Artykuł metodologiczny

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/55836

⸱

3 czerwca 2017

 , 
1Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Biology, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie jest kluczowe dla zrozumienia regulacji genów, przebudowy chromatyny i innych procesów rezydujących w chromatynie. Sieciowanie formaldehydu, a następnie immunoprecypitacja chromatyny i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe (X-ChIP-seq) zostały wykorzystane do uzyskania wielu cennych informacji na temat biologii genomu. Jednak X-ChIP-seq ma znaczące ograniczenia związane z sieciowaniem i sonikacją. Natywny ChIP pozwala uniknąć tych wad poprzez pominięcie sieciowania, ale często powoduje słabe odzyskiwanie białek związanych z chromatyną. Ponadto wszystkie metody oparte na ChIP podlegają rozważaniom na temat jakości przeciwciał. Enzymatyczne metody mapowania interakcji białko-DNA, które obejmują fuzję białka będącego przedmiotem zainteresowania z enzymem modyfikującym DNA, zostały również wykorzystane do mapowania interakcji białko-DNA. Niedawno połączyliśmy jedną z takich metod, endogenne rozszczepienie chromatyny (ChEC), z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym jako sekwencjonowanie ChEC. ChEC-seq opiera się na fuzji białka związanego z chromatyną, które jest przedmiotem zainteresowania z nukleazą mikrokokową (MNazą) w celu wytworzenia ukierunkowanego rozszczepienia DNA w obecności wapnia w żywych komórkach. Sekwencja ChEC nie opiera się na immunoprecypitacji, a więc omija potencjalne problemy związane z sieciowaniem, sonikacją, solubilizacją chromatyny i jakością przeciwciał, zapewniając jednocześnie mapowanie w wysokiej rozdzielczości przy minimalnym sygnale tła. Przewidujemy, że ChEC-seq będzie potężnym odpowiednikiem ChIP, zapewniając niezależne środki, za pomocą których można zarówno walidować wyniki ChIP-seq, jak i odkrywać nowe informacje na temat regulacji genomu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mapowanie miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (TF), remodelerów chromatyny i innych czynników regulacyjnych związanych z chromatyną jest kluczem do zrozumienia wszystkich procesów opartych na chromatynie. Chociaż metody immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq) zostały wykorzystane do uzyskania wielu ważnych informacji na temat biologii genomu, mają one znaczące ograniczenia. Niedawno wprowadziliśmy alternatywną metodę, zwaną endogennym rozszczepieniem chromatyny i sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChEC-seq)1, aby obejść te wady.

ChIP-seq jest najczęściej wykonywane z początkowym etapem sieciowania formaldehydu (X-ChIP-seq) w celu zachowania interakcji białko-DNA. Jednak wiele ostatnich badań wykazało, że X-ChIP-seq wychwytuje przejściowe lub niespecyficzne interakcje białko-DNA2,3,4,5,6,7,8, co powoduje powstawanie fałszywie dodatnich miejsc wiązania. Ponadto, sonikacja, powszechnie stosowana do fragmentacji chromatyny w eksperymentach X-ChIP-seq, preferencyjnie ścina regiony otwartej chromatyny, prowadząc do tendencyjnego odzyskiwania fragmentów z tych regionów9,10. Sonikacja daje również niejednorodną mieszaninę długości fragmentów, co ostatecznie ogranicza rozdzielczość miejsca wiązania, chociaż dodanie etapu trawienia egzonukleazą może znacznie poprawić rozdzielczość11,12. Natywne metody ChIP, takie jak zajęte regiony genomów z naturalnie izolowanej chromatyny (ORGANIC) oczyszczonej powinowactwem (ORGANIC)13 nie używają sieciowania i fragmentacji chromatyny za pomocą nukleazy mikrokokowej (MNazy), łagodząc potencjalne błędy związane z sieciowaniem formaldehydu i sonikacją. Jednak rozpuszczalność wielu białek związanych z chromatyną w stosunkowo łagodnych warunkach wymaganych do ekstrakcji natywnej chromatyny jest słaba, co może prowadzić do zmniejszenia zakresu dynamiki i/lub wyników fałszywie ujemnych14.

