Artykuł metodologiczny

Nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55841

⸱

7 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę izolacji i hodowli komórek zrębu okołonaczyniowego nerek (kPSC) opartą na perfuzji całego narządu za pomocą enzymów trawiennych i wzbogacaniu komórek NG2. Dzięki tej metodzie możliwe jest uzyskanie wystarczającej liczby komórek do terapii komórkowej.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to homeostatyczne i immunomodulujące komórki, które wykazały korzystne działanie w chorobach nerek i transplantacji. Komórki zrębu okołonaczyniowego (PSC) mają wspólne cechy z MSC szpiku kostnego (bmMSC). Posiadają one jednak również, najprawdopodobniej ze względu na miejscowe imprinting, właściwości specyficzne dla tkanek i odgrywają rolę w lokalnej homeostazie tkanek. Ta specyficzność tkankowa może powodować naprawę specyficzną dla tkanki, również w obrębie ludzkiej nerki. Wcześniej wykazaliśmy, że ludzkie PSC nerek (kPSC) przyspieszają gojenie się ran nabłonkowych nerek, podczas gdy bmMSC nie mają tego potencjału. Co więcej, kPSC mogą łagodzić uszkodzenia nerek in vivo. W związku z tym kPSC stanowią interesujące źródło w terapii komórkowej, szczególnie w chorobach nerek i transplantacji nerek. Tutaj pokazujemy szczegółową metodę izolacji i hodowli kPSC z ludzkich nerek do przeszczepu, opartą na perfuzji enzymów trawiennych w całym narządzie przez tętnicę nerkową i wzbogaceniu w marker okołonaczyniowy NG2. W ten sposób można uzyskać duże ilości komórek, które są odpowiednie do terapii komórkowej.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to komórki modulujące układ odpornościowy, które pierwotnie zostały wyizolowane ze szpiku kostnego. Charakteryzują się morfologią w kształcie wrzeciona, zdolnością do różnicowania się w tłuszcz, kości i chrząstki oraz przyleganiem plastycznym. MSC wyrażają markery zrębowe CD73, CD90, CD105, podczas gdy są ujemne dla markerów CD31 i CD451,2,3. MSCs są obiecującym kandydatem do terapii komórkowej ze względu na ich zdolności homeostatyczne i immunomodulacyjne tkanek. bmMSC są obecnie badane w badaniach klinicznych dla kilku chorób, w tym chorób nerek i przeszczepów nerek, jak omówiono w innym miejscu4.

Poprzednio wykazano, że komórki okołonaczyniowe z kilku różnych organów stałych, w tym tkanki tłuszczowej, łożyska i mięśni szkieletowych, mają wspólne cechy z MSCs9. Jednak komórki te wykazują również funkcje specyficzne dla tkanki, które mogą prowadzić do naprawy organotypowej10. Na przykład ludzkie komórki okołonaczyniowe mięśnia sercowego stymulowały odpowiedzi angiogenne po niedotlenieniu i różnicowały się w kardiomiocyty, podczas gdy komórki okołonaczyniowe wyizolowane z innych tkanek nie wykazywały tych potencjałów11.

Komórki zrębu okołonaczyniowego mogą być również izolowane z myszy12,13,14 i ludzkiej nerki15,16. Szczegółowo scharakteryzowaliśmy kPSC i porównaliśmy je z bmMSC. Odkryliśmy, że kPSC, podobnie jak bmMSC, mają zdolności immunosupresyjne i mogą wspierać tworzenie splotów naczyniowych. Istnieją jednak specyficzne tkankowo różnice między typami komórek, ponieważ kPSC wykazywały organotypową sygnaturę ekspresji transkrypcyjnej, w tym nefrogenne czynniki transkrypcyjne HoxD10 i HoxD11. kPSC, w przeciwieństwie do bmMSC, nie ulegały transformacji miofibroblastów po stymulacji TGF-β i nie były w stanie różnicować się w adipocyty. Co więcej, kPSC przyspieszyły integralność nabłonka w teście zadrapania rany nabłonka kanalików nerkowych, zjawiska, którego nie zaobserwowano w przypadku bmMSC. To ulepszone gojenie się ran było pośredniczone przez uwalnianie czynnika wzrostu hepatocytów. Co więcej, kPSC złagodziły uszkodzenie nerek w mysim modelu ostrego uszkodzenia nerek15. Dlatego wydaje się, że kPSC mają lepsze zdolności naprawcze nerek i są interesującym nowym źródłem terapii komórkowej w chorobach nerek.

