Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

37.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55833

⸱

1 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Clinical Microbiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Streszczenie

Miana przeciwciał są powszechnie używane jako zastępcze markery do ochrony serologicznej przed grypą i innymi patogenami. Szczegółowa wiedza na temat produkcji przeciwciał przed i po szczepieniu jest niezbędna do zrozumienia odporności indukowanej przez szczepionkę. W tym artykule opisano wiarygodny protokół punkt po punkcie do określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Pierwszy protokół opisuje metodę określania ilości antygenu wymaganych do hemaglutynacji, która standaryzuje stężenia do późniejszego wykorzystania w drugim protokole (test hemaglutynacji, test HA). Drugi protokół opisuje kwantyfikację mian przeciwciał specyficznych dla grypy przeciwko różnym szczepom wirusa przy użyciu seryjnego rozcieńczania surowicy ludzkiej lub supernatantów z hodowli komórkowych (test hamowania hemaglutynacji, test HI).

Jako przykład, pokazujemy odpowiedź przeciwciał zdrowej kohorty, która otrzymała trójwalentną inaktywowaną szczepionkę przeciw grypie. Dodatkowo pokazano reaktywność krzyżową między różnymi wirusami grypy i wyjaśniono metody minimalizacji reaktywności krzyżowej przy użyciu różnych typów zwierzęcych krwinek czerwonych (RBC). Dyskusja zwraca uwagę na zalety i wady prezentowanych testów oraz na to, w jaki sposób określenie miana przeciwciał swoistych dla grypy może poprawić zrozumienie odporności związanej ze szczepionką.

Wprowadzenie

Zakażenie wirusem grypy wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i wysokimi kosztami opieki zdrowotnej1,2,3,4. W szczególności osoby starsze, noworodki, kobiety w ciąży i pacjenci z chorobami przewlekłymi są narażeni na cięższe wyniki kliniczne. W związku z tym szczepienie przeciwko krążącym szczepom wirusa grypy jest podstawowym środkiem mającym na celu zmniejszenie obciążenia chorobami w tych populacjach wysokiego ryzyka. Wzrost indywidualnej odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu, np. przeciwciała swoiste dla grypy powyżej progu ochronnego, zmniejsza indywidualne ryzyko infekcji i ogólnie prawdopodobieństwo transmisji wirusa w populacji5. Szczegółowe zrozumienie humoralnej odpowiedzi immunologicznej wywołanej szczepionką w różnych populacjach i w różnych grupach wiekowych jest kluczowym elementem odpowiedzi na ważne pytania kliniczne6,7,8,9, takie jak: Dlaczego niektórzy starsi pacjenci mają infekcje pomimo wcześniejszego szczepienia? Co to jest "dobra" i "wystarczająca" ochrona wywołana szczepionką? Jak często należy podawać szczepionkę pacjentowi z obniżoną odpornością, aby osiągnąć ochronne miano? Jaka jest najskuteczniejsza dawka? Jaki jest wpływ nowego adiuwantu na miana przeciwciał po szczepieniu? Pomiar produkcji przeciwciał specyficznych dla szczepionki może pomóc odpowiedzieć na te ważne pytania i poprawić wyniki szczepień.

Kwantyfikacja mian przeciwciał specyficznych dla wirusa może być przeprowadzona za pomocą różnych metod immunologicznych. Obejmuje to testy fazy stałej10 lub testy ELISA11, test HI12 oraz testy neutralizujące13. Metody oparte na teście ELISA umożliwiają badanie przesiewowe stosunkowo dużych ilości próbek surowicy pod kątem różnych antygenów. Również immunoglobuliny (Ig)M i IgG specyficzne dla patogenu mogą być badane oddzielnie. Chociaż charakterystyka antygenu, np. liniowa sekwencja aminokwasów lub cząstka wirusopodobna, może wpływać na wiązanie przeciwciał, spektrum potencjalnych epitopów jest bardzo szerokie i nie dostarcza informacji o tym, czy odpowiedź przeciwciała ma znaczenie funkcjonalne.

