Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

37.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55833

⸱

1 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Clinical Microbiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Streszczenie

Miana przeciwciał są powszechnie używane jako zastępcze markery do ochrony serologicznej przed grypą i innymi patogenami. Szczegółowa wiedza na temat produkcji przeciwciał przed i po szczepieniu jest niezbędna do zrozumienia odporności indukowanej przez szczepionkę. W tym artykule opisano wiarygodny protokół punkt po punkcie do określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Pierwszy protokół opisuje metodę określania ilości antygenu wymaganych do hemaglutynacji, która standaryzuje stężenia do późniejszego wykorzystania w drugim protokole (test hemaglutynacji, test HA). Drugi protokół opisuje kwantyfikację mian przeciwciał specyficznych dla grypy przeciwko różnym szczepom wirusa przy użyciu seryjnego rozcieńczania surowicy ludzkiej lub supernatantów z hodowli komórkowych (test hamowania hemaglutynacji, test HI).

Jako przykład, pokazujemy odpowiedź przeciwciał zdrowej kohorty, która otrzymała trójwalentną inaktywowaną szczepionkę przeciw grypie. Dodatkowo pokazano reaktywność krzyżową między różnymi wirusami grypy i wyjaśniono metody minimalizacji reaktywności krzyżowej przy użyciu różnych typów zwierzęcych krwinek czerwonych (RBC). Dyskusja zwraca uwagę na zalety i wady prezentowanych testów oraz na to, w jaki sposób określenie miana przeciwciał swoistych dla grypy może poprawić zrozumienie odporności związanej ze szczepionką.

Wprowadzenie

Zakażenie wirusem grypy wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i wysokimi kosztami opieki zdrowotnej1,2,3,4. W szczególności osoby starsze, noworodki, kobiety w ciąży i pacjenci z chorobami przewlekłymi są narażeni na cięższe wyniki kliniczne. W związku z tym szczepienie przeciwko krążącym szczepom wirusa grypy jest podstawowym środkiem mającym na celu zmniejszenie obciążenia chorobami w tych populacjach wysokiego ryzyka. Wzrost indywidualnej odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu, np. przeciwciała swoiste dla grypy powyżej progu ochronnego, zmniejsza indywidualne ryzyko infekcji i ogólnie prawdopodobieństwo transmisji wirusa w populacji5. Szczegółowe zrozumienie humoralnej odpowiedzi immunologicznej wywołanej szczepionką w różnych populacjach i w różnych grupach wiekowych jest kluczowym elementem odpowiedzi na ważne pytania kliniczne6,7,8,9, takie jak: Dlaczego niektórzy starsi pacjenci mają infekcje pomimo wcześniejszego szczepienia? Co to jest "dobra" i "wystarczająca" ochrona wywołana szczepionką? Jak często należy podawać szczepionkę pacjentowi z obniżoną odpornością, aby osiągnąć ochronne miano? Jaka jest najskuteczniejsza dawka? Jaki jest wpływ nowego adiuwantu na miana przeciwciał po szczepieniu? Pomiar produkcji przeciwciał specyficznych dla szczepionki może pomóc odpowiedzieć na te ważne pytania i poprawić wyniki szczepień.

Kwantyfikacja mian przeciwciał specyficznych dla wirusa może być przeprowadzona za pomocą różnych metod immunologicznych. Obejmuje to testy fazy stałej10 lub testy ELISA11, test HI12 oraz testy neutralizujące13. Metody oparte na teście ELISA umożliwiają badanie przesiewowe stosunkowo dużych ilości próbek surowicy pod kątem różnych antygenów. Również immunoglobuliny (Ig)M i IgG specyficzne dla patogenu mogą być badane oddzielnie. Chociaż charakterystyka antygenu, np. liniowa sekwencja aminokwasów lub cząstka wirusopodobna, może wpływać na wiązanie przeciwciał, spektrum potencjalnych epitopów jest bardzo szerokie i nie dostarcza informacji o tym, czy odpowiedź przeciwciała ma znaczenie funkcjonalne.

Natomiast test neutralizacji określa potencjał przeciwciał do funkcjonalnego hamowania infekcji komórek, a zatem odzwierciedla potencjał neutralizacji. Metoda ta jest jednak bardzo pracochłonna, wymaga hodowli określonych linii komórkowych i żywych wirusów, a co za tym idzie, jest czasochłonna, kosztowna i wymaga specjalnego sprzętu.

