Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Summary

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Abstract

Procesy komórkowe są złożone i wynikają z wzajemnego oddziaływania między wieloma typami komórek i ich środowiskiem. Istniejące techniki biologii komórki często nie pozwalają na dokładną interpretację tej wzajemnej zależności. Stosując podejście oparte na obrazowaniu ilościowym, przedstawiamy protokół o wysokiej zawartości do charakteryzowania dynamicznych odpowiedzi fenotypowych (tj. zmian morfologii, proliferacji, apoptozy) heterogenicznych populacji komórek na zmiany bodźców środowiskowych. Podkreślamy naszą zdolność do rozróżniania typów komórek na podstawie intensywności fluorescencji lub nieodłącznych cech morfologii w zależności od zastosowania. Platforma ta pozwala na bardziej kompleksową charakterystykę reakcji subpopulacji na perturbacje przy jednoczesnym wykorzystaniu krótszego czasu, mniejszych ilości odczynników i mniejszego prawdopodobieństwa błędu niż tradycyjne testy biologii komórki. Jednak w niektórych przypadkach populacje komórek mogą być trudne do zidentyfikowania i ilościowego określenia na podstawie złożonych cech komórkowych i będą wymagały dodatkowego rozwiązywania problemów; Zwracamy uwagę na niektóre z tych okoliczności w protokole. Demonstrujemy tę aplikację za pomocą odpowiedzi na lek w modelu raka; Można go jednak z łatwością zastosować szerzej do innych procesów fizjologicznych. Protokół ten pozwala zidentyfikować subpopulacje w systemie kokultur i scharakteryzować szczególną reakcję każdej z nich na bodźce zewnętrzne.

Introduction

Testy oparte na komórkach były koniem pociągowym w podstawowych badaniach i opracowywaniu leków. Jednak ograniczenia tych standardowych testów stają się coraz bardziej widoczne wraz z rozbieżnością między danymi in vitro a danymi klinicznymi oraz nieuzyskaniem zatwierdzenia przez FDA większości leków. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę wykorzystania obrazowania ilościowego do jednoczesnej analizy fenotypów heterokomórkowych w odpowiedzi na odpowiednie, współwystępujące bodźce środowiskowe.

Tradycyjne testy komórkowe, które są używane do pomiaru żywotności komórek, obejmują: testy wykluczenia błękitu trypanowego, MTT/MTS i barwienie cytometrią przepływową Annexin V-FITC. Testy wykluczania błękitu trypanowego, choć proste i niedrogie, wymagają dużej liczby komórek, są czasochłonne i często wpływają na nie stronniczość użytkownika¹. Testy MTT i MTS pośrednio mierzą żywotność komórek poprzez pomiary tempa metabolizmu mitochondriów. Jednak na aktywność metaboliczną komórek mogą wpływać różne warunki hodowli (takie jak pożywka lub stężenie tlenu), co prowadzi do niedokładnych wyników i uniemożliwia standaryzację między typami komórek i warunkami^2,3. Inną poważną wadą tych technik jest ich niezdolność do rozróżnienia wielu typów komórek – większość systemów biologicznych jest heterokomórkowa. Chociaż metody cytometrii przepływowej mają zdolność rozróżniania wielu populacji komórek, wymagane są etykiety komórek, dynamiczne pobieranie próbek jest trudne, a w przypadku korzystania z przylegających komórek aplikacja ta staje się czasochłonna i podatna na błędy.

Inne ważne fenotypy komórkowe, w tym zmiany morfologiczne, występują w odpowiedzi na bodźce środowiskowe, ale nie są wychwytywane przez tradycyjne testy komórkowe. Profilowanie stanów komórek poprzez charakterystykę morfologiczną i mapowanie podobieństw między próbkami jest potężnym, bezstronnym narzędziem, które może dostarczyć nowatorskich spostrzeżeń w wielu aspektach badań podstawowych i translacyjnych, w tym podstawowej biologii komórki i odkrywania leków⁴. Ponadto wykazano, że morfologia komórek nowotworowych koreluje z podtypami nowotworów⁵ i agresywność⁶. W związku z tym bardzo interesujące jest badanie tych cech komórkowych i ich związku z określonymi zaburzeniami środowiskowymi. Dodatkowo można wykorzystać różnice w cechach morfologicznych do rozróżnienia subpopulacji w systemach kokulturowych. Znakowanie fluorescencyjne komórek ma wady (tj. zmiana wrodzonych właściwości komórek, jest czasochłonne) i dlatego korzystne są dodatkowe metody klasyfikacji typów komórek.

Obrazowanie oparte na mikroskopii jest alternatywną metodą profilowania fenotypów komórkowych w sposób multipleksowany, ilościowy i solidny. W tym manuskrypcie stosujemy nasz potok obrazowania ilościowego, aby podkreślić dynamikę ewolucyjną heterogenicznych populacji komórek w guzie. Koncentrujemy się na interakcji między komórkami niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) a fibroblastami związanymi z rakiem (CAF), najbardziej rozpowszechnionym typem komórek zrębu występującym w nowotworach. CAF są zaangażowane w inicjację, progresję i odpowiedź terapeutyczną guza; dlatego wykonywanie testów fenotypowych na komórkach nowotworowych przy braku CAF może być mylące^7,8,9. W szczególności oceniliśmy wpływ CAF na komórki nowotworowe w odpowiedzi na erlotynib, małą cząsteczkę ukierunkowaną na receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), który jest często stosowany w leczeniu klinicznym NSCLC. Do oceny wykorzystaliśmy platformę przesiewową o wysokiej zawartości i towarzyszące jej oprogramowanie do analizy obrazu; Próbując udostępnić tę metodologię innym badaczom, opracowaliśmy również porównywalny protokół downstream przy użyciu oprogramowania open source: CellProfiler¹⁰ i CellProfiler Analyst¹¹. Większość opartych na obrazach testów przesiewowych o wysokiej zawartości jest analizowana za pomocą skomercjalizowanego oprogramowania specyficznego dla danego modelu urządzenia. Wyniki są trudne do powtórzenia w innych laboratoriach z innym oprogramowaniem, ponieważ podstawowe algorytmy są często zastrzeżone. Korzystając z tego potoku opartego na obrazie, zmierzono proliferację, śmierć i morfologię komórek każdej subpopulacji kultury heterokomórkowej w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne przy użyciu klasyfikacji opartej zarówno na fluorescencji, jak i morfologii. Poniższy protokół zapewnia solidną metodologię sondowania złożonych procesów komórkowych.

Protocol

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Tutaj badano fenotypowe odpowiedzi komórek NSCLC (H3255) na czynnik celujący w EGFR, erlotynib, podczas wspólnej hodowli z fibroblastami płuc (CCD-19Lu GFP). Dla tego samego zestawu danych przeprowadzono klasyfikację opartą na fluorescencji i morfologii dwóch populacji komórek (H3255 i CCD-19Lu GFP) w celu zilustrowania ich zgodności. Należy jednak zastosować tylko jedną metodę klasyfikacji, którą należy wybrać na podstawie zastosowania.

1. Przygotuj 500 ml RPMI-1640 uzupełnionego 10% inaktywowanym termicznie FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
   UWAGA: Pożywkę wzrostową i suplementy można w razie potrzeby wymienić na inne typy komórek.
2. Hodować komórki w 10 cm³ płytki jako czyste populacje w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C i pasować w odpowiednim stosunku co 3-4 dni.

2. Przygotowanie komórek

1. Aby przygotować zawiesinę komórkową, usuń pożywkę komórkową i umyj komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS).
2. Odessać z PBS, dodać 1 ml 0,05% trypsyny ogrzanej do 37 °C i inkubować przez 5 minut (lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do płytki) w temperaturze 37 °C.
3. Aby zneutralizować trypsynę, dodaj 4 ml RPMI do płytek GFP H3255 i CCD-19Lu i odpipetuj roztwory komórek do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
4. Odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml pożywki RPMI w stożkowych probówkach, aby przygotować się do wysiewu.

3. Poszycie komórek

1. Policz komórki, aby ustandaryzować wysiew.
   1. Odwróć probówki, aby wymieszać komórki w roztworze. Pobrać pipetą 10 μl zawiesiny każdej komórki do probówki mikrowirówkowej i dodać 10 μl błękitu trypanowego.
   2. Odpipetować 10 μl tego roztworu do szkiełka do liczenia komórek i włożyć do automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Można stosować inne metody zliczania komórek (np. hemocytometr).
   3. Powtórz liczbę komórek co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy uzyskana liczba będzie spójna.
2. Komórki nasienne na płytce wielodołkowej
   UWAGA: Liczba płytek do wysiewu zależy od liczby punktów czasowych, które zostaną zobrazowane. Alternatywnie, jedna płytka może być ponownie obrazowana w czasie, jeśli komórki są transdukowane histonem-2B-GFP (lub innymi stabilnymi barwnikami jądrowymi lentiwirusa, które zapewniają odpowiednią segmentację jądrową).
   1. Wysiewaj łącznie 1,500 komórek/studzienkę w 100 μl RPMI. Przygotuj trzy zawiesiny komórkowe do pokrycia trzech populacji komórek: H3255, CCD-19Lu GFP i 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Wykonaj każdy z nich w trzech egzemplarzach z identycznymi ustawieniami płytek dla każdego punktu czasowego.
      UWAGA: Początkowe gęstości wysiewu powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej i rozmiaru płytki.
   2. Komórki nasienne w 3 x 96-dołkowych płytkach za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

4. Dawkowanie leków

1. Dodać DMSO do proszku erlotynibu, aby uzyskać końcowy roztwór podstawowy erlotynibu o stężeniu 10 mM.
   UWAGA: Lek można zastąpić według uznania.
2. Rozcieńczyć lek pożywką do hodowli komórkowych do 2x końcowego stężenia o najwyższym stężeniu końcowym przy 10 μM i seryjnie rozcieńczyć czterokrotnie w stosunku 1:10, co daje w sumie pięć stężeń leku i brak kontroli leku.
   UWAGA: Jeśli stężenie DMSO jest równe lub przekracza 0,1% v/v przy najwyższej dawce leku, kontrola bez leku powinna zawierać równoważną ilość DMSO, aby zapewnić, że obserwowane efekty nie są spowodowane toksycznością DMSO.
3. Odpipetować 100 μl roztworu leku do odpowiedniego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie leku 1x rozcieńczonego w pożywce.

5. Akwizycja obrazu

UWAGA: Obrazy zostały pozyskane w dniach 0, 2 i 3. W zależności od typów komórek i badanych procesów komórkowych można badać inne pożądane punkty czasowe.

1. Wybarwiaj komórki, aby przygotować się do obrazowania.
   1. Uzupełnić roztwór barwnika w następujących końcowych stężeniach.
      1. Do klasyfikacji na podstawie fluorescencji należy przygotować 5 μg/ml barwienia jądrowego i 5 μM barwienia martwych komórek w PBS (patrz tabela materiałów).
      2. Do klasyfikacji opartej na morfologii należy przygotować 5 μg/ml barwienia jądrowego, 5 μM barwienia martwych komórek i 5 μM barwienia komórek w PBS (patrz tabela materiałów).
   2. Dodaj 20 μl roztworu barwnika do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
2. Optymalizuj i pozyskuj obrazy.
   1. Wyjąć płytkę dołka z inkubatora, przetrzeć spód płytki 70% EtOH i umieścić płytkę w komorze obrazowania.
   2. W zakładce "Konfiguracja" kliknij przycisk "+" w sekcji "Wybór kanału", aby dodać odpowiednie kanały do obrazu (np. jasne pole, plama jądrowa, plama martwych komórek, sygnały GFP i RFP).
   3. Kliknij "Wybór układu" i wykonuj zdjęcia testowe ze stosem z co 2 μm, zaczynając od 0 μm i kończąc na 20 μm, aby zidentyfikować płaszczyznę ostrości. Wprowadź tę odległość dla każdego kanału w polu "Wysokość".
   4. Kliknij "Migawka" pod każdym kanałem, aby ocenić intensywność i zoptymalizować czas ekspozycji. W razie potrzeby wprowadź wyższe lub niższe wartości w polu "Czas".
   5. Po prawej stronie ekranu zaznacz odpowiednie dołki (do zobrazowania) na schemacie tablicy. Na poniższym schemacie studni zaznacz dwadzieścia pięć pól, które mają zostać zobrazowane w podobny sposób.
   6. W sekcji "Uruchom eksperyment" zidentyfikuj tabliczkę w "Nazwa tablicy" po lewej stronie i kliknij przycisk "Start" (poniżej), aby uruchomić protokół akwizycji obrazu z obiektywem 10X w celu wygenerowania obrazów TIFF w skali szarości w wyżej wymienionych kanałach.
      UWAGA: Instrukcje krok po kroku dotyczące protokołu obrazowania mogą się różnić w zależności od instrumentu, ale wartości parametrów powinny być nadal zoptymalizowane.
   7. Powtórz obrazowanie w drugim i trzecim dniu.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Wszystkie analizy obrazów zostały przeprowadzone przy użyciu zastrzeżonego oprogramowania. Ponieważ jednak nie jest to publicznie dostępna, porównywalne analizy zaprojektowano również dla CellProfiler 2.2 i CellProfiler Analyst 2.0, z krótkim protokołem wymienionym poniżej i szczegółowym protokołem dostarczonym jako materiał uzupełniający (obrazy testowe są już załadowane do potoków w celu przetestowania przepływu pracy). Obrazy z tego eksperymentu zostały pogrupowane razem dla każdego dołka, tak aby każdy studzienek mógł być ładowany indywidualnie. Poniższe potoki CellProfiler zawierają wyrażenie regularne, które analizuje informacje o metadanych z każdej nazwy pliku obrazu i umożliwia dalsze grupowanie obrazów według kanałów.

1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie open source: "CellProfiler" i "CellProfiler Analyst". Zaakceptuj wszystkie domyślne opcje i dodatki podczas instalacji.
2. Klasyfikuj kultury heterokomórkowe do subpopulacji.
   1. Otwórz program 'CellProfiler', kliknij 'Plik'| 'Import Pipeline'| 'From File' i wybierz odpowiedni plik ("Fluorescence_Classification.cppipe" do klasyfikacji opartej na fluorescencji lub "Morphology_Classification.cppipe" do klasyfikacji opartej na morfologii).
      UWAGA: Pliki te zawierają protokoły podstawowego przetwarzania obrazu i segmentacji jąder/komórek. Ze względu na nierównomierne zabarwienie Hoechsta obecne w tych komórkach, jądra zostały podzielone na segmenty i powiększone, a następnie wykorzystane do zamaskowania obrazu, aby umożliwić segmentację jąder o mniejszej intensywności.
      1. Wybierz potok klasyfikacji oparty na fluorescencji, aby sklasyfikować komórki jako H3255 lub CCD-19Lu na podstawie intensywności eGFP i obliczyć cechy morfologii.
         UWAGA: Komórki CCD-19Lu transdukowano za pomocą GFP.
      2. Wybierz potok klasyfikacji oparty na morfologii, aby podzielić jądra i komórki na segmenty oraz obliczyć cechy morfologii.
         UWAGA: Do klasyfikacji potrzebna jest dalsza analiza w programie "CellProfiler Analyst". Martwe komórki są klasyfikowane za pomocą klasyfikacji opartej na fluorescencji.
   2. Kliknij "Wyświetl ustawienia wyjściowe" w lewym dolnym rogu ekranu. Wybierz lokalizację plików graficznych do analizy ("Domyślny folder wejściowy") i miejsce docelowe wyodrębnionych danych ("Domyślny folder wyjściowy").
   3. Kliknij "Analizuj obrazy", aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy kliknij "OK" i przejdź do "Domyślnego folderu wyjściowego", aby wyświetlić obliczone dane.
      UWAGA: Przykładowe wartości parametrów i obrazy są dostępne w pliku uzupełniającym 1-CellProfilerProtocol.pdf.
   4. W przypadku klasyfikacji opartej na morfologii (tylko) wykonaj następujące czynności.
      1. Otwórz oprogramowanie 'CellProfiler Analyst', wybierz plik właściwości bazy danych wygenerowany w CellProfiler i kliknij 'Otwórz'.
      2. Kliknij zakładkę "Klasyfikator" w lewym górnym rogu ekranu. Aby wywołać losowe obrazy komórek z eksperymentu, kliknij "Pobierz"; Obrazy pojawią się w oknie Niesklasyfikowane.
   5. Ręcznie sklasyfikuj komórki jako dodatnie (H3255) lub ujemne (CCD-19Lu), zaznaczając i przeciągając komórki do odpowiedniego kosza (patrz Plik uzupełniający 2-Pipeline.pdf: Rysunek B). Po sklasyfikowaniu co najmniej 50 komórek na subpopulację kliknij "Trenuj klasyfikator", a następnie kliknij "Sprawdź postęp".
      UWAGA: Komórki są klasyfikowane za pomocą nadzorowanego przez użytkownika algorytmu losowego uczenia maszynowego lasu¹². Jeśli dokładność nie przekracza zatwierdzonego progu (>90%), może być konieczne cofnięcie się i optymalizacja segmentacji komórek w programie "CellProfiler" lub komórki mogą nie być idealne do klasyfikacji według morfologii.
   6. Kliknij "Oceń wszystko", aby wygenerować tabelę z liczbą komórek dla każdej subpopulacji.

Results

Wygenerowano zestaw obrazów składający się z 25 pól/studni, 54 dołków/płytki (3 populacje komórek x 6 koncentracji leków x 3 powtórzenia), na trzech płytkach, co daje w sumie 4 050 indywidualnych obrazów. Zestawy obrazów wygenerowane w trakcie eksperymentu zostały przeanalizowane za pomocą zastrzeżonego oprogramowania (patrz tabela materiałów) w celu wyodrębnienia różnych właściwości ilościowych komórek (tj. morfologii, fluorescencji), które następnie można było wykorzystać do klasyfikacji subpopulacji komórek. Jednak ze względu na ograniczony dostęp do używanego oprogramowania komercyjnego stworzono porównywalne potoki podrzędne w programach CellProfiler i CellProfiler Analyst.

Klasyfikacja heterokomórkowa na subpopulacje

Jądra zostały zidentyfikowane i podzielone na segmenty na podstawie barwienia DNA (tutaj Hoechst), a populacje komórek zostały sklasyfikowane na podstawie fluorescencji lub morfologii (Rysunek 1). Do klasyfikacji opartej na fluorescencji fibroblasty (CCD-19Lu) były wcześniej transdukowane lentiwirusem GFP. Poziomy intensywności GFP mierzono dla każdego jądra, a te, które zostały obliczone powyżej przyjętego progu (na podstawie sygnału tła), zostały sklasyfikowane jako CCD-19Lu, podczas gdy te poniżej zostały zidentyfikowane jako komórki nowotworowe (H3255). W celu klasyfikacji opartej na morfologii komórki zostały wcześniej wybarwione nietoksycznym barwnikiem komórkowym (patrz tabela materiałów), który został wykorzystany do identyfikacji i segmentacji cytoplazmy. Algorytm uczenia maszynowego został przeszkolony na ~50-100 komórkach z każdej populacji. Zidentyfikowano cechy morfologiczne, które znacząco różniły się między populacjami, które następnie wykorzystano do zaprojektowania klasyfikatora liniowego w celu rozróżnienia komórek CCD-19Lu i H3255. Protokoły klasyfikacji fluorescencji i morfologii były zgodne w 97,4% (n = 1403) w rozróżnianiu między dwiema populacjami komórek w warunkach nieleczonych i 92,5% (n = 916) zgodne w warunkach leczenia farmakologicznego (1 μM erlotynib) (Ryc. 2).

Analizy fenotypowe subpopulacji

Oprócz rozróżnienia typów komórek, naszym celem było scharakteryzowanie właściwości fenotypowych każdej subpopulacji. Testy multipleksowania oszczędzają czas i odczynniki, zwiększają spójność i dostarczają dodatkowych informacji dotyczących badanego systemu. Istnieje wiele potencjalnych wyników fenotypowych i należy je wybierać na podstawie interesujących nas pytań. W tym przypadku badano zmiany w morfologii komórek i stanie żywotności w odpowiedzi na leczenie erlotynibem. Po trzech dniach leczenia farmakologicznego zaobserwowano zmniejszenie obszaru jądrowego i zwiększenie obszaru komórkowego komórek H3255 (Rysunek 3A). Stwierdzono, że średnia różnica w obszarze jądrowym między populacjami leczonymi "bez leku" i "z lekiem" jest statystycznie istotna za pomocą dwustronnego testu t typu 2 (równa wariancja) (p = 7,92 x ^10-16). Stawiamy hipotezę, że ta obserwacja jest odpowiedzią komórkową na stres narzucony przez leczenie farmakologiczne.

Warto również zbadać, czy lek ma cytotoksyczny (tj. wzrost liczby martwych komórek w czasie) lub cytostatyczny (tj. zmniejszenie liczby urodzeń komórek w czasie) wpływ na komórki, ponieważ ma to głęboki wpływ kliniczny. Na przykład działanie leku cytostatycznego indukuje zatrzymanie wzrostu, ale nie eliminuje komórek z guza, dlatego istnieje możliwość, że komórki rakowe ponownie zainicjują proliferację komórek po usunięciu leku. Działanie leku może często zależeć od kontekstu, stężenia i typu komórki. Wcześniej zaobserwowaliśmy, że erlotynib wywołuje odpowiedź cytotoksyczną w jednym typie komórek, podczas gdy wykazuje odpowiedź cytostatyczną w innym¹³.

Tradycyjne testy żywotności generują względną liczbę komórek i dlatego nie rozróżniają między zatrzymaniem wzrostu a śmiercią komórki. W tym przypadku martwe komórki zostały zidentyfikowane na podstawie barwienia jodkiem propidyny (Rysunek 3B). Zaobserwowano zarówno cytotoksyczne, jak i cytostatyczne działanie erlotynibu na komórki H3255, ze wzrostem liczby zgonów i spadkiem liczby urodzeń po leczeniu farmakologicznym (Ryc. 3C). Warto zauważyć, że liczba martwych komórek spada po 1 dniu, prawdopodobnie z powodu klirensu komórek. Komórki CCD-19Lu nie zostały dotknięte przez lek. Dodatkowym atutem tej platformy jest generowanie danych ilościowych. Na przykład w naszym eksperymencie z jednoczesną hodowlą stwierdzono, że początkowa subpopulacja 1 118 (75,8%) komórek H3255 wynosiła 2 817 (87,9%) lub 396 (57,2%) po trzech dniach bez lub z leczeniem erlotynibem (Ryc. 4). Ponieważ możemy wygenerować rzeczywistą liczbę komórek zamiast względnego procentu (jak w przypadku metod cytometrii przepływowej), wnioskujemy, że zmiana składu podczas leczenia farmakologicznego jest spowodowana spadkiem liczby komórek H3255, a nie wzrostem CCD-19Lu. Nic nie warte jest to, że śmiertelność może być niedoszacowana ze względu na klirens komórek, który jest trudny do oceny eksperymentalnie i prawdopodobnie różni się w zależności od typu komórek.

Rysunek 1: Omówienie protokołu analizy obrazu. Dwa potencjalne potoki dalszej analizy obrazu do klasyfikacji populacji heterokomórkowych przy użyciu klasyfikacji opartej na morfologii lub klasyfikacji opartej na fluorescencji. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zgodność między morfologią a klasyfikacją opartą na fluorescencji. (A) Wykres zgodności przedstawiający nakładanie się dwóch protokołów klasyfikacyjnych. Te same komórki zostały sklasyfikowane jako H3255 przy użyciu klasyfikacji opartej zarówno na morfologii, jak i fluorescencji. Oba protokoły były zgodne, z klasyfikacją dla 97,4% (n = 1403) komórek nieleczonych i 92,5% (n = 916) komórek leczonych erlotynibem (Uwaga: biały obszar jest zbyt mały, aby go uwidocznić). (B) 10-krotne obrazy przedstawiające przykłady dobrej i złej zgodności między klasyfikacją opartą na fluorescencji a klasyfikacją opartą na morfologii. Białe strzałki wskazują komórki, które zostały niespójnie sklasyfikowane między platformami. Obraz wejściowy: niebieski – jądra (Hoechst); zielony – CCD19Lu (GFP). Obrazy klasyfikacyjne: Czerwony – H3255; zielony – CCD-19Lu. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Multipleksowane pomiary fenotypowe z pojedynczej konfiguracji eksperymentalnej. (A) Cechy morfologiczne, takie jak jądra i powierzchnia komórki, zostały obliczone na poziomie pojedynczej komórki w obecności i bez obecności leku. Uwaga: Obszary komórek o wymiarach mniejszych niż 100^μm2 uznano za szczątki i wyłączono z analiz. Wykres pudełkowy przedstawia medianę z zakresami pierwszego i trzeciego kwartyla oraz 95% słupkami błędu przedziału ufności. (B) Komórki H3255 (niebieskie) i CCD-19Lu (zielone) hodowano jednocześnie, a martwe komórki identyfikowano na podstawie intensywności barwienia jodkiem propidyny (czerwony) i obrazowano za pomocą obiektywu 10X. Podziałka = 1 mm (górny panel); 100 μm (dolne obrazy). (C) Całkowita liczba żywych i martwych komórek została obliczona w ciągu trzech dni z leczeniem farmakologicznym lub bez niego, z oczywistym spadkiem liczby żywych komórek i wzrostem martwych komórek po dodaniu erlotynibu. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej obliczonej na podstawie trzech powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Dynamika subpopulacji w czasie. Reprezentatywne 10-krotne obrazy studzienek zawierających H3255 (niebieski) i CCD-19Lu (zielony) w dniu 0 lub 3 z lekiem i bez. Komórki należące do każdej subpopulacji zostały policzone, a proporcjonalne wykresy kołowe pokazują rzeczywistą zmianę składu populacji w próbkach. Podziałka = 1 mm (środkowe panele, shpwn in ; skrajny panel), 1 mm (górne zdjęcie), 100 μm (dolne obrazy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisany powyżej protokół ulepsza obecne testy biologii komórki, zapewniając bardziej wszechstronny wgląd w dynamikę fenotypową wielu typów komórek w odpowiedzi na zakłócenia środowiskowe przy użyciu zredukowanych odczynników i czasu. Główną zaletą tego eksperymentalnego projektu jest możliwość analizowania wielu fenotypów za pomocą jednej konfiguracji i generowania danych ilościowych charakteryzujących te fenotypy na poziomie pojedynczej komórki. Jedną z technicznych zalet tej platformy jest łatwość początkowego rozwiązywania problemów w porównaniu z innymi testami. Ponieważ ta metoda jest oparta na obrazie, można wizualizować studnie pod kątem pozornego wysiewu nad/niedostatecznego. Wskazane jest, aby komórki znajdowały się w fazie wzrostu wykładniczego przez cały czas trwania eksperymentu i nie były ograniczone przez ograniczenia żywieniowe lub przestrzenne, ani nie były zakłócone przez starzenie się z powodu rzadkiego wysiewu. W przeciwnym razie wskaźniki urodzeń i zgonów mogą nie być powtarzalne między eksperymentami. Dla porównania, CellPD jest publicznie dostępnym programem do obliczania współczynników urodzeń i zgonów¹⁴. Dodatkowo można zwizualizować, czy do każdej studzienki dodano odpowiednie stężenia barwników. Problemy z pipetowaniem w pojedynczej studzience mogą powodować błędną segmentację i zniekształcone dane, ale można je łatwo wykryć za pomocą wyżej wymienionego protokołu.

Niestety, nie wszystkie typy komórek mogą być podatne na tę aplikację. Ważne jest, aby móc dokładnie segmentować jądra i komórki, dlatego analiza komórek, które organizują się w bardziej kuliste lub zbite struktury, może nie być odpowiednia. W przypadku niektórych komórek korzystne może być również użycie sitka komórkowego przed wysiewem, aby zapewnić wstępny wysiew pojedynczych komórek. Ponadto technika klasyfikatora liniowego ma zastosowanie tylko do typów komórek, które można łatwo odróżnić na podstawie cech morfologicznych.

Aby protokół był skuteczny, ważne jest, aby najpierw zoptymalizować warunki obrazowania, ponieważ ważność dalszych analiz zależy od jakości obrazów. Podczas gdy w tym przypadku przeprowadziliśmy eksperymenty przy użyciu platformy przesiewowej o wysokiej zawartości, akwizycję obrazu można również przeprowadzić za pomocą dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego (chociaż zautomatyzowana platforma obrazowania jest idealna do podejść o wysokiej przepustowości). Obrazy testowe powinny być wykonywane przed każdym punktem czasowym obrazowania, aby upewnić się, że nie ma problemów z mikroskopem lub protokołem. Stosunek sygnału do szumu powinien być wysoki, szczególnie dla kanałów, które będą wykorzystywane do segmentacji (tj. jądra, barwienia komórek). Dodatkowo ważne jest, aby obrazować w optymalnej płaszczyźnie ostrości. Jeśli obrazy są nieostre, segmentacja staje się znacznie trudniejsza, a obliczone cechy morfologiczne będą prawdopodobnie niedokładne. Różnice w oświetleniu między polami mogą również powodować problemy z segmentacją obrazu. Duże różnice w jasności utrudniają automatyczny wybór wartości progowych. Dodatkowo, jeśli między komórkami występują niejednorodne intensywności fluorescencji, pojedyncza wartość progowa może nie wystarczyć do segmentacji wszystkich komórek na obrazie. W tej analizie problemy te zostały przezwyciężone poprzez stworzenie masek wokół jaśniejszych i ciemniejszych populacji komórek oraz segmentację każdej populacji osobno.

Podczas gdy fenotypy badane w tym protokole ograniczają się do charakterystyki żywej, martwej i morfologicznej, można je łatwo rozszerzyć w celu zbadania innych cech. Na przykład funkcjonalne badania genetyczne mogą być dodawane z RNAi, nadekspresją lub innymi zaburzeniami chemicznymi.

W niniejszej pracy zademonstrowano możliwości protokołu do pomiaru odpowiedzi komórek niedrobnokomórkowego raka płuca na erlotynib w obecności i bez CAF. Jest to jednak tylko jeden z wielu typów komórek i parametrów mikrośrodowiskowych, które można przetestować. Rozszerzyliśmy ten protokół, aby można go było stosować z innymi typami komórek i badaniami leków, w tym komórkami pierwotnymi wyizolowanymi z guzów pacjentów^13,15.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Pożywka do hodowli komórkowych	Corning	10-040-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gemini	100-106	średni suplement
Penicylina/streptomycyna	Gibco	15-140-122	średni suplement
TC20	Licznik komórek	1450102 Biorad
Szkiełka z błękitem trypanowym	Komórka 1450003 Biorad		szkiełka licznikowe
Płytki 96-dołkowe	Corning	3904	przezroczyste dolne czarne płytki
Erlotinib	LC Laboratories	E-4007
DMSO	VWR	317275-100ML	roztwór do ponownego zawieszenia leku
Hoechst	Invitrogen	H21491	barwnik jądrowy
Jodek propidyny (PI)	Invitrogen	P1304MP	barwienie martwych komórek
Cell Tracker Orange CMRA	Life Technologies	C34551	barwienie całych komórek
System obrazowania o wysokiej zawartości Operetka	Perkin Elmer
CellProfiler	Broad Institue	wersja 2.2.0 (rev 9969f42)	http://cellprofiler.org/releases/
Inkubator			do hodowli komórkowychOdpowiedni będzie każdy inