Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Summary

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Abstract

Tworzenie funkcjonalnych obwodów nerwowo-mięśniowych opiera się na precyzyjnych połączeniach między rozwijającymi się aksonami motorycznymi a docelowymi mięśniami. Neurony ruchowe wydłużają stożki wzrostu, aby poruszać się po określonych ścieżkach, reagując na dużą liczbę wskazówek przewodnich aksonów, które emanują z otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego. Rozpoznawanie celu stożka wzrostu również odgrywa kluczową rolę w specyficzności nerwowo-mięśniowej. W niniejszej pracy przedstawiono standardowy protokół immunohistochemiczny do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Protokół ten obejmuje kilka kluczowych kroków, w tym procedurę genotypowania, w celu sortowania pożądanych zmutowanych zarodków; procedura barwienia immunologicznego w celu znakowania zarodków przeciwciałem przeciwko fasciclin II (FasII); oraz procedura preparacji w celu wytworzenia filetowanych preparatów z utrwalonych zarodków. Projekcje aksonów ruchowych i wzorce mięśniowe na obrzeżach są znacznie lepiej uwidocznione w płaskich preparatach filetowanych zarodków niż w zarodkach pełnomocowanych. W związku z tym, filetowane przygotowanie utrwalonych zarodków barwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do charakteryzowania genów wymaganych do odnajdywania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celu, a także może być stosowane zarówno do badań genetycznych utraty funkcji, jak i wzmocnienia funkcji.

Introduction

Precyzyjne i selektywne połączenia między aksonami motorycznymi a docelowymi mięśniami podczas rozwoju embrionalnego są niezbędne do prawidłowego poruszania się u larw Drosophila. Embrionalny wzór 30 włókien mięśniowych w każdym z półsegmentów brzusznych A2-A7 jest ustalany przez etap 16¹. 36 neuronów ruchowych, które są generowane w brzusznym rdzeniu nerwowym, rozciąga swoje aksony na obrzeża, aby unerwić określone mięśnie docelowe². Odnajdywanie ścieżki aksonu ruchowego i rozpoznawanie celu można zwizualizować za pomocą immunohistochemii z przeciwciałem (mysie przeciwciało monoklonalne 1D4)^3,4. Wiele obrazów wzorców projekcji aksonów motorycznych w zarodkach typu dzikiego jest dostępnych na stronie internetowej⁵. Przeciwciało 1D4 oznacza wszystkie aksony ruchowe i trzy podłużne pęczki aksonów po każdej stronie linii środkowej embrionalnego ośrodkowego układu nerwowego (OUN)^4,6 (Rysunek 1C i Rysunek 2A). W związku z tym immunohistochemia z przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do identyfikacji genów wymaganych do połączeń nerwowo-mięśniowych w celu zademonstrowania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kierowania aksonami ruchowymi i rozpoznawania celów.