Natomiast test neutralizacji określa potencjał przeciwciał do funkcjonalnego hamowania infekcji komórek, a zatem odzwierciedla potencjał neutralizacji. Metoda ta jest jednak bardzo pracochłonna, wymaga hodowli określonych linii komórkowych i żywych wirusów, a co za tym idzie, jest czasochłonna, kosztowna i wymaga specjalnego sprzętu.

Ten artykuł opisuje krok po kroku protokół HI oparty na Światowej Organizacji Zdrowia (WHO)12 do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Hemagglutynacja jest charakterystycznym efektem niektórych wirusów prowadzącym do aglutynacji erytrocytów. Zahamowanie tego efektu za pomocą surowic pacjenta pozwala na pomiar stężeń przeciwciał hamujących, co odzwierciedla działanie neutralizujące.

Zmodyfikowaliśmy przepływ pracy protokołu WHO, aby umożliwić bardziej efektywną obsługę wielu próbek w tym samym czasie, a tym samym skrócić wymagany czas. Pierwszy protokół opisuje określenie potencjału aglutynacyjnego określonego antygenu grypy. W ten sposób określa się prawidłowe stężenie antygenu grypy dla drugiego protokołu. Ta część powinna być powtarzana z każdym nowym antygenem wirusowym, a także z każdą partią krwi.

Drugi protokół opisuje oznaczanie mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Przedstawione protokoły są zoptymalizowane pod kątem badania próbek wirusa grypy i surowicy ludzkiej, jednak mogą być również stosowane do próbek surowicy myszy lub supernatantów z kultur komórkowych ze stymulowanych komórek odpornościowych, np. limfocytów B specyficznych dla wirusa. Wyniki można określić jako bezwzględne zmierzone miana. W wielu badaniach nad szczepionkami średnia geometryczna miana i 95% przedział ufności są pokazane dla każdej poszczególnej populacji. Dla interpretacji seroprotekcja lub serokonwersja są często używane do opisania podatności populacji na określonego wirusa. Seroprotekcję definiuje się jako miano ≥1:40, a serokonwersję jako ponad 4-krotny wzrost miana wraz z osiągnięciem miana seroprotekcyjnego między dwoma punktami czasowymi (najczęściej stosuje się miano przed szczepieniem i 30 dni po szczepieniu).

Oba protokoły są łatwe w użyciu i mogą być dostosowane do szerokiego zakresu pytań badawczych. W szczególności mogą być używane do wiarygodnego i szybkiego określania miana przeciwciał przeciwko różnym innym wirusom zdolnym do hemaglutynacji, takim jak odra, poliomawirusy, świnka lub różyczka14,15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły badań zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (www.EKNZ.ch), a od wszystkich uczestników uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniu.

1. Pobieranie surowicy

  1. Pobrać próbki surowicy od ludzi w wybranych punktach czasowych. W niniejszym badaniu surowice pobierano w dniach 0 (moment szczepienia przeciw grypie) oraz +7, +30, +60 i +180 po szczepieniu.
  2. Aby uzyskać surowicę, odwirować probówki z próbkami przy 1,200 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C).
    UWAGA: Nieodwirowane próbki krwi należy przechowywać w temperaturze 4 °C, nie dłużej niż przez 24 h.
  3. Rozdzielić surowicę do oddzielnych probówek (probówek kriogenicznych) i zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  4. Kolejne analizy należy przeprowadzać partiami, obejmując wszystkie punkty czasowe jednej osoby, aby zredukować zmienność w obrębie pacjenta.

2. Przygotowanie antygenów

UWAGA: Wykorzystuje się pięć różnych antygenów (patrz Tabela materiałów). Antygeny należy przygotować w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).

  1. Zgodnie z instrukcjami producenta, zrekonstytuować całkowitą zawartość jednej ampułki z liofilizowanym antygenem grypy, dodając 1,0 mL wody destylowanej, a następnie pozostawić rozpuszczony antygen na minimum 5 min w temperaturze pokojowej przed dalszymi czynnościami.
  2. Rozdzielić roztwór antygenu do probówek o pojemności 1,5 mL i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Przygotowanie filtratu cholery

UWAGA: Filtrat cholery jest wykorzystywany jako enzym niszczący receptory (RDE) zgodnie z protokołem WHO12. Pozwala to na usunięcie z surowicy wrodzonych inhibitorów, które mogłyby zakłócić przebieg analizy17.

