

UWAGA: Kroki 1.1-1.3 dostarczają metody montażu komory do hodowli komórkowej do obrazowania z obiektywami o dużym powiększeniu (np. 63X lub 100X), które zazwyczaj mają krótkie odległości robocze. Obiektywy te wymagają cienkiego szklanego szkiełka nakrywkowego (np. o grubości #1,5, 170 μm) jako podłoża do obrazowania. Alternatywnie można użyć naczynia/szkiełka do hodowli komórek ze szklanym dnem. W takim przypadku kroki 1.1-1.3 można pominąć.

  1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
    1. Umieść 30 szklanych szkiełek nakrywkowych w uchwycie na szkiełka nakrywkowe.
    2. Do plastikowej zlewki o pojemności 600 ml dodaj 20 g detergentu i 400 ml ciepłej wody z kranu. Umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym i mieszaj, aż cały detergent się rozpuści. Usuń piankę za pomocą bibuły.
    3. Spód płytki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm należy wykorzystać jako element dystansowy od mieszadła oraz jako powierzchnię dla uchwytu szkiełka nakrywkowego. Aby utrzymać odpowiedni przepływ podczas procesu czyszczenia, wykonaj 3-4 otwory odpływowe w szalce Petriego.
    4. Aby wykonać otwory odpływowe, rozgrzej lutownicę i przepal plastik w wentylowanym okapie.
      UWAGA: Nie dotykaj rozgrzanej lutownicy gołymi rękami.
    5. Umieścić uchwyt szkiełka nakrywkowego na szalce Petriego w zlewce. Mieszaj przez 2 godziny do nocy w temperaturze pokojowej.
    6. Umyć trzykrotnie 500 ml wody demineralizowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Roztwór detergentu można użyć ponownie.
    7. Podnieś pojedyncze szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczy. Zanurz szkiełka nakrywkowe w etanolu o zawartości 190 procent (95%) na 1 minutę.
    8. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe w sterylnym kapturze. Przechowuj szkiełka nakrywkowe w sterylnym plastikowym pojemniku do czasu użycia.
  2. Wytwarzanie szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną (PLL)
    1. Sporządzić 0,1 M bufor boranowy, rozpuszczając 1,24 g kwasu borowego i 1,9 g tetraboranu disodu w 400 ml wody. Doprowadzić pH do 8,5 za pomocą 10 M NaOH.
    2. Rozpuścić PLL w buforze boranowym do końcowego stężenia 1 mg/ml. Roztwór PLL należy rozdzielić do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    3. Dodać 50 ml roztworu powlekającego PLL do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowych. Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby podgrzać roztwór PLL.
    4. Otwórz pojemnik na szkiełko nakrywkowe (krok 1.1.8) w sterylnym kapturze.
    5. Zanurzyć oczyszczone szkiełka nakrywkowe jeden po drugim we wstępnie podgrzanym roztworze PLL w naczyniu do hodowli tkankowych. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, aby zanurzyć wszystkie powierzchnie.
    6. Umieścić naczynie ze szkiełkiem nakrywkowym w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 na noc. Wyjmij każde szkiełko nakrywkowe i umieść je w sterylnym uchwycie na szkiełko nakrywkowe. Spłukać trzykrotnie autoklawowaną ultraczystą wodą (rezystywność 18,2 MΩ·cm) w zlewce o pojemności 1 000 ml w sterylnym kapturze.
    7. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe w uchwycie szkiełka nakrywkowego w sterylnym kapturze. Przechowuj szkiełka nakrywkowe w sterylnym plastikowym pojemniku do czasu użycia.
  3. Montaż komór do hodowli komórkowych z polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. W plastikowym pojemniku odważ 40 g bazy PDMS i dodaj 4 g utwardzacza, aby uzyskać stosunek 10:1 w/w PDMS i utwardzacza. Wymieszaj PDMS/utwardzacz, mieszając końcówką pipety przez 2 minuty. Alternatywnie użyj mieszalnika odśrodkowego.
    2. Użyj zlewki o średnicy 4 cali jako szablonu, aby zrobić uchwyt z kawałkiem folii aluminiowej. Umieść uchwyt z folii aluminiowej na szalce Petriego o średnicy 15 cm. Umieść 4-calową wafel silikonowy w tym uchwycie z folii aluminiowej.
    3. Wlej zmieszany roztwór PDMS do uchwytu. Użyj cienkiego szklanego pręta, aby delikatnie dotknąć krawędzi wafla. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod płytką.
    4. Włóż 15-centymetrową szalkę Petriego do komory próżniowej w celu odgazowania roztworu PDMS. Kontynuuj odgazowywanie przez około 20 minut, aż nie powstaną pęcherzyki. W międzyczasie rozgrzej piec konwekcyjny do 65 °C.
    5. Ostrożnie włóż 15-centymetrową szalkę Petriego do piekarnika. Inkubować przez 2 godziny.
    6. Wyjmij talerz z piekarnika. Użyj szklanego pręta, aby delikatnie dotknąć krawędzi PDMS i zapewnić całkowite usieciowanie. Jeśli nie, inkubuj dłużej, aż PDMS stanie się twardy i nie będzie lepki.
    7. Zdejmij folię aluminiową z płytki i oderwij ją od wafla silikonowego. Zaczynając od krawędzi, ostrożnie oderwij utwardzony PDMS od wafla krzemowego.
      UWAGA: Unikaj stosowania zbyt dużej siły, ponieważ może to spowodować pęknięcie wafla.
    8. Przytnij PDMS na prostokątne kawałki o wymiarach 20 mm x 30 mm, aby pasowały do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 40 mm z żyletką.
    9. Użyj ostrza w kształcie dłuta, aby wyciąć prostokątny otwór o wymiarach 10 mm x 20 mm od środka każdego elementu PDMS.
    10. Wyczyść komory PDMS zgodnie z protokołem detergentu opisanym w kroku 1.1.
    11. Wysuszyć komory PDMS w czystym okapie. Umieść suche komory w autoklawowalnym pojemniku pokrytym folią aluminiową.