W każdym z półsegmentów brzusznych A2-A7, aksony motoryczne wystają i selektywnie łączą się na dwie główne gałęzie nerwowe, nerw segmentowy (SN) i nerw międzysegmentowy (ISN)^2,4, oraz mniejszą gałąź nerwową, nerw poprzeczny (TN)⁷. SN selektywnie defacykuluje, dając początek dwóm gałęziom nerwowym zwanym SNa i SNc, podczas gdy ISN dzieli się na trzy gałęzie nerwowe zwane ISN, ISNb i ISNd^2,4. Wśród nich wzorce projekcji aksonów motorycznych ISN, ISNb i SNa są najdokładniej wizualizowane, gdy zarodki w późnym stadium 16 są barwione przeciwciałem FasII i filetowane (Rysunek 1C i Figura 2A). Neurony ruchowe ISN rozciągają swoje aksony do unerwienia mięśni grzbietowych 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 i 20^2,4 (Rysunek 2A). Neurony ruchowe ISNb unerwiają mięśnie brzuszno-boczne 6, 7, 12, 13, 14, 28 i 30^2,4 (Rysunek 2A i 2B). Gałąź nerwowa SNa wystaje do unerwienia mięśni bocznych 5, 8, 21, 22, 23 i 24^2,4 (Rysunek 2A). TN, który składa się z dwóch aksonów motorycznych, wystaje ipsilateralnie wzdłuż granicy segmentu, aby unerwić mięsień 25 i tworzy synapsy z bocznym dwubiegunowym neuronem dendrytycznym (LBD) na peryferii⁷ (Rysunek 2A). Te docelowe unerwienie mięśni wymaga nie tylko selektywnej defacykulacji aksonów ruchowych w określonych punktach wyboru, ale także rozpoznania mięśni docelowych. Ponadto niektóre przypuszczalne mezodermalne komórki przewodnie, które działają jako cele pośrednie, zostały znalezione zarówno w szlakach ISN, jak i SNa, ale nie wzdłuż szlaku ISNb⁴. Może to sugerować, że odnajdywanie ścieżki aksonu motorycznego ISNb może być regulowane w odmienny sposób w porównaniu z prowadzeniem aksonów motorycznych ISN i SNa, a także wskazuje, że peryferyjne prowadzenie aksonów motorycznych stanowi atrakcyjny model eksperymentalny do badania zróżnicowanych lub konserwatywnych ról pojedynczej cząsteczki wskazującej naprowadzanie⁸.

Ta praca przedstawia standardową metodę wizualizacji wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. Opisane protokoły obejmują sposób preparowania utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem 1D4 i przetworzonych w 3,3′-diaminobenzydynie (DAB) do filetowanych preparatów. Jedną z kluczowych zalet płaskich preparatów utrwalonych zarodków jest lepsza wizualizacja projekcji aksonalnych i wzorców mięśniowych na obrzeżach. Co więcej, praca ta pokazuje również, w jaki sposób genotypować utrwalone zarodki w celu sortowania pożądanych zmutowanych zarodków za pomocą metody barwienia LacZ.

Protocol

1. Przygotowanie

1. Przygotować 500 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) z roztworem t-oktylofenoksypolietylenu (PBT), dodając 0,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5 ml t-oktylofenoksyetoksyetanolu (patrz tabela materiałów) do 500 ml 1X PBS i mieszając przez co najmniej 30 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Stosować w miarę świeżej i przechowywać roztwór w czystej butelce.
2. Przygotuj 10 ml 4% paraformaldehydu, dodając 2,5 ml 16% podstawowego roztworu paraformaldehydu i 1 ml 10x PBS do 6,5 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia.
   UWAGA: Unikać kontaktu skóry z roztworem paraformaldehydu, ponieważ jest on wysoce toksyczny.
3. Przygotować substrat X-Gal (10% w/v X-Gal w dimetylosulfotlenku (DMSO)) przez rozpuszczenie 0,1 g substratu X-Gal na 1 ml DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 100 μl porcji.
4. Przygotować roztwór barwiący X-Gal przy użyciu 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 3 mM K₄[FeII(CN)₆], 3 mM K₃[FeIII(CN)₆] i 0,3% t-oktylofenoksyetoksyetanolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
5. Przygotuj 3% roztwór nadtlenku wodoru, rozcieńczając 30% nadtlenku wodoru w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną.
6. Przygotować roztwór 3,3′-diaminobenzydyny (DAB), całkowicie rozpuszczając 1 tabletkę (10 mg) DAB w 35 ml świeżego roztworu PBT. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C w 910 μl porcji.
   UWAGA: Wyrzuć wszystkie odpady DAB do wybielacza, aby zniszczyć DAB.
7. Zrób talerze jajkowe z sokiem jabłkowym. Dodać 35 g agaru i 1 l wody dejonizowanej do kolby o pojemności 2 l. Do kolby o pojemności 1 litra dodać 33 g sacharozy, 2 g tegoseptu i 375 ml soku jabłkowego. Rozpuść je w autoklawie przez 30 minut. Pozostawić oba roztwory do ostygnięcia do temperatury około 60 °C. Połączyć i dobrze wymieszać te roztwory, mieszając. Wlać ~11 ml połączonego roztworu na 60 mm naczynie hodowlane.
8. Przygotuj pastę drożdżową, mieszając drożdże piekarskie z wodą dejonizowaną (w stosunku 1:0,8) i przechowuj w temperaturze 4 °C.

