Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer

Summary

Ten protokół umożliwia mikroskopię pojedynczych komórek różnie różniących się komórek pływaka i roju Vibrio parahaemolyticus. Metoda ta tworzy populację komórek roju łatwo dostępnych do analizy pojedynczej komórki i obejmuje przygotowanie kultur komórkowych, indukcję różnicowania roju, przygotowanie próbki i analizę obrazu.

Abstract

Możliwość badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek jest niezbędna do zrozumienia wielu procesów komórkowych. To z kolei wymaga możliwości uzyskania pojedynczych komórek do mikroskopii fluorescencyjnej, co może być szczególnie trudne w przypadku obrazowania komórek istniejących w społecznościach bakteryjnych. Na przykład ludzki patogen Vibrio parahaemolyticus występuje w postaci krótkich komórek pływaka w kształcie pręta w warunkach płynnych, które w kontakcie powierzchniowym różnicują się w subpopulację wysoce wydłużonych komórek roju wyspecjalizowanych do wzrostu na powierzchniach stałych. W pracy przedstawiono metodę analizy mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek V. parahaemolyticus w jego dwóch stanach różnicowych. Protokół ten bardzo powtarzalnie indukuje różnicowanie V. parahaemolyticus w cyklu życiowym komórki roju i ułatwia ich proliferację na powierzchniach stałych. Metoda ta wytwarza rozbłyski zróżnicowanych komórek roju rozciągających się od krawędzi kolonii roju. Warto zauważyć, że na samym końcu rozbłysków roju komórki roju znajdują się w pojedynczej warstwie komórek, co pozwala na ich łatwe przeniesienie na szkiełko mikroskopowe, a następnie obrazowanie pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo przedstawiono przebieg analizy obrazu na potrzeby reprezentacji demograficznej społeczeństw bakteryjnych. Jako dowód słuszności zasady opisano analizę wewnątrzkomórkowej lokalizacji układów sygnalizacyjnych chemotaksji w komórkach pływaka i roju V. parahaemolyticus.

Introduction

Bakterie nieustannie doświadczają zmian w swoim środowisku zewnętrznym i rozwinęły kilka technik, aby odpowiednio zmienić i dostosować swoje zachowanie. Jeden z takich mechanizmów polega na różnicowaniu się w odrębne typy komórek, które lepiej uzupełniają zmienione środowisko. Różnicowanie często wiąże się z poważnymi zmianami w regulacji cyklu komórkowego, morfologii komórek i czasoprzestrzennej organizacji komórek. Jednym z organizmów, który może ulegać różnicowaniu, jest Vibrio parahaemolyticus. V. parahaemolyticus należy do rodziny Vibrionaceae, która jest rodziną proteobakterii, które zwykle zamieszkują słodką lub słoną wodę. Vibrionaceae są szeroko rozpowszechnione w środowisku i obejmują kilka gatunków, które powodują infekcje przewodu pokarmowego u ludzi, w tym również Vibrio cholerae.V. parahaemolyticus jest organizmem dymorficznym i jest w stanie różnicować się w dwa odrębne typy komórek w odpowiedzi na zmiany w swoim środowisku zewnętrznym. W środowisku wodnym występuje jako krótka komórka pływaka w kształcie pręta z pojedynczą polarną wicią umieszczoną na starym biegunie komórki. Po kontakcie z powierzchnią wyzwalane jest różnicowanie się w komórkę roju. Różnicowanie komórek roju obejmuje dwie główne zmiany: morfogenezę komórek roju poprzez hamowanie podziału komórek oraz indukcję drugiego systemu wici. Powoduje to powstanie okołoskórej i bardzo wydłużonej komórki roju w kształcie pręcika, która może albo kontynuować styl życia roju, w którym zdarzenia podziału skutkują powstaniem komórek roju potomnego, albo alternatywnie różnicować się z powrotem w komórki pływaka.