Ten artykuł opisuje krok po kroku protokół HI oparty na Światowej Organizacji Zdrowia (WHO)12 do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Hemagglutynacja jest charakterystycznym efektem niektórych wirusów prowadzącym do aglutynacji erytrocytów. Zahamowanie tego efektu za pomocą surowic pacjenta pozwala na pomiar stężeń przeciwciał hamujących, co odzwierciedla działanie neutralizujące.

Zmodyfikowaliśmy przepływ pracy protokołu WHO, aby umożliwić bardziej efektywną obsługę wielu próbek w tym samym czasie, a tym samym skrócić wymagany czas. Pierwszy protokół opisuje określenie potencjału aglutynacyjnego określonego antygenu grypy. W ten sposób określa się prawidłowe stężenie antygenu grypy dla drugiego protokołu. Ta część powinna być powtarzana z każdym nowym antygenem wirusowym, a także z każdą partią krwi.

Drugi protokół opisuje oznaczanie mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Przedstawione protokoły są zoptymalizowane pod kątem badania próbek wirusa grypy i surowicy ludzkiej, jednak mogą być również stosowane do próbek surowicy myszy lub supernatantów z kultur komórkowych ze stymulowanych komórek odpornościowych, np. limfocytów B specyficznych dla wirusa. Wyniki można określić jako bezwzględne zmierzone miana. W wielu badaniach nad szczepionkami średnia geometryczna miana i 95% przedział ufności są pokazane dla każdej poszczególnej populacji. Dla interpretacji seroprotekcja lub serokonwersja są często używane do opisania podatności populacji na określonego wirusa. Seroprotekcję definiuje się jako miano ≥1:40, a serokonwersję jako ponad 4-krotny wzrost miana wraz z osiągnięciem miana seroprotekcyjnego między dwoma punktami czasowymi (najczęściej stosuje się miano przed szczepieniem i 30 dni po szczepieniu).

Oba protokoły są łatwe w użyciu i mogą być dostosowane do szerokiego zakresu pytań badawczych. W szczególności mogą być używane do wiarygodnego i szybkiego określania miana przeciwciał przeciwko różnym innym wirusom zdolnym do hemaglutynacji, takim jak odra, poliomawirusy, świnka lub różyczka14,15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły badań zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (www.EKNZ.ch), a od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę.

1. Pobieranie surowicy

  1. Pobierz próbki surowicy od ludzi w wybranych punktach czasowych. W niniejszym badaniu surowice pobierano w dniach 0 (moment szczepienia przeciw grypie) oraz +7, +30, +60 i +180 po szczepieniu.
  2. Aby uzyskać surowicę, odwiruj probówki z próbkami przy 1,20 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C).
    UWAGA: Nieodwirowane próbki krwi należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez 24 h.
  3. Rozdziel surowicę do osobnych probówek (probówek kriogenicznych) i zamroź w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  4. Kolejne analizy wykonuj partiami, obejmując wszystkie punkty czasowe dla jednej osoby, aby zminimalizować zmienność w obrębie jednego pacjenta.

2. Przygotowanie antygenów

UWAGA: Wykorzystano pięć różnych antygenów (patrz Tabela materiałów). Antygeny należy przygotować w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).

  1. Zgodnie z instrukcją producenta, należy zrekonstytuować całkowitą zawartość jednej ampułki z liofilizowanym antygenem grypy za pomocą 1.0 mL wody destylowanej i pozostawić rozpuszczony antygen na minimum 5 min w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do dalszych czynności.
  2. Rozdzielić roztwór antygenu do probówek o pojemności 1.5 mL i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Przygotowanie filtratu cholery

UWAGA: Filtrat cholery jest wykorzystywany jako enzym niszczący receptory (RDE) zgodnie z protokołem WHO12. Pozwala to na usunięcie z surowicy inhibitorów wrodzonych, które mogłyby zakłócić przebieg analizy17.