  1. Zrekonstytuuj liofilizowany RDE zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przechowuj roztwór RDE w probówce 15 mL w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

4. Test HA

UWAGA: Aby zapewnić porównywalność wyników testów HI pomiędzy kilkoma płytkami, do każdej płytki należy użyć tej samej ilości cząsteczek wirusa. Test HA (zwany również mianowaniem HA) wykonuje się w celu ilościowego oznaczenia cząsteczek wirusa niezbędnych do hemaglutynacji, a wynik zapisuje się w jednostkach HA. „Jednostka” hemaglutynacji jest jednostką operacyjną zależną od metody zastosowanej do mianowania HA i nie jest miarą bezwzględnej ilości wirusa. Zatem jednostka HA jest definiowana jako ilość wirusa potrzebna do aglutynacji równej objętości znormalizowanej zawiesiny RBC. Zgodnie z wytycznymi WHO, standardowa ilość stosowana w teście HI to 4 jednostki HA na 25 µL. Ilustrację zasady działania testu HA przedstawiono na Rysunku 1.

figure-protocol-1
Rycina 1: Zasada hemaglutynacji i inhibicji hemaglutynacji. W sytuacji kontroli negatywnej bez obecności wirusów i przeciwciał nie dochodzi do hemaglutynacji (lewa kolumna), a erytrocyty ulegają hemaglutynacji wyłącznie w obecności wirusa grypy (środkowa kolumna). Jednakże, gdy hemaglutynina wirusa grypy zostanie zablokowana przez swoiste przeciwciała przeciwwirusowe, hemaglutynacja nie może zajść (prawa kolumna). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Stosowane erytrocyty (RBCs) zależą od typu wirusa grypy w analizie (Tabela 1). Ponadto, w zależności od rodzaju płytek mikrotytrujących z 96 dołkami, różnią się czas inkubacji oraz wygląd nieaglutynowanych komórek (Tabela 2).

Antygen grypyA/California/7/09 (H1N1)A/Szwajcaria/9715293/2013 (H3N2)A/Texas/50/2012 (H3N2)B/Brisbane/60/08B/Massachusetts/02/2012
gatunki RBCKurczakŚwinia morskaŚwinka morskaIndykIndyk

Tabela 1: Antygeny grypy i odpowiadające im gatunki krwineczków czerwonych (RBC). Zgodnie z instrukcjami producenta (NIBSC).

gatunki RBCKurczakIndykŚwinia domowa (Cavia porcellus)Krew grupy 0 u ludzi
Stężenie erytrocytów (v/v)0.75%0.75%1%1%
Typ płytki mikrotitracyjnejdno w kształcie litery Vdna w kształcie litery Vdno w kształcie litery Udno w kształcie litery U
Czas inkubacji, temperatura pokojowa30 min30 min1 godzina1 godzina
Wygląd nieaglutynowanych komórekPrzyciskPrzycisk*WitajWitaj

Tabela 2: Warunki analizy dla różnych gatunków RBC. Zgodnie z protokołem WHO. (* przepływa po przechyleniu).