Podczas gdy różne iteracje ChIP-seq są najczęściej używane do mapowania całego genomu interakcji białko-DNA, zaimplementowano również kilka technik mapowania opartych na fuzji białek będących przedmiotem zainteresowania z różnymi enzymami modyfikującymi DNA. Jednym z takich podejść jest identyfikacja metylotransferazy adeninowej DNA (DamID)15, w której białko wiążące chromatynę, będące przedmiotem zainteresowania, jest genetycznie łączone z Dam, a fuzja ta ulega ekspresji w komórkach lub zwierzętach, co powoduje metylację sekwencji GATC proksymalnie do miejsc wiązania białka. DamID jest korzystny, ponieważ nie opiera się na immunoprecypitacji, a więc unika sieciowania, przeciwciał lub rozpuszczania chromatyny. Wykonuje się go również in vivo. Jednak rozdzielczość DamID jest ograniczona do skali kilozasadowej, a aktywność metylacyjna białka fuzyjnego Dam jest konstytutywna. Drugą metodą opartą na fuzji enzymatycznej jest Calling Card-seq16, która wykorzystuje fuzję czynnika będącego przedmiotem zainteresowania z transpozazą, kierując specyficzną dla miejsca integracją transpozonów. Podobnie jak DamID, Calling Card-seq nie opiera się na immunoprecypitacji, a zatem ma podobne zalety, z dodatkową korzyścią w postaci zwiększonej rozdzielczości. Jednak sekwencja kart telefonicznych może być ograniczona przez odchylenia sekwencji transpozaz i zależy również od obecności miejsc restrykcyjnych w pobliżu miejsc insercji transpozonów.

Trzecią metodą fuzji enzymatycznej, opracowaną w laboratorium Laemmli, jest endogenne rozszczepienie chromatyny (ChEC)17. W ChEC fuzja między białkiem związanym z chromatyną a MNazą ulega ekspresji w komórkach, a po dodaniu wapnia w celu aktywacji MNazy, DNA jest rozszczepiane proksymalnie do miejsc wiązania znakowanego czynnika (ryc. 1). W połączeniu z Southern blotting, ChEC został użyty do scharakteryzowania struktury chromatyny i wiązania białek w wielu indywidualnych loci w drożdżach17,18, i został połączony z analizą mikromacierzy o niskiej rozdzielczości w celu zbadania interakcji składników porów jądrowych z genomem drożdży19. ChEC oferuje korzyści podobne do DamID i Calling Card-seq, a jego rozdzielczość jest prawie pojedynczą parą zasad, gdy jest analizowana przez primer extension19. ChEC jest również kontrolowany: silne rozszczepienie DNA przez MNazę zależy od dodania milimolowego wapnia, co zapewnia, że MNaza jest nieaktywna przy niskich stężeniach wolnego wapnia obserwowanych w żywych komórkach drożdży20.

Wcześniej postulowaliśmy, że połączenie ChEC z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChEC-seq) dostarczy mapy miejsc wiązania TF o wysokiej rozdzielczości. Rzeczywiście, w ramach projektu ChEC-seq wygenerowano mapy o wysokiej rozdzielczości pączkujących ogólnych czynników regulacyjnych (GRF) drożdży Abf1, Rap1 i Reb1 w całym genomie1. Udało nam się również zastosować ChEC-seq do modułowego kompleksu Mediator, konserwatywnego, niezbędnego globalnego koaktywatora transkrypcji21, rozszerzając zastosowanie ChEC-seq do kompleksów o rozmiarach megadaltonów, które nie stykają się bezpośrednio z DNA i mogą być trudne do zmapowania metodami opartymi na ChIP. ChEC-seq to skuteczna metoda zarówno do niezależnej walidacji wyników ChIP-seq, jak i do generowania nowych informacji na temat regulacji procesów rezydujących w chromatynie. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący wdrożenia tej metody w pączkujących drożdżach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja szczepów drożdży