  1. Rekonstytuuj liofilizowany RDE zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przechowuj roztwór RDE w probówce 15 mL w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

4. Analiza HA

UWAGA: Aby zapewnić porównywalność testów HI pomiędzy kilkoma płytkami, na każdą z nich należy użyć tej samej ilości cząsteczek wirusa. Test HA (zwany również mianowaniem HA) wykonuje się w celu ilościowego oznaczenia cząsteczek wirusa niezbędnych do hemaglutynacji, a wynik zapisuje się w jednostkach HA. „Jednostka” hemaglutynacji jest jednostką operacyjną zależną od metody mianowania HA i nie jest pomiarem bezwzględnej ilości wirusa. Zatem jednostkę HA definiuje się jako ilość wirusa potrzebną do aglutynacji równej objętości standaryzowanej zawiesiny RBC. Według WHO standardowa ilość stosowana w teście HI to 4 jednostki HA na 25 µL. Ilustracja zasady testu HA znajduje się na Rysunku 1.

Schemat hamowania hemaglutynacji; interakcje wirusa, erytrocytów i przeciwciał; wyniki immunologiczne.
Rysunek 1Zasada hemaglutynacji i inhibicji hemaglutynacji. W sytuacji kontrolnej negatywnej, bez obecności wirusów i przeciwciał, nie dochodzi do hemaglutynacji (lewa kolumna), a erytrocyty ulegają hemaglutynacji wyłącznie w obecności wirusa grypy (środkowa kolumna). Jednakże, gdy hemaglutynina wirusa grypy zostanie zablokowana przez swoiste przeciwciała przeciwwirusowe, hemaglutynacja nie może zajść (prawa kolumna). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

UWAGA: Stosowane RBC zależą od rodzaju wirusa grypy w analizie (Tabela 1). Ponadto, w przypadku różnych typów płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych, czas inkubacji, a także wygląd nieaglutynowanych komórek różnią się od siebie (Tabela 2).

Antygen grypyA/California/7/09 (H1N1)A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2)A/Texas/50/2012 (H3N2)B/Brisbane/60/08B/Massachusetts/02/2012
gatunki RBCKurczakŚwinia morskaŚwinia morskaIndykIndyk

Tabela 1: Antygeny grypy i odpowiadające im gatunki erytrocytów (RBC). Zgodnie z instrukcjami producenta (NIBSC).

gatunki RBCKurczakIndykKawiarekludzka grupa krwi O
Stężenie RBC (v/v)0.75%0.75%1%1%
Typ płytki mikrotitracyjnejdniem w kształcie litery Vdna w kształcie litery Vdno w kształcie litery Udno w kształcie litery U
Czas inkubacji, temperatura pokojowa30 min30 min1 godzina1 godzina
Wygląd nieaglutynowanych komórekPrzyciskPrzyciskWitaj/Dzień dobrywitaj

Tabela 2: Warunki testu dla różnych gatunków RBC. Zgodnie z protokołem WHO. (* przepływ podczas przechylania).

  1. Przygotowanie zawiesiny erytrocytów (RBC)
    1. Rozcieńczyć roztwór zapasowy zawiesiny RBC (10%, v/v; z wyjątkiem ludzkich grupy O) (patrz Tabela materiałów) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby uzyskać odpowiednie stężenia dla erytrocytów ptasich (0,75%) oraz ssaczych (1%).