  1. Przygotowanie zawiesiny erytrocytów
    1. Rozcieńczyć zawiesinę stokową erytrocytów (10%, v/v; z wyjątkiem ludzkich typu O) (patrz Tabela materiałów) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby uzyskać odpowiednie stężenia dla erytrocytów ptasich (0,75%) i ssaków (1%).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Projekt płytek w teście HA.  Miareczkowanie HA przeprowadzono w duplikacie. Do rzędów kontrolnych nie dodawano antygenu. Patrz również Rysunek 4 w celu określenia optymalnego stężenia antygenu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie 96-dołkowej płytki mikrotytrowej
    UWAGA: Przegląd projektu płytki znajduje się na Rysunku 2 .
    1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 25 µL PBS do dołków od 1 do 12 każdego używanego rzędu 96-dołkowej płytki mikrotytrowej (Rysunek 2). W przypadku pracy z RBC ptaków, np. kurczaka i indyka, należy użyć płytki mikrotytrowej o kształcie litery V. W przypadku pracy z RBC ssaków, np. świnki morskiej i człowieka grupy krwi O, należy użyć płytki mikrotytrowej o kształcie litery U (Tabela 2).
    2. Dodaj 25 µL antygenu grypy do pierwszego dołka w rzędach z antygenem, które są ułożone w dubletach. Do rzędów kontrolnych nie dodaje się antygenu. Rzędy kontrolne nie powinny wykazywać efektu hemaglutynacji i służą jako kontrole ujemne (Rysunek 2).
    3. Wykonaj szeregowe rozcieńczenie dwukrotne, przenosząc 25 µL z pierwszego dołka rzędów z antygenem do kolejnych dołków za pomocą pipety wielokanałowej. Każdy stopień rozcieńczenia wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy.
    4. Odrzuć ostatnie 25 µL z końcowych dołków.
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 25 µL PBS do dołków od 1 do 12 każdego używanego rzędu, aby osiągnąć całkowitą objętość 50 µL na dołek.
    6. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 µL zawiesiny RBC do każdego używanego dołka.
    7. Aby wymieszać zawartość, ostrożnie opukaj płytkę 10 razy z każdej z czterech stron.
    8. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez odpowiedni czas w zależności od użytego gatunku RBC (patrz Tabela 2). Nie przesuwaj płytki podczas inkubacji.

figure-protocol-3
Rycina 3: Wzorce aglutynacji RBC ptaków i ssaków. Do pracy z RBC ptaków stosuje się mikropłytki w kształcie litery V. Odczyt przeprowadza się przy przechylonej płytce, a nieagglutynowane RBC zaczynają spływać, tworząc kształt przypominający łzę. Do pracy z RBC ssaków stosuje się mikropłytki w kształcie litery U. Odczyt jest wówczas wykonywany w pozycji nieprzechylonej, a nieagglutynowane RBC tworzą niewielką aureolę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Odczyt płytki
    UWAGA: Odczyt różni się nieco w przypadku użycia erytrocytów ptasich w porównaniu do erytrocytów ssaków, ze względu na różny kształt dołków mikrotytrujących (Rysunek 3).
    1. Odczyt erytrocytów ptasich
      1. Przechylić płytkę o 90° na 25 s.
        ​UWAGA: Przechylenie płytki jest kluczowe dla rozróżnienia wzorów u ptaków, ponieważ wszystkie trzy rodzaje wzorów aglutynacyjnych (całkowicie aglutynowane, częściowo aglutynowane i nieaglutynowane) wyglądają jak guzek, gdy płytka nie jest przechylona.
      2. Wyniki należy odnotować natychmiast, gdy płytka jest nadal w pozycji przechylonej, na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej. Wzory aglutynacji erytrocytów ptasich przedstawiono na Rysunku 3.
    2. Odczyt erytrocytów ssaków
      1. Wyniki należy odnotować na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, bez przechylania płytki (pozycja pozioma na blacie).
        UWAGA: W przypadku wystąpienia hemaglutynacji, aglutynowane komórki nie opadają na dno, podczas gdy komórki nieaglutynowane tworzą halo na dnie dołka. Halo komórek częściowo aglutynowanych jest mniej intensywne i ma większą średnicę (Rysunek 3).
    3. Wyznaczenie 4 jednostek HA.
      UWAGA: Punkt końcowy mianowania HA to ostatni dołek, w którym zachodzi całkowita hemaglutynacja. Dołek ten zawiera 1 jednostkę HA wirusa. Ze względu na dwukrotne rozcieńczenia antygenu, dołek znajdujący się dwa miejsca przed punktem końcowym mianowania HA zawiera 4 jednostki HA wirusa (Rysunek 4).

