Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy

22.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55843

⸱

26 października 2017

 ,  ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, CNRS, INSERM, iBV, 2Department of Pathology, CHU Nice, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie echokardiograficzne jest często stosowane u myszy. W tym celu opracowano drogie urządzenia ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje niedrogą procedurę echokardiograficzną połączoną z histologicznymi analizami morfometrycznymi w celu określenia morfologii serca.

Streszczenie

W ostatnich latach dostępna jest coraz większa liczba genetycznie modyfikowanych modeli myszy. Ponadto liczba badań farmakologicznych przeprowadzanych na myszach jest wysoka. Charakterystyka fenotypowa tych modeli mysich wymaga również zbadania funkcji i morfologii serca. Echokardiografia i rezonans magnetyczny (MRI) są powszechnie stosowanymi metodami do charakteryzowania funkcji i morfologii serca u myszy. Sprzęt echokardiograficzny i MRI wyspecjalizowany do stosowania u małych gryzoni jest drogi i wymaga dedykowanej przestrzeni. Protokół ten opisuje pomiary serca u myszy przy użyciu klinicznego systemu echokardiograficznego z ludzką sondą naczyniową 15 MHz. Pomiary wykonuje się na znieczulonych dorosłych myszach. Co najmniej trzy sekwencje obrazów są rejestrowane i analizowane dla każdego zwierzęcia w trybie M w widoku przymostkowym w krótkiej osi. Następnie wykonywane jest badanie histologiczne serca i oznaczane są średnice kardiomiocytów na skrawkach parafiny barwionych hematoksyliną-eozyną lub aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA). Gęstość naczyń określa się morfometrycznie po barwieniu immunologicznym Pecam-1. Protokół został z powodzeniem zastosowany w badaniach farmakologicznych i różnych genetycznych modelach zwierzęcych w warunkach wyjściowych, a także po eksperymentalnym zawale mięśnia sercowego poprzez trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD). Z naszego doświadczenia wynika, że badanie echokardiograficzne jest ograniczone do znieczulonych zwierząt i jest wykonalne u dorosłych myszy o masie ciała co najmniej 25 g.

Wprowadzenie

Dostępna jest duża różnorodność genetycznie modyfikowanych modeli myszy, a liczba badań farmakologicznych na myszach jest wysoka1,2. Echokardiografia i rezonans magnetyczny są powszechnie stosowanymi metodami do fenotypowej charakterystyki funkcji i morfologii serca w tych modelach mysich3. Celem przedstawionego protokołu jest analiza funkcji i morfologii serca u dorosłych myszy. Łączy w sobie pomiary echokardiograficzne, histologiczne i immunohistochemiczne. Badanie echokardiograficzne jest szeroko stosowane u myszy4,5,6,7,8,9,10,11,12. Pachon i wsp.11 zidentyfikował 205 badań opublikowanych w Circulation, Circulation Research, American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology, and Cardiovascular Research w latach 2012-2015, w których wykorzystano badanie echokardiograficzne u zwierząt.

Echokardiografia służy do identyfikacji fenotypów serca u genetycznie zmodyfikowanych myszy5,6,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, a także do analizy funkcji serca w przewlekłych modelach hipertrofii wywołanej przeciążeniem, niedokrwieniem mięśnia sercowego i kardiomiopatią u myszy (recenzja w12). Ulepszony sprzęt do echokardiografii pozwala na standardowy pomiar wymiarów skurczowych i rozkurczowych lewej komory (LV), obrazowanie dopplerowskie tkanek, echografię kontrastową mięśnia sercowego oraz ocenę funkcji regionalnej lewej komory i rezerwy wieńcowej12. Idealnie byłoby, gdyby badanie echokardiograficzne zostało przeprowadzone u przytomnych myszy, aby uniknąć negatywnego wpływu znieczulenia na funkcję skurczową, kontrolę odruchów autonomicznych i częstość akcji serca11. Niemniej jednak podejście to jest ograniczone wymogiem szkolenia zwierząt; trudności w utrzymaniu stabilnej temperatury ciała; artefakty ruchu; stres; bardzo wysokie częstotliwości pracy serca; oraz wymóg, aby doświadczenie przeprowadziło co najmniej dwóch badaczy, zwłaszcza jeśli badana jest duża liczba zwierząt. Co ciekawe, niedawne badanie nie wykazało różnic w parametrach echokardiograficznych u wyszkolonych i niewyszkolonych zwierząt19. Wykonujemy pomiary echokardiograficzne u znieczulonych myszy. Poniżej zostaną omówione różne protokoły znieczulenia.