2. Pobieranie zarodków (Dzień 1)

1. Zbierz młode samice i samce much (młodsze niż 5 dni) i przez 1-2 dni trzymaj je w plastikowej klatce z talerzem jajowym (60 mm x 15 mm), który zawiera niewielką ilość pasty drożdżowej pośrodku.
2. W celu optymalnego pobrania zarodków w późnym stadium 16 należy ustawić koszyk na bidon z muchami (> 50) około godziny 17:00 i pozwolić im złożyć jaja w temperaturze 25 °C przez 3 godziny.
3. Przenieś muchy do butelki ze świeżym jedzeniem.
4. Zamknij talerz jaj pokrywką i inkubuj go do góry nogami w temperaturze 25 °C w nawilżanym inkubatorze (~70% wilgotności) przez noc.

3. Przygotowanie zarodków do barwienia immunologicznego (Dzień 2)

1. Dodaj 1,8 ml roztworu PBT do talerza jaj około godziny 10:20 i użyj bawełnianego wacika, aby poluzować zarodki z płytki, przechylając ją.
   Uwaga: Delikatnie rozgniatając pastę drożdżową za pomocą bawełnianego wacika, rozpuść ją w przypadku, gdy znajdzie się na niej duża liczba zarodków. Rozpocznij pobieranie zarodków ~40 minut przed fiksacją (około godziny 11:00).
2. Przenieś zarodki z płytki jajowej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml.
3. Pozwól zarodkom się uspokoić i odessać roztwór PBT tak bardzo, jak to możliwe. Przepłukać zarodki dwukrotnie 1 ml roztworu PBT. Zasysać roztwór PBT tak bardzo, jak to możliwe.
4. Napełnij probówkę 1 ml 50% wybielacza (tj. rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej) i zdekorionuj zarodki, inkubując je na nutatorze przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
   Uwaga: Ten etap nie zabija zarodków z odkorionowaną zarodkami.
5. Pozwól zarodkom z odciętą kosmówką się uspokoić, odessaj 50% wybielacza tak bardzo, jak to możliwe, i przepłucz zarodki 3 razy 1 ml roztworu PBT.
6. Dodać 0,5 ml heptanu, a następnie dodać 0,5 ml 4% roztworu paraformaldehydu do probówki w temperaturze pokojowej około godziny 11:00.
7. Inkubować zarodki na nutatorze przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
8. Usuń 4% roztwór paraformaldehydu (dolna warstwa).
9. Dodaj 0,5 ml 100% metanolu i zdewitelinizuj zarodki, energicznie potrząsając probówką przez 30 sekund.
10. Usuń heptan (tj. górną warstwę).
11. Dodaj 0,5 ml 100% metanolu i energicznie potrząsaj probówką przez 10 sekund.
12. Pozwól zarodkom się uspokoić, stukając w rurkę i odessaj metanol tak bardzo, jak to możliwe. Opłucz zarodki 1 ml 100% metanolu, wstrząsając przez mniej niż 10 s.
    Uwaga: Długotrwała ekspozycja na metanol niszczy aktywność β-Gal.
13. Usunąć metanol i przepłukać zdewitynizowane zarodki 3 razy 1 ml roztworu PBT.

