Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad schwannomakiem przedsionkowym

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55827

⸱

20 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest nakreślenie procesu zbierania i przetwarzania ludzkich próbek chirurgicznych do wielu dalszych zastosowań w badaniach nad schwannoma przedsionkowym i komórkami Schwanna.

Streszczenie

Nerwiaki osłonkowe przedsionkowe są najczęstszymi nowotworami kąta móżdżkowo-móżdżkowego, stanowiąc 6-8% wszystkich narośli wewnątrzczaszkowych. Chociaż guzy te powodują odbiorczy ubytek słuchu nawet u 95% osób dotkniętych tym ubytkiem, mechanizmy molekularne leżące u podstaw tego ubytku słuchu pozostają nieuchwytne. W tym artykule przedstawiono kroki ustalone w naszym laboratorium w celu ułatwienia pobierania i przetwarzania różnych pierwotnych próbek tkanek ludzkich do dalszych zastosowań badawczych integralnych z badaniem nerwiaków osłonkowych. W szczególności praca ta opisuje ujednolicone ramy metodologiczne dla pobierania, przetwarzania i hodowli komórek Schwanna i nerwiaka osłonkowego z próbek chirurgicznych. Jest to zintegrowane z równoległymi etapami przetwarzania, które są obecnie uważane za niezbędne dla obecnych badań: zbieraniem wydzielin nowotworowych i nerwowych, konserwacją RNA i ekstrakcją białka z pobranych tkanek, utrwalaniem tkanki do przygotowania skrawków oraz ekspozycją pierwotnych komórek ludzkich na wirusy związane z adenowirusami w celu zastosowania w terapii genowej. Ponadto praca ta podkreśla translabiryntowe podejście chirurgiczne do pobrania tego guza jako wyjątkową okazję do uzyskania ludzkiego nabłonka czuciowego z ucha wewnętrznego i perylimfy. Podano wskazówki dotyczące poprawy jakości eksperymentów i podkreślono typowe pułapki.

Wprowadzenie

Nerzaki przedsionkowe (VS) są najczęstszymi nowotworami kąta móżdżkowo-oponowego, diagnozowanymi u 1 na 100 000 osób. Chociaż nie ma przerzutów, guzy te poważnie wpływają na jakość życia pacjenta1,2,3,4,5,6. Osoby dotknięte chorobą często żyją z ubytkiem słuchu, szumami usznymi i uczuciem pełności słuchowej. Objawy stają się coraz bardziej wyniszczające w miarę wzrostu guza, powodując problemy z równowagą, paraliż twarzy i upośledzenie innych funkcji nerwów czaszkowych. Mogą również wystąpić zagrażające życiu powikłania spowodowane uciskiem pnia mózgu7.

Opcje zarządzania VS są zasadniczo ograniczone do czujnego oczekiwania na guzy statyczne i radioterapii stereotaktycznej lub chirurgicznej resekcji rosnących guzów8. Chirurgiczne usunięcie tych guzów w szpitalach związanych z badaniami daje możliwość pozyskania i analizy świeżej tkanki nowotworowej pobranej podczas operacji pacjentów. Jedno ze specyficznych podejść chirurgicznych do VS, resekcja translabiryntowa, może nawet zapewnić dostęp do cennego ludzkiego nabłonka czuciowego z ucha wewnętrznego i perylimfy.

Ponieważ VS powstają z obwodowego nerwu czuciowego (tj. nerwu przedprzedsionkowego), ważne jest porównanie obserwacji związanych z VS z tymi pochodzącymi z odpowiedniego nerwu kontrolnego, takiego jak ludzki wielki nerw uszny (GAN). Zdrowe GAN są regularnie poświęcane podczas parotydektomii lub sekcji szyi i mogą być używane jako solidne modele dla zdrowej fizjologii komórek Schwanna9.

Ponieważ nie ma zatwierdzonych przez FDA leków do leczenia lub zapobiegania sporadycznym VS, konieczne jest, aby badacze wyjaśnili mechanizmy molekularne leżące u podstaw choroby, aby zidentyfikować cele terapeutyczne. Białka, które odgrywają rolę w patogenezie VS, obejmują merlinę, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), cyklooksygenazę 2 (COX-2), czynnik jądrowy kappa B (NF-κB), czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-alfa), receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i powiązane cząsteczki sygnałowe10,11,12,13,14,15,16,17.