Zgłoszono kilka czynników, które indukują lub wpływają na różnicowanie rojów. Wydaje się, że główny bodziec jest napędzany przez mechanosensing, w którym V. parahaemolyticus wykorzystuje wić polarną jako czujnik dotykowy, który wykrywa zahamowanie rotacji przy kontakcie z powierzchnią, ale w grę wchodzi również kilka innych czynników¹. W laboratorium rotacja wici polarnej może być sztucznie zahamowana przez dodanie fenamilu, który blokuje rotację wiciowców napędzaną kanałem sodowym, indukując w ten sposób różnicowanie roju². Co więcej, we wcześniejszym badaniu Vibrio alginolyticus został nakłoniony do rojenia się na pożywkach stałych, gdy komórki rozmnażano na pożywce wzrostowej na szalce Petriego zamkniętej przezroczystą plastikową taśmą. Bibuła filtracyjna nasycona alkaliami zapobiegała rojeniu się w tych warunkach, co sugeruje, że jeden lub więcej lotnych kwasów może być zaangażowanych w indukcję roju. Tak więc uszczelnienie szalki Petriego plastikową taśmą prawdopodobnie pozwoliło na gromadzenie się lotnych kwasów, powstałych jako produkty uboczne metabolizmu komórkowego, w przestrzeni nad głową płytki. Ten sam efekt osiągnięto, gdy H₂O₂ został dodany do pożywki wzrostowej na niezamkniętych szalkach Petriego w celu sztucznego wytworzenia lotnych kwasów poprzez hydrolizę składników pożywki^3,4,5. Niemniej jednak tożsamość takich lotnych kwasów pozostaje nieznana. Co więcej, wykazano, że nadmierna dostępność wapnia⁶ i iron-limitation⁷ zwiększają różnicowanie roju i proliferację na powierzchniach stałych. Komórki mogą być pozbawione żelaza poprzez dodanie do pożywki 2,2'-bipirydylu, który, jak wykazano, wpływa na różnicowanie roju⁸. Czynniki, o których wiadomo, że regulują różnicowanie, są obecnie wdrażane w projektowaniu protokołu, który w powtarzalny sposób indukuje różnicowanie V. parahaemolyticus w komórki roju i ich proliferację na stałych powierzchniach agaru.

V. Różnicowanie parahaemolyticus obejmuje poważne zmiany w regulacji podziału komórek, morfologii komórek i pozycjonowaniu maszyn makromolekularnych, takich jak aparaty wici i chemotaksji - procesy, które wymagają specyficznej lokalizacji białek zgodnie z cyklem komórkowym. Tak więc możliwość badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji takich białek jest niezbędna do zrozumienia wyżej wymienionych procesów komórkowych. Do wykonania takich badań niezbędna jest mikroskopia fluorescencyjna na pojedynczych komórkach. Może to być szczególnie trudne w przypadku obrazowania komórek, które istnieją w gęstych populacjach bakterii, jak ma to miejsce w przypadku komórek roju. Podjęto próby wywołania różnicowania roju w płynnych pożywkach, które mogłyby potencjalnie wygenerować pojedyncze komórki do badań mikroskopowych. I chociaż na poziomie transkrypcyjnym komórki te częściowo indukowały program różnicowania roju, nie przechodzą tych samych wyraźnych zmian morfologicznych, co w pełni zróżnicowane komórki roju hodowane na stałym podłożu⁸. W artykule tym przedstawiono solidny i powtarzalny protokół metody indukowania różnicowania komórek roju na powierzchni agaru. Protokół tworzy populację łatwo dostępnych komórek roju, które są łatwo dostępne do mikroskopii pojedynczej komórki i późniejszej analizy. Ponadto protokół umożliwia badania lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie zarówno w typach komórek pływaka, jak i roju (sekcje 1, 2, 3, 4). Dodatkowo w protokole opisano późniejszy proces przetwarzania i analizy danych generowanych z eksperymentów mikroskopii fluorescencyjnej, co pozwala na analizę demograficzną społeczeństw bakteryjnych (sekcja 5).

Protocol

1. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek V. parahaemolyticus i elektroporacja plazmidowego DNA do komórek pływaka

UWAGA: Poniższa sekcja protokołu pozwala na przygotowanie elektrokompetentnych komórek i późniejsze elektroportowanie plazmidowego DNA do komórek pływaka. Ten krok jest ważny, jeśli białka fluorescencyjne ulegają ektopowej ekspresji z plazmidu.