4. Genotypowanie zarodków za pomocą barwienia LacZ (Dzień 2)

1. Dodać 1 ml roztworu PBT do probówki i inkubować probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C lub łaźni wodnej przez 15 minut.
2. Podczas inkubacji umieścić roztwór barwiący X-Gal (1 ml na probówkę) w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej, aż stanie się mętny. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Odessać roztwór PBT i dodać do probówki 1 ml roztworu barwiącego X-Gal i 20 μl podłoża X-Gal.
4. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C z nutacją, aż do uzyskania widocznego niebieskiego osadu.
   Uwaga: Czas inkubacji dla 2. i 3. niebieskiej wyważarki wynosi na ogół od 2 do 4 godzin.
5. Usuń roztwór barwiący X-Gal i spłucz zarodki 3 razy 1 ml roztworu RT PBT.
6. Za pomocą sondy igłowej lub kleszczy ręcznie posortuj zarodki o pożądanym genotypie (tj. niebarwione białe zarodki) za pomocą lekkiego mikroskopu preparacyjnego (obiektywy 1,6X-2,5X).
   Uwaga: Ponieważ niektóre niebieskie równoważniki, takie jak CyO, aktyna-LacZ i TM3, aktyna-LacZ, przenoszą transgeniczny konstrukt eksprymujący bakteryjny β-Gal (LacZ) pod kontrolą promotora aktyny, zarodki zabarwione na niebiesko w wszechobecny sposób zawierają jedną lub dwie kopie chromosomów niebieskiego balansera. Dlatego niebarwione białe zarodki są homozygotyczne pod względem pożądanego allelu letalnego.

5. Barwienie immunologiczne zarodków za pomocą przeciwciał anty-fasciclin II (Dzień 2-3)

1. Pobrać i przenieść zarodki o pożądanym genotypie (tj. niebarwione białe zarodki) do mikroprobówki o pojemności 0,5 ml za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
   Uwaga: Na tym etapie zarodki mogą być z grubsza klasyfikowane zgodnie z kryteriami morfologicznymi, w tym wzorcami segmentacji naskórka oraz strukturami głowy i ogona⁹. Podczas inwolucji głowy, między 10 a 16 godzinami po złożeniu jaj, zarodek ulega wyraźnemu zmniejszeniu najbardziej przedniego segmentu⁹.
2. Umyj zarodki raz 0,4 ml roztworu PBT i dodaj 0,3 ml roztworu blokującego (5% normalnej surowicy koziej i 5% DMSO w roztworze PBT).
3. Zablokuj zarodki za pomocą nutacji w RT na 15 minut.
4. Dodać 75 μl przeciwciała anty-fasciclin II i inkubować probówkę z nutacją w temperaturze pokojowej przez noc.
5. Umyj zarodki 4 razy 0,4 ml roztworu PBT przez co najmniej 20 minut na przemycie.
6. Dodać 0,3 ml roztworu blokującego (5% normalnej surowicy koziej w roztworze PBT) zawierającego kozie przeciwciało anty-mysie-HRP (2 μg/ml) i inkubować probówkę z nutacją w temperaturze pokojowej przez noc.
7. Umyj zarodki 6 razy 0,4 ml roztworu PBT przez co najmniej 20 minut na płukanie.
8. Dodać 0,3 ml roztworu DAB do probówki.
   UWAGA: Załóż rękawice i umieść wszystkie odpady/tuby/końcówki DAB w wybielaczu.
9. Dodać 2 μl 3% nadtlenku wodoru i inkubować probówkę w ciemności z nutacją w temperaturze pokojowej, aż do wytworzenia pożądanej ilości osadu.
   Uwaga: Czas inkubacji dla immunohistochemii 1D4 ogólnie waha się od 0,5-1 godziny.
10. Przemyć zarodki 4 razy 0,4 ml roztworu PBT.
    UWAGA: Usuń roztwór DAB i pierwsze dwa płukania pipetą i wyrzuć je do wybielacza.
11. Dodać 0,2 ml 70% roztworu glicerolu/PBS do probówki i przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
    Uwaga: Trzymaj rurkę z dala od światła. Bardziej klarowne preparaty można uzyskać, umieszczając zarodki w 90% roztworze glicerolu/PBS¹⁰. Jednak trudniej jest wypreparować zarodki oczyszczone w 90% roztworze glicerolu/PBS niż te oczyszczone w 70% roztworze glicerolu/PBS¹⁰.

6. Inscenizacja, preparacja, montaż i obrazowanie zarodków (Dzień 4)

1. W celu oceny stopnia zaawansowania przenieść zarodki zrównoważone 70% glicerolem/PBS na szkiełko podstawowe.
2. Zbierz zarodki w późnym stadium 16, które mają nerwy ISN segmentu brzusznego 7 (A7), A8 i A9 zbiegające się, aby się stykać lub / i mają jelito środkowe podzielone na trzy pasma.
   Uwaga: Zarodki barwione przeciwciałem 1D4 mogą być klasyfikowane na podstawie wzorców projekcji aksonów motorycznych ISN i ISNb. Po wyjściu z OUN, nerwy A7, A8 i A9 ISN zarodków w późnym stadium 16 zbiegają się, aby się stykać, a następnie rozchodzą się, aby rozciągnąć się daleko do mięśni grzbietowych (grot strzałki w Ryc. 1A). Jednak w zarodkach w środkowym stadium 16 nerwy ISN A7 rozciągają się równolegle z nerwami A8/A9 (nawias kwadratowy w Ryc. 1B). Ponadto osie projekcyjne nerwów A6 ISNb (prostopadłych do mięśni brzuszno-bocznych) w obu półsegmentach są z grubsza wyrównane z tylnym końcem pęczków aksonów podłużnych OUN (strzałki i linia w Rysunek 1C). Te kryteria morfologiczne różnią się nieco w zależności od różnych genotypów. Alternatywnie, zarodki mogą być klasyfikowane na podstawie morfologii jelit^9,11. Przed etapem 17 jelito środkowe ma kształt przypominający serce, podczas gdy jelito środkowe jest podzielone na trzy pasma według etapu 17¹².
3. Wypreparuj zarodki.
   1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyjmij każdy zarodek z kropli glicerolu i umieść zarodek brzusznie do góry. Odetnij przednią część na 1/4 długości ciała i najbardziej tylny obszar, który jest wolny od aksonów motorycznych.
   2. Za pomocą sondy igłowej wyjmij odcięty koniec zarodka z kropli glicerolu, zwiń, aby ustawić go grzbietem do góry i umieść poziomo na polu.
      Uwaga: Kiedy zarodek jest usuwany z kropli glicerolu, odrobina glicerolu związanego z zarodkiem sprawia, że staje się on lepki.
   3. Przeciąć zarodek wzdłuż grzbietowej linii środkowej za pomocą pojedynczej, bardzo cienkiej igły wolframowej¹³. Wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu zarodka, a następnie kontynuuj cięcie grzbietowej linii środkowej w kierunku przedniej; Cięcie w przeciwnym kierunku jest również w porządku.
   4. Za pomocą sondy igłowej przenieś zarodek przecięty w linii środkowej do kropli glicerolu, umieść go grzbietem do góry i odłącz jelito od ściany ciała, rozkładając każdą ścianę ciała w kierunku brzuszno-bocznym (ukośnym) (obiektyw 2,5x).
      Uwaga: Upewnij się, że grzbietowa linia środkowa jest całkowicie przecięta, co spowoduje całkowite oddzielenie lewej i prawej ściany ciała.
   5. Ostrożnie wysuń zarodek wycięty w linii środkowej z kropli glicerolu, a następnie połóż dwa płaty ściany ciała na szkiełku podstawowym za pomocą sondy cienkoigłowej (obiektyw 2,5x).
   6. Za pomocą bardzo cienkiej igły wolframowej usuń narządy wewnętrzne z wypreparowanego zarodka, popychając je na boki (obiektyw 5X).
      Uwaga: Bardziej szczegółowy opis innej podobnej procedury preparacji można znaleźć na stronie internetowej⁵.
4. Do montażu dodaj 2-3 μl 70% roztworu glicerolu/PBS do czystych, wypreparowanych zarodków i za pomocą sondy cienkoigłowej przenieś je na nowe szkiełko podstawowe, na którym rozprowadzono 8 μl 70% roztworu glicerolu/PBS w środku (obiektyw 2,5X).
5. Założyć szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm). Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego zwykłym lakierem do paznokci (przezroczystym lub kolorowym jest w porządku).
6. Rejestruj obrazy w wysokiej rozdzielczości (obiektywy zanurzeniowe 20X, 40X i 63X) pod mikroskopem świetlnym z kontrastem interferencyjnym (DIC), zgodnie z instrukcjami producenta.
   Uwaga: Lepsza wizualizacja i charakterystyka fenotypowa, szczególnie w przypadku aksonów motorycznych ISNb, można uzyskać przy użyciu obiektywu 63X z zanurzeniem w olejku.