Chociaż echokardiografia o standardowej rozdzielczości (>10 MHz) jest wystarczająca do pomiaru wymiarów skurczowych i rozkurczowych LV oraz funkcji serca u dorosłych myszy, metoda ta jest ograniczona w opisie podstawowych zjawisk strukturalnych. W związku z tym łączymy pomiary >in vivo z analizami histologicznymi i immunohistologicznymi, aby zmierzyć np. średnicę kardiomiocytów i gęstość naczyń. Inne badania histologiczne i immunohistologiczne, takie jak oznaczanie proliferacji, badanie apoptozy, pomiary wielkości zawału, oznaczanie zwłóknienia i ekspresji specyficznych markerów, mogą być również wykonywane na tym samym typie przetwarzanej tkanki, ale nie są przedmiotem niniejszego protokołu. Połączenie badania echokardiograficznego in vivo z analizami histologicznymi dostarcza dodatkowych informacji na temat leżących u podstaw zmian strukturalnych. W dodatkowym kroku możemy uzupełnić te pomiary o badania molekularne i ultrastrukturalne. Analizy histologiczne nie tylko uzupełniają badanie echokardiograficzne, ale stają się również niezbędne, gdy rozdzielczość echokardiografii nie jest wystarczająca. Dzieje się tak zwłaszcza w modelach genetycznie zmodyfikowanych myszy, które są w embrionalnym stadium śmiertelnym23,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi instytucjonalnymi i francuskimi prawami, wytycznymi i politykami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Zostały one zatwierdzone przez francuską komisję etyczną (Comité Institutionnel d'Ethique Pour l'Animal de Laboratoire; numer NCE/2012-106).