Aby móc używać kPSC do celów terapii komórkowej, kPSC powinny być izolowane w sposób kliniczny za pomocą enzymów i protokołów klasy klinicznej. Ponadto, aby móc leczyć kilku pacjentów z kPSC od 1 dawcy, należy uzyskać wystarczającą liczbę komórek. Tutaj szczegółowo pokazujemy procedurę izolacji kPSC w stopniu klinicznym z całych nerek do przeszczepu, uzyskując wystarczającą liczbę komórek do wykorzystania w klinicznej terapii komórkowej.

Protokół

Lokalna komisja etyki medycznej i rada doradcza ds. etyki europejskiego konsorcjum (STELLAR) zatwierdziły badania i zbieranie ludzkich nerek do przeszczepu, które zostały odrzucone głównie z powodów chirurgicznych. Zgodę na badania wydano dla wszystkich nerek.

1. Przygotowania do hodowli komórkowej

  1. Przygotuj pulę lizatów płytek krwi.
    1. Płytki krwi, które straciły ważność krócej niż 2 dni, należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (maksymalnie przez 1 rok).
      UWAGA: Płytki krwi zostały pierwotnie pozyskane od komercyjnego dostawcy. Pozyskano materiał z demobilu szpitalnego dystrybuowany przez miejscowy bank krwi.
    2. Rozmrozić płytki krwi co najmniej 5 dawców (najlepiej 10) O/N w temperaturze 4 °C.
    3. Zebrać płytki krwi w dużej sterylnej butelce, przenieść do stożkowych probówek wirówkowych i wirować przez 10 minut w temperaturze 1 960 x g w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Objętość płytek krwi zależy od liczby dawców i ilości nadmiaru materiału szpitalnego przypadającego na dawcę.
    4. Odpipetować szwadron do worków z krwią (50 ml/worek) przez cylinder strzykawki o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych.
    1. Rozmrozić jedną torebkę lizatów płytek krwi w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 1 l (tj. 2 butelki) Minimum Essential Medium - alfa modification (alphaMEM), 5 ml 200 mM glutaminy i 20 ml penicyliny (5 000 U/ml)/streptomycyny (5 000 μg/ml) (wstrzykiwacz/paciorkowiec) do torebki.
    3. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    4. Potrząśnij workiem w celu odżelowania, delikatnie stukając w worek, gdy worek spoczywa na płaskiej powierzchni.
    5. Przefiltrować 5% pożywkę z lizatami płytkowymi, przeciągając lizaty przez filtr systemu do transfuzji za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml.
    6. Podzielić pożywkę na porcje do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Każda nowa partia lizatów płytek krwi jest testowana w hodowli komórkowej i porównywana z poprzednią partią poprzez hodowlę interesujących komórek (bmMSC lub kPSC) do konfluencji w obu partiach. Pod względem liczby komórek i żywotności kPSC lub bmMC wyhodowane w nowej partii nie powinny różnić się o więcej niż 10%, a ekspresja markerów CD73, CD90, CD105 i CD31, CD34 i CD45 analizowana za pomocą cytometrii przepływowej nie powinna się różnić. Metody hodowli komórkowej opisano w sekcji 6 protokołu (Hodowla kPSC).