Schemat testu aglutynacji hemocytów; metoda rozcieńczeń seryjnych; detekcja antygenu; etapy przygotowania PBS i zawiesiny erytrocytów.
Rysunek 2Układ płytki w teście HA.  Miareczkowanie HA wykonuje się w dwóch powtórzeniach. Do rzędów kontrolnych nie dodano antygenu. Patrz również Rycina 4 w celu wyznaczenia optymalnego stężenia antygenu. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie 96-dołkowej mikropłytki miareczkowej
    UWAGA: Patrz Rysunek 2 w celu uzyskania przeglądu projektu płytki.
    1. Dodaj 25 µL PBS do dołków od 1 do 12 w każdym użytym rzędzie płytki mikrotytracyjnej 96-dołkowej przy użyciu pipety wielokanałowej (Rycina 2). W przypadku pracy z erytrocytami (RBC) ptaków, np. kurczaka i indyka, należy używać mikro płytek miareczkowych w kształcie litery V. W przypadku pracy z erytrocytami (RBC) ssaków, np. świnki morskiej oraz ludzi grupy O, należy używać mikro płytek miareczkowych w kształcie litery U.Tabela 2).
    2. Dodaj 25 µL antygenu grypy do pierwszej studni w rzędach antygenowych, które są ułożone w duplikatach. Do rzędów kontrolnych nie dodaje się antygenu. W rzędach kontrolnych nie powinien wystąpić efekt hemaglutynacji; służą one jako kontrole negatywne (Rysunek 2).
    3. Przeprowadź szeregowanie dwukrotnych rozcieńczeń poprzez przenoszenie 25 µL z pierwszej studzienki w rzędach z antygenem do kolejnych studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Każdy stopień rozcieńczenia wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy.
    4. Odrzuć końcowy 25 µL ostatnich studzienek.
    5. Dodaj 25 µL PBS do studzienek od 1 do 12 w każdym użytym rzędzie za pomocą pipety wielokanałowej, aby osiągnąć całkowitą objętość wynoszącą 50 µL na dołek.
    6. Dodaj 50 µL zawiesiny RBC do każdej użytej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
    7. Ostrożnie ostukaj płytkę 10 razy z każdej z czterech stron, aby wymieszać zawartość.
    8. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować w temperaturze pokojowej przez odpowiedni czas, zależnie od zastosowanego gatunku erytrocytów (patrz Tabela 2). Nie przesuwać płytki podczas inkubacji.

Schemat wyników hemaglutynacji; wzory na płytce mikrotitracyjnej; pełna, częściowa, brak aglutynacji.
Rysunek 3Wzorce aglutynacji erytrocytów ptaków i ssaków. W pracy z erytrocytami ptaków stosuje się mikropłytki z dołkami w kształcie litery V. Odczyt przeprowadza się przy przechylonej płytce, a nieagglutynowane erytrocy zaczynają spływać, tworząc kształt przypominający łzę. W pracy z erytrocytami ssaków stosuje się mikropłytki z dołkami w kształcie litery U. Odczyt wykonuje się wówczas w pozycji poziomej, a nieagglutynowane erytrocy tworzą niewielki halo. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Odczyt płytki
    UWAGA: Odczyt różni się nieco w przypadku stosowania RBC ptaków w porównaniu do RBC ssaków ze względu na różny kształt dołków mikrotitracyjnych (Rysunek 3).
    1. Odczyt RBC ptaków
      1. Przechylić płytkę o 90° na 25 s.
        ​UWAGA: Przechylenie płytki jest kluczowe dla rozróżnienia wzorców u ptaków, ponieważ wszystkie trzy różne typy wzorców aglutynacji (całkowicie aglutynowane, częściowo aglutynowane i nieaglutynowane) w pozycji poziomej wyglądają jak guzek.
      2. Wyniki należy zaznaczyć natychmiast, gdy płytka jest wciąż przechylona, na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej. Wzorce aglutynacji RBC ptaków przedstawiono na Rysunku 3.
    2. Odczyt RBC ssaków
      1. Wyniki należy zaznaczyć na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, nie przechylając płytki (pozycja pozioma na blacie).
        UWAGA: W przypadku wystąpienia hemaglutynacji aglutynowane komórki nie opadają na dno, podczas gdy komórki nieaglutynowane tworzą halo na dnie dołka. Halo w przypadku komórek częściowo aglutynowanych jest mniej intensywne i ma większą średnicę (Rysunek 3).
    3. Wyznaczenie 4 jednostek HA.
      UWAGA: Punkt końcowy miana HA to ostatni dołek, w którym występuje całkowita hemaglutynacja. Dołek ten zawiera 1 jednostkę HA wirusa. Ze względu na dwukrotne rozcieńczenia antygenu, dołek znajdujący się dwa miejsca przed punktem końcowym miana HA zawiera 4 jednostki HA wirusa (Rysunek 4).