    12. Autoklawować pojemnik grawitacyjnie (121 °C, 15 psi) przez 30 minut i przechowywać pojemnik w temperaturze pokojowej.
  4. Hodowla i transfekcja komórek BHK21
    1. Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli komórek BHK21, mieszając 445 ml DMEM z 50 ml FBS i 5 ml 100× Penn-Strep-Glutamine (10 000 U/ml penicyliny, 10 mg/ml streptomycyny i 29,2 mg/ml L-glutaminy). Upewnij się, że końcowe stężenie FBS wynosi 10%.
    2. Podwielokrotność 10 ml pożywki niezależnej od CO2 niezależnej od HEPES, do obrazowania żywych komórek.
      UWAGA: Pożywka niezależna od CO2 wspomaga wzrost komórek bez inkubatora CO2 i jest idealna do obrazowania komórek w warunkach atmosferycznych. Szczegółowe informacje można znaleźć na liście materiałów. Oprócz linii komórkowej BHK21, inne typy komórek ssaków również powinny dawać podobne wyniki.
    3. Zmontuj urządzenie do hodowli komórkowej, umieszczając jedną autoklawowaną, sterylną komorę PDMS (krok 1.3) na sterylnym szkiełku nakrywkowym pokrytym PLL (krok 1.2) w sterylnym kapturze.
    4. Umieść każde urządzenie na sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm.
    5. Użyj 0,5 ml 0,25% trypsyny, aby odłączyć komórki od jednego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Policz gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Płytkę 20 000 komórek BHK21 w komorze (około 10 000 komórek/cm2) z 200 μl pożywki do hodowli komórkowych.
    6. Przygotuj plazmid DNA za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu (patrz Lista materiałów).
      UWAGA: Konstrukcja i funkcjonalność CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX są pokazane w Rysunek 1A-1B.
    7. Dwadzieścia cztery (24) godziny po posiewie komórek, transfekować komórki 50-100 ng plazmidu CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX, zgodnie z protokołem producenta.
    8. Trzy (3) godziny po transfekcji zmienić pożywkę na 200 μl świeżej pożywki hodowlanej (etap 1.4.1) i pozwolić komórkom na regenerację przez noc poprzez inkubację kultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek
    1. Włącz komputer, źródło światła, mikroskop i kamerę. Użyj konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy 100X w olejku) do pozostałej części protokołu.
      UWAGA: Można również użyć odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego.
    2. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 200 μl pożywki niezależnej od CO2 .
    3. Skonfiguruj protokół gromadzenia danych przed umieszczeniem komórek w mikroskopie. Użyj kanału wzbudzenia 488 nm FITC do stymulacji optogenetycznej. Użyj kanału TRITC wzbudzenia 561 nm, aby zlokalizować transfekowane komórki i śledzić lokalizację komórkową białka znakowanego mCherry.
    4. Ustaw wzmocnienie kanałów FITC i TRITC odpowiednio na 120 i 200. Użyj czasu przebywania w pikselach 2,2 μs i rozmiaru 512 x 512 pikseli.
    5. Zmierz moc światła o długości fali 488 nm, umieszczając miernik mocy w pobliżu okienka obiektywu. Całkowita moc 2 μW (około 10 000 W/cm2 w ognisku) jest wystarczająca do wywołania asocjacji CIBN-CRY2PHR.
    6. Ustaw akwizycję znacznika czasu z interwałem 5 s i całkowitym czasem akwizycji wynoszącym 2 minuty.
    7. Nałóż odpowiedni materiał pasujący do indeksu (olejek immersyjny) na okienko obiektywu. Użyj trybu kontrastu fazowego, aby ustawić ostrość na komórkach na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    8. Zlokalizuj transfekowaną komórkę w świetle o długości fali 561 nm, przesuwając stolik mikroskopu.
      UWAGA: Na tym etapie należy unikać używania niebieskiego światła, ponieważ aktywuje ono skojarzenie między białkami fotoaktywowanymi.
    9. Po zlokalizowaniu transfekowanej komórki zainicjuj akwizycję danych.
      UWAGA: Pomyślnie transfekowane komórki powinny wykazywać fluorescencję zarówno w kanałach FITC (z 2CIBN-GFP-CaaX), jak i TRITC (z CRY2-mCherry-Raf1) (Figura 1C-D).
    10. Nagraj serię obrazów ze znacznikiem czasu zarówno w kanałach FITC, jak i TRITC (rysunek 1D).
    11. Aby zbadać spontaniczną dysocjację kompleksu białkowego CRY2-CIBN, nagraj kolejny znacznik czasu z samym kanałem Txred przez 20 minut, w odstępie 30 sekund.
    12. Zapisz obraz ze znacznikiem czasu do analizy danych.
  6. Analiza obrazu
    1. Otwórz obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, które może wyodrębnić intensywność z obrazu40.
    2. Wybierz dwie reprezentatywne migawki: jedną przed ekspozycją na światło niebieskie, a drugą po ekspozycji na światło niebieskie.
    3. Narysuj linię w poprzek komórki obejmującą tło, błonę plazmatyczną i cytoplazmę. Rzutuj intensywność wzdłuż tej linii. Zapisz wartości i wykreśl je, aby porównać różnicę przed i po ekspozycji na światło (Rysunek 1D).
    4. Aby przeanalizować kinetykę asocjacji białek, wybierz jeden reprezentatywny region zainteresowania (ROI) w błonie plazmatycznej, jeden ROI w cytoplazmie i jeden ROI w tle.
    5. Uzyskaj średnie intensywności błony plazmatycznej (IPM), cytoplazmy (ICYT) i tła (IBKD) dla stosu obrazów.
    6. Oblicz stosunek intensywności błony do cytozolu dla każdego obrazu, korzystając z następującego równania:
      figure-protocol-1
    7. Wykreśl stosunek w funkcji czasu i określ kinetykę wiązania lub dysocjacji CRY2-CIBN (Rysunek 1E-F).