2. Przygotowania do pobierania komórek

  1. Przygotowanie roztworów.
    1. Przygotować zwykłą pożywkę, dodając 10 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 500 ml (1 butelka) Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.
    2. Przygotować pożywkę myjącą, dodając 50 ml normalnej ludzkiej surowicy (NHS) i 10 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 1 butelki DMEM-F12.
    3. Przygotować bufor enzymatyczny przez dodanie 2,9 ml 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1,2 ml NaHCO3 2,5% [w/v] i 160 μl CaCl2 (1 M) do 160 ml roztworu Uniwersytetu Wisconsin.
    4. Przygotować roztwór kolagenazy, powoli dodając 20 ml buforu enzymatycznego do butelki kolagenazy klasy GMP zawierającej kolagenazę o stężeniu >2000 j./butelkę. Rozpuścić w temperaturze 4 °C przez około 40 minut. Delikatnie wstrząśnij kilka razy w okresie rozpuszczania.
    5. Przygotuj pożywkę do zamrażania, dodając 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 45 ml NHS.
  2. Przygotowanie tacki perfuzyjnej (Rysunek 1A).
    1. Wyczyść kabinę przepływową i przykryj obłożeniami chirurgicznymi. Podgrzej łaźnię wodną do około 40 - 45 °C, aby podgrzać tackę perfuzyjną do 37 °C. Załóż fartuchy chirurgiczne i rękawice chirurgiczne.
    2. Podłącz wysterylizowaną tackę perfuzyjną do łaźni wodnej, aby wstępnie podgrzać tackę perfuzyjną ciepłą wodą. Upewnij się, że w tacce perfuzyjnej nie ma powietrza, zaczynając od tacki perfuzyjnej w pozycji pionowej. W razie potrzeby dodaj więcej wody do łaźni wodnej, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do tacki perfuzyjnej.
    3. Umieść rurkę LS25 w pompie. Pozostaw oba sterylne końce probówki w komorze przepływowej. Umieść kleszcze Kochera na jednym końcu rurki i pozostaw na dnie tacki perfuzyjnej. Umieść sterylną gazę na rurce, aby zapobiec niedrożności. Podłącz złącze Luer na drugim końcu rurki.
    4. Dodaj około 100 ml zwykłego podłoża do tacki perfuzyjnej i rozpocznij płukanie probówki z prędkością pompy 100 ml/min.

3. Izolacja komórek nerkowych

  1. Przygotowanie nerki.
    1. Wyjmij nerkę z podwójnych sterylnych worków i umieść na sterylnej tacce perfuzyjnej (Rysunek 1B). Usuń okołonerkową tkankę tłuszczową i torebkę nerkową nożyczkami i delikatnym rozdarciem ( Rysunek 1C) i zidentyfikuj tętnicę nerkową na plamie aortalnej, jak pokazano na Rysunek 1D.
    2. Kankaniutować tętnicę nerkową za pomocą dodatkowego kolca, przymocować za pomocą wysterylizowanego natarcia i przymocować do końca rurki pompy za pomocą złącza Luer, gdy pompa jest włączona. Jeśli probówki nie są całkowicie napełnione, najpierw dodaj więcej pożywki do tacki i przepłucz rurki, uruchamiając pompę (Rysunek 1E - F). Przepłukać nerkę zwykłym podłożem za pomocą pompy o przepływie 100 ml/min.
  2. Leczenie kolagenazą i izolacja komórek nerkowych.
    1. Dodaj kolagenazę (20 ml, >2,000 j.) i DNazę (2,5 ml, 1 mg / ml) do tacki perfuzyjnej (Rysunek 1G). Od czasu do czasu delikatnie obracaj nerkę ręką. Poczekaj, aż nerka stanie się miękka, a płyn perfuzyjny stanie się mniej przezroczysty (około 30 - 40 min).
    2. Delikatnie masuj nerkę (Rysunek 1H), aż do uzyskania zawiesiny komórek (Rysunek 1I). Usunąć niestrawiony materiał i kolec w tętnicy nerkowej.
  3. Mycie i pobieranie komórek nerkowych.
    1. Dodaj 50 ml NHS do zawiesiny komórek. Opróżnij zawiesinę komórek z tacki perfuzyjnej, ustawiając pompę na niski przepływ i umieszczając rurkę najpierw podłączoną do nerki powyżej probówek o pojemności 50 ml (Rysunek 1J).
    2. Wirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Umyć granulki środkiem myjącym zawierającym 10% NHS i ponownie odwirować przy 300 x g przez 7 minut. Powtórz pranie jeszcze raz. Zmierz objętość osadów komórkowych i dodaj równą objętość pożywki do hodowli komórkowych.
    3. Albo kriokonserwować komórki stąd, dodając pożywkę zamrażającą 1:1 do zawiesiny komórek i przechowywać w fiolkach kriogenicznych zgodnie ze standardowymi protokołami, albo kontynuować hodowlę komórek (sekcja 4).
      UWAGA: Zawiesina komórkowa zawiera grudki komórek i wymaga dodatkowych kroków w celu uzyskania pojedynczych komórek, co powoduje wzrost śmierci komórki. W związku z tym komórki są utrzymywane w zawiesinie i nie są liczone na tym etapie.