1. Komórki V. parahaemolyticus należy rozsiać po wyrobisku glicerolu o temperaturze -80 °C na świeżą płytkę agarową LB zawierającą 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia zaszczepić 200 ml pożywki LB pojedynczą kolonią V. parahaemolyticus i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach wstrząsania, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ wynoszącego 1,0. Zwykle potrzeba 5-6 godzin inkubacji, aby hodowla komórkowa osiągnęła pożądaną gęstość optyczną.
3. Natychmiast przenieść komórki na lód i wykonać wszystkie dalsze czynności na lodzie i w wirówkach wstępnie schłodzonych o temperaturze 4 °C.
4. Zbierać komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g.
5. Odrzucić supernatant przez dekantację i ponownie zawiesić osad komórkowy w 25 ml lodowatego roztworu sacharozy o stężeniu 273 mM (pH 7,4, buforowanego KOH).
6. Ponownie zebrać komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 2000 x g. Powtórzyć jeszcze dwa razy.
7. Ponownie zawiesić przemyty osad komórkowy w 400 μl lodowatego roztworu sacharozy o stężeniu 273 mM. Następnie dodać glicerol do końcowego stężenia 15% obj./obj. Ogniwa są teraz gotowe do elektroporacji, ale można je również zamrozić w porcjach 70 μl w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
8. Do elektroporacji należy wymieszać 70 μl podwielokrotności elektrokompetentnych ogniw ze 100 - 1000 ng plazmidowego DNA i przenieść mieszaninę do lodowatej kuwety do elektroporacji (odstęp elektrody 0,2 cm). Wykonaj elektroporację z następującymi ustawieniami: 25 μF, 2400 V i 200 Ω.
9. Zawiesić komórki w kuwecie do elektroporacji w 600 μl bulionu LB, przenieść do probówki o pojemności 2 ml i inkubować, wytrząsając w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
10. Odwiruj komórki przy 2,000 x g przez 5 minut i ponownie zawieś granulkę w 100 μl bulionu LB. Rozprowadzić zawiesinę komórkową na selektywnych płytkach agarowych LB zawierających niezbędne antybiotyki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
11. Następnego dnia sprawdź płytki pod kątem tworzenia kolonii. Kolonie, które rosną, mają prawidłowy gen oporności na antybiotyki zakodowany w plazmidzie i mogą być teraz wykorzystywane do dalszych eksperymentów.

2. Indukcja różnicowania komórek roju

UWAGA: Poniższe kroki opisują, jak wywołać różnicowanie V. parahaemolyticus w cyklu życia komórki roju i jak stymulować proliferację na powierzchniach stałych.

1. Zawiesić 4 g agaru do naparu sercowego (HI) w 100 ml ddH₂O w celu przygotowania płytek rojowych.
2. Ostrożnie zagotuj roztwór agaru HI w kuchence mikrofalowej i od czasu do czasu potrząsaj butelką, aż proszek się rozpuści. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min.
3. Po sterylizacji w autoklawie schłodzić agar HI do temperatury 60-65 °C. Dodać 2,2'-bipirydyl do końcowego stężenia 50 μM (roztwór podstawowy 50 mM w 100% etanolu). Dodać CaCl₂ do końcowego stężenia 4 mM (roztwór podstawowy 4 M w ddH₂O). Jeśli to konieczne, dodaj antybiotyki do roztworu, aby utrzymać plazmidy.
   UWAGA: Jeśli planujesz użyć indukowalnego plazmidu, dodaj środek indukujący do jego końcowego stężenia.
   UWAGA: 2,2'-Bipirydyl: Ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna). Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy używać rękawic i okularów ochronnych.
4. Wlać 30 - 35 ml końcowego roztworu agaru HI do okrągłej szalki Petriego o średnicy 150 mm i pozwolić agarowi zastygnąć.
5. Tuż przed wykryciem hodowli komórkowej suszyć płytkę agarową w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut (lub do momentu, gdy wszelkie pozostałości płynu znikną, ale nie dłużej) w pionie z otwartą pokrywką.
   UWAGA: Czas suszenia w dużym stopniu zależy od używanego inkubatora, a mocno wysuszone płytki nie pozwolą na rojenie się V. parahaemolyticus. (Ten krok jest bardzo ważny!) Talerze muszą być świeże i nie powinny być starsze niż 2 - 3 godziny. Stare talerze będą zbyt suche, aby stymulować rojenie.
6. Zaszczepij niewielką ilość komórek z krawędzi pojedynczej kolonii do 5 ml bulionu LB. Inkubować kulturę, wstrząsając w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ = 0,8, zwykle trwa to około 2-3 godzin. Następnie komórki są gotowe do nakrycia na płytkach agarowych roju HI.
7. Umieścić 1 μl kultury komórkowej w środku płytki do roju agaru HI (ryc. 1A).
8. Pozostaw miejsce do wyschnięcia (Rysunek 1B).
9. Uszczelnij płytkę przezroczystą plastikową taśmą i upewnij się, że jest dobrze przymocowana, w przeciwnym razie może się odczepić podczas nocnej inkubacji (Rysunek 1C).
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby uszczelka była idealna. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza i fałd na taśmie podczas jej nakładania.
10. Inkubować płytkę w temperaturze 24 °C przez noc. Spowoduje to powstanie kolonii roju V. parahaemolyticus z rozbłyskami roju rozciągającymi się od obrzeży kolonii roju (ryc. 2).