Schemat testu aglutynacji krwinkowej; oddziaływanie antygen-przeciwciało, wyniki mianowania, ilościowe oznaczenie antygenu.
Rycina 4Odczyt miareczkowania HA z użyciem ptasich erytrocytów w celu oznaczenia miana odpowiadającego 4 jednostkom HA.  Optymalna ilość antygenu wymagana do aglutynacji hemocytów jest mierzona za pomocą testu aglutynacji (testu mianowania antygenu). Ostatnia studzienka, w której zachodzi całkowita aglutynacja, stanowi punkt końcowy mianowania HA i zawiera 1 jednostkę HA. Ze względu na dwukrotne rozcieńczenia antygenu, dwie studzienki przed punktem końcowym mianowania HA miano odpowiada 4 jednostkom HA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Test HI

UWAGA: Przepływ pracy w protokole został zoptymalizowany, aby umożliwić bardziej efektywną obsługę wielu próbek jednocześnie, dzięki zastosowaniu pasków probówek do PCR i termocyklera (patrz poniżej).

  1. Przygotowanie próbek surowicy
    UWAGA: Próbki surowicy należy przygotować w laboratorium klasy BSL-2.
    1. Zamrożone próbki surowicy dla każdego punktu czasowego każdego badanego (patrz krok 1.2) rozmrozić w temperaturze pokojowej.
    2. Do probówki z paska probówek PCR (10 probówek w jednym pasku) przenieść alikwot 10 µL każdej rozmrożonej próbki surowicy.
      UWAGA: Dużą zaletą stosowania pasków probówek PCR jest możliwość użycia pipety wielokanałowej w kolejnych krokach testu HI; pozwala to zaoszczędzić czas przy badaniu dużej liczby próbek surowicy oraz podczas powtórnych pomiarów mian przeciwciał przeciwko różnym szczepom wirusa w tych samych próbkach.
    3. Alikwoty próbek surowicy w paskach probówek PCR przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    4. Na dzień przed wykonaniem testu HI rozmrozić w temperaturze pokojowej odpowiednie alikwoty próbek surowicy.
    5. Do pustej probówki PCR dodać 10 µL odpowiedniego antysurowicy.
      UWAGA: Antysurowica przeciwko konkretnemu wirusowi, służąca jako kontrola dodatnia, musi odpowiadać użytemu wirusowi. Kontrola dodatnia umożliwia standaryzację wyników uzyskanych z wielu płytek.
    6. Do każdej alikwoty surowicy oraz do antysurowicy dodać 30 µL roztworu filtratu cholery (stosunek 3 objętości filtratu cholery do 1 objętości surowicy), używając pipety wielokanałowej.
    7. Probówki PCR umieścić w statywie do płytek PCR 96-dołkowych lub w pustym pudełku na końcówki i mieszać w wortexie przez 5 s.
    8. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
    9. Próbki inkubować w temperaturze 56 °C przez 30 min w termocyklerze w celu inaktywacji filtratu cholery.
      UWAGA: W zależności od modelu termocyklera, ten krok można zaprogramować, aby dodatkowo zautomatyzować proces.
    10. Probówki PCR umieścić w statywie do płytek PCR 96-dołkowych lub w pustym pudełku na końcówki i mieszać wortexie przez 5 s.
    11. Próbki przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu wykonania testu HI.