1. Echokardiografia

  1. Określ masę ciała myszy za pomocą standardowej wagi laboratoryjnej, trzymając ją lekko za ogon, aby zapewnić prawidłowe ułożenie.
  2. Znieczulić zwierzę przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie 50 mg/kg pentobarbitalu25,26.
    UWAGA: Każdy inny rodzaj znieczulenia może być zastosowany, jeśli ten sam protokół jest stosowany przez cały czas trwania badania. Zalety i wady zostaną omówione poniżej.
  3. Umieść mysz z powrotem w jej własnej klatce i poczekaj, aż przestanie reagować, zacznie oddychać równomiernie, a odruchy tylnej stopy nie będą odczuwalne. Aby to sprawdzić, lekko ściśnij stopę i obserwuj, czy noga nadal się chowa.
  4. Ogol lewą stronę klatki piersiowej i lewą pachę za pomocą dostępnej w handlu golarki dla gryzoni.
    UWAGA: Zastosowanie dedykowanej golarki dla gryzoni pozwala na całkowite usunięcie cienkiego włosa myszy, aby uniknąć zakłóceń w pomiarze echokardiograficznym. Należy unikać komercyjnych kremów lub roztworów do depilacji, ponieważ są one zwykle perfumowane, co będzie przeszkadzać zwierzęciu po przebudzeniu. Unikaj nadmiernego golenia, ponieważ zwiększa to utratę ciepła.
  5. Śpiące zwierzę ułożyć na ciepłej podkładce ustawionej na 40 - 42 °C w płytkiej pozycji lewostronnej, z głową na godzinie 12 i ogonem na godzinie 6. Przymocuj lewe ramię, lewą nogę i ogon taśmą.
  6. Nałóż wstępnie podgrzany żel do echokardiografii na ogoloną klatkę piersiową i głowicę głowicy.
  7. Umieść przetwornik przymostkowo w lewo, kierując go na prawą stronę szyi, aby uzyskać dwuwymiarowy (2D) widok przymostkowy w długiej osi na poziomie mięśnia brodawkowatego. Obróć przetwornik o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby uzyskać widok z krótkiej osi na poziomie mięśni brodawkowych. Użyj minimalnego ustawienia głębi i powiększenia, aby zmaksymalizować jakość obrazu i liczbę klatek na sekundę. Ustaw prędkość zamiatania na maksimum.
    1. Aby uzyskać te ustawienia, można użyć różnych opcji ustawień powiększenia i głębi, w zależności od urządzenia i oprogramowania. Nagrywaj obrazy w trybie M z przewodnikiem 2D w widoku krótkoosiowym27. Patrz Rysunek 1A i B27.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na klatkę piersiową, ponieważ może to spowodować bradykardię.
  8. Nagraj co najmniej 3 serie po 3 pętle cine z biciem serca dla każdego zwierzęcia.
    UWAGA: W przypadku oprogramowania echokardiograficznego używanego w tym badaniu należy nacisnąć przycisk "Pobierz/Zapisz" tylko raz. Ta metodologia jest specyficzna dla echokardiografu z tym konkretnym oprogramowaniem. Inne pakiety oprogramowania mogą być używane z różnymi maszynami.
  9. Po udanych nagraniach zetrzyj żel echokardiograficzny z klatki piersiowej myszy, poduszki grzewczej i przetwornika. Usuń taśmę z kończyn i ogona.
  10. Pozostaw mysz pod obserwacją na poduszce grzewczej, przykrytą chusteczką, aby uniknąć niepotrzebnej ekspozycji na światło i utraty ciepła, aż się obudzi.
  11. Umieść zwierzę z powrotem w klatce.
  12. Analizuj zarejestrowane obrazy w trybie M z widoku krótkiej osi przymostkowej, aby określić wymiary i funkcję lewej komory (LV). Zmierzyć grubość przedniej ściany lewej komory w skurczu i rozkurczu (LVAW i LVAWd), wewnętrzną średnicę końca skurczowego i końcoworozkurczowego lewej komory (LVIDs i LVIDd) oraz grubość tylnej ściany lewej komory (LVPW) w skurczu i rozkurczu (LVPWs i LVPWd), identyfikując granicę faz tkanka-krew na przechowywanych obrazach.
  13. Zmierzyć wymiary rozkurczowe w czasie pozornych maksymalnych wymiarów rozkurczowych LV i wymiarów skurczowych LV w czasie najbardziej wysuniętego do przodu skurczowego wychylenia tylnej ściany lewej wysokości. Dotknij ekranu dotykowego ikony "Analizuj", a następnie ikony "LVAWd". Umieścić suwmiarkę elektroniczną na styku prawej jamy komorowej z przednią ścianą lewej komory w rozkurczu.
  14. Umieść suwmiarkę elektroniczną na styku między przednią ścianą lewej komory a jamą lewej wysokości, aby uzyskać rozkurczową grubość przedniej ściany lewej komory; oprogramowanie bezpośrednio przełączy się na wewnętrzny pomiar końca rozkurczowego LV.
  15. Umieść suwmiarkę na granicy faz między wnęką lewej komory a tylną ścianą lewej komory, aby uzyskać wewnętrzną średnicę końcoworozkurczową lewej komory; oprogramowanie przełączy się na pomiar grubości tylnej ściany lewej komory.
  16. Umieść suwmiarkę na granicy między tylną ścianą lewej komory a osierdziem, aby uzyskać rozkurczową tylną ścianę lewej komory. W przypadku wymiarów skurczowych LV dotknij ekranu dotykowego ikony "LVAWs" i ustaw suwmiarkę elektroniczną na styku między prawą jamą komorową a przednią ścianą lewej komory w skurczu.
  17. Ustawić suwmiarkę elektroniczną na granicy faz między przednią ścianą lewej komory a jamą lewej komory, aby uzyskać skurczową przednią ścianę lewej komory. Powtórz proces opisany powyżej dla wewnętrznej średnicy końca skurczu lewej komory i grubości tylnej ściany skurczowej lewej lewej wysokości. Użyj najnowocześniejszej konwencji przyjętej przez Amerykańskie Towarzystwo Echokardiografii, aby prześledzić granice wsierdzia i nasierdzia13,27.
    UWAGA: Parametry funkcji kurczliwości LV zostaną automatycznie obliczone na podstawie poprzednich pomiarów. Skrócenie ułamkowe LV (FS) definiuje się jako FS (%) = [(LVIDd - LVIDs)/LVIDd] x 100. Frakcję wyrzutową lewej komory (EF) oblicza się za pomocą zmodyfikowanego wzoru Teicholza, gdzie EF (%) = [(LVIDd3 - LVIDs3)/LVIDd3] x 10012. Patrz Rysunek 1A i B.
  18. Przechowuj dane na płytach kompaktowych lub pamięciach USB i twórz kopie zapasowe.
  19. Importuj, analizuj i eksportuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    UWAGA: Po tych pomiarach bazowych eksperyment można wstrzymać. W przypadku bezpośredniego porównania zwierząt nokautowych i rodzeństwa z miotu typu dzikiego, należy przeprowadzić analizy histologiczne6. Dla Cre-ERT2; Linie myszy Lox/LOX, kontynuuj następnego dnia z indukcją tamoksyfenu przez wstrzyknięcie I.P., zgodnie z opisem5,24. W przypadku wywołania eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego przez podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej5,28, operację można przeprowadzić bezpośrednio po pomiarach echokardiograficznych, gdy myszy są pod narkozą. W przeciwnym razie należy zachować minimalny tygodniowy odstęp między dwiema rundami znieczulenia, aby ograniczyć częstość występowania śmiertelności pooperacyjnej.

2. Przygotowanie próbek serca do oceny histologicznej

  1. Składaj zwierzęta w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy. Zmierz ich masę ciała. Zdezynfekuj klatkę piersiową i brzuch za pomocą wacika nasączonego 70% alkoholem.
  2. Wykonaj poprzeczne nacięcie w skórze 1 cm dystalnie do mostka. Za pomocą kleszczy usuń skórę z klatki piersiowej, poruszając się w kierunku głowy. Lekko przytrzymaj mostek cienkimi kleszczami i otwórz przeponę, wkładając koniec cienkich nożyczek.
  3. Przetnij klatkę piersiową po obu stronach równolegle do mostka. Przesuń mostek w kierunku głowy. Zlokalizuj serce w klatce piersiowej. Przytrzymaj pień naczyniowy serca cienkimi kleszczami i przetnij poniżej cienkimi nożyczkami.
  4. Otwórz klatkę piersiową i wytnij całe serce z klatki piersiowej, zmierz masę serca i ustal stosunek masy serca do masy ciała4,5,6,23,29,30.
  5. Umieścić serce w 2 ml 10% obojętnego buforowanego roztworu formaliny w 15-mililitrowych probówkach przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Niebezpieczeństwo! Praca z roztworami formaliny musi być wykonywana w dygestorii chemicznej; Nosić rękawice i okulary ochronne.
    UWAGA: Ponieważ skład buforowy dla roztworów formaliny różni się w zależności od różnych dostawców, należy używać tego samego dostawcy przez cały czas trwania badania.
  6. Następnego dnia wytnij serca w płaszczyźnie poprzecznej, pośrodku i przenieś je do kaset w celu zatopienia parafiny, co odbywa się w laboratorium patomorfologicznym za pomocą zautomatyzowanego aparatu do zatapiania.
  7. Wykonaj sekcje.
    1. Bloki parafiny o grubości 3 μm należy rozdrobnić za pomocą mikrotomu i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C zawierającej wodę destylowaną.
    2. Przenieś sekcje na slajdy. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przechowywać je w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu do momentu, gdy użytkownik będzie gotowy do barwienia (krok 3).
  8. Odparafinować i ponownie nawodnić szkiełka tkankowe.
    1. Umieścić szkiełka w słoikach do barwienia ze szklanymi wkładkami w piekarniku o temperaturze 55 °C na 10 minut, aby rozpuścić parafinę.
    2. Odparafinować szkiełka w dwóch zmianach po 200 ml ksylenu lub substytutu ksylenu przez 5 minut każda.
      UWAGA: Wysoce łatwopalny i toksyczny! Praca w dygestoriach chemicznych; Nosić rękawice i okulary ochronne.
    3. Przenieś szkiełka do 200 ml 100% alkoholu. Dokonaj dwóch zmian po 3 minuty każda i przelej raz przez 200 ml 95% alkoholu przez 3 min.
      UWAGA: Wysoce łatwopalny! Przechowywać z dala od źródeł zapłonu; Zakaz palenia.
    4. Przepłukać dwukrotnie w 200 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS) przez 5 minut każdy i kontynuować krok 3, 4 lub 5.

3. Barwienie hematoksyliną i eozyną

  1. Opłucz szkiełka wraz z ich sekcjami w wodzie destylowanej.
  2. Jądra należy barwić roztworem hematoksyliny przez 8 minut.
  3. Płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
  4. Barwieć roztworem eozyny przez 2 min.
  5. Odwodnić trzy razy przez 2 minuty w 100% etanolu (EtOH). Klarować trzy razy przez 2 minuty w ksylenie lub substytucie ksylenu. Zamontuj w medium montażowym na bazie ksylenu.
  6. Sfotografuj szkiełka i zmierz średnicę kardiomiocytów na poziomie jądra w podłużnych odcinkach przegrody międzykomorowej. Zmierz co najmniej 100 komórek na sekcję i trzy sekcje na serce.

4. Barwienie WGA

  1. Inkubować szkiełka otrzymane z kroku 2.7 z WGA sprzężonym z tetrametylorodaminą (lub innymi barwnikami fluorescencyjnymi) (1:100 w PBS) przez 60 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  2. Umyj trzy razy PBS przez 5 minut każdy.
  3. Zamontuj za pomocą fluorescencyjnego nośnika montażowego zawierającego DAPI. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przed analizą.
    UWAGA: Nosić okulary ochronne i kompatybilne rękawice odporne na chemikalia.
  4. Sfotografuj slajdy.
    1. Użyć mikroskopu wyposażonego w epi-oświetlenie fluorescencyjne i zestawy filtrów do DAPI i tetrametylorodaminy (patrz Tabela materiałów). Ustaw przysłonę na maksimum, a jasność na automatyczną ekspozycję.
    2. Uzyskuj oddzielne obrazy przy 400-krotnym powiększeniu dla kanałów niebieskiego i czerwonego. Otwórz obrazy w ImageJ. W razie potrzeby dostosuj jasność i kontrast (Image > Adjust > Brightness/contrast).
    3. Ustaw każdy obraz na 8-bitowy (Typ > obrazu > 8-bitowy). Nałóż na siebie obrazy DAPI i WGA. Użyj kanału niebieskiego dla DAPI i kanału czerwonego dla WGA; ustaw kanały zielony i szary na brak (Obraz > Kolor > Scal kanały)31.
  5. Określ średnice kardiomiocytów na poziomie jądra w poprzecznych odcinkach przegrody międzykomorowej.
    1. Zdefiniuj skalę obrazów w ImageJ. W tym celu należy sfotografować obiekt o znanej wielkości (np. komorę hemocytometru w tym samym powiększeniu co wycinki serca; krok 4.4).
    2. Użyj narzędzia linia prosta, aby narysować linię od początku do końca znanej struktury (Analizuj > Ustaw skalę).
      UWAGA: Odległość w pikselach zostanie wyświetlona automatycznie; Konieczne będzie wprowadzenie znanej odległości i jednostki długości. Kontynuuj pomiary kardiomiocytów na poziomie jądra.
    3. Narysuj linię prostą od błony WGA-dodatniej przez jądro DAPI-dodatnie do przeciwnego miejsca błony komórkowej WGA-dodatniej (Analizuj > Zmierz). W oknie wyników upewnij się, że wartości długości mają znaczącą liczbę miejsc dziesiętnych (Analizuj > Ustaw pomiary > miejsc dziesiętnych).
    4. Zmierz co najmniej 100 komórek na sekcję i trzy sekcje na serce. Eksportuj wyniki do Excela (kliknij > plik wyników > Zapisz jako > .csv)6,31.