figure-protocol-4
Rysunek 4: Odczyt miareczkowania HA z wykorzystaniem ptasich RBC w celu wyznaczenia miana 4 jednostek HA.  Optymalna ilość antygenu niezbędna do wywołania hemaglutynacji jest mierzona za pomocą testu hemaglutynacji (test miareczkowania antygenu). Ostatnia studzienka, w której występuje pełna hemaglutynacja, stanowi punkt końcowy miareczkowania HA i zawiera 1 jednostkę HA. Ze względu na dwukrotne rozcieńczenia antygenu, dwie studzienki przed punktem końcowym miareczkowania HA miano odpowiada 4 jednostkom HA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Test HI

UWAGA: Przepływ pracy w protokole został zoptymalizowany, aby umożliwić bardziej efektywną obsługę wielu próbek jednocześnie, poprzez zastosowanie pasków probówek do PCR oraz termocyklera (patrz poniżej).

  1. Przygotowanie próbek surowicy
    UWAGA: Próbki surowicy należy przygotowywać w laboratorium klasy BSL-2.
    1. Zamrożone próbki surowicy z każdego punktu czasowego dla każdej osoby (patrz krok 1.2) rozmrozić w temperaturze pokojowej.
    2. Do probówki z pasku probówek do PCR (10 probówek w jednym pasku) przenieść alikwot 10 µL każdej rozmrożonej próbki surowicy.
      UWAGA: Dużą zaletą stosowania pasków probówek do PCR jest możliwość użycia pipety wielokanałowej w kolejnych etapach testu HI; pozwala to znacznie zaoszczędzić czas przy badaniu dużej liczby próbek surowicy oraz podczas wielokrotnych pomiarów mian przeciwciał przeciwko różnym szczepom wirusa w tych samych próbkach.
    3. Alikwoty próbek surowicy w paskach probówek do PCR przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    4. Na dzień przed wykonaniem testu HI rozmrozić w temperaturze pokojowej odpowiednie alikwoty próbek surowicy.
    5. Do pustej probówki do PCR dodać 10 µL odpowiedniego antyserum.
      UWAGA: Aby służyć jako kontrola dodatnia, antyserum przeciwko konkretnemu wirusowi musi być dopasowane do użytego wirusa. Kontrola dodatnia pozwala na standaryzację wyników dla wielu płytek.
    6. Do każdego alikwotu surowicy oraz do antyserum dodać 30 µL roztworu filtratu cholery (stosunek 3 objętości filtratu cholery do 1 objętości surowicy), używając pipety wielokanałowej.
    7. Umieścić probówki do PCR w statywie 96-dołkowym do PCR lub w pustym pudełku na końcówki i mieszać w wortexie przez 5 s.
    8. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
    9. Próbki inkubować w temperaturze 56 °C przez 30 min w termocyklerze w celu inaktywacji filtratu cholery.
      UWAGA: W zależności od modelu termocyklera krok ten można zaprogramować, aby dodatkowo zautomatyzować proces.
    10. Umieścić probówki do PCR w statywie 96-dołkowym do PCR lub w pustym pudełku na końcówki i mieszać w wortexie przez 5 s.
    11. Próbki przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu wykonania testu HI.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Projekt płytki i schemat pracy testu HI. Na jednej płytce można zmierzyć pięć punktów czasowych dla dwóch osób. Miano HI mieści się w zakresie od 8 do 1 024. Jako kontrolę dodatnią wykorzystano antyserum użytego antygenu, a w celu sprawdzenia, czy rozcieńczenie antygenu odpowiada 4 jednostkom HA, przeprowadzono miareczkowanie wsteczne. Przedstawiono rozcieńczenia seryjne próbek surowicy dla dwóch poszczególnych osób zaszczepionych.  Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. test HI
    UWAGA: Ilustracja zasady testu HI znajduje się w Rycina 1W zależności od rodzaju wirusa do analizy wykorzystuje się erytrocyty różnych gatunków (Tabela 1). Różne gatunki erytrocytów wykorzystuje się w różnych rodzajach płytek 96-dołkowych, a czas inkubacji oraz wygląd nieagglutynowanych komórek różnią się (Tabela 2). W teście HI do serii dwukrotnych rozcieńczeń próbek dodaje się 4 jednostki HA wirusa lub antygenu.
    1. Przygotowanie roztworu antygenu
      1. Oblicz objętość potrzebnego roztworu antygenu zgodnie z liczbą użytych płytek 96-dołkowych (25 µL antygen na studzienkę × 96 = 2,400 µL antygenu na płytkę 96-dołkową; dodać 100 µL dodatkowo na płytkę ze względu na zastosowanie zbiorniczka dla pipety wielokanałowej; łącznie 2,5 ml antygenu na płytkę).
        UWAGA: Na przykład, w przypadku pomiaru 100 próbek surowicy potrzebnych jest 10 płytek (10 próbek na płytkę): 2,5 ml x 10 = łącznie potrzeba 25 ml roztworu antygenu.
      2. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie 4 jednostek HA dla obliczonej objętości, używając PBS.
        UWAGA: Dla testu HA wyznacza się 4 jednostki HA. Aby uzyskać odpowiednią ilość antygenu, należy podzielić obliczoną objętość przez miano odpowiadające 4 jednostkom HA. Na przykład, jeśli 4 jednostki HA odpowiadają rozcieńczeniu 1/64, a potrzebujemy 15,000 µL roztworu antygenu jest wymagane: 15 000/64 = 234.4 µL dodaje się liofilizowany antygen grypy po rozpuszczeniu.