3. Przygotowanie komórek roju V. parahaemolyticus do mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: Poniższy protokół opisuje, jak przygotować mikroskopowe preparaty agarozowe i następnie odciskać rozbłyski roju na podkładce agarozowej, aby uzyskać pojedyncze komórki roju do mikroskopii.

1. Aby przygotować szkiełka agarozowe do mikroskopii, dodaj 1 g agarozy do 100 ml roztworu bulionu PBS o stężeniu 20% obj. / obj. i 10% obj. LB. Ostrożnie zagotuj roztwór w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę i pozwól jej ostygnąć do 65-70 °C, mieszając z mieszadłem magnetycznym.
2. Umieść czyste szkiełko mikroskopowe na idealnie wypoziomowanej części stołu roboczego. Przykryj oba końce prowadnicy dwiema warstwami uniwersalnej laboratoryjnej taśmy etykietowej, mocując prowadnicę do stołu roboczego. Odległość między dwoma kawałkami taśmy powinna wynosić około 3 cm.
   UWAGA: Dwie warstwy taśmy tworzą bardzo małą wysokość, która określi wysokość podkładki agarozowej. Ważne jest, aby przestrzeń robocza była wypoziomowana, aby upewnić się, że komórki będą znajdować się w tej samej płaszczyźnie do analizy mikroskopowej.
3. Odmierzyć pipetą ~ 250 μL uprzednio przygotowanego roztworu agarozy na niepokrytą powierzchnię szkła.
4. Teraz umieść drugie szkiełko mikroskopowe w tej samej orientacji co dolne na górze i lekko dociśnij je, aby resztki agarozy mogły wypłynąć na boki.
5. Pozwól agarozie zastygnąć przez 1-2 minuty, a następnie powoli ściągnij górną szklankę z dolnej w ruchu poziomym.
6. Za pomocą skalpela odetnij wszelkie resztki agarozy, które są przymocowane do boków szkiełka mikroskopowego i powoli usuń taśmę z końców szkiełka mikroskopowego.
   UWAGA: Szkiełko agarozowe jest teraz gotowe i należy je zużyć jak najszybciej, ponieważ zacznie powoli wysychać.
7. Aby przeprowadzić mikroskopię na komórkach roju, wytnij kawałek agaru rojowego o wymiarach ~3 mm x 10 mm z najbardziej zewnętrznej krawędzi kolonii roju (ryc. 1D). Bardzo ważne jest, aby nie zerwać uszczelki taśmy na płytce roju aż do momentu bezpośrednio przed przeniesieniem komórek roju na szkiełko mikroskopowe. Po usunięciu taśmy rojące się komórki V. parahaemolyticus inicjują różnicowanie w komórki pływaka.
   UWAGA: Upewnij się, że nacięcia są kierowane od zewnątrz krawędzi roju kolonii do wnętrza kolonii (Rysunek 1D). W ten sposób można zapobiec "zanieczyszczeniu pływaka" na krawędzi rojącej się kolonii.
8. Przenieś kawałek agaru rojowego na szkiełko agarozowe mikroskopu z komórkami skierowanymi w stronę podkładki agarozowej (ryc. 1E). To odciska rojące się komórki na poduszce agarozy.
9. Po odczekaniu ~30 s ostrożnie wyjmij kawałek agaru z podkładki agarozowej (Rysunek 1F).
10. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na podkładce agarozowej, w której odciśnięto komórki. Komórki są teraz gotowe do mikroskopii.
    UWAGA: Ważne jest, aby natychmiast zobrazować komórki roju, ponieważ komórki roju powoli inicjują różnicowanie do stanu pływaka.

4. Przygotowanie kultur komórkowych V. parahaemolyticus pływaków do mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje, jak przygotować hodowlę V. parahaemolyticus do przeprowadzenia mikroskopii fluorescencyjnej na typie komórek pływaka.

1. Zaszczepij niewielką ilość komórek z krawędzi pojedynczej kolonii do 5 ml bulionu LB. Inkubować kulturę, wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub do momentu, gdy widoczny stanie się niewielki wzrost komórek.
2. Na tym etapie, jeśli to konieczne, dodać środek indukujący do ekspresji interesujących nas białek. W tym przykładzie L-arabinoza została dodana do końcowego stężenia 0,2% (w/vol) w celu wywołania ekspresji YFP-CheW⁹.
3. Inkubować kulturę, wstrząsając przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 37 °C.
4. Wykonaj kroki 3.1-3.7, aby przygotować szkiełka agarozowe do mikroskopii.
5. Umieść 1 μl kultury komórkowej na środku podkładki agarozowej i pozwól plamce inkubować, aż wyschnie.
6. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na podkładce agarozowej, na której wykryto komórki. Komórki są teraz gotowe do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym.

5. Analiza obrazu

Ta część protokołu opisuje proces analizy obrazu, a w szczególności sposób ekstrakcji danych fluorescencyjnych pojedynczych komórek do analizy demograficznej.

1. Przed rozpoczęciem analizy obrazu upewnij się, że wszystkie obrazy mikroskopowe są zapisane w 16-bitowym formacie TIF.
2. Załaduj do oprogramowania obraz DIC (lub kontrast fazowy) i odpowiadające mu obrazy kanałów fluorescencyjnych.
3. Wygeneruj obraz nakładki obu kanałów, wybierając opcję "Wyświetlanie/Nakładanie obrazów". Ustaw liczbę obrazów ("# Images:") na dwa i wybierz obraz DIC w pierwszym kanale i obraz fluorescencyjny w drugim kanale.
4. Wybierz narzędzie "Multi-Line" z paska narzędzi i zaznacz komórki od jednego bieguna do drugiego przez środek komórki. Aby uzyskać listę wszystkich wygenerowanych linii (obiektów linii), otwórz "Pomiary miary/regionu". Skonfiguruj pomiary regionu tak, aby wyświetlała tylko etykietę regionu, odległość i średnią intensywność.
5. Dostosuj rozmiar piksela w sekcji "Zmierz/Kalibruj odległości" do rozmiaru piksela specyficznego dla konfiguracji mikroskopu i kliknij "Zastosuj do wszystkich otwartych obrazów".
6. Przenieś wszystkie obszary (obiekty liniowe) na obraz kanału fluorescencyjnego. W sekcji "Regiony/Regiony transferu" wybierz obraz źródłowy (obraz nakładki) i obraz docelowy (obraz kanału fluorescencyjnego). Wybierz "Wszystkie regiony" i naciśnij "OK".
   UWAGA: Aby móc później odtworzyć dokładne linie (obiekty linii, regiony, ROI), otwórz "Regiony/Zapisz regiony" i zapisz regiony.
7. Wyeksportuj wszystkie pomiary regionów do arkusza kalkulacyjnego, otwierając "Pomiary miary/regionu" i naciskając "Otwórz dziennik". Potwierdź, aby otworzyć i wyeksportować dane. Po otwarciu arkusza kalkulacyjnego w tle na koniec wyeksportuj dane, naciskając "F9: Dane dziennika".
8. Aby określić położenie ognisk fluorescencyjnych wzdłuż komórki, otwórz "Measure/Linescan". Ustaw "Szerokość skanowania linii" na wartość, aby cała szerokość komórki była pokryta przez wcześniej utworzony region. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres skanowania linii i wybierz "Pokaż dane wykresu". Klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając kursor myszy wzdłuż skanowania linii do interesującego punktu, w oknie "Dane wykresu" zostanie wyświetlony odpowiedni piksel/odległość między dwoma punktami. Zaznacz podświetlony na niebiesko wiersz, a następnie skopiuj zawartość.
   UWAGA: Cały profil intensywności skanowania linii można zapisać w arkuszu kalkulacyjnym, naciskając "Dane dziennika" w oknie "Linescan". Wyodrębnione dane można teraz wykorzystać do wizualizacji na wykresach lub dalszej analizy statystycznej. Wzorce lokalizacji w cyklu komórkowym można łatwo zobrazować w demograficznej reprezentacji długości komórki i intensywności fluorescencji wzdłuż ciała komórki. Te reprezentacje można uzyskać przy użyciu tych samych wcześniej wybranych ROI. W poniższych krokach przedstawiono przykład generowania danych demograficznych podobnych do tych pokazanych na rysunkach 3C i 4C.
   1. W Fiji/ImageJ załaduj oznaczenia regionu (.rgn) utworzone wcześniej w oprogramowaniu (krok 5.6) za pomocą "Importera plików Metamorph nd & ROI". Alternatywnie, obszary zainteresowania (ROI) komórek, które mają być analizowane, można utworzyć bezpośrednio w Fiji/ImageJ za pomocą wbudowanego narzędzia "Segmented Line".
   2. Otwórz "Analizuj/Narzędzia/Menedżer ROI" i zaznacz wszystkie aktywne wpisy listy".
   3. Następnie kliknij "Więcej/Wiele działek", a następnie wybierz "Lista" w nowym oknie "Wiele działek". Kliknij wpis w tabeli, a następnie wybierz i "skopiuj wszystko". Następnie wklej do nowego arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Upewnij się, że dane najdłuższej komórki (dwie odpowiadające sobie kolumny X i Y z największą liczbą wierszy) znajdują się jako ostatnie po prawej stronie arkusza kalkulacyjnego.
   4. Zapisz arkusz kalkulacyjny jako plik "CSV (rozdzielany przecinkami)" (*.csv)".
   5. Pobierz skrypty języka R z tego miejsca "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"¹⁰. Skrypty sortują komórki według długości i normalizują profile intensywności fluorescencji wszystkich komórek jako średnią fluorescencji każdej komórki.
   6. Uruchom cały skrypt "funkcja profili komórek. R" w R [wersja 3.0.1;¹¹].
   7. Edytuj "przykładowe wykresy. R" w wierszu 30 tak, że ścieżka pliku odnosi się do folderu, w którym zapisany jest wcześniej wygenerowany plik .csv. Ponadto zmień nazwę pliku "profile.csv" w wierszu 31 na nazwę pliku wybraną dla pliku wygenerowanego .csv kroku 5.9.4. Następnie uruchom "przykładowe wykresy". R" i postępuj zgodnie z dokumentacją z "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles", a także komentarzami z pliku skryptu, aby wygenerować analizę demograficzną.