  1. Wygeneruj szczep drożdży noszący interesujący czynnik oznaczony MNazą.
    1. PCR amplifikuje kasetę znakującą MNazę z żądanego wektora (Tabela 1) przy użyciu określonej mieszaniny reakcyjnej (Tabela 2) i warunków cyklicznych (Tabela 3). Wymieszaj 5 μl reakcji PCR i 1 μl 6-krotnego barwnika ładującego DNA. Uruchom każdą podwielokrotność PCR na 0,8% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar produktu to ~2.3 kb.
    2. Przekształć amplifikowaną kasetę znakującą w wybrany szczep za pomocą standardowego octanu litu transformation22 i przeprowadź selekcję.
    3. Sprawdź, czy kaseta znakująca jest prawidłowo zintegrowana z PCR kolonii.
      1. Przygotować określoną mieszaninę reakcyjną (tabela 4) dla liczby kolonii, które mają być przesiewane. Trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny.
      2. Pobrać porcję każdej kolonii do badania na dno probówki do PCR za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety.
      3. Podgrzewaj zebrane kolonie w kuchence mikrofalowej z dużą mocą przez 1 minutę.
      4. Dodaj 50 μl mieszanki PCR (Tabela 4) do każdej kolonii podgrzanej w kuchence mikrofalowej i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Przeprowadzić PCR w określonych warunkach cyklicznych (tabela 5).
      5. Wymieszaj 50 μl reakcji PCR i 10 μl barwnika ładującego DNA 6X bezpośrednio w każdej probówce PCR. Umieścić 10 μl każdej próbki w 1% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar produktu to ~ 700 bp.
        UWAGA: W razie potrzeby sprawdź prawidłową ekspresję białka fuzyjnego MNazy za pomocą western blotting. Oczekuje się przesunięcia o ~ 20,6 kilodaltonów w masie cząsteczkowej znakowanego białka.
  2. Wygeneruj wolny szczep MNazy poprzez klonowanie promotora interesującego genu w oparciu o homologię do pGZ136 (Tabela 1) oraz transformację i selekcję, jak w kroku 1.1.2.
    1. Alternatywnie, złóż promotor interesującego genu i 3xFLAG-MNase-SV40 NLS w wektor plazmidowy, przekształć i wybrać jak w kroku 1.1.2, a następnie wyhodować szczep w odpowiednich warunkach selektywnych dla utrzymania plazmidu.

2. ChEC

  1. Po południu/wieczorem w dniu poprzedzającym doświadczenie ChEC zaszczepić 3 ml dekstrozy drożdżowo-peptonowej (YPD) lub odpowiednią selektywną pożywką pojedynczą kolonią szczepu zawierającą czynnik znakowany MNazą. Inkubować tę kulturę przez noc (wstrząsanie 180 obr./min, 30 °C).
  2. Rano w dniu eksperymentu ChEC rozcieńczyć nocną kulturę w 50 ml pożywki do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,2 - 0,3. Inkubować tę kulturę (wstrząsanie 180 obr./min, 30 °C), aż osiągnie OD600 0,5-0,7. Gdy kultura zbliża się do odpowiedniego OD600, ustawić blok grzewczy lub łaźnię wodną na 30 °C i rozpocząć rozmrażanie dodatków buforu A (tabela 6).
  3. Przygotować 5 ml buforu A z dodatkami (tabela 6) na kulturę. Podczas zabiegu należy utrzymywać bufor A w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować probówki do mikrodymów zawierające 90 μl roztworu zatrzymującego (Tabela 7) i 10 μl 10% SDS dla każdego punktu czasowego, który ma być zebrany. Dla każdego nowego analizowanego czynnika należy pobrać próbki po 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min i 10 min.
  5. Zdekantować kulturę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 500 x g i temperaturze pokojowej (RT) przez 1 min.