5. Barwienie immunologiczne Pecam-1

  1. Wykonaj demaskowanie antygenu.
    1. Dodaj 1,600 ml buforu cytrynianu sodu (10 mM cytrynianu sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0) do szybkowaru. Umieść szybkowar na płycie grzejnej i włącz go z pełną mocą. W tym momencie nie zabezpieczaj pokrywy szybkowaru; po prostu połóż go na wierzchu.
      UWAGA: Gorąco!
    2. Gdy bufor cytrynianu sodu się zagotuje, przenieś szkiełka z kroku 2.5 do szybkowaru. Zabezpiecz pokrywę szybkowaru. Gdy tylko szybkowar osiągnie pełne ciśnienie, odczekaj 7 minut. Po upływie 7 minut wyłącz płytę grzejną i umieść szybkowar w pustym zlewie. Aktywuj zawór spustowy ciśnienia i przelej kuchenkę zimną wodą. Po rozhermetyzowaniu otwórz pokrywę i wlej zimną wodę do szybkowaru na 5 minut. Umieść szkiełka w 200 ml PBS.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować demaskowanie antygenu mikrofalowego, chociaż ryzyko przegrzania jest zwiększone.
  2. Użyj 0,3% nadtlenku wodoru w metanolu, aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy na 5 minut. Przepłukać szkiełka trzy razy po 2 minuty w 200 ml PBS.
    UWAGA: Łatwopalny i toksyczny!
  3. Inkubować szkiełka przez 15 minut w rozcieńczonej normalnej surowicy blokującej (5% normalnej surowicy koziej w PBS), która zawiera również blok awidyny (4 krople w 1 ml).
  4. Ostrożnie postukaj płyn z skrawków i inkubuj je z przeciwciałem Pecam-1 od królika, rozcieńczonym w stosunku 1:50 w PBS zawierającym 2,5% normalnej surowicy koziej i 4 krople bloku biotyny na ml. Szkiełka należy inkubować przez noc w wilgotnej komorze o temperaturze 4 °C.
  5. Umyj szkiełka trzy razy po 5 minut w 200 ml PBS. Inkubować skrawki z biotynylowanym kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG rozcieńczonym w stosunku 1:200 w PBS zawierającym 2,5% normalnej surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzy razy po 5 minut w 200 ml PBS.
  6. Inkubować skrawki z systemem peroksydazy na bazie awidyny/biotyny przez 20 minut (odczynnik A i odczynnik B należy połączyć 30 minut przed użyciem). Umyj szkiełka trzy razy po 5 minut w 200 ml PBS.
  7. Rozpuścić 1 tabletkę 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i 1 tabletkę nadtlenku wodoru mocznika w 5 ml podwójnie destylowanej wody. Inkubuj skrawki z roztworem DAB przez około 3 minuty, uważnie monitorując rozwój koloru. Zatrzymaj reakcję barwną, delikatnie myjąc szkiełka w 200 ml PBS.
    UWAGA: Rakotwórcze; Nosić rękawice odporne na chemikalia!
  8. Przeciwbarwić jądra przez 6 minut hematoksyliną. Płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty. Odwodnić trzy razy po 2 minuty w 200 ml 100% alkoholu. Klarować trzy razy przez 2 minuty w 200 ml ksylenu lub substytutu ksylenu. Zamontuj w medium montażowym na bazie ksylenu.
  9. Sfotografuj szkiełka (co najmniej dziesięć pól w 40-krotnym powiększeniu od przegrody międzykomorowej każdego serca) i zmierz gęstość obszaru Pecam-1 za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ31. Użyj wtyczki color deconvolution32 dla DAB i hematoksyliny i dostosuj kontrast obrazu do tego samego poziomu.
    UWAGA: W przypadku, gdy kolor brązowy i fioletowy/niebieski mają znaczne nakładanie się widmowe, co może powodować trudności z dekonwolucją kolorów, można wypróbować różne marki roztworu hematoksyliny, aby uzyskać przezroczyste, jasnoniebieskie barwienie jądrowe. Alternatywnie można przeprowadzić immunofluorescencję lub ręczne liczenie naczyń włosowatych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na Rysunku 1 reprezentatywne zapisy echokardiograficzne demonstrują użyteczność echokardiografii w identyfikacji fenotypów serca u myszy modyfikowanych genetycznie. Różnicę między myszą o prawidłowej funkcji serca (Rysunek 1A) a zwierzęciem z rozszerzoną lewą komorą i upośledzoną funkcją LV (Rysunek 1B) można łatwo zidentyfikować. Rysunek 2 przedstawia porównanie pomiaró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowano różne metody oceny struktury i funkcji serca u myszy, w tym echokardiografię, rezonans magnetyczny ze wzmocnieniem kontrastowym, mikrotomografię komputerową i skan PET. Ze względu na swoją opłacalność i prostotę, echokardiografia jest najczęściej stosowaną techniką analizy funkcjonalnej u myszy11. Ogólnie rzecz biorąc, ze względu na mały rozmiar serca i wysoką częstotliwość tętna u myszy, należy stosować przetworniki o częstotliwości >10 MHz, chociaż odnotowano udane pomiary za pomocą p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca była wspierana przez rząd francuski (Narodowa Agencja Badawcza, ANR) poprzez program LABEX SIGNALIFE "Inwestycje dla przyszłości" (numer referencyjny ANR-11-LABX-0028-01) oraz przez dotacje dla K. D. W. od Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France i Plan Cancer Inserm. D. B. i A. V. otrzymali stypendia od Fondation pour la Recherche Médicale oraz od miasta Nicei, odpowiednio. Echokardiograf i głowica zostały dostarczone przez firmę Philips. Dziękujemy A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouarowi, A. Martresowi, A. Biancardiniemu i S. M. Wagnerowi za ich kompetentną pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tetrametylodamina sprzężona z kiełkami pszenicy (WGA)Life Technologies, Sondy molekularneW849
Biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgGVectorlabsBA-1000
Zestaw blokujący awidynę/biotynęVectorlabsSP-2001
Zestaw VECTASTAIN Elite ABC HRP (peroksydaza, standard)VectorlabsPK-6100
VECTASHIELD Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPIVectorlabsH-1200
SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzydyna w tabletkachSigmaD4168
Roztwór nadtlenku wodoruSigmaH1009
Przeciwciało anty-Pecam-1 (CD31)Abcamab28364
Żel do transmisji ultradźwięków, Żel Aquasonic 100Parker
Liniowa sonda ultradźwiękowa, L15-7ioEchokardiograf Philips Healthcare
, Mikroskop IE33 xMATRIXPhilips Healthcare
Filtr fluorescencyjny
TxRLeica11525310
Oprogramowanie do obrazowania
obrazu, SPOT 5.2 Zaawansowane i podstawowe oprogramowanieKomputer
Fine ScissorsFine Science Tools14028-10
Duże nożyczkiFine Science Tools14501-14
Ostrza skalpelaFine Science Tools10023-00
Graefe KleszczeFine Science Tools11650-10
Golarka do gryzoniAparat Harvard34-0243
Kasety do zatapiania parafinySakura4155F
neutralnie buforowana FormalinaSakura8727
KsylenSakura8733
Paraffine TEK IIISakura4511
automatyczna aparatura do zatapiania,Sakura6032
Tissue-Tek TEC 5Sakura5229
Accu-Edge S35Sakura4685
, szkiełkaSakura9533
, Tissue-TekSakura9582
Podłoże montażowe Tissue-TekSakura1408
Skrzynki przesuwneSakura3958
roztwór eozynySakura8703
roztwór hematylinyMikrotom Sakura8711
, RM2125RTLeica720-1880 (VWR)
kąpiel wodna, Leica HI1210Leica720-0113(VWR)
EtanolVWRACRO444220050
probówki 15 mlVWR734-0451
naczynie witrażoweSłoiki doVWR MARI4200005 MARI4220004
D4293
PBS (10X)Thermo Fisher Scientific70011044
, Leica DMi8 DAPI Zestaw filtrów Leica 11525304 Aparat cyfrowy , Kolorowy suwak punktowy SPOT RT3 do obrazowania punktowego Dell stacja do zatapiania parafiny Tissue-Tek VIP Ostrza mikrotomu , szkiełka mikroskopowe nakrywkowe Tissue-Tek barwienia Inkubator VWR Binder 9010-0012 DAB i tabletki nadtlenku wodoru mocznika, SIGMAFAST 3,3′-diaminobenzydyna tabletki Sigma

Bibliografia

  1. Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
  2. Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
  3. Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
  4. Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
  5. Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085(2016).
  6. Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953(2016).
  7. Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
  8. de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
  9. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691(2012).
  10. Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541(2015).
  11. Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
  12. Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
  13. Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
  14. Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
  15. Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
  16. Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
  17. Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
  18. Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
  19. Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
  20. Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
  21. Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
  22. Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960(2016).
  23. Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
  24. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852(2014).
  25. Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
  26. Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
  27. Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
  28. van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
  29. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
  30. Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
  33. Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
  34. Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
  35. Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
  36. Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
  37. Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
  38. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Badanie echokardiograficznemodele mysieobrazowanie w trybie Mkr tka o w przekroju przyobojczykowymrednica kardiomiocyt wg sto naczybarwienie immunochemiczne Pecam 1wymiary lewej komory
Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.