    2. Przygotowanie zawiesiny erytrocytów
      1. Oblicz objętość potrzebnej zawiesiny erytrocytów (RBC) w zależności od liczby użytych 96-dołkowych płytek mikrotytracyjnych (50 µL zawiesina RBC na dołek × 96 = 4,800 µL suspensja RBC na płytkę 96-dołkową; dodać 200 µL na płytkę więcej ze względu na zastosowanie zbiornika dla pipety wielokanałowej).
      2. Rozcieńczyć zawiesinę RBC z zapasu (zazwyczaj 10% v/v; z wyjątkiem grupy krwi O u ludzi) w PBS, aby uzyskać właściwe stężenia dla RBC ptasich i ssaczych, wynoszące odpowiednio 0,75% i 1%.
    3. Przygotowanie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej
      1. Oznacz płytki mikrotytrujące z 96 dołkami (identyfikator próbki, kontrola dodatnia i miareczkowanie wsteczne). Proszę sprawdzić orientację płytki w Rycina 5 starannie.
      2. Dodaj 25 µL PBS do każdej studzienki z wyjątkiem pierwszej studzienki "miareczkowanie wsteczne" rząd (Rycina 5, 12th (rzędu) za pomocą pipety wielokanałowej.
        UWAGA: Wykonano miareczkowanie zwrotne w celu sprawdzenia, czy zastosowane rozcieńczenie antygenu odpowiada 4 jednostkom HA. Miano antygenu wynoszące 4 jednostki HA stwierdza się, jeśli hemaglutynacja występuje w trzech pierwszych dołkach "miareczkowanie powrotne" w rzędzie, ale nie w czwartej studzience.
      3. Dodaj 50 µL przygotowanego roztworu antygenu (opisanego w punkcie 5.2.1) do pierwszej studni "miareczkowanie powrotne" rząd (12th rzęd.).
      4. Dodaj 25 µL próbki surowicy poddanej działaniu RDE do pierwszych studzienek w rzędach od 1 do 10 na każdej płytce, używając pipety wielokanałowej.
      5. Dodać 25 µL odpowiedniego antyserum do pierwszej studzienki 11th wiersz jako kontrola pozytywna.
      6. Wykonaj seryjne rozcieńczenia dwukrotne poprzez przeniesienie 25 µL z pierwszej studzienki każdego rzędu (1–12) do kolejnych studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10–15 razy dla każdego etapu rozcieńczenia. Te same końcówki można wykorzystać dla każdego etapu rozcieńczenia danej próbki.
      7. Odrzuć końcowy 25 µL ostatnich dołków.
      8. Dodaj 25 µL roztworu antygenu za pomocą pipety wielokanałowej do każdej studzienki w rzędach od 1 do 11 (próbki surowicy i antysurowica). Można używać tych samych końcówek, pod warunkiem, że nie dotykają one studzienek.
      9. Dodaj 25 µL PBS zamiast antygenu do każdej studzienki "miareczkowanie powrotne" rząd (12th rząd).
      10. Ostrożnie postukaj płytkę 10 razy z każdej z czterech stron, aby wymieszać zawartość.
      11. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Nie przesuwać płytki podczas inkubacji.
      12. Dodaj 50 µL zawiesiny erytrocytów do każdej studzienki.
      13. Ostrożnie postukaj płytkę 10 razy z każdej z 4 stron, aby wymieszać zawartość.
      14. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować w temperaturze pokojowej przez odpowiedni czas, zależnie od użytego gatunku erytrocytów (patrz Tabela 2). Nie przesuwać płytki podczas inkubacji.
    4. Odczyt płytki
      UWAGA: Miano HI to odwrotność ostatniego rozcieńczenia (anty-)surowicy, która całkowicie hamuje hemaglutynację. Należy wziąć pod uwagę, że surowice traktowane RDE zostały już uprzednio rozcieńczone 1:4, zatem po etapie rozcieńczeń seryjnych surowice w pierwszych dołkach są rozcieńczone 1:8, co odpowiada mianu HI równemu 8.
      1. Odczyt erytrocytów ptasich
        1. Przechyl płytkę 90° przez 25 s.
          ​UWAGA: Przechylenie płytki jest kluczowe dla rozróżnienia wzorów u ptaków, ponieważ wszystkie trzy rodzaje wzorów aglutynacji (całkowita aglutynacja, częściowa aglutynacja i brak aglutynacji) w przypadku braku przechylenia przyjmują postać guzka.
        2. Należy natychmiast odnotować wyniki na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, gdy płytka wciąż znajduje się w pozycji nachylonej. Wzory aglutynacji erytrocytów ptasich przedstawiono w Rycina 3.
      2. Odczyt erytrocytów ssaków
        1. Zaznacz wyniki na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, nie przechylając płytki.
          UWAGA: W przypadku wystąpienia hemaglutynacji zaglutinowane komórki nie opadają na dno, natomiast komórki niezaglutinowane tworzą halo na dnie studzienki. Halo komórek częściowo zaglutinowanych jest mniej intensywne i ma większą średnicę (Rycina 3).
        2. Wyznacz HI dla każdej próbki i przenieś dane do tabeli komputerowej (Rysunek 6)
        3. UWAGA: Studzienki z częściową aglutynacją uznawano za niższy miano. Na przykład, jeśli próbka surowicy całkowicie hamuje hemaglutynację do 4. studzienki (rozcieńczenie 1:64), a w 5.th jeśli w dołku (rozcieńczenie 1:128) występuje częściowa aglutynacja, to dla analizy końcowej miano HI przyjmuje się jako miano niższe, tj. 64 (Rysunek 6, 4th rząd).