  6. Dokładnie zawiesić komórki w 1 ml buforu A i przenieść zawieszone komórki do probówki do mikrofuge. Granulki zawieszone w mikrofugach o stężeniu 1 500 x g i RT przez 30 s.
  7. Odessać supernatant i dokładnie zawiesić komórki w 1 ml buforu A, pipetując w górę iw dół. Granulki zawieszone w mikrofugach o stężeniu 1 500 x g i RT przez 30 s. Powtórz ten krok raz.
  8. Dokładnie zawieś komórki w 570 μl buforu A. Dodaj 30 μl 2% digitoniny (0,1% stężenia końcowego), aby ułatwić przenikanie komórek i odwróć, aby wymieszać.
  9. Przepuszczać komórki w bloku grzewczym lub łaźni wodnej w temperaturze 30 °C przez 5 minut.
  10. Pipetować reakcję w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Usunąć 100 μl podwielokrotności przepuszczalnych komórek jako kontrolę ujemną do probówki do mikrodymki zawierającej roztwór zatrzymujący i SDS (krok 2.4) i krótko zmieszać w celu wymieszania.
  11. Dodaj 1,1 μl 1 M CaCl2 (2 mM stężenie końcowe) do przepuszczalnych komórek, aby aktywować MNazę i szybko odwrócić kilka razy lub krótko wirować w celu wymieszania. Natychmiast przywrócić mieszaną reakcję w temperaturze 30 °C i uruchomić stoper.
  12. W każdym punkcie, który ma być zebrany, pipetować reakcję w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek, a następnie usunąć 100 μl porcji przepuszczalnych komórek do probówki z mikrodymą zawierającą roztwór zatrzymujący i SDS i krótko wirować w celu wymieszania. Dla każdego nowego analizowanego czynnika weź 0 s (bez dodatku CaCl2), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min i 10 min punkty czasowe.
    UWAGA: Eksperymenty ChEC z czynnikami, które szybko rozszczepiają DNA w temperaturze 30°C, mogą być przeprowadzane w niższych temperaturach, aby spowolnić kinetykę cięcia MNazy.
  13. Po zebraniu wszystkich punktów czasowych dodać 4 μl 20 mg/ml proteinazy K do każdej próbki, krótko odwirować w celu wymieszania i inkubować w temperaturze 55 °C przez 30 minut.
  14. Dodać 200 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego w proporcji 25:24:1 do każdej próbki, energicznie wirować do wymieszania i odwirować z maksymalną prędkością i RT w mikrodyfie przez 5 minut.
  15. Usunąć każdą fazę wodną (~ 150 μl) do nowej probówki. Dodaj 30 μg glikogenu i 500 μl 100% etanolu. Energicznie wirować, mieszać i wytrącać na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, gdy roztwór będzie lepki.
  16. Osad wytrącał DNA z maksymalną prędkością i w temperaturze 4 °C w mikrofugach przez 10 minut.
  17. Zdekantować supernatanty i przepłukać granulki 1 ml RT 70% etanolu.
  18. Zdekantuj etanol, usuwając pozostałą część przez odwrócenie i delikatnie stukając rurkami w ręcznik papierowy. Krótko odwirować próbki za pomocą wirówki stołowej i użyć pipety do usunięcia pozostałości etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Suszenie na powietrzu granulek przy temperaturze rynkowej przez 5 min.
  19. Podczas suszenia granulek przygotuj mieszankę główną, aby ponownie zawiesić wysuszone granulki w 29 μl Tris, pH 8,0 + 1 μL 10 mg/ml RNazy A każdy. Trawić RNA w temperaturze 37 °C przez 20 min.
  20. Wymieszaj 1 μl barwnika 6X obciążającego DNA z 5 μl każdej próbki i uruchom na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 40 minut.

