Method Article

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)

DOI:

10.3791/55840

⸱

June 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skalowanie liczby mierzalnych parametrów, co pozwala na wielowymiarową analizę danych, a tym samym na uzyskanie większej pewności wyników statystycznych, było głównym trendem w zaawansowanym rozwoju cytometrii przepływowej. Warto zauważyć, że dodanie możliwości obrazowania w wysokiej rozdzielczości pozwala na złożoną analizę morfologiczną struktur komórkowych/subkomórkowych. Nie jest to możliwe w przypadku standardowych cytometrów przepływowych. Jest jednak cenny dla pogłębiania naszej wiedzy na temat funkcji komórkowych i może przynieść korzyści badaniom z zakresu nauk przyrodniczych, diagnostyce klinicznej i monitorowaniu środowiska. Włączenie możliwości obrazowania do cytometrii przepływowej pogarsza przepustowość testu, głównie ze względu na ograniczenia szybkości i czułości technologii kamer. Aby sprostać temu wyzwaniu polegającemu na szybkości lub przepustowości, przed którym stoi obrazowa cytometria przepływowa, przy jednoczesnym zachowaniu jakości obrazu, wykazano, że mikroskopia optyczna z asymetrycznym wykrywaniem w czasie i rozciągnięciem w czasie (ATOM) umożliwia obrazowanie pojedynczych komórek o wysokim kontraście i rozdzielczości subkomórkowej przy przepustowości obrazowania wynoszącej nawet 100 000 komórek/s. Opierając się na koncepcji obrazowania konwencjonalnego obrazowania rozciągającego w czasie, która opiera się na całkowicie optycznym kodowaniu i odzyskiwaniu obrazu za pomocą ultraszybkich szerokopasmowych impulsów laserowych, ATOM jeszcze bardziej zwiększa wydajność obrazowania, zwiększając kontrast obrazu nieznakowanych/niebarwionych komórek. Osiąga się to poprzez dostęp do informacji o gradinie fazowym komórek, które są kodowane spektralnie w pojedynczych impulsach szerokopasmowych. W związku z tym ATOM jest szczególnie korzystny w wysokoprzepustowych pomiarach morfologii i tekstury pojedynczych komórek – informacji wskazujących na typy, stany, a nawet funkcje komórek. Ostatecznie może to stać się potężną platformą obrazowania cytometrii przepływowej do biofizycznego fenotypowania komórek, uzupełniając obecny stan wiedzy na temat biochemicznych testów komórkowych opartych na markerach. W pracy opisano protokół służący do ustanowienia kluczowych modułów systemu ATOM (od frontendu optycznego do zaplecza przetwarzania i wizualizacji danych), a także przebieg pracy obrazowania cytometrii przepływowej opartej na ATOM, na przykładzie komórek ludzkich i mikroalg.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie optyczne stanowi potężne narzędzie i test oparty na komórkach, który pozwala (prawie) nieinwazyjnie wizualizować szczegółowy rozkład przestrzenny wielu komponentów komórkowych/subkomórkowych, odkrywając w ten sposób mnogość morfologicznych, biofizycznych i biomolekularnych sygnatur komórek. Jednak ta zdolność do wydobywania informacji o wysokiej zawartości z pojedynczych komórek była na ogół zagrożona, gdy trzeba było zbadać ogromną i niejednorodną populację komórek. Oznacza to powszechny kompromis w testach komórkowych między wydajnością pomiaru a zawartością. Godnym uwagi przykładem jest to, że dodanie możliwości obrazowania do cytometrii przepływowej spowodowało zmniejszenie przepustowości o co najmniej 1-2 rzędy wielkości w porównaniu z klasycznymi cytometrami przepływowymi bez obrazowania. Chociaż może zaoferować złożoną morfologiczną analizę pojedynczych komórek, która nie jest możliwa przy użyciu standardowych cytometrów przepływowych1, obrazowa cytometria przepływowa na ogół nie ma wystarczającej przepustowości, aby zidentyfikować heterogeniczność komórkową z dużą pewnością statystyczną. Jest to niezbędne do nowych odkryć w biologii i do zrozumienia patogenezy chorób. Kluczowym wyzwaniem technicznym jest nieodłączne ograniczenie prędkości narzucone przez powszechne strategie obrazowania optycznego: skanowanie wiązką laserową (np. za pomocą zwierciadeł galwanometrycznych) i/lub czujniki obrazu (np. urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) i komplementarny półprzewodnik metalowo-tlenkowy (CMOS)). Szybkość skanowania laserowego jest z natury ograniczona przez bezwładność mechaniczną luster skanujących, podczas gdy liczba klatek na sekundę CCD lub CMOS jest ograniczona przez podstawowy kompromis między szybkością obrazowania a czułością (tj. zwiększenie liczby klatek na sekundę prowadzi do zmniejszenia czułości wykrywania sygnału i odwrotnie).