Ostatnie postępy rozszerzyły i ulepszyły protokoły gromadzenia, przetwarzania, hodowli i dalszego badania pierwotnych ludzkich nerwiaków przedsionkowych i zdrowych tkanek nerwowych18,19. Jednak większość istniejących protokołów jest zaprojektowana tak, aby umożliwić przygotowanie takich tkanek do pojedynczego dalszego zastosowania badawczego (tj. samej hodowli komórkowej). W artykule przedstawiono ujednolicone ramy metodologiczne dla jednoczesnego przetwarzania pojedynczej pierwotnej próbki ludzkiej VS lub GAN do wielu dalszych zastosowań: hodowla specyficzna dla typu komórki, ekstrakcja białek, konserwacja RNA, pobieranie wydzieliny guza i utrwalanie tkanek. Praca ta szczegółowo opisuje również chirurgiczne pobieranie i przetwarzanie ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i perylimfy podczas translabiryntowej resekcji VS, ponieważ te blisko spokrewnione tkanki mogą służyć jako ważne źródła biomarkerów VS. Wreszcie, protokół ten przedstawia etapy transdukcji wirusa pierwotnych ludzkich komórek VS w hodowli jako nowatorskie zastosowanie tej tkanki do zastosowania w terapii genowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pisemna świadoma zgoda na pobranie wszystkich próbek została uzyskana przed operacją, a eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Medycznego (Deklaracja Helsińska). Wszystkie sekcje protokołu badania zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of Massachusetts Eye and Ear oraz Massachusetts General Hospital.

UWAGA: Sekcje 1-7 poniżej są przeznaczone do wykonania sekwencyjnie po otrzymaniu próbki od człowieka z sali operacyjnej. Przetwarzanie powinno zawsze rozpoczynać się od punktu 1. Następnie, z reguły, w pierwszej kolejności należy zachować RNA (sekcja 2), a następnie przygotować tkankę do pobrania wydzielin (sekcja 3) i ekstrakcji białka (sekcja 4). Tkanka, która ma być hodowana (sekcja 5 dla VS, sekcja 6 dla GAN) może znajdować się w uzupełnionej pożywce hodowlanej podczas wykonywania sekcji 2, 3 i 4. Utrwalanie tkanki do sekcji (sekcja 7) jest bardzo krótkie i można je przeprowadzić na dowolnym etapie wirowania. Sekcja 8 (przetwarzanie perylimfy) i sekcja 9 (przetwarzanie płynu mózgowo-rdzeniowego) mogą być przeprowadzone po otrzymaniu perylimfy lub płynu mózgowo-rdzeniowego z sali operacyjnej podczas translabiryntowej resekcji VS. Sekcja 10 (transdukcja wirusa) może być wykonana na rosnących komórkach VS lub Schwanna w hodowli.

1. Przygotowanie i odbiór próbki chirurgicznej

UWAGA: Następujące kroki należy wykonać w sterylnym środowisku, takim jak kaptur do hodowli tkanek lub kaptur z przepływem laminarnym. Oczekuje się znajomości podstawowej techniki sterylnej.

  1. Przygotowanie pożywki do pierwotnej hodowli komórek ludzkich VS lub komórek Schwanna
    1. Rozmrozić 50 ml porcji zamrożonej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 5 ml mieszaniny penicyliny i streptomycyny do 500 ml butelki DMEM/F-12, uzyskując końcowe rozcieńczenie 1:100.
    3. Dodać 50 ml rozmrożonego FBS do 500 ml butelki DMEM/F-12, uzyskując końcowe rozcieńczenie 1:10.
    4. Na butelce napisz datę, inicjały badacza i informacje uzupełniające (np. 1% P/S, 10% FBS).
    5. Umieścić nową pożywkę hodowlaną w lodówce (4 °C).
  2. Odbiór i oczyszczanie próbki VS lub GAN
    1. Na sali operacyjnej umieścić świeżo pobraną próbkę VS lub GAN w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w pojemniku na próbki. Próbkę można przetransportować na lodzie z sali operacyjnej do okapu z przepływem laminarnym w laboratorium.
      UWAGA: Rozmiary i masy próbek różnią się znacznie między pacjentami w zależności od wielkości odpowiedniego guza lub ilości wyciętego nerwu.
    2. Usunąć z zamrażarki porcje roztworu podstawowego hialuronidazy (25 000 U/ml) i kolagenazy (3 200 U/ml) i pozostawić enzymom do rozmrożenia w temperaturze pokojowej (wymagane dla kroku 5.1.4 lub 6.1.6, w zależności od tego, czy próbka jest VS czy GAN).
      UWAGA: Ponowne zawieszenie liofilizowanych enzymów jest szczegółowo opisane w kartach informacyjnych produktu. Kolagenazę można ponownie zawiesić w dowolnym zrównoważonym roztworze soli bez wapnia, a hialuronidaza w roztworze 0,02 M buforu fosforanowego (pH 7,0), 77 mM NaCl i 0,01% 1 mg / ml albuminy surowicy bydlęcej. Specyficzna aktywność każdego liofilizowanego enzymu różni się w zależności od partii i powinna być zweryfikowana przed ponownym wymieszaniem.
    3. Używając serii trzech probówek o pojemności 1,5 ml wypełnionych 1,4 ml sterylnego PBS 1x, umyj próbkę VS lub GAN trzy razy. Ostrożnie przenieś próbkę z probówki do probówki za pomocą sterylnych kleszczyków. Zamknij każdą probówkę, gdy zawiera próbkę, i delikatnie wstrząśnij, aby umyć.
      UWAGA: Aby uniknąć zalania probówek o pojemności 1,5 ml, można użyć mniej niż 1,4 ml PBS na probówkę, jeśli fragment guza jest duży.
    4. Umieść próbkę na suchej szalce Petriego o średnicy 60 mm i za pomocą kleszczy usuń wszystkie martwe tkanki (tj. kauteryzowane części, które są zwykle białe lub nieprzezroczyste) oraz obszary z widocznymi naczyniami krwionośnymi.
    5. Użyj kleszczy lub ostrza skalpela, aby podzielić próbkę na oddzielne części w celu zachowania RNA, ekstrakcji białka, zbierania wydzieliny, utrwalania i hodowli komórkowej (patrz sekcje 2 - 6 poniżej).
    6. Przenieść fragment próbki przeznaczony do hodowli komórkowej (sekcja 5/6) do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm zawierającego 5-8 ml zimnej, uzupełnionej pożywki DMEM/F-12 (alternatywnie do tego etapu można użyć pokrywki pierwszej pożywki do hodowli).
      UWAGA: Potrzebna ilość pożywki DMEM/F-12 (od kroku 1.1) będzie zależeć od wielkości guza lub nerwu, ale powinna mieścić się w przedziale od 5 do 8 ml. Ten kawałek może siedzieć w pożywce hodowlanej podczas wykonywania kolejnych kroków.

2. Zachowanie RNA w tkance VS i GAN (dotyczy również ludzkiego nabłonka czuciowego)

  1. Pod pokrywą z przepływem laminarnym przenieś 1-1,2 ml roztworu stabilizującego RNA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Po umyciu próbki PBS (krok 1.2.3), na krótko zanurzyć mały kawałek tkanki przeznaczony do konserwacji RNA (około 3mm3 VS lub 5 mm długości GAN) w roztworze stabilizującym RNA. Upewnij się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze.
  3. Przygotuj i oznacz nową probówkę o pojemności 1,5 ml. Pobrać próbkę z roztworu stabilizującego RNA, przenieść ją do nowej probówki i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

3. Zbiór wydzielin VS i GAN

  1. Dzień 1
    1. Po umyciu próbki PBS (krok 1.2.3) umieścić kawałek VS lub GAN przeznaczony do zbierania wydzieliny w pustej probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Przygotować dwie dodatkowe probówki o pojemności 1,5 ml i odpipetować 500 μl DMEM (nieuzupełnionego FBS) do każdej probówki.
      UWAGA: Pierwsza probówka DMEM będzie używana do zbierania wydzielin guza, a druga rurka DMEM będzie służyć jako dopasowana kontrola. Wydzieliny można zbierać w DMEM, dowolnym innym typowym pożywce hodowlanej, która nie jest uzupełniona surowicą, lub PBS.
    3. Umieść jedną z probówek zawierających DMEM na skalibrowanej wadze cyfrowej. Wytaruj skalę w taki sposób, aby gdy probówka znajduje się na górze skali, wskazywała 0 mg.
    4. Wyjmij probówkę DMEM z wagi, umieść w probówce kawałek próbki przeznaczony do zbierania wydzieliny i zważ ją. Zwróć uwagę na wynik, który będzie reprezentował wagę samej tkanki.
    5. Pod okapem z przepływem laminarnym dostosować objętość DMEM w probówce do 100 μl na 10 mg próbki.
    6. Umieścić probówkę zawierającą próbkę tkanki i jej dopasowaną kontrolę (sam DMEM) w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na okres zgodny z planami tego eksperymentu. Inkubuj tkankę przez co najmniej 72 godziny, aby zebrać biologicznie użyteczne ilości wydzielin guza lub nerwów15.
  2. Dzień 4
    1. Po inkubacji przez 72 godziny usunąć z próbki pożywkę zawierającą wydzielinę (tj. pożywkę kondycjonowaną tkankowo) za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Aby zapobiec powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania, należy podwielokrotnić pożywkę do nowych probówek zgodnie z planowanymi dalszymi analizami (np. aby przeprowadzić test ELISA z 4 dołkami wymagającymi 50 μl każdy, można przygotować podwielokrotności 210 μl).
    2. W razie potrzeby zamrozić fragment tkanki pozostały w oryginalnej probówce (już oznakowanej w dniu 1) w temperaturze -80 °C w celu przeprowadzenia dodatkowych analiz, takich jak ekstrakcja DNA, w późniejszym terminie.
    3. Przechowuj tkanki, wydzieliny i kontrolny DMEM w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia dalszych zastosowań (np. ELISA, LC-MS/MS, macierze cytokin itp.).

4. Ekstrakcja białka z tkanki VS lub GAN

  1. Przygotowanie wzmocnionego buforu RIPA
    1. Dodać jedną tabletkę inhibitora fosfatazy i jedną tabletkę inhibitora proteazy do 10 ml buforu RIPA w probówce o pojemności 15 ml; jest to wzbogacony bufor RIPA.
      UWAGA: Przechowywać bufor RIPA w temperaturze 4 °C i dodać tabletki tuż przed użyciem.
  2. Ekstrakcja białek
    1. Przenieść 210 μl wzmocnionego buforu RIPA (krok 4.1.1) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Po umyciu próbki PBS (etap 1.2.3) przenieść mały fragment tkanki przeznaczony do ekstrakcji białka (około 3mm3 VS lub 5 mm długości GAN) do probówki zawierającej bufor RIPA i umieścić ją na lodzie na co najmniej 10 minut. Jeśli badasz ufosforylowane formy białek, uzupełnij bufor RIPA inhibitorami proteazy i fosfatazy14. W międzyczasie można przeprowadzić kroki dla innych elementów przetwarzania tkanki, takich jak utrwalenie (sekcja 7).
    3. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
    4. Za pomocą plastikowego tłuczka homogenizować tkankę w probówce zawierającej bufor RIPA. Sonikuj tkankę przez 10-15 s przy 20% amplitudzie. Upewnij się, że próbka pozostaje na lodzie, nawet podczas sonikacji.
    5. Wirować przez 10 minut przy 15 000 x g i temperaturze 4 °C.
    6. Porcjować supernatant w odstępach co 50 μl do nowych probówek o pojemności 0,5 ml (w zależności od zamierzonych dalszych zastosowań można wybrać dowolną wielkość przyrostu).
    7. Porcje lizatu białkowego należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia dalszych zastosowań (np. testów ELISA lub Western Blot)20,21.