2. Budowa matrycy LED do długotrwałej stymulacji światłem w inkubatorzeCO2

UWAGA: Ogólny schemat eksperymentalnej konfiguracji jest pokazany w Rysunek 2A.

  1. Stwórz matrycę LED, wkładając 12 niebieskich diod LED do dwóch płytek stykowych i podłączając rezystory ograniczające prąd.
    UWAGA: Przy zasilaniu 30 V cztery diody LED można połączyć szeregowo, a ich jasność można kontrolować za pomocą rezystora ograniczającego prąd.
  2. Umieść płytki stykowe w aluminiowym pudełku.
    UWAGA: Wysokość aluminiowego pudełka powinna wynosić 2 cale. Ta wysokość jest optymalna do oświetlenia 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, ponieważ rozmiar rozchodzącej się plamki świetlnej jest taki sam jak w przypadku pojedynczej studzienki.
  3. Użyj dwóch metalowych przewodów, aby podłączyć się do zasilania. Upewnij się, że długość przewodu jest wystarczająca, gdy kaseton oświetleniowy jest umieszczony w inkubatorze CO2 .
  4. Użyj przezroczystego dyfuzora światła jako pokrywy kasetonu świetlnego (Rysunek 2C).
  5. Skalibruj moc wyjściową każdej diody LED przy różnych wejściach napięcia. Użyj mocy 0,2 mW/cm2 do 24-godzinnego testu różnicowania komórek PC12. Użyj mocy 5 mW/cm2 do żywych zarodków Xenopus lub testów eksplantatów.