Bazując na całkowicie optycznym, ultraszybkim mechanizmie kodowania obrazu, optyczne obrazowanie w czasie zostało uznane za atrakcyjną platformę dla wysokoprzepustowych cytometrów przepływowych do obrazowania, bez potrzeby stosowania konwencjonalnych czujników obrazu lub mechanicznego skanowania laserowego2,3. Szczegółowe opisy zasady działania obrazowania rozciągającego czas można znaleźć w references4,5,6,7. Krótko mówiąc, składa się z dwóch wymiennych etapów mapowania: (i) kodowania spektralnego (mapowanie długości fali i przestrzeni), w którym współrzędne przestrzenne obrazowanej próbki są odwzorowywane na różne długości fal w całym widmie wiązki impulsów świetlnych8,9, oraz (ii) dyspersyjna transformacja Fouriera (mapowanie długości fali-czasu)9, w którym składowe długości fal poszczególnych impulsów laserowych są przekształcane (rozciągane) za pomocą grupowej dyspersji prędkości (GVD) w przebiegi czasowe (przemiatane przez długość fali) (rysunek 1). Ważną cechą obrazowania rozciągliwego w czasie jest wzmocnienie optyczne, które odgrywa kluczową rolę w zwalczaniu utraty czułości spowodowanej ultraszybką fotodetekcją i utratą GVD, poprawiając w ten sposób stosunek sygnału do szumu obrazu (SNR) bez zanieczyszczenia szumem fotodetektora9. Ponieważ każdy impuls laserowy koduje skan liniowy obrazowanej próbki, który jest prostopadły do jednokierunkowego przepływu komórek, efektywna szybkość skanowania liniowego jest określana przez częstotliwość powtarzania lasera, która zwykle przekracza 10 MHz. Ta ultraszybka operacja umożliwia przechwytywanie obrazu pojedynczej komórki bez rozmycia z przepustowością 10 000-100 000 komórek/s (tj. 10-100 razy wyższą niż konwencjonalna obrazowa cytometria przepływowa). W rezultacie, obrazowanie rozciągnięte w czasie może znaleźć unikalne zastosowania w wysokoprzepustowych, jednokomórkowych badaniach przesiewowych opartych na obrazie, zwłaszcza gdy istnieje potrzeba identyfikacji nieznanej heterogeniczności lub rzadkich/nieprawidłowych komórek w dużej populacji (tysiące do milionów komórek), takich jak badania przesiewowe rzadkich komórek nowotworowych10 lub klasyfikacja mikroglonów11.

Obrazowanie rozciągające w czasie opiera się głównie na przechwytywaniu obrazu w jasnym polu (BF), z którego kontrast obrazu jest generowany przez rozpraszanie i absorpcję światła z komórek2,3,9,10,11. Takie bezznacznikowe możliwości obrazowania pojedynczych komórek mogą ominąć szkodliwe skutki związane ze znacznikami fluorescencyjnymi, takie jak cytotoksyczność i fotowybielanie, a jednocześnie dostarczyć cennych informacji do analizy pojedynczych komórek w oparciu o strukturę i morfologię komórkową i subkomórkową. Udowodniono, że te bezznacznikowe parametry są skuteczne w głębokiej klasyfikacji obrazów komórek, zwłaszcza gdy dostępna jest ogromna populacja komórek11,12. Jednak w wielu przypadkach obrazowanie BF nie zapewnia wystarczającego kontrastu, aby ujawnić szczegółową morfologię przezroczystych komórek bez znaczników. Opracowano różne metody obrazowania bez znaczników, kontrastu fazowego i rozciągnięcia w czasie w celu zwiększenia kontrastu obrazowania przy ultradużej liczbie klatek na sekundę13,14,15. Wśród tych technik opracowano mikroskopię optyczną z asymetryczną detekcją i rozciągnięciem w czasie (ATOM), aby ujawnić kontrast podobny do gradientu fazowego (różnicowo-interferencyjno-kontrastowego (DIC)) w oparciu o koncepcję podobną do fotografii Schlierena, umożliwiając bezznacznikowe, wysokokontrastowe obrazowanie pojedynczych komórek z ultrawysoką prędkością mikroprzepływową (do 10 m/s)16. Efekt ten można łatwo wygenerować poprzez detekcję ukośną lub oświetlenie poprzez częściowe zablokowanie ścieżki wiązki zakodowanej w obrazie lub przechylenie wiązki przed fotodetekcją. Kolejną zaletą ATOM jest jego zdolność do jednoczesnego uzyskiwania dwóch kontrastów gradientu fazowego wzdłuż przeciwnych orientacji. Odejmowanie intensywności i sumowanie dwóch obrazów o przeciwnym kontraście daje odpowiednio kontrast różnicowy gradientu fazowego i kontrast absorpcyjny z tego samego skanu liniowego. W pracy przedstawiono szczegółowy protokół opisujący implementację ATOM, w tym ustalenie układu optycznego, przygotowanie próbki oraz akwizycję i wizualizację danych. W szczególności praca ta demonstruje działanie ATOM z obrazowaniem pojedynczych komórek ludzkich komórek krwi, komórek rakowych i fitoplanktonu (mikroalg). Podkreśla to możliwość zastosowania ATOM w obrazowej cytometrii przepływowej, nie tylko w dziedzinie biomedycyny, ale także w badaniach morskich i biopaliwowych17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie próbki (komórki przylegające; Ogniwa MCF-7)
    1. Wyjmij naczynie do hodowli komórkowych z inkubatora i odcedź pożywkę.
    2. Opłucz komórki na naczyniu 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć nadmiar pożywki hodowlanej.
    3. Dodać 3 ml roztworu 0,25% trypsyny do naczynia hodowlanego (średnica 100 mm) i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 4 minuty.
      UWAGA: Trypsyna rozpuszcza białko adhezyjne komórek, dzięki czemu odczepiają się one od naczynia hodowlanego.
    4. Sprawdź, czy wszystkie komórki odłączyły się od naczynia hodowlanego za pomocą mikroskopu świetlnego (obiektyw 10X). Jeśli nie, delikatnie potrząśnij naczyniem do hodowli komórkowych.
    5. Dodać 4 ml standardowej pożywki hodowlanej (zawierającej 89% zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle Medium (DMEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (PS)), aby zatrzymać działanie trypsyny.
    6. Przenieść całą mieszaninę (komórki w roztworze trypsyny i pożywkę hodowlaną) do probówki wirówkowej i wirować przez 5 minut przy 200 x g.
    7. Usunąć cały płyn i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS (wartość pH: 7,4, wstępnie podgrzany do 37 °C).
  2. Przygotowanie próbki (hodowane mikroalgi)
    1. Przenieś hodowane mikroalgi i pożywkę hodowlaną (np. wodę morską, agar lub słodką wodę) do nowych szklanych probówek hodowlanych (~15 ml) w stosunku objętościowym (mikroalgi do pożywki hodowlanej) 1:5, aby ustalić nową pożywkę do subkultury.
    2. Umieść szklane probówki hodowlane w pyłoszczelnej komorze pod stałym oświetleniem przez sztuczne oświetlenie z żarówek fluorescencyjnych zgodnie z cyklem światło/ciemność (LD) (zwykle LD 16:8) przez 72 - 120 godzin przed eksperymentem.
    3. Przenieść subkultury próbek do probówki wirówkowej i dobrze wymieszać.

2. Ustawienia systemu ATOM

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat systemu ATOM. Szerokopasmowy laser impulsowy jest wykorzystywany do dostarczania ultraszybkich impulsów do (a) modułu rozciągania czasu i (b) modułu wzmacniacza optycznego w linii. Moduł rozciągania czasu generuje ciąg przebiegów czasowych, z których każdy jest repliką widma długości fali źródła laserowego (tj. mapowanie długości fali na czas). Moduł wzmacniacza służy do kompensacji strat rozciągających impulsowo (dyspersyjnych). Rozciągnięty impuls jest następnie (c) przestrzennie rozpraszany przez siatkę dyfrakcyjną, tworząc widmowe oświetlenie prysznica 1D, w którym poszczególne składowe długości fali są przekazywane przez parę soczewek przekaźnikowych i skupiane przez soczewkę obiektywu w różnych miejscach na przepływającej komórce wewnątrz (d) chipa mikroprzepływowego. Jest to proces kodowania spektralnego. Światło zakodowane spektralnie ponownie przejdzie przez komórkę przez inną soczewkę obiektywu i lustro, powracając do siatki dyfrakcyjnej i rekombinując jako przestrzennie nierozproszona wiązka pulsacyjna. Ta zakodowana w obrazie wiązka impulsowa jest następnie (e) dzielona na dwie ścieżki, tak że obie wiązki są częściowo blokowane (f) krawędzią noża, ale z przeciwnych kierunków, zanim zostaną sprzężone z włóknami. Te dwie wiązki reprezentują dwa (przeciwne) zakodowane kontrasty gradientu fazowego końcowego obrazu. W celu jednoczesnego wykrycia obu kontrastów sygnałów, jeden z sygnałów przechodzi (g) linię opóźnienia czasowego, tak że oba sygnały są multipleksowane (przeplatane) w czasie. Do pozyskiwania danych wykorzystywany jest szybki fotodetektor i oscyloskop w czasie rzeczywistym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Moduł rozciągania czasu
    1. Zastosuj szerokopasmowe femtosekundowe (fs) lub pikosekundowe (ps) impulsowe źródło laserowe o zalecanej środkowej długości fali w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR), 800-1,500 nm.
      UWAGA: Typowa wymagana szerokość impulsu może wynosić od poniżej 100 fs do kilku ps. Szczegółowe wymagania dotyczące impulsowych źródeł laserowych można znaleźć w odnośnikach 4 i 5. Ważne wskaźniki przedstawiono w tabeli 1.
      1. Upewnij się, że źródło lasera ma wysoką częstotliwość powtarzania, która powinna być w reżimie megaherców (np. dziesiątki MHz), aby zapewnić ultraszybkie obrazowanie w ATOM. Ustaw również szczytową moc wyjściową lasera znacznie poniżej progu uszkodzenia wnęki światłowodowej, około 1 kW.
      2. Zapewnienie dobrej stabilności czasowej i spektralnej impulsowego źródła lasera między ujęciami.
        UWAGA: Typowa tolerancja fluktuacji amplitudy widmowej powinna mieścić się w granicach 1,2%19,20,21, jak osiągnięto za pomocą lasera światłowodowego z blokadą w tym ustawieniu.
        UWAGA: Oczekuje się, że szerokość pasma optycznego źródła laserowego wyniesie 10-100 nm, co jest niezbędne do zagwarantowania wystarczającego pola widzenia obrazowania (FOV) w obrazowaniu jednokomórkowym21.
    2. Za pomocą kolimatora światłowodowego sprzęgnij wiązkę impulsów laserowych z jednomodowym światłowodem dyspersyjnym, w którym impulsy są rozciągane za pomocą grupowej dyspersji prędkości (GVD) (Rysunek 1a).
      UWAGA: Jest to proces, po którym widmo każdego impulsu jest odwzorowywane na czas jako przebieg przemiatany przez długość fali (tj. mapowanie długości fali do czasu).
      UWAGA: Całkowita wymagana GVD powinna być wystarczająca, aby zapewnić, że proces mapowania długości fali do czasu nie ma wpływu na ogólną rozdzielczość obrazu ATOM (patrz Dyskusja). Zazwyczaj w zakresie NIR GVD powinno znacznie przekraczać 0,1 ns/nm. Na przykład światłowód jednomodowy zastosowany w tej obecnej konfiguracji zapewnia całkowitą GVD 0,38 ns/nm wokół długości fali 1,060 nm (całkowita długość światłowodu 10 km).
  2. Moduł kodowania spektralnego
    1. Zbuduj system mikroskopu optycznego, aby wykonać spektralnie kodowane obrazowanie komórek przepływających wzdłuż kanału mikroprzepływowego, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
      UWAGA: Kluczowe elementy tego mikroskopu optycznego obejmują: (1) siatkę dyfrakcyjną, teleskopowy moduł soczewki przekaźnikowej (RL1 i RL2 w Rysunek 1) oraz dwie soczewki obiektywowe (Obj1 i Obj2 w Rysunek 1).
      1. Najpierw oświetl rozciągniętą w czasie i skolimowaną wiązkę na siatce dyfrakcyjnej (w tej konfiguracji zastosowano siatkę transmisyjną), aby wygenerować prysznic widmowy ( Rysunek 1c).
        UWAGA: Moc wiązki dyfrakcyjnej (tj. wydajność dyfrakcji) można zmaksymalizować, dostosowując orientację siatki zamkniętą do konfiguracji Littrow.
      2. Skonfiguruj dwie soczewki przekaźnikowe (RL1 i RL2) w systemie obrazowania 4-f (tj. umieść siatkę dyfrakcyjną na płaszczyźnie ogniskowej RL1 i oddziel RL1 i RL2 na odległość równą sumie ich ogniskowych. Deszcz widmowy zostanie następnie zobrazowany na tylnej płaszczyźnie ogniskowej soczewki obiektywu Obj1).
      3. Ostrożnie ustaw prysznic widmowy tak, aby wypełnił tylny otwór Obj1, tak aby deszcz widmowy mógł być rzutowany i skupiony na płaszczyźnie obrazu mikroskopu.
        UWAGA: W tym przypadku NA soczewki obiektywu (Obj1 w Rysunek 1) wynosi 0,75.
      4. Umieść inną soczewkę obiektywu (Obj2 w Rysunek 1) z podobną NA i płaskim lustrem na tylnym otworze tej soczewki obiektywu (Obj2), tak aby widmowa wiązka prysznica mogła być ustawiona tak, aby dwukrotnie przejść przez płaszczyznę obrazu i powrócić do siatki dyfrakcyjnej.
      5. Wyreguluj parę soczewek obiektywu (Obj1 i Obj2) tak, aby ich płaszczyzny ogniskowe nakładały się na siebie. Sprawdź, czy prysznic widmowy dwukrotnie przechodzi przez płaszczyznę obrazu w tym samym miejscu i wraca do siatki po tej samej ścieżce. Jeśli nie, wykonaj dalsze wyrównywanie i strojenie układu optycznego.
        UWAGA: Odbite światło powinno przejść przez dodatkowy rozdzielacz wiązki, tak aby światło mogło być transmitowane do asymetrycznego modułu detekcyjnego.
      6. Wyreguluj wzmocnienie wzmacniacza optycznego na odpowiednim poziomie, tak aby wynikowy sygnał mógł zostać wykryty przez fotodetektor z dobrym SNR, który zwykle wynosi >10 dB.
      7. Umieść i dostosuj położenie chipa mikroprzepływowego na platformie próbki i upewnij się, że prysznic widmowy, a tym samym obszar obrazowania, jest umieszczony w poprzek kanału mikroprzepływowego (Rysunek 1d).
        UWAGA: Prysznic spektralny jest oświetlony prostopadle do kierunku przepływu fluidyki wewnątrz chipa mikroprzepływowego, tak że ruch przepływowy automatycznie wykonuje dwuwymiarowe (2D) skany.
  3. Moduł detekcji asymetrycznej
    1. Umieść dodatkowy rozdzielacz wiązki, aby rozdzielić wiązkę zakodowaną w obrazie na dwie części (Rysunek 1e).
      UWAGA: Każda replika belki jest częściowo zablokowana przez krawędź noża.
    2. Zmierz i zapisz moc optyczną wiązki przed blokiem wiązki. Następnie ręcznie ustaw krawędzie noża (zamontowane na stoliku z liniowym przesunięciem) tak, aby z grubsza blokowały połowę belki (poprzez oględziny). Następnie użyj miernika mocy optycznej, aby monitorować moc wiązki, jednocześnie dostrajając położenie krawędzi noża, przesuwając je w poprzek wiązki.
      UWAGA: Sugeruje się, że optymalna pozycja to taka, w której moc jest zmniejszona o ~50% pierwotnej wartości (tj. odblokowana obudowa). Jest to warunek, który zapewnia najlepszą kombinację siły sygnału obrazu i poprawy kontrastu obrazu.
    3. Powtórz krok 2.3.2 dla innej repliki belki. Należy zauważyć, że orientacja częściowego bloku belki dla jednej belki powinna być przeciwna w stosunku do drugiej belki (Rysunek 1f).
    4. Połącz dwie częściowo zablokowane wiązki w dwa oddzielne, jednomodowe ramiona światłowodowe za pomocą dwuwłókienowych kolimatorów.
      UWAGA: Jedno z ramion ma dodatkową długość włókna, służącą jako linia opóźniająca oparta na włóknie, aby wprowadzić opóźnienie czasowe w stosunku do drugiej repliki (bez linii opóźniającej) (Rysunek 1g). Oba są kierowane do pojedynczego włókna za pomocą łącznika światłowodowego przed fotodetekcją. Opóźnienie czasowe powinno być wystarczająco długie, aby czasowo oddzielić dwie repliki i wystarczająco krótkie, aby uniknąć czasowego nakładania się na następny przebieg (tj. dwie repliki są zawsze przeplatane w czasie i multipleksowane w czasie w jednym włóknie przed wykryciem (Rysunek 2a)).
    5. Przechwytuj i digitalizuj wykryte sygnały optyczne za pomocą oscyloskopu w czasie rzeczywistym. Zauważ, że szerokość pasma, a tym samym częstotliwość próbkowania oscyloskopu, powinny być wystarczająco wysokie, aby zapewnić, że nie wpływają na ostateczną rozdzielczość obrazu (patrz dyskusja).
      UWAGA: W tym przypadku, przy GVD wynoszącym 0,38 ns/nm, wymagana jest przepustowość akwizycji zaplecza i częstotliwość próbkowania odpowiednio >20 GHz i >40 GSa/s.

3. Procedury eksperymentalne

  1. Ładowanie próbki
    1. Zliczanie komórek należy przeprowadzić pod konwencjonalnym mikroskopem z kontrastem fazowym w standardowym hemocytometrze.
    2. Dostosuj gęstość komórek, rozcieńczając 1x PBS (z wodą źródlaną dla mikroalg) i dobrze wymieszaj pipetą.
      UWAGA: Sugerowane stężenie wynosi od 105 do 106 komórek/ml.
    3. Zamontuj chip mikroprzepływowy na platformie próbki systemu obrazowania optycznego.
      UWAGA: Chip mikroprzepływowy jest wykonany głównie z polidimetylosiloksanu (PDMS) i jest wytwarzany przy użyciu standardowej metody formowania repliki. Kanał mikroprzepływowy został zaprojektowany z asymetrycznym zakrzywionym kanałem w celu wygenerowania efektu ogniskowania przepływu inercyjnego, dzięki czemu komórki mogą przepływać w jednym pliku w sekcji obrazowania (o wymiarach 80 μm x 80 μm (wysokość x szerokość)) z dużą prędkością.
    4. Przenieść roztwór komórek o dostosowanej gęstości do strzykawki o pojemności 10 ml.
    5. Podłączyć strzykawkę do wlotu chipa mikroprzepływowego, a rurkę odśrodkową do wylotu chipa mikroprzepływowego w celu zebrania
      6. odpadów.
    6. Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i ustaw odpowiednie natężenie przepływu, aby uzyskać pożądaną przepustowość i uniknąć wywierania nadmiernej siły ścinającej między komórkami a kanałem.
      UWAGA: Prędkość liniowa próbek powinna mieścić się w zakresie od 0,5 do 10 m/s. Należy pamiętać, że przed faktycznym zapisem obrazu często konieczne jest dalsze dopracowanie systemu pod kątem maksymalizacji siły sygnału obrazu i optymalizacji ostrości obrazu poprzez powtórzenie kroków 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. Akwizycja danych

  1. Ustaw odpowiednią liczbę punktów danych do zapisania dla każdego eksperymentu. Liczba punktów danych, które mają zostać zapisane, zależy od wielkości i natężenia przepływu próbek.
    UWAGA: Zazwyczaj jest ona ustawiona na 8-16 milionów punktów próbkowania przy częstotliwości próbkowania 80 GSa/s.
  2. Pobieraj i zapisuj dane w trybie wsadowym za pomocą oscyloskopu.

5. Przetwarzanie zaplecza

figure-protocol-2
Rysunek 2: Rekonstrukcja obrazów ATOM na podstawie śledzenia czasu skanowania liniowego. Aby zrekonstruować obrazy ATOM z kontrastem absorpcyjnym i zróżnicowanym (wzmocnionym) kontrastem gradientu fazowego, dwa zestawy impulsów rozciągniętych w czasie (patrz impulsy fioletowe i zielone) są ekstrahowane z (a) zwielokrotnionego w czasie śladu fali czasowej, a następnie są cyfrowo segmentowane i układane w stos w celu utworzenia (b) dwóch obrazów 2D pokazujących dwa przeciwstawne kontrasty gradientu fazowego. Należy pamiętać, że operacja ścinania jest potrzebna do utworzenia (c) obrazów wolnych od zniekształceń poprzez kompensację przesunięcia podindeksu spowodowanego błędem zaokrąglenia w szacowaniu częstotliwości powtarzania lasera. Odejmując (d) surowy skan liniowy od obwiedni intensywności spektralnej źródła laserowego, można usunąć tło obrazów. (g) Obraz o kontraście absorpcyjnym można uzyskać przez sumowanie intensywności piksel po pikselu obrazów (e) i (f), podczas gdy (h) obraz o kontraście różnicowym można uzyskać z odjęcia obrazów (e) i (f). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przenieś dane z oscyloskopu do komputerów w celu rekonstrukcji obrazu w trybie offline.
    UWAGA: W tym przypadku dane są przechowywane na przenośnym dysku twardym i przesyłane ręcznie między oscyloskopem a komputerami przetwarzającymi. Pojemność dysku twardego powinna być większa niż 500 GB dla każdego eksperymentu.
    1. Użyj kluczowej procedury rekonstrukcji obrazu, aby cyfrowo ułożyć skany linii, aby utworzyć obraz 2D (Rysunek 2).
      UWAGA: Następnie niestandardowy program (w MATLAB) tworzy dwa asymetryczne obrazy detekcji, oddzielając dwa multipleksowane w czasie zestawy danych (fioletowe i zielone przebiegi w Rysunek 2).
      1. Obraz z kontrastem różnicowym i gradientem fazowym można uzyskać, odejmując intensywność dwóch obrazów detekcji asymetrycznej; obraz z kontrastem absorpcyjnym można uzyskać, dodając dwa obrazy detekcji asymetrycznej. Zobacz wybrane zdjęcia MCF-7 i mikroalg w Rysunek 3. Należy pamiętać, że profile tła poszczególnych obrazów powinny być najpierw wyeliminowane, a ich intensywność znormalizowana, przed operacjami sumowania i odejmowania obrazu.
    2. Wygeneruj bibliotekę parametrów pochodzących z obrazów, takich jak objętość komórki, kołowość, gęstość absorpcji itp., do dalszej analizy.
  2. Wprowadź bibliotekę danych do platformy wizualizacji danych (Rysunek 4).
    1. Załaduj bibliotekę parametrów i odpowiadające im zrekonstruowane obrazy na platformę interfejsu wizualizacji.
    2. Ustaw osie tak, aby były parametrami zainteresowania.
      UWAGA: Parametry są specyficzne dla problemu i są definiowane przez użytkownika. Są one uzyskiwane z obrazów ATOM przez program MATLAB. Tutaj do wyboru jest gęstość absorpcji optycznej komórki, obszar komórki, objętość komórki i okrągłość komórki.
    3. Wybierz zestaw danych do wyświetlenia, tak aby każdy obraz komórki mógł być wizualizowany jako inny punkt danych na diagramie punktowym.
    4. Przesuń kursor myszy do każdego punktu, tak aby odpowiadający mu obraz i inne parametry były wyświetlane w ruchomym oknie podrzędnym.
      UWAGA: Osie można przełączać między skalami liniową i logarytmiczną w sposób interaktywny.
    5. Przeprowadź dalszą analizę dowolnego podzbioru danych przez ręczne bramkowanie na wykresie punktowym.
      UWAGA: Histogram w każdym parametrze podzbioru bramkowanego można porównać z histogramem całej biblioteki. Oddzielne histogramy są wyświetlane w innym ruchomym oknie podrzędnym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca ilustruje dwie demonstracje obrazowania pojedynczych komórek przez ATOM: jedną z komórkami ssaków (ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i komórki raka piersi (MCF-7)) oraz drugą z fitoplanktonem s (Scenedesmus i Chlamydomonas). Pierwszy eksperyment był motywowany rosnącym zainteresowaniem płynną biopsją do wykrywania, liczenia i charakteryzowania krążących komórek nowotworowych (CTC) w klasie blood23. Możliwość pomiaru ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka szczegółów technicznych, które wymagają szczególnej uwagi podczas konfiguracji systemu ATOM. Po pierwsze, należy zauważyć, że asymetryczne/ukośne oświetlenie kodowane spektralnie może wprowadzać szczątkowe składowe gradientu fazowego (tj. efekt cieniowania) w kontraście absorpcyjnym i wpływać na wzmocnienie kontrastu gradientu fazowego w ATOM. Dlatego ten efekt ukośnego oświetlenia powinien być zminimalizowany. Po drugie, należy podkreślić, że schemat multipleksowania lub przeplotu czasowego obejm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Panu P. Yeungowi za przygotowanie dla nas MCF-7. Prace te były częściowo wspierane przez granty z Rady ds. Grantów Badawczych Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu w Chinach (projekt nr 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 i HKU 720112E), Programu Wsparcia Innowacji i Technologii (ITS/090/14) oraz Funduszu Rozwoju Uniwersytetów HKU.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Obiektywy Nikon Plan Fluorite Physiology 40XNikonMRF07420Obiektyw (Obj2)
Obiektyw fluorytowy Olympus Plan, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X SoczewkaOlympusRMS40X-PF(Obj1)
N-BK7 Soczewki plano-wypukłeThorlabsLA1145-CDo przekazywania prysznica spektralnego
Pakiet kolimacyjny FC / APC FiberThorlabsF220APC-1064Do wyprowadzania i zbierania impulsów laserowych
Rozdzielacz wiązki PellicleThorlabsBP145B3Do wykonania repliki belki
Zabezpieczone srebrne lustroThorlabsPF10-03-P01Do odbijania światła
800-1650nm 12GHz jednomodowy odbiornik NIR sprzężony z prądem stałymNewport1544-BDo konwersji światła na sygnał elektryczny
Oscyloskopo wysokiej wydajności InfiniiumAgilentDSOX91604AAby zapisać sygnały elektryczne przekształcone w światło
, światłowód HI1060CorningHI1060Światłowód do rozciągania w czasie
WZMACNIACZ ŚWIATŁOWODOWY DOMIESZKOWANY ITERBEMKeopsysKPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FAOptyczny wzmacniacz liniowy
Krata holograficznaWasatch Photonics020305-6Krata
Strzykawka do zaparzania/wycofywania PompyHarvard ApparatusPHD 2000Pompa strzykawkowa do ładowania próbek w kanałach mikroprzepływowych
obiektywowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102(2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821(2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471(2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001(2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656(2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937(2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259(2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Asymmetric detection Time stretch Optical MicroscopyMicrofluidic Imaging Flow CytometryLabel free High contrast ImagingSingle cell ImagingUltra fast Image CaptureSubcellular Resolution AnalysisTime stretch ImagingOptical Frontend SetupData Processing VisualizationBiophysical Phenotyping Cells

Related Articles