5. Pierwotna kultura ludzka kontra kultura

  1. Dzień 1
    1. Oddzielić tkankę VS przeznaczoną do hodowli komórkowej (która znajdowała się w pożywce hodowlanej, jak opisano w kroku 1.2.6) na około 1 mm3 części, używając pary kleszczy w każdej ręce.
    2. Odessać pożywkę zawierającą cząstki guza za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 25 °C.
    4. Przygotować pożywkę do rozpadu w nowym naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm, łącząc 4,7 ml uzupełnionej pożywki DMEM/F-12 z 250 μl kolagenazy (stężenie końcowe: 160 U/ml) i 50 μl hialuronidazy (stężenie końcowe: 250 U/ml), aby uzyskać końcową objętość 5 ml.
      UWAGA: Oba enzymy powinny być przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C, ale rozmrożone przed przygotowaniem tej pożywki (krok 1.2.2).
    5. Po odwirowaniu kawałki guza utworzą osad na dnie stożkowej rurki. Ostrożnie odpipetować i wyrzucić supernatant.
    6. Dodać 2 ml świeżo przygotowanej pożywki dezintegracyjnej zawierającej enzymy (krok 5.1.4) do osadu guza. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby zmobilizować tkankę i przenieść fragment guza zawierający pożywkę do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm.
    7. Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 18 godzin.
  2. Dzień 2
    1. Ciepła pożywka DMEM/F-12 uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny (przygotowana w kroku 1.1) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Wyjąć z inkubatora płytkę Petriego zawierającą kulturę VS (krok 5.1.7). Za pomocą igły 22 G dołączonej do strzykawki o pojemności 6 ml odessać pożywkę zawierającą kulturę i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 37 °C.
    4. W międzyczasie użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić wymaganą liczbę szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną i lamininą na 24-dołkowej płytce hodowlanej.
      UWAGA: Liczba studzienek, które mają być hodowane, zależy od wielkości próbki; Z guza o wielkości 1 cm3 można wyhodować około 24-32 dołki, więc w przypadku większości mniejszych guzów właściwe jest zaplanowanie 8-16 dołków hodowanych komórek.
    5. Po odwirowaniu odrzucić supernatant (tj. pożywkę wzbogaconą enzymatami) i ponownie zawiesić pozostałą osadkę komórkową w świeżym, uzupełnionym pożywce DMEM/F-12, wstępnie ogrzanej w kroku 5.2.1.
      UWAGA: Objętość, w której należy ponownie zawiesić osad, zależy od liczby studzienek zaplanowanych w kroku 5.2.4, szacując 1 ml pożywki na planowaną studzienkę.
    6. Odessać 2 ml zawiesiny komórkowej (etap 5.2.5) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Umieścić 1 ml pożywki zawierającej komórki nowotworowe w każdym przygotowanym dołku na 24-dołkowej płytce.
    7. Kontynuuj zasysanie i odkładanie pożywki zawierającej komórki nowotworowe (zasysanie w odstępach co 2 ml, z czego 1 ml jest deponowany w każdym planowanym dołku), aż zawiesina komórek nowotworowych zostanie równo podzielona między wszystkie przygotowane studzienki.
    8. Umieścić na noc 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. Dzień 3
    1. Jeśli na dnie studzienek zauważy się znaczne zanieczyszczenia, należy ostrożnie zmienić pożywkę w każdym dołku na nową uzupełnioną pożywkę hodowlaną DMEM/F-12, uważając, aby nie usunąć przylegających komórek. W przeciwnym razie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i zmienić podłoże po raz pierwszy w dniu 5.
  4. Dni 5-7 i później
    1. Zmieniaj podłoże co 3 dni.
      UWAGA: Pierwotne ludzkie komórki VS i GAN są na ogół utrzymywane w hodowli do czasu ich wykorzystania w dalszych zastosowaniach, w wieku około 14 dni. Czystość kultury zmniejsza się po tym19.

6. Pierwotna ludzka kultura GAN

  1. Dzień 1
    1. Pod mikroskopem preparacyjnym wyizolować pęczki z tkanki przeznaczonej do hodowli GAN (która znajdowała się w pożywce hodowlanej, jak opisano w kroku 1.2.6).
      1. Odizoluj pęczki od epineurium i osłonki włóknistej, ciągnąc za krocze za pomocą kleszczy nr 5, jednocześnie zaciskając epineurium kleszczami nr 3.
    2. Gdy pęczki zostaną wystarczająco odizolowane od otaczającego je epineurium, przenieś je do nowego naczynia hodowlanego zawierającego 2 ml świeżej suplementowanej pożywki.
    3. Pokrój pęczki na segmenty od 1 do 2 mm za pomocą ostrza skalpela.
    4. Odpipetować małe kawałki pęczka i otaczające je podłoże do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml świeżej, uzupełnionej pożywki hodowlanej, tak aby całkowita objętość w probówce o pojemności 15 ml wynosiła 5 ml.
    5. Odwirować próbkę przez 3 minuty w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 25 °C.
    6. W międzyczasie przygotuj pożywkę do hodowli komórek Schwanna na nowej szalce Petriego o średnicy 60 mm, łącząc 4,7 ml uzupełnionej pożywki DMEM/F-12, 250 μl kolagenazy i 50 μl hialuronidazy, aby uzyskać końcową objętość 5 ml.
      UWAGA: Przechowywać oba enzymy w temperaturze -20 °C; Rozmrozić je w temperaturze pokojowej przed przygotowaniem tego podłoża (krok 1.2.2).
    7. Po odwirowaniu próbki pęczki skondensują się w mały granulek w stożkowej probówce. Odrzucić supernatant.
    8. Dodać 2 ml świeżo przygotowanej pożywki dezintegracyjnej zawierającej enzymy (krok 6.1.6) do osadu nerwowego. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby zmobilizować tkankę i przenieść ją do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm.
    9. Umieść naczynie w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 20-22 godz.
      UWAGA: Jest to inkubacja dłuższa niż jest to konieczne w przypadku próbek VS (krok 5.1.7).
  2. Dzień 2
    1. Ciepłe podłoże z dodatkiem DMEM/F-12 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Za pomocą igły o pojemności 22 g dołączonej do strzykawki o pojemności 6 ml odessać pożywkę zawierającą hodowlę komórkową i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 37 °C.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbkę w nowej, wstępnie ogrzanej, uzupełnionej pożywce hodowlanej DMEM/F-12.
    5. Za pomocą sterylnych kleszczyków umieść wymaganą liczbę powlekanych szkiełek nakrywkowych w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej.
      UWAGA: Obliczenie dwóch studzienek hodowanych komórek na 1-centymetrową próbkę nerwu sprzyja silnemu wzrostowi hodowli.
    6. Dodać 1 ml pożywki zawierającej kulturę do każdego wyznaczonego dołka na płytce 24-dołkowej.
    7. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Dzień 3
    1. Jeśli w studzienkach zauważy się znaczne zanieczyszczenia, ostrożnie zastąp pożywkę nową uzupełnioną pożywką hodowlaną DMEM/F-12, uważając, aby nie usunąć przylegających komórek. W przeciwnym razie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i zmienić podłoże po raz pierwszy w dniu 5.
  4. Dni 5-7 i później
    1. Zmieniaj podłoże co 3 dni.