4. Hodowla komórkowa surowych komórek nerkowych

  1. Dodać około 1 ml zawiesiny komórkowej do 24 ml 5% lizatów płytek krwi alphaMEM (pożywka do hodowli komórkowych) w kolbie do hodowli komórkowych T175 (Rysunek 1K) i hodować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 2 dniach usunąć pożywkę i resztki komórek z przylegających komórek i odświeżyć pożywkę za pomocą 25 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  2. Odświeżać pożywkę dwa razy w tygodniu, usuwając połowę pożywki (12,5 ml) i dodając świeżą pożywkę (12,5 ml) przy użyciu technik aseptycznych.
  3. Kultura aż do zlewu (zwykle 5 - 7 dni) (Rysunek 1L). Usunąć pożywkę, przemyć dwukrotnie PBS i trypsynizować komórki, dodając 5 ml trypsyny do każdej kolby T175 przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć w pożywce hodowlanej i odwirować przy 490 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.

5. Wzbogacanie komórek dla NG2 przez magnetyczną separację komórek (Rysunek 1M)

  1. Przygotuj bufor do separacji komórek zgodnie z protokołem producenta.
  2. Ponownie zawiesić trypsynizowane kPSC w 10 ml buforze do separacji komórek. Wirować przy 490 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforze do separacji komórek.
  3. Dodać 100 μl reagenu blokującego FcR/5 x 107 komórek, dodać 100 μl kulek przeciwczerniakowych (NG2) na 5 x 107 komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Oddzielić frakcję NG2-dodatnią zgodnie z protokołem producenta. Dodać 10 ml pożywki i odwirowywać komórki przez 5 minut przy 490 x g.
  4. Policzyć ogniwa za pomocą komory liczącej Bürker zgodnie z protokołem producenta. Wysiać komórki w kolbie hodowlanej (około 4 x 103 komórki/cm2) i inkubować.
    UWAGA: Wysiewaj komórki w następujących stężeniach: <250 000 w kolbie T25, 250 000 - 500 000 w kolbie T75 i 700 000 - 800 000 w kolbie T175. Po magnetycznym wzbogaceniu komórek izoluje się frakcję dodatnią około 1 - 2%. Ponieważ jednak ten etap polega na wzbogacaniu komórek, a nie sortowaniu komórek, w hodowli będą obecne inne typy komórek (Rysunek 1N). Po kilku przejściach (zwykle około 4 - 5) obecna jest tylko jednorodna populacja kPSC (Rysunek 1P).