3. Optogenetyczna indukcja różnicowania komórek PC12

  1. Hodowla komórkowa i transfekcja
    1. Przygotować 500 ml pożywki do hodowli komórkowej guz chromochłonnego (PC12) szczura, mieszając 407,5 ml F12K z 75 ml surowicy końskiej + 12,5 ml FBS + 5 ml 100× Penn-Strep-Glutamine (końcowe stężenia surowicy końskiej i FBS: odpowiednio 15% i 2,5%). Przygotować pożywkę o niskiej zawartości surowicy, mieszając 1 objętość pełnej pożywki z 99 objętościami pożywki F12K.
    2. Umieść komórki PC12 w 12-dołkowej płytce o gęstości 300 000 komórek/dołek lub 75 000 komórek/cm2.
    3. Transfekcję komórek za pomocą CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 godziny po posiewaniu komórek (podobnie jak w kroku 1.4.7). Użyj 1,2 μg DNA dla każdego dołka. Pozostawić komórki do regeneracji przez noc w pożywce hodowlanej w inkubatorze o temperaturze 37 °C uzupełnionym 5% CO2 . Sprawdź wydajność transfekcji 16 godzin po transfekcji.
      UWAGA: Należy osiągnąć 30-50% wydajność transfekcji, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek.
    4. Zmienić pożywkę z pożywki na niską surowicę 24 godziny po transfekcji. Użyj 1 ml pożywki na zagłębienie 12-dołkowej płytki.
  2. Różnicowanie komórek PC12 pod wpływem światła
    1. Umieść matrycę LED w inkubatorzeCO2. Podłącz go do zasilania za pomocą pary przewodów. Ustaw moc diody LED na 0,2 mW/cm2. Umieścić 12-dołkową płytkę zawierającą transfekowane komórki PC12 (krok 3.1.3) w okienku matrycy LED. Stosować ciągłe oświetlenie światłem przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C uzupełnione 5% CO2 .
  3. Obrazowanie żywych komórek fluorescencyjnych
    1. Wykonaj kroki 1.5.1-1.5.4 dla mikroskopu i przygotowania próbki.
    2. Skonfiguruj pobieranie danych z jedną migawką. Użyj 200 ms zarówno dla kanału GFP, jak i Txred.
    3. Przechwytywanie obrazów transfekowanych komórek zarówno w kanałach GFP, jak i Txred. Nagraj około 200 komórek dla każdego warunku. Zapisz pliki do analizy danych.
  4. Analiza obrazu
    1. Policz procent komórek zróżnicowanych w stosunku do całkowitej liczby komórek transfekowanych.
    2. Użyj dowolnego modułu zliczania komórek w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby policzyć komórki.
    3. Ręcznie policz zróżnicowane komórki.
      UWAGA: Zróżnicowane komórki definiuje się jako te, w których co najmniej jeden neuryt jest zauważalnie dłuższy niż ciało komórki (Rysunek 3A-3B).
    4. Powtórz krok 3.4.3 z niezróżnicowanymi komórkami.
    5. Oblicz współczynnik różnicowania, korzystając z następującego równania:
      figure-protocol-2

4. Optogenetyczna kontrola aktywności kinazy w zarodkach Xenopus

  1. Przygotowanie
    1. Przygotuj 1 l 1x zmodyfikowany dzwonek Marca (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 i 5 mM HEPES; pH 7,5.
  2. Przygotowanie mRNA
    1. Trawić plazmidowe DNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX (2 μg) z 1 μl ApaI (50 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Wytrój zlinearyzowane DNA w 60 μl 100% etanolu. Wiruj w temperaturze 12 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać DNA. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i ponownie przemyć osad 60 μl 70% etanolu. Wirować w temperaturze 12 000 × g przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad DNA w 6 μl H2Owolnego od RNaz.
    3. Przeprowadzić transkrypcję in vitro, inkubując 1 μg zlinearyzowanego DNA z 2 μl dostarczonej polimerazy RNA SP6, mieszaniną rybonukleotydów (10 mM ATP, CTP i UTP; 2 mM GTP i 8 mM analog kapu) i 20 μl wody wolnej od nukleaz w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Usunąć matrycę DNA przez trawienie DNazy I w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut i oczyścić zsyntetyzowany RNA za pomocą kolumny wirowej z membraną krzemionkową.
    5. Zatrzymaj reakcję i wytrącić RNA, dodając 30 μl wody wolnej od nukleaz i 30 μl roztworu wytrącającego LiCl. Dokładnie wymieszać i schłodzić przez 30 minut w temperaturze -20 °C.
    6. Wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut w temperaturze 12 000 × g w celu osadzenia RNA.
    7. Ostrożnie usunąć supernatant. Umyj RNA raz 1 ml 70% etanolu i ponownie zanurz w 40 μl wody wolnej od nukleaz.
    8. Załadować 40 μl RNA do kolumny wirowej. Wirować w temperaturze 4 °C przez 1 minutę w temperaturze 12 000 × g w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów i czapeczek.
  3. Zbieraj zarodki Xenopus
    1. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym przez Sive i wsp.41, aby uzyskać zarodki Xenopus.
  4. Mikroiniekcja mRNA
    1. Wytwarzaj igły do mikroiniekcji, ciągnąc szklane naczynia włosowate za pomocą ściągacza do naczyń włosowatych. Ustaw program ciągnięcia na: ciepło = 355, siła ciągnięcia = 80, prędkość = 50 i czas = 100.
    2. Usuń galaretowatą powłokę z zarodków, traktując je 3% cysteiną (rozcieńczoną w 0,2x MMR).
    3. Przenieś zarodki do 3% polisacharozy i 0,5 x roztworu MMR do mikroiniekcji. Wstrzyknij 500 pg do 1 ng RNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX do każdego zarodka.
      UWAGA: Wstrzyknięcie dawki większej niż 1 ng powoduje niezależną od światła niebieskiego aktywację sygnalizacji MAPK.
  5. Optogenetyczna stymulacja aktywności kinazy
    1. Hodowla zarodków z mikrowstrzykniętymi nasionami w 3% polisacharozie, 0,5 x roztwór MMR w temperaturze pokojowej, aż osiągną stadium środkowego żołądka (etap 12). Następnie hoduj zarodki w 0,2x roztworze MMR.
    2. Przenieś zarodki lub eksplantaty na płytkę 12-dołkową. Umieść 12-dołkową płytkę na domowej matrycy LED (krok 2.5) w celu leczenia światłem niebieskim (475 nm).
    3. Umieść lusterko na górze 12-dołkowej płytki, aby zapewnić pełne oświetlenie zarodków lub eksplantatów światłem niebieskim.
    4. Dostosuj moc niebieskiego światła do 5 mW/cm2,
      UWAGA: Leczenie światłem niebieskim można wykonać w dowolnym momencie, w 3% polisacharozie, 0,5 x roztworze MMR lub 0,2 x roztworze MMR.
    5. Zbieraj zarodki w dowolnym momencie. Użyj ich do analizy histologicznej, Western-blot lub ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ratiometryczne wyrażenie fotoaktywowalnych par białek: Rysunek 1A przedstawia projekt bicystronicznego konstruktu optogenetycznego, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (określanego jako CRY2-2A-2CIBN), opartego na świńskim peptydzie teschovirum-1 2A (P2A), który wykazuje najwyższą skuteczność pomijania rybosomów wśród linii komórkowych ssaków42. W poprzednich pracach ustalono, że optymalnym stosunkiem dla CIBN-GFP-CaaX:CRY2-mCherry-Raf1 jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas budowy kasetonu należy zmierzyć moc poszczególnych diod LED. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, moc wyjściowa może się różnić między poszczególnymi diodami LED ze względu na różnice produkcyjne. Wybierz zestaw diod LED, które mają moc wyjściową w granicach 10% od siebie. Liczba diod LED, rezystor ograniczający prąd i pobór mocy mogą być modyfikowane dla różnych typów pojemników do hodowli komórkowych (np. płytka 6-dołkowa lub 24-dołkowa). 24 godziny oświetlenia światłem o mocy 0,2 mW/c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez University of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC) oraz National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkowe VWR48393 230Podłoże do obrazowania żywych komórek
Uchwyt szkiełka nakrywkowego Nowości Dostawa6817BUchwyt do szkiełek nakrywkowych
Detergent ThermoFisher16 000 104Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Kwas borowy Sigma-AldrichB6768-500GDo wytwarzania buforu PLL
Tetraboran disodowySigma-Aldrich71996-250GDo wytwarzania  Bufor PLL
Zlewka plastikowaNalgene1201-1000Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Wodorotlenek sodu Sigma-Aldrich221465-2.5KGDo regulacji pH
Bromek poli-L-lizynySigma-AldrichP1274-500MGDo powlekania szkiełka nakrywkowego
Woda uzdatniona dietylopirowęglanem (DEPC)ThermoFisher Scientific750024Do przygotowania DNA
Kleszcze do szkła nakrywkowegoTed Pella5645Obsługa szkła nakrywkowego
Naczynie na sztućce Thermofisher12565321Naczynie do hodowli komórkowych
Sterylne probówki wirówkoweThermoFisher12-565-271Przechowywanie buforowe
Odczynnik do transfekcjiThermoFisherR0534Transfekcja
CO2-independent ThermoFisher18045088Do obrazowania żywych komórek
Polidimetylosiloksan (PDMS)Ellsworth Kleje184 SIL ELAST KIT 0,5 kgForma komory komórkowej
Zestaw plazmidowy MaxiprepQiagen12965Preparat plazmidowy
Pożywka DMEMThermoFisher11965-084Pożywka do hodowli komórek
Składnik F12K ThermoFisher21127022Składnik pożywki do hodowli komórek
Surowica dla koniThermoFisher16050122Składnik pożywki do hodowli komórek
Płodowa surowica bydlęcaSigna-Aldrich12303C-500 mLPożywka do hodowli komórek Składnik
Penicylina-Streptomycyna-GlutaminaThermoFisher10378016Pożywka do hodowli komórek
Trypsyna (0,25%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific15050065 Do dysocjacji komórek ssaków
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Do przygotowania DNA
Ficoll PM400GE Heathcare Life Sciences17-5442-02Do buforu zarodkowego
Monohydrat chlorowodorku L-cysteinySigma-Aldrich1.02839.0025Preparat oocytów
ApaIThermoFisherFD1414Do linearyzacji plazmidów
Dnaza IThermoFisherAM2222Do usuwania matrycy DNA w teście transkrypcyjnym in vitro
Materiały o dopasowanym indeksie (olejek immersyjny)ThorlabsMOIL-20LNDo dopasowania indeksu między substratem próbki a obiektywem
Niebieska dioda LEDAdafruit301Źródło światła do stymulacji optogenetycznej
Zestaw rezystorówAmazonEPC-103Rezystor ograniczający prąd
Skrzynki aluminioweKaseton świetlny BUD IndustriesAC-401 
BreadBoardJekewin837654333686Do wykonania tablicy LED
Hook up WireElectronix Express27WK22SLD25Do wykonania
modułu przekaźnikaJbtekSRD-05VDC-SL-CDo przerywanego sterowania oświetleniem
Zasilacz prądu stałego TMSDCPowerSupply-LW-(PS-305D)Zasilacz do LED
Silicon  Moc  GłowicaThorlabsS121CDo pomiaru natężenia światła
Miernik mocyThorlabsPM100D Do pomiaru natężenia światła
MikroskopLeica BiosystemsDMI8Do obrazowania żywych komórek
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermoFisher1300 Series A2Do obsługi komórek ssaków
Inkubator CO2ThermoFisherIsotempDo hodowli komórek ssaków
Mikroskop stereoskopowyLeicaM60Do mikromanipulacji zarodkami
MikrowtryskiwaczNarishigeIM300Do mikroiniekcji zarodków Ściągacz
do mikropipetSutter InstrumentsP87Ściągacz igieł
in vitro zestaw do transkrypcjiThermoFisherAM1340Do transkrypcji in vitro. W skład zestawu wchodzi woda wolna od nukleaz, SP6 RNA  Polimeraza, mieszanina rybonukleotydów, analog kapu, roztwór do wytrącania chorydu litu i kolumna wirowa   
Zestaw do oczyszczania RNAQiagen74104Kolumna wirowa z membraną krzemionkową do oczyszczania zsyntetyzowanego RNA 
Piec konwekcyjnyMTI corporation  EQ-DHG-9015Utwardzanie PDMS
Mieszalnik odśrodkowy i pojemnik teflonowyTHINKYAR310Do mieszania PDMS
Wafelkrzemowy UniversityWafer452Baza do wykonywania urządzeń PDMS 
OstrzeTechni Edge01-801Do cięcia PDMS
Szkło kapilarneSutter InstrumentsBF100-58-10Do produkcji igieł iniekcyjnych. nbsp;
LED

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975(2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469(2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917(2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256(2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057(2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Strategia optogenetycznasystem CRY2 CIBNtranslokacja bia ekmikroskopia fluorescencyjnamacierz LEDanaliza ekspresji gen w

Powiązane artykuły