7. Fiksacja tkanek VS i GAN

  1. Odpipetować 1-1,2 ml 4% paraformaldehydu (PFA; UWAGA) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Po umyciu guza lub nerwu PBS (krok 1.2.3), przenieść mały kawałek tkanki (około 3mm3 VS lub 5 mm długości GAN) do 4% PFA i umieścić probówkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze.
  3. Po co najmniej 2 godzinach utrwalania wyjmij probówkę z wytrząsarki i przystąp do dalszej obróbki (np. zatopienia w parafinie lub związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) do późniejszej immunohistochemii lub immunofluorescencji)22,23,24. Alternatywnie, tkankę można zamrozić zatrzaskowo, jak opisano wcześniej25,26.

8. Pobieranie i przechowywanie ludzkiej perylimfy podczas translabiryntowej resekcji VS

  1. Umieść trzy sterylne probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    UWAGA: Jedna probówka będzie przechowywana jako zapasowa na wypadek zanieczyszczenia.
  2. Napełnij jedną probówkę o pojemności 1,5 ml około 1,2 ml roztworu PBS, który został dwukrotnie przefiltrowany za pomocą filtra 0,22 μm.
    UWAGA: Aby pobrać perylimfę podczas translabiryntowej resekcji VS, chirurg musi najpierw upewnić się, że pole operacyjne jest wolne od pyłu kostnego, krwi lub soli fizjologicznej. W tym celu chirurg może użyć rurki ssącej Schuknecht 21 lub 24 G w ręce niedominującej.
    Typowym miejscem, z którego pobiera się perylimfę, jest boczny kanał półkolisty (jednak można również uzyskać dostęp do tylnego kanału półkolistego lub okrągłej błony okiennej, w zależności od preferencji chirurga). Chirurg powinien ostrożnie usunąć kość błędnika za pomocą wiertła diamentowego (przy użyciu ciągłego irygacji ssącej), aby zidentyfikować niebieską linię (tj. błędnik błoniasty) kanału półkolistego. Kanał półkolisty jest penetrowany przez niebieską linię za pomocą długiej igły 27 G przymocowanej do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml.
  3. Poproś chirurga, aby delikatnie zasysał niewielką ilość perylimfy, a następnie przekazał strzykawkę i dołączoną igłę pielęgniarce chirurgicznej.
    UWAGA: Zazwyczaj zbiera się kroplę perylimfy lub mniej. Jeśli obserwowana objętość jest większa, próbka jest prawdopodobnie zanieczyszczona innym płynem.
  4. Bezpośrednio przed użyciem należy otworzyć przygotowaną, pustą probówkę o pojemności 1,5 ml i probówkę napełnioną PBS. Uważaj, aby nie dotknąć wnętrza pokrywek tubek podczas ich otwierania.
  5. Otrzymać strzykawkę i dołączoną igłę od pielęgniarki chirurgicznej i całkowicie usunąć płyn do pustej probówki, uważając, aby nie dotknąć igły samej probówki.
  6. Ostrożnie odłączyć igłę od strzykawki. Nie zanieczyszczać końcówki igły i nadal trzymać ją w jednej ręce.
    UWAGA: Zebrano bardzo małą objętość perylimfy, więc pewna ilość płynu może pozostać w długiej końcówce igły.
  7. Drugą ręką należy użyć samej strzykawki (bez igły) do zassania 0,2 ml przefiltrowanego roztworu PBS z przygotowanej probówki do korpusu strzykawki.
  8. Ponownie przymocować igłę do strzykawki. Całkowicie opróżnić strzykawkę do probówki zawierającej perylimfę, używając sterylnego PBS do przepłukania końcówki igły.
  9. Zamknij probówkę zawierającą perylimfę i PBS i umieść ją na lodzie.
  10. Wyrzuć igłę do pojemnika na ostre przedmioty.
  11. Umieścić probówkę zawierającą perylimfę w zamrażarce w temperaturze -80 °C tak szybko, jak to możliwe.