6. Kultura kPSC

  1. Odświeżaj pożywkę dwa razy w tygodniu, usuwając połowę pożywki i zastępując ją świeżo rozmrożoną pożywką hodowlaną (Rysunek 1N).
    UWAGA: kPSC wydają się być bardziej żywotne i proliferacyjne, gdy odświeżana jest tylko połowa pożywki.
  2. Pasażowanie kPSCs.
    UWAGA: Przejdź przez kPSC przy zbieganiu 90 - 100% lub gdy pojawią się struktury 3D (patrz Rysunek 1O), lub gdy nie było wzrostu komórek przez ponad tydzień. Dwa ostatnie mogą szczególnie wystąpić we wczesnych pasażach po wzbogaceniu komórek. W tym przypadku, po pasażowaniu, komórki zwykle zaczynają ponownie rosnąć w hodowli jednowarstwowej (Rysunek 1P).
    1. Usuń pożywkę z 90 - 100% zlewających się komórek (zachowaj pożywkę do późniejszego użycia). Przemyć kolbę dwukrotnie PBS (1 ml w T25, 5 ml w T75, 10 ml w T175). Dodać trypsynę (0,5 ml w T25, 2 ml w T75, 5 ml w T175) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać starą pożywkę do kolby i delikatnie zawiesić.
    2. Przenieść do probówki o pojemności 15 lub 50 ml (w zależności od objętości) i odwirować przy 490 x g przez 5 minut. Policz żywe komórki i płytkę <250 000 w T25, 250 000 - 500 000 w T75 lub 700 000 - 800 000 w T175 (około 4 x 103 komórek/cm2).
  3. Zbadać kPSC w pasażu 5 lub 6 (np. test zarysowania, sekcja 7).
    UWAGA: Scharakteryzuj rozmnożone komórki za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu standardowych protokołów. Ekspresja markerów NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC powinna być dodatnia, a CD31, CD34, CD45 i HLA-DR powinna być ujemna. Test na obecność mykoplazmy, bakterii i grzybów w pożywce hodowlanej zgodnie ze standardowymi protokołami klinicznego laboratorium mikrobiologicznego. Przetestuj funkcjonalnie kPSC w teście zadrapania nabłonka nerki. Eksperymenty są zwykle przeprowadzane na sterylnych, potwierdzonych cytometrią przepływową jednorodnych populacjach kPSC o zdolności gojenia się ran między pasażem 6-8.
  4. Kriokonserwacja kPSC poprzez dodanie 0,5 ml pożywki do 0,5 ml zawiesiny komórek (2 miliony komórek na ml pożywki hodowlanej) przy użyciu standardowych protokołów.
    UWAGA: Po rozmrożeniu zasiej kPSC o większej gęstości (106 komórek w T175).

7. Test funkcjonalny kPSC: Test zadrapań ran nabłonkowych nerek

  1. Hodować kPSC na 6-dołkowej płytce o gęstości 200 000 komórek/basenik w 2 ml pożywki hodowlanej. Po 48 godzinach hodowli w temperaturze 37 °C, 5% CO2 zebrać sklarowany osad. To jest podłoże kondycjonowane.
  2. Wysiewaj HK-2 (proksymalne komórki nabłonkowe kanalików kanalikowych)17 w 2 ml pożywki z bliższych komórek nabłonka kanalików kanalikowych (PTEC) składającej się ze stosunki 1:1 DMEM-F12 uzupełnionej insuliną (5 mg / ml), transferyną (5 mg / ml), selenem (5 ng / ml), hydrokortyzonem (36 ng / ml), trójjodotyryryną (40 pg / ml), naskórkowym czynnikiem wzrostu (10 ng / ml) i piórem / paciorkowcem, w gęstości 500 000 komórek na studzienkę na 6-dołkowej płytce do hodowli komórek.
  3. Hodowla przez 48 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z HK-2 i utworzyć ranę zadrapania w monowarstwie HK-2, wykonując rysę końcówką żółtego punktu pipety od góry do dołu studzienki. Przemyć HK-2 PBS i dodać kondycjonowaną pożywkę kPSC lub pożywkę kontrolną. Zaznacz na spodzie tabliczki obszar, który ma być sfotografowany.
    UWAGA: HK-2 powinny być zlewne. Wyobraź sobie dwa obszary na studzienkę.
  4. Zobrazuj rysę po 4, 8, 12 i 24 godzinach w tym samym zaznaczonym miejscu za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola.
  5. Zmierz obszar rysy na obrazie J za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby określić procent zamknięcia.