Schemat eksperymentu z rozcieńczeniami seryjnymi z zastosowaniem metody wstecznego miareczkowania antyserum w celu analizy miana przeciwciał.
Rycina 5Projekt płytki i schemat postępowania w teście HI. Na jednej płytce można zmierzyć pięć punktów czasowych dla dwóch osób. Miano HI mieści się w zakresie od 8 do 1024. Jako kontrolę pozytywną posłużyło antiserum przeciwko zastosowanemu antygenowi, a w celu sprawdzenia, czy rozcieńczenie antygenu odpowiada 4 jednostkom HA, przeprowadzono titrację zwrotną. Przedstawiono rozcieńczenia seryjne próbek surowicy dla 2 poszczególnych biorców szczepionki.  Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. test HI
    UWAGA: Ilustracja zasady testu HI znajduje się w Rysunek 1W zależności od wirusa do analizy wykorzystuje się erytrocy różnych gatunków (Tabela 1). Różne gatunki erytrocytów stosuje się w różnych typach płytek 96-dołkowych, a czas inkubacji, jak i wygląd nieagglutynowanych komórek, różnią się (Tabela 2). W przypadku testu HI do serii dwukrotnych rozcieńczeń próbek dodaje się 4 jednostki HA wirusa lub antygenu.
    1. Przygotowanie roztworu antygenu
      1. Oblicz objętość wymaganego roztworu antygenu w zależności od liczby użytych płytek 96-dołkowych (25 µL ilość antygenu na dołek × 96 = 2,400 µL antygen na płytkę 96-dołkową; dodać 100 µL dodatkowa ilość na płytkę ze względu na zastosowanie zbiornika do pipety wielokanałowej; łącznie 2,5 ml antygenu na płytkę).
        UWAGA: Na przykład w przypadku pomiaru 10 próbek surowicy wymaganych jest 10 płytek (10 próbek na płytkę): 2,5 ml x 10 = łącznie potrzeba 25 ml roztworu antygenu.
      2. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie 4 jednostek HA dla obliczonej objętości, używając PBS.
        UWAGA: Dla testu HA wyznacza się 4 jednostki HA. Aby uzyskać odpowiednią ilość antygenu, należy podzielić obliczoną objętość przez miano odpowiadające 4 jednostkom HA. Na przykład, jeśli 4 jednostki HA odpowiadają rozcieńczeniu 1/64, a potrzebujemy 15,000 µL roztworu antygenu jest wymagane: 15 0/64 = 234.4 µL dodaje się rozpuszczonego liofilizowanego antygenu grypy.
    2. Przygotowanie zawiesiny erytrocytów
      1. Oblicz objętość potrzebnej zawiesiny erytrocytów w zależności od liczby użytych 96-dołkowych płytek miareczkowych (50 µL zawiesina RBC na dołek × 96 = 4,800 µL zawiesina erytrocytów na płytkę 96-dołkową; dodać 200 µL na płytkę więcej ze względu na zastosowanie zbiorniczka dla pipety wielokanałowej).
      2. Rozcieńczyć zawiesinę zapasową erytrocytów (zazwyczaj 10% v/v; z wyjątkiem ludzkich erytrocytów grupy O) w PBS, aby uzyskać odpowiednie stężenia dla erytrocytów ptasich (0,75%) oraz ssaków (1%).
    3. Przygotowanie 96-dołkowej płytki miareczkowej
      1. Oznakuj 96-dołkowe płytki mikrotytrucyjne (identyfikator próbki, kontrola dodatnia i miareczkowanie zwrotne). Proszę sprawdzić orientację płytki w Rycina 5 ostrożnie.
      2. Dodaj 25 µL PBS do każdej studzienki z wyjątkiem pierwszej studzienki w rzędzie „tytracji wstecznej” (Rysunek 5, 12th (rzędowi) za pomocą pipety wielokanałowej.
        UWAGA: Przeprowadzono miareczkowanie zwrotne, aby sprawdzić, czy zastosowane rozcieńczenie antygenu odpowiada 4 jednostkom HA. Miano antygenu wynoszące 4 jednostki HA jest stwierdzone, jeśli hemaglutynacja występuje w trzech pierwszych studzienkach rzędu „miareczkowania zwrotnego”, ale nie występuje w czwartej studzience.
      3. Dodaj 50 µL przygotowanego roztworu antygenu (opisanego w punkcie 5.2.1) do pierwszej studzienki rzędu „back titration” (12th rzędu).
      4. Dodaj 25 µL próbki surowicy traktowane RDE do pierwszych studzienek rzędów od 1 do 10 na każdej płytce, używając pipety wielokanałowej.
      5. Dodaj 25 µL odpowiedniego antyserum do pierwszej studzienki 1th rząd jako kontrola pozytywna.
      6. Przeprowadź seryjne rozcieńczenia dwukrotne poprzez przenoszenie 25 µL z pierwszej studzienki każdego rzędu (1–12) do kolejnych studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10–15 razy dla każdego stopnia rozcieńczenia. Te same końcówki można stosować dla każdego stopnia rozcieńczenia danej próbki.
      7. Odrzuć końcowy 25 µL ostatnich studzienek.
      8. Dodaj 25 µL roztworu antygenu za pomocą pipety wielokanałowej do każdej studzienki w rzędach od 1 do 1 (próbki surowicy i antysurowica). Można użyć tych samych końcówek, pod warunkiem, że nie dotknęły one studzienek.
      9. Dodaj 25 µL PBS zamiast antygenu do każdej studzienki w rzędzie „tytracji wstecznej” (12th rzędu).
      10. Ostrożnie postukaj płytkę 10 razy z każdej z czterech stron, aby wymieszać zawartość.
      11. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Nie przesuwać płytki podczas inkubacji.
      12. Dodaj 50 µL zawiesiny erytrocytów do każdego dołka.
      13. Ostrożnie ostukaj płytkę 10 razy z każdej z czterech stron, aby wymieszać zawartość.
      14. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować w temperaturze pokojowej przez odpowiedni czas, zależnie od użytego gatunku erytrocytów (patrz Tabela 2). Nie przesuwać płytki podczas inkubacji.
    4. Odczyt płytek
      UWAGA: Miano HI jest odwrotnością ostatniego rozcieńczenia (anty-)surowicy, która całkowicie hamuje aglutynację krwi. Należy wziąć pod uwagę, że surowice poddane działaniu RDE zostały już rozcieńczone 1:4, zatem po etapie rozcieńczeń seryjnych surowice w pierwszych dołkach są rozcieńczone 1:8, co odpowiada mianu HI wynoszącemu 8.
      1. Odczyt erytrocytów ptasich
        1. Przechyl płytkę 90° przez 25 s.
          UWAGA: Przechylenie płytki jest kluczowe dla rozróżnienia wzorów aglutynacji u ptaków, ponieważ wszystkie trzy różne typy wzorów aglutynacji (całkowicie aglutynowane, częściowo aglutynowane i nieaglutynowane) w przypadku braku przechylenia przyjmują formę skupiska (tzw. guzika).
        2. Zapisz wyniki niezwłocznie, gdy płytka wciąż znajduje się w pozycji nachylonej, na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej. Wzorce aglutynacji erytrocytów ptasich przedstawiono w Rysunek 3.
      2. Odczyt erytrocytów ssaków
        1. Zaznacz wyniki na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, nie przechylając płytki.
          UWAGA: W przypadku wystąpienia hemaglutynacji zaglutynowane komórki nie opadają na dno, podczas gdy komórki niezaglutynowane tworzą pierścień na dnie studzienki. Pierścień częściowo zaglutynowanych komórek jest mniej intensywny i ma większą średnicę (Rycina 3).
        2. Wyznacz HI dla każdej próbki i przenieś wynik do tabeli komputerowej (Rycina 6)
        3. UWAGA: Studzienki z częściową aglutynacją uznawano za mniejszy miano. Na przykład, jeśli próbka surowicy całkowicie hamuje hemaglutynację do 4. studzienki (rozcieńczenie 1:64), a 5.th studzienka (rozcieńczenie 1:128) wykazuje częściową aglutynację, to w analizie końcowej miano HI ustala się na niższe miano wynoszące 64 (Rysunek 6, 4th rzędu).