9. Gromadzenie i przechowywanie ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego

  1. Umieść trzy (lub więcej) sterylne probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    UWAGA: Jedna probówka będzie kopią zapasową w przypadku zanieczyszczenia lub objętości próbki większej niż oczekiwano.
  2. Po otwarciu opony twardej należy poprosić chirurga o pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml (bez dołączonej igły).
    UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu, pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego powinno odbyć się natychmiast po otwarciu opony twardej.
  3. Poproś chirurga, aby podał strzykawkę pielęgniarce chirurgicznej.
  4. Otrzymać strzykawkę od pielęgniarki chirurgicznej i całkowicie usunąć wymaganą objętość płynu mózgowo-rdzeniowego do probówki (probówek).
  5. Zamknij probówkę (rurki) i umieść je na lodzie.
  6. Umieść probówkę (probówki) w zamrażarce o temperaturze -80 °C tak szybko, jak to możliwe.

10. Eksperymenty z transdukcją wirusa dla pierwotnych komórek VS

  1. Korzystając ze stężenia zapasów wirusa jako punktu odniesienia, oblicz pożądaną liczbę genomu (gc) i wielokrotność infekcji (MOI) niezbędne do proponowanego eksperymentu transdukcji; zapas wirusa można rozcieńczyć bezpośrednio w uzupełnionej pożywce hodowlanej.
    UWAGA: Można użyć dowolnego wektora wirusowego odpowiedniego do pierwotnej transdukcji komórki; zobacz Landegger et al. (2017), aby uzyskać szczegółowe porównanie sześciu różnych serotypów wirusa związanego z adenowirusem27. Dodatkowo, podczas hodowli pierwotnych komórek ludzkich, liczba komórek zwykle nie jest określana przed posiewem na szkiełkach nakrywkowych. Pierwotne komórki VS nie reagują dobrze na trypsynizację i pasażowanie, więc w celu uzyskania wiarygodnych obliczeń MOI liczbę przylegających komórek na studzienkę można oszacować za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Alternatywnie, jeśli komórki znajdują się blisko konfluencji, ich liczbę można wiarygodnie oszacować, używając standardowych wartości gęstości komórek dla płytki 24-dołkowej (np. 5 x 104 komórki na dołek).
  2. Pod okapem z przepływem laminarnym przygotować uzupełnioną pożywkę zawierającą pożądaną ilość wirusa w stożkowej probówce laboratoryjnej o pojemności 15 ml, tak aby przygotować 1 ml pożywki zawierającej wirusa dla każdej studzienki komórek, która ma być transdukowana. Odpipetować pożywkę zawierającą wirusa w górę i w dół, aby delikatnie, ale dokładnie wymieszać.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś szkiełka nakrywkowe zawierające pierwotne komórki VS (krok 5.2.8) z oryginalnej płytki 24-dołkowej na nową płytkę 24-dołkową. Po przeniesieniu każdego pojedynczego szkiełka nakrywkowego dodać 1 ml pożywki zawierającej wirusa. Obracaj płytką za każdym razem, gdy dodawana jest pożywka, aby upewnić się, że komórki są równomiernie pokryte wirusem.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez czas trwania planowanego doświadczenia.
    UWAGA: Inkubacje trwające od 48 do 120 godzin wykazały obiecujące wyniki transdukcji27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne ludzkie komórki VS w hodowli, przygotowane zgodnie z sekcją 5, mogą służyć jako informatywne modele procesów związanych z chorobą w wielu późniejszych zastosowaniach badawczych (Rysunek 1). Zdrowe komórki Schwanna hodowane w sekcji 6 stanowią bezpośredni i pouczający punkt odniesienia. Jak opisano poniżej, obszerne dane z VS i GAN opracowane zgodnie z tą jednolitym ramami metodologicznymi są dostępne w wielu wcześniej opublikowanych artykułach

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy manuskrypt opisuje ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad VS, przedstawiając zarys jednoczesnego przetwarzania ludzkich próbek VS i GAN do dalszych zastosowań badawczych. W miarę jak badania VS wkraczają w erę medycyny precyzyjnej, przygotowanie tej samej próbki w formie zdolnej do udzielenia odpowiedzi na wiele pytań badawczych umożliwi odkrycie wglądów molekularnych, komórkowych, genetycznych i proteomicznych specyficznych dla poszczególnych pacjentów.