figure-protocol-6
Rysunek 6: Odczyt testu HI z wykorzystaniem RBC ptaków. Odpowiedź przeciwciał specyficznych przeciwko grypie indukowana przed i po szczepieniu jest określana za pomocą testu HI. W tym przykładzie osoba pierwsza wykazuje wyższe miana HI niż osoba druga. Obie osoby wykazują odpowiedź przeciwciał po szczepieniu; 180 dni po szczepieniu miana przeciwciał u obu osób ponownie spadły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Odpowiedź przeciwciał indukowana przed i po szczepieniu przeciwko grypie A H3N2
Odpowiedź przeciwciał indukowaną przez szczepionkę oceniono u 26 zdrowych ochotników, którzy przed sezonem grypowym 2014/2015 otrzymali inaktywowaną trójwalentną podjednostkową szczepionkę przeciwko grypie zawierającą szczepy Influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 oraz B/Massachusetts/02/2012. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywny przykład dla 2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kwantyfikacja mian przeciwciał swoistych dla wirusa grypy przed i po szczepieniu jest ważnym narzędziem niezbędnym do badań nad szczepionkami. W oparciu o zastępcze środki ochrony przed zakażeniem wirusem, takie jak seroprotekcja (>1:40) lub serokonwersja (4-krotne zwiększenie miana), można zoptymalizować strategie szczepień9. Korzystając z dostarczonych protokołów, można określić: (i) potencjał hemaglutynacji danego wirusa oraz (ii) miana przeciwciał dla wirusa będącego przedmiotem zainteresowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