Wykres testu hamowania hemaglutynacji, wyniki miareczkowania surowicy, badanie oddziaływań wirus-gospodarz.
Rycina 6Odczyt testu HI z użyciem ptasich erytrocytów. Odpowiedź przeciwciał specyficznych przeciwko grypie indukowaną przed i po szczepieniu określa się za pomocą testu HI. W tym przykładzie osoba pierwsza wykazuje wyższe miana HI niż osoba druga. Obie osoby wykazują odpowiedź przeciwciał po szczepieniu; 180 dni po szczepieniu miana przeciwciał u obu osób ponownie spadają. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Odpowiedź przeciwciał indukowana przed i po szczepieniu przeciwko grypie A H3N2
Odpowiedź przeciwciał indukowaną szczepionką oceniono u 26 zdrowych ochotników, którzy przed sezonem grypowym 2014/2015 otrzymali inaktywowaną trójskładnikową podjednostkową szczepionkę przeciw grypie zawierającą szczepy Influenza A/H1N1/California/209, A/H3N2/Texas/2012 oraz B/Massachusetts/02/2012. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywny przykład dla 2 osób za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kwantyfikacja mian przeciwciał swoistych dla wirusa grypy przed i po szczepieniu jest ważnym narzędziem niezbędnym do badań nad szczepionkami. W oparciu o zastępcze środki ochrony przed zakażeniem wirusem, takie jak seroprotekcja (>1:40) lub serokonwersja (4-krotne zwiększenie miana), można zoptymalizować strategie szczepień9. Korzystając z dostarczonych protokołów, można określić: (i) potencjał hemaglutynacji danego wirusa oraz (ii) miana przeciwciał dla wirusa będącego przedmiotem zainteresowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