Czystość ludzkich kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych R01DC015824 (K.M.S.) i T32DC00038 (wspierające J.E.S i S.D.), grant Departamentu Obrony W81XWH-14-1-0091 (K.M.S.), Fundację Bertarelli (K.M.S.), Fundację Nancy Sayles Day (K.M.S.), Centrum Badań nad Szumami Usznymi Lauer (K.M.S.), oraz Fundacja Barnesa (K.M.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 Niemieckie szkiełko nakrywkoweCorning354087Lub przygotuj szkiełka nakrywkowe z Corning Laminin (CB-40232) i Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
Probówki wirówkowe CELLSTAR 15 mL, stożkowe dno, podziałka, sterylneGreiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 mL Probówki wirówkowe, stożkowe dno, podziałka, sterylnyGreiner Bio-One227261
Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 60 mmGreiner Bio-One628160
Kolagenaza z Clostridium histolyticum, sterylnie filtrowanaSigma-AldrichC1639
Costar 24 dobrze przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, sterylneCorning3526
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian, bez glutaminy, 500 mlThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 mlKleszcze Thermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3, DumoxelFine Science Tools11231-30Autoklaw przed użyciem
Dumont #5 Kleszcze, standardowa końcówka, InoxFine Science Tools11251-20Autoklaw przed użyciem
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowane, zatwierdzone przez USDA, 500 mlThermo Fisher Scientific10437-028Podwielokrotność w probówkach 50 ml i przechowywać w temperaturze -20& C zamrażarka
Hialuronidaza z jąder bydlęcych, typ I-S, liofilizowany proszekSigma-AldrichH3506
Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, 33 mm, sterylnyEMD MilliporeSLGP033RS
Paraformaldehyd, klasa odczynnika, krystalicznaSigma-AldrichP6148Przed użyciem: Ustal standardowe procedury operacyjne w oparciu o protokoły dostępne online
PBS, pH 7,4, 500 mlAutoklaw Thermo Fisher Scientific10010-023przed użyciem
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL), 100 mlThermo Fisher Scientific15140-122
PhosSTOP Tabletki inhibitora fosfatazyRoche04906845001
Pierce Tabletki inhibitora proteazyThermo Fisher Scientific88666
Pipety i końcówki do pipet, 5/10/25 mLZmienny
plastikowy tłuczek homogenizacyjny do mikroprobówek 1,5/2,0 mlE& K ScientificEK-10539
Igły PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 calaBD301629
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115
RNAlater (roztwór stabilizujący RNA)Thermo Fisher ScientificAM7021
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 0,5 mlautoklawEppendorf022363719
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 1,5 mlAutoklaw Eppendorf022363204przed użyciem
Sól fizjologiczna - 0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, bakteriostatyczny, 20 mlHospira0409-1966-05
Ostrza skalpela - #15Fine Science Tools10015-00
Schuknecht Rura ssąca 24 gaugeBausch + LombN1698 42Przydatny do dostępu chirurgicznego (oprócz typowych otologicznych narzędzi chirurgicznych) i np. niebieski marker chirurgiczny
Pojemnik na próbki, LUB sterylny, 4OZMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C Mikroskop stereoskopowyZeiss000000-1106-133
Kombinacja strzykawka/igła, końcówka Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 cal.BD309630
Tylko strzykawka tuberkulinowa, końcówka poślizgowa, 1 mlBD309659
Tylko strzykawka tuberkulinowa, końcówka poślizgowa, 3 mlBD309656
Homogenizator ultradźwiękowy, seria 4710, sonda CV18Cole-ParmerCP25013
przed użyciem

Bibliografia

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215(2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki Schwannapierwotna hodowla kom rkowapobieranie wydzieliny nowotworowejkonserwacja RNAekstrakcja bia ekfiksacja tkankiwirusy towarzysz ce adenowirusompodej cie translabiryntoweprotok hodowli kom rkowej
Ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad schwannomakiem przedsionkowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.