Results

Precyzyjne połączenia między aksonami motorycznymi a docelowymi mięśniami podczas rozwoju neuronalnego zależą od selektywnego odpychania aksonów-aksonów i rozpoznawania celów w określonych punktach wyboru⁴. U Drosophila selektywne odpychanie między aksonami motorycznymi jest częściowo regulowane przez połączone działanie semaforyn klasy 1 i 2 (Semas), w tym Sema-1a, Sema-2a i Sema-2b^8,14,

Discussion

Szczegóły wad prowadzenia aksonów motorycznych są oceniane szybciej i z większą dokładnością przez filetowane przygotowanie zarodków barwionych DAB niż przez laserową skaningową mikroskopię konfokalną zarodków znakowanych fluorescencyjnie. W związku z tym filetowany preparat zarodków utrwalonych i wybarwionych 1D4 najlepiej nadaje się do funkcjonalnej charakterystyki cząsteczek wskazówek. Cztery główne klasy wskazówek naprowadzających, w tym netryny, szczeliny, semaforyny (Semas) i efryny oraz ich pokrewne receptory mają...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surowica bydlęca Albumina	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-oktylofenoksyetoksyetanol
16% roztwór paraformaldehydu	Ted Pella	18505
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P5405
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	30435
Jednozasadowy fosforan sodu	Sigma-Aldrich	71500
Podłoże X-Gal	US Biological	X1000	X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galaktozyd galaktopiranozyd)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
Heksacyjanożelazian(II) potasu trójwodny	Sigma-Aldrich	P9387
Heksacyjanożelazian(III)	Sigma-Aldrich	244023
Nadtlenek wodoru	Sigma-Aldrich 216763
Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sacharoza	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (4-hydroksybenzoesan metylu)	Sigma-Aldrich	H5501
Naczynie hodowlane (60 mm)	Corning	430166
Zlewka Tricon	Simport	B700-100	Służy do wykonania plastikowej klatki na zlewkę do pobierania zarodków.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Drożdżowy czerwony
wacik bawełniany (drewniany bawełniany z pojedynczą końcówką PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Wybielacz	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Metanol	J.T. Baker	UN1230
technologie życia	w surowicy koziej	16210-064
przeciwciał anty-FasciculinII	Bank Hybridoma	1D4 anty-Fasciclin II
Koza Przeciwciało anty-mysie-HRP	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment kozy Anty-mysia IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Szkło ślizgowe	Duran Group	235501403
Szkiełko nakrywkowe	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Strzykawka	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Igła wolframowa	Ted Pella	#27-11	Drut wolframowy, ø 0,13 mm/6,1 m (ø. 005"/20 stóp)
Nutator (Mini twister)	Koreańska nauka	KO. VS-96TWS	Alternatywnie, nutator marki BD Clay Adams (BD 421125)