3. Wybór rozmiaru

UWAGA: Celem wyboru rozmiaru jest usunięcie wielokilozasadowych fragmentów genomowego DNA z próbki do sekwencjonowania i wzbogacenie fragmentów o wielkości ~150 pz (w przybliżeniu wielkości nukleosomalnego DNA) lub mniejszej. W danych sekwencjonowania fragmenty <400 pz są wzbogacone, z zauważalnym pikiem o wielkości nukleosomalnego DNA (~150 pz) i szczytem lub szerokim rozkładem fragmentów subnukleosomalnych.

  1. Do każdej próbki dodać 75 μl kulek odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI) w roztworze glikolu polietylenowego (PEG)23 i pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować mieszaninę kulek:DNA w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  2. Podczas inkubacji kulek SPRI należy przygotować probówki do mikrofuge zawierające 96 μl 10 mM Tris, pH 8,0 i 4 μl 5 M NaCl dla każdej próbki.
  3. Umieść rurki w stojaku magnetycznym, aby zebrać koraliki z boku tuby. Pozwól koralikom zebrać się z boku rurki przez 2 minuty.
  4. Przenieść każdy supernatant do nowej probówki zawierającej Tris i NaCl (krok 3.2).
  5. Dodać 200 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego o proporcji 25:24:1 do każdej próbki, zwirować do wymieszania i odwirować z maksymalną prędkością i suchą temperaturą w mikrodymie przez 5 minut.
  6. Usuń każdą fazę wodną do nowej probówki. Dodaj 30 μg glikogenu i 500 μl 100% etanolu. Wytrącić DNA na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, gdy roztwór będzie lepki.
  7. Osad wytrącał DNA z maksymalną prędkością i w temperaturze 4 °C w mikrofugach przez 10 minut.
  8. Zdekantować supernatanty i przepłukać granulki 1 ml 70% etanolu.
  9. Zdekantuj etanol, usuwając pozostałą część przez odwrócenie i delikatnie stukając rurkami w ręcznik papierowy. Krótko odwirować próbki za pomocą wirówki stołowej i użyć pipety do usunięcia pozostałości etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Suszenie na powietrzu granulek przy temperaturze rynkowej przez 5 min.
  10. Ponownie zawiesić wysuszone granulki w 25 μl Tris, pH 8,0. Określ stężenie próbki za pomocą testu o wysokiej czułości. W przypadku eksperymentów TF ChEC rutynowo odzyskuje się 10-100 ng DNA po doborze wielkości.
  11. Przygotuj biblioteki sekwencjonowania. Protokoły przygotowania biblioteki, które nie opierają się na wyborze rozmiaru, jak opisano wcześniej24, są pożądane, aby umożliwić sekwencjonowanie szerokiego zakresu rozmiarów fragmentów (25-500 pz).
  12. Biblioteki sekwencji w trybie sparowanego końca. Do wysokiej jakości mapowania odczytu potrzebnych jest co najmniej 25 baz sekwencji na każdym końcu. Od 1 do 2 milionów odczytów zapewnia wystarczające pokrycie dla próbki ChEC.
    UWAGA: Analiza danych ChEC-seq jest złożoną procedurą i wykracza poza zakres tego artykułu. Szczegółowe informacje na temat analizy danych można znaleźć w poprzednich publikacjach1,21, a niestandardowe skrypty wykorzystywane do analizy są dostępne na GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER25 (http://homer.salk.edu) może być również używany do analizy danych ChEC-seq za pomocą wiersza poleceń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku udanego eksperymentu ChEC, analiza DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym ujawni zależny od wapnia wzrost fragmentacji DNA w miarę upływu czasu, na co wskazuje rozmazywanie i ostateczne całkowite trawienie genomowego DNA. W niektórych przypadkach po dłuższym trawieniu obserwuje się drabinę pasm podobną do tej obserwowanej przy tradycyjnym trawieniu MNazy. Tak jest w przypadku analizy ChEC Reb1, ogólnego czynnika regulacyjnego, który wiąże regiony zubożone w nukleosomy (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazaliśmy, że ChEC może mapować różne klasy białek drożdży na chromatynie i przewidujemy, że będzie miał szerokie zastosowanie do różnych rodzin TF i innych czynników wiążących chromatynę w drożdżach. ChEC-seq jest korzystny, ponieważ nie wymaga sieciowania, solubilizacji chromatyny ani przeciwciał. W ten sposób ChEC unika artefaktów potencjalnie obecnych w X-ChIP-seq, takich jak artefakt hiper-ChIPable 3,4, i natywnego ChIP, takiego jak fałszywie ujemne wyniki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Moustafie Salehowi i Jayowi Tourigny'emu za krytyczne przeczytanie manuskryptu oraz Stevenowi Hahnowi i Stevenowi Henikoffowi za mentoring i wsparcie podczas rozwoju ChEC-seq i jego zastosowania w kompleksie Mediator. S.G. jest wspierany przez granty NIH R01GM053451 i R01GM075114, a G.E.Z. jest wspierany przez fundusze startowe Indiana University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
dNTPsNEBN0447
Q5 polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0491LInne polimerazy DNA o wysokiej wierności, takie jak Phusion, mogą być używane do amplifikacji kasetowej.
TrackIt 1 Kb Plus Drabinka DNAThermoFisher Scientific10488085
Taq Polimeraza DNANEBM0273L
cOmplete Mini koktajl inhibitorów proteaz bez EDTASigma-Aldrich11836170001Ważne jest, aby stosować mieszankę inhibitorów proteazy wolną od EDTA, aby nie hamować rozszczepienia MNazy przez chelatację Ca2+.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
digitonina, EMDMillipore300410-250MGPrzygotuj 2% bulionu, rozpuszczając 20 mg digitoniny w 1 ml DMSO z energicznym wirowaniem.
Proteinaza K, 20 mg/mlInvitrogen25530049
RNaza A, 10 mg/mlThermoFisher ScientificEN0531
Koraliki Ampure XPBeckman CoulterA63880Kulki podobne do ampure można wygenerować przy użyciu opublikowanego protokołu (ref 24).
Stojak magnetyczny MagneSpherePromegaZ5342
o wysokiej czystości

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733(2015).
  2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
  3. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  4. Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506(2013).
  5. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
  6. Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
  7. Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
  8. Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412(2014).
  9. Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241(2009).
  10. Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700(2009).
  11. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  12. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
  13. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
  14. Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042(2014).
  15. Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
  16. Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
  17. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  18. Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
  19. Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
  20. Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
  21. Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
  22. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  23. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
  24. Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
  25. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  26. Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
  27. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
  28. Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
  29. Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
  30. Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
  31. Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323(2013).
  32. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  33. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
  34. Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  35. van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
  36. Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nukleaza mikrokokkowachromatyna dro d yaktywacja wapniemci cie DNAkuleczki SPRIfenol chloroformel agarozowy

Powiązane artykuły