A.E. otrzymało stypendium badawcze z programu "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), Uniwersytetu w Bazylei "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte", Stiftungsinfektionskrankheiten Basel oraz Bangeter Rhyner Stiftung. Projekt L.K. otrzymał stypendium Uniwersytetu Technicznego w Grazu w Austrii. J.L. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium doktoranckiego programu SystemsX.ch initiative in systems biology (9. zaproszenie ).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
25 ml Jednorazowe wielokanałowe zbiorniki na pipetyIntegra4312
8-dołkowe probówki do PCRMarka GMBH781332Do podwielokrotności surowicy
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania,TPP92097Do testu HI przy użyciu krwinek czerwonych
ssaków 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania, w kształcie litery VCorning Costar3897Do testu HI przy użyciu ptasich krwinek czerwonych
Aqua ad iniect. SterilBichsel AG1000004Do przygotowywania roztworów antygenu grypy i filtratu
RBC kurczaka (10%)CedarlanCLC880010% zawiesina czerwonych krwinek kurczaka w roztworze Alsevera
FiltratSigma-AldrichC8772Stosowany jako enzym niszczący receptory (RDE)
PBS DulbeccoSigma-AldrichD8537Do rozcieńczania próbek surowicy, krwinek czerwonych i antygenów
Eppendorf Pipeta wielokanałowa, 12-kanałowa, 10-100 i mikro; lPipeta wielokanałowa Sigma-AldrichZ683949
Eppendorf, 8-kanałowa, 10-100 i mikro; lSigma-AldrichZ683930
Świnka morska RBC (10%)CedarlaneCLC180010% zawiesina czerwonych krwinek świnki morskiej w roztworze Alsevera
Influenza Anti-A/California/7/09 Surowica HA NIBSC14/134 Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Surowica HA przeciw grypie Anti-A/Szwajcaria/9715293/2013 NIBSC14/272Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Surowica NIBSC13/178Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Surowica Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA NIBSC13/254 Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Grypa Anti-B/Massachusetts/02/2012 Surowica HA NIBSC13/182Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Antygen grypy A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) NIBSC12/168Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)  (ca. 46µ gHA/ml)
Antygen grypy A/Szwajcaria/9715293/2013 (NIB88)NIBSC14/254Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/Szwajcaria/9715293/2013 (NIB88) (ok. 55&mikro; gHA/ml)
Antygen grypy A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)NIBSC13/112Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) (ca. 74µ gHA/ml)
Antygen grypy B/Brisbane/60/2008NIBSC13/234Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus B/Brisbane/60/2008 (ok. 42&mikro; gHA/ml)
Antygen grypy B/Massachusetts/02/2012NIBSC13/134Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus B/Massachusetts/02/2012 (ok. 35&mikro; gHA/ml)
Surowica-ProbówkiS-Monovette, Sardstedt01.1601.100Do ekstrakcji surowicy z aktywatorem krzepnięcia
Pojedynczy dawca Ludzkie RBC, Typ 0Innowacyjne badaniaIPLA-WB3 Zawiesina krwinek czerwonych ludzkich od pojedynczego dawcy w roztworze Alsevera (ok. 26%)
Indyk RBC (10%)CedarlaneCLC118010% zawiesina czerwonych krwinek indyka w roztworze Alsevera
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco
w kształcie litery U

Bibliografia

  1. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).
  2. Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
  3. Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
  4. Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).
  5. Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042(2014).
  6. Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
  7. Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282(2015).
  8. Egli, A., et al. Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940(2014).
  9. O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420(2014).
  10. Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
  11. Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
  12. Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
  13. Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
  14. Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
  15. Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
  16. Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
  17. Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
  18. Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614(2014).
  19. Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
  20. Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test hamowania hemaglutynacjimiana przeciwciał przeciwko grypietest hemaglutynacjirozcieńczenia seryjneerytrocytysurowica traktowana RDEroztwór antygenupłytka mikrotitracyjna 96-dołkowareaktywność krzyżowaodporność indukowana szczepionką
Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.