Wyniki

Metoda izolacji kPSC klasy klinicznej została przedstawiona w Rysunku 1. Surowe komórki nerek są izolowane z ludzkich nerek klasy transplantacyjnej poprzez perfuzję kolagenazą. Otrzymana zawiesina komórkowa jest hodowana w 5% lizatach płytek krwi aż do uzyskania konfluencji. Następnie frakcja peryvaskularnych komórek zrębowych jest izolowana na podstawie ekspresji NG2.

kPSC są adherentnymi do tworzywa sztucznego komórkami o wrzecionowatym kształcie (Rysunek 2A) i wykazują dodatnią ekspresję markerów stromalnych CD73, CD90, CD105 oraz markerów okołonaczyniowych NG2, PDGFR-B i CD146, natomiast są ujemne dla CD31, CD34, CD45 i HLA-DR (Rysunek 2B). Zazwyczaj jednorodna populacja kPSC jest uzyskiwana w 4. pasażu, a kPSC wchodzą w stan senescencji około 9. – 10. pasażu (Rysunek 2C). Dlatego zalecamy przeprowadzanie eksperymentów między 5. a 8. pasażem.

Aby ocenić zdolność funkcjonalną wyizolowanych kPSC, przeprowadzamy test gojenia rany in vitro komórek nabłonkowych nerek dla każdej nowej partii kPSC, ponieważ wcześniej wykazaliśmy, że medium warunkowane kPSC może przyspieszać gojenie rany nabłonkowej w tym teście15. Medium warunkowane kPSC przygotowuje się poprzez hodowlę kPSC przez 48 h w pożywce alphaMEM z 5% lizatami płytek krwi, a następnie poprzez zebranie nadsączu. Następnie uwiecznione ludzkie komórki nabłonkowe kanalików proksymalnych nerek (HK-2)17 są hodowane do momentu osiągnięcia konfluencji, po czym wykonuje się zadrapanie (ranę). Następnie do dołków dodaje się medium warunkowane kPSC lub medium kontrolne, a następnie mierzy się szybkość gojenia rany. Po dodaniu medium warunkowanego kPSC rana zamyka się znacznie szybciej (Rysunek 2D).

Metody izolacji komórek nerek i hodowli kPSC, schematy, proces perfuzji, zawiesina komórkowa, analiza.
Rysunek 1: Metoda izolacji ludzkich kPSC w stopniu klinicznym. Nerki klasy transplantacyjnej są kaniulowane i poddawane perfuzji kolagenazą poprzez tętnicę nerkową (A - G), a otrzymana zawiesina komórkowa jest płukana i następnie krio konserwowana lub poddana hodowli (H - K). Po osiągnięciu przez komórki konfluencji (L) przeprowadzane jest wzbogacenie w komórki NG2 (M). Komórki są trypsynizowane, gdy osiągną konfluencję, przestaną proliferować lub gdy pojawią się struktury 3D (N - P). Kryteriami dopuszczenia kPSC są sterylność, ekspresja markerów oraz zdolność do wspomagania gojenia ran nabłonka cewkowego (Q). Strzałka: tętnica nerkowa. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Charakterystyka komórek macierzystych: obraz mikroskopowy, cytometria przepływowa, krzywa wzrostu, test gojenia ran.
Rysunek 2: Charakterystyka ludzkich kPSC. A) kPSC są komórkami wrzecionowatymi, przylegającymi do tworzywa sztucznego. B) kPSC wykazują pozytywną ekspresję markerów mezenchymalnych CD73, CD90, CD105 oraz markerów okołonaczyniowych NG2, PDGFR-β i CD146, natomiast są negatywne dla CD31, CD34 i CD45. kPSC wykazują ekspresję cząsteczek MHC klasy I (HLA-ABC), ale nie klasy II (HLA-DR). C) Charakterystyka wzrostu kPSC od trzech różnych dawców; cytometria przepływowa potwierdziła homogeniczne populacje NG2-dodatnie (w pasażu 4). kPSC osiągają stan starzenia około 9–10 pasażu. D) kPSC są w stanie wspomagać regenerację nabłonka nerek w teście zarysowania rany (wound scratch assay). Przedstawiono reprezentatywne obrazy dla pożywki kontrolnej oraz pożywki warunkowanej kPSC w czasie t=0, 4, 8 i 12 h. Pasek skali w A) = 200 µm, w D) = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Komórki okołonaczyniowe zostały wyizolowane z wielu różnych ludzkich narządów stałych, w tym trzustki, tłuszczu, chrząstki i nerek 9,15,16. Większość metod opiera się jednak na małych próbkach tkanek, które są preparowane, a następnie traktowane enzymami trawiennymi. Co więcej, zwykle nie jest to wykonywane w przypadku produktów klasy klinicznej. To sprawia, że strategie te są mniej odpowiednie do bezpośredniej translacji klinicznej, gdzie konieczne są duże ilości komórek klasy klinicznej.