A.E. otrzymało stypendium badawcze z programu "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), Uniwersytetu w Bazylei "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte", Stiftungsinfektionskrankheiten Basel oraz Bangeter Rhyner Stiftung. Projekt L.K. otrzymał stypendium Uniwersytetu Technicznego w Grazu w Austrii. J.L. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium doktoranckiego programu SystemsX.ch initiative in systems biology (9. zaproszenie ).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
25 ml Jednorazowe wielokanałowe zbiorniki na pipetyIntegra4312
8-dołkowe probówki do PCRMarka GMBH781332Do podwielokrotności surowicy
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania,TPP92097Do testu HI przy użyciu krwinek czerwonych
ssaków 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania, w kształcie litery VCorning Costar3897Do testu HI przy użyciu ptasich krwinek czerwonych
Aqua ad iniect. SterilBichsel AG1000004Do przygotowywania roztworów antygenu grypy i filtratu
RBC kurczaka (10%)CedarlanCLC880010% zawiesina czerwonych krwinek kurczaka w roztworze Alsevera
FiltratSigma-AldrichC8772Stosowany jako enzym niszczący receptory (RDE)
PBS DulbeccoSigma-AldrichD8537Do rozcieńczania próbek surowicy, krwinek czerwonych i antygenów
Eppendorf Pipeta wielokanałowa, 12-kanałowa, 10-100 i mikro; lPipeta wielokanałowa Sigma-AldrichZ683949
Eppendorf, 8-kanałowa, 10-100 i mikro; lSigma-AldrichZ683930
Świnka morska RBC (10%)CedarlaneCLC180010% zawiesina czerwonych krwinek świnki morskiej w roztworze Alsevera
Influenza Anti-A/California/7/09 Surowica HA NIBSC14/134 Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Surowica HA przeciw grypie Anti-A/Szwajcaria/9715293/2013 NIBSC14/272Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Surowica NIBSC13/178Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Surowica Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA NIBSC13/254 Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Grypa Anti-B/Massachusetts/02/2012 Surowica HA NIBSC13/182Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI
Antygen grypy A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) NIBSC12/168Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)  (ca. 46µ gHA/ml)
Antygen grypy A/Szwajcaria/9715293/2013 (NIB88)NIBSC14/254Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/Szwajcaria/9715293/2013 (NIB88) (ok. 55&mikro; gHA/ml)
Antygen grypy A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)NIBSC13/112Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) (ca. 74µ gHA/ml)
Antygen grypy B/Brisbane/60/2008NIBSC13/234Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus B/Brisbane/60/2008 (ok. 42&mikro; gHA/ml)
Antygen grypy B/Massachusetts/02/2012NIBSC13/134Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus B/Massachusetts/02/2012 (ok. 35&mikro; gHA/ml)
Surowica-ProbówkiS-Monovette, Sardstedt01.1601.100Do ekstrakcji surowicy z aktywatorem krzepnięcia
Pojedynczy dawca Ludzkie RBC, Typ 0Innowacyjne badaniaIPLA-WB3 Zawiesina krwinek czerwonych ludzkich od pojedynczego dawcy w roztworze Alsevera (ok. 26%)
Indyk RBC (10%)CedarlaneCLC118010% zawiesina czerwonych krwinek indyka w roztworze Alsevera
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco
w kształcie litery U

Bibliografia

  1. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).
  2. Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
  3. Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
  4. Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).
  5. Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042(2014).
  6. Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
  7. Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282(2015).
  8. Egli, A., et al. Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940(2014).
  9. O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420(2014).
  10. Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
  11. Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
  12. Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
  13. Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
  14. Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
  15. Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
  16. Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
  17. Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
  18. Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614(2014).
  19. Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
  20. Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test hamowania hemaglutynacjimiana przeciwcia przeciwko grypietest hemaglutynacjirozcie czenia seryjneerytrocytysurowica traktowana RDEroztw r antygenup ytka mikrotitracyjna 96 do kowareaktywno krzy owaodporno indukowana szczepionk

Powiązane artykuły