Results

Indukcja różnicowania i tworzenia rojowych kolonii

Rysunek 1 przedstawia schemat ważnych etapów związanych z tworzeniem rojowych kolonii V. parahaemolyticus (Rysunek 1A-C). Kultura pływaka została zauważona na agarze roju i inkubowana w temperaturze 24 ^oC, indukując różnicowanie i proliferację roju na stałej powierzchni agaru. Reprezentatywny obraz stereomikroskopowy kolonii roj...

Discussion

W artykule przedstawiono metodę obrazowania mikroskopowego komórek roju V. parahaemolyticus, a następnie dalsze analizy mające na celu rozwiązanie i ilościowe określenie lokalizacji subkomórkowej i innych cech badanych białek znakowanych fluorescencyjnie. Chociaż istnieje kilka narzędzi do przetwarzania i analizy obrazów mikroskopowych 14,15,16,17,18, analiza komórek roju V. parahaemolyticus pozostaje wyzwaniem, głównie dlatego, że zwykle występują one w gęstej społeczności^<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Składniki pożywki
LB medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulowany	BD	214510	Do przygotowania agaru LB z pożywką
LB Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	Do przygotowania płytek rojowych HI agar
Agaroza NEEO, ultra jakości	Roth	2267.3	Do przygotowania mikroskopii pady agarozowe
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Dodatki
L-arabinoza	Roth	5118.3	Służy do indukcji pochodnych pBAD
2,2'-Bipirydyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	Do przygotowania płytek roju agaru HI
Dwuwodny chlorek wapnia	Roth	5239.1	Do przygotowania płytek rojowych HI
agar Sól sodowa ampicyliny	Roth	K029.3
Chloramfenikol	Roth	3886.3
Bufor PBS	-		Standardowa receptura soli fizjologicznej
D(+) Sacharoza	Roth	4621.1	Do przygotowania ogniw elektrokompetentnych
Glycerol	Roth	3783.5	Do przygotowania ogniw elektrokompetentnych
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Hardware
szalka Petriego 150 mm x 20 mm z krzywkami	Sarstedt	82.1184.500	Do przygotowania płytek rojowych HI
agar kelvitron t (B 6420)	Heraeus-Używany		do suszenia płytek rojowych HI
agar Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Służy do elktroporacji plazmidowego DNA
strong>Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Software
MetaMorph Offline (wersja 7.7.5.0)	Urządzenia molekularne-Używane		do analizy obrazu mikroskopowego
Excel	Microsoft-Używany	do analizy danych mikroskopowych