Tutaj pokazujemy nowatorską metodę izolacji ludzkich kPSC dla całych narządów w oparciu o perfuzję z enzymami i materiałami klasy klinicznej. Protokół został zaadaptowany z klinicznych wysepek protokołu izolacji Langerhansa, który jest obecnie stosowany do zastosowań klinicznych w naszym centrum18.

Jest to pierwsza metoda klasy klinicznej, w której można uzyskać duże ilości kPSC. Zmienność wydajności komórek jest w dużej mierze zależna od dawcy. Jednakże, gdy ekstrapoluje się wydajność komórek, którą obecnie uzyskujemy z frakcji surowej zawiesiny komórek trzech różnych dawców, teoretycznie można osiągnąć średnią wydajność 2,7 x10 12 kPSC na dawcę. Ponieważ terapia MSC zazwyczaj składa się z 2 infuzji komórkowych o stężeniu 1-2 x 106 komórek/kg masy ciała4, liczba tych komórek jest wystarczająca do leczenia allogenicznego u kilku pacjentów.

Jednym z krytycznych etapów procedury izolacji jest czas trawienia kolagenazy. Gdy okres trawienia jest zbyt krótki, pozostaną duże grudki tkanki, które będą trudniejsze do wyhodowania. Gdy okres perfuzji jest zbyt długi, można zaobserwować zwiększoną śmierć komórek. Dlatego, gdy tylko nerka zacznie stawać się miękka, a płyny mniej przezroczyste, nerkę należy delikatnie masować i przerwać leczenie kolagenazą.

Kolejnym krytycznym krokiem jest hodowla komórek po wzbogaceniu komórek NG2. Czasami po wzbogaceniu komórek NG2 komórki okołonaczyniowe nie zaczynają się namnażać ani nie zaczynają rosnąć w strukturach 3D. W takim przypadku, gdy komórki są trypsynizowane i ponownie wysiewane, komórki zwykle zaczynają rosnąć w hodowli jednowarstwowej.

Jako materiał wyjściowy wykorzystano ludzkie nerki do przeszczepu, odrzucane głównie z przyczyn chirurgicznych. Są to funkcjonalne narządy bez większego zwłóknienia. Zdajemy sobie sprawę, że może to być ograniczenie, ponieważ jest to stosunkowo rzadkie i trudne do zdobycia źródło narządów. Innym źródłem mogą być wyeksplantowane nerki; Jednak w zależności od przyczyny eksplantacji nerek, nerki te mogą zawierać więcej zwłóknienia, a tym samym miofibroblastów, dlatego należy zachować ostrożność, ponieważ miofibroblasty mogą być izolowane i hodowane zamiast komórek okołonaczyniowych.

Ponieważ kPSC wyizolowane za pomocą tego protokołu wykazują właściwości organotypowe i zdolność gojenia się ran nabłonka nerek15, terapia komórkowa kPSC w chorobach nerek i transplantacji byłaby interesującym zastosowaniem w przyszłości. W tym celu istnieje kilka strategii dostarczania produktu komórkowego/komórkowego. Pierwszą strategią jest dożylna infuzja kPSC, stosowana obecnie w badaniach klinicznych bmMSC. Innym ciekawym zastosowaniem jest zastosowanie kPSC lub czynników wydalanych przez kPSC w perfuzji maszynowej przed przeszczepem. W ten sposób jakość eksplantowanej nerki może ulec poprawie, co może prowadzić do poprawy funkcji nerek po przeszczepie. W przypadku obu strategii kPSC są interesującym nowym źródłem komórek, które można dalej badać do celów klinicznych.

Oświadczenia

D.G.L., M.A.E. i T.J.R. są związani ze zgłoszeniem patentowym dotyczącym tych badań. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant numer 305436 STELLAR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Worki BaxterFenwalR4R-7004
Ludzkie płytki krwiNadwyżka materiału szpitalnego Sanquinprzeterminowana na mniej niż 2 dni używany
jest lizatwykonane na zamówienie
Jednorazowe sterylne butelkiCorning09-761-11
Probówki wirówkowe PP 500 mlCorning431123
a-MEM średniLonzaBE12-169F
glutamaxthermo fisher35050038
długopis/paciorkowiec Invitrogen15070063
Codan455609
DMEM-F12life technologies11320-074
Normalna surowica ludzka (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7.5%LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWMost do życia32911
HeparynaLeo Pharma
kolagenaza NB1 GMP klasaSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
serwety chirurgiczne3M NederlandDH999969404
pompa perfuzyjnametrohmx007528300
głowica pompymetrohmx077202600
perfuzyjnawykonana na zamówienie
rurki masterflex LS25 KolecMasterflexHV-96410-25
Gambro DASCO6038020
pulmozymehodowlane Roche
25 cm2greiner690175
kolba hodowlana 75 cm2greiner658170
kolba hodowlana 175 cm2greiner661160
Trypsynasigmat4174
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
Odczynnik blokujący FcRmiltenyi130-059-901
kulki przeciw czerniakowi (NG2)miltenyi130-090-452
sitko komórkowe 70 i mikro; mCorning352350
Kolumny LSMiltenyi130-042-401
Magnes MACSmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
CD146 PEBD 
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITCBD 
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r R& Mysz Dmab 1263
IgG1 FITCBD 
345815 mysz IgG1 PEBD 
345816 mysz IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
koza przeciw myszy PEDakoR0480
azydek soduMerck822335
DMEM Szynka ' s F12Gibco31331-028
ITS (insulina, transferyna, selen)SigmaI1884
hydrokortyzonSigmaH0135
trójjodotyryninaSigmaT5516
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)sigmaE9644
Unieśmiertelnione ludzkie nerkowe PTEC (HK2)dzięki uprzejmości M. Ryana, kolegium uniwersyteckie w Dublinie
płytkowy System transfuzji taca akcesoriów Kolby 555821555485550315555596555555559866555516550257555445345818555743

Bibliografia

  1. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
  2. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  3. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  4. Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
  5. Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
  6. Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
  7. Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
  8. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
  9. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  10. Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
  11. Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
  12. Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
  13. Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
  14. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
  15. Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  16. Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
  17. Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
  18. Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Marker oko onaczyniowy NG2perfuzja ca ego narz dutrawienie enzymatycznemagnetyczna separacja kom rektest gojenia ran wound scratch assayprotok hodowli kom rkowejkaniulacja t tnicy nerkowejtrawienie kolagenaz

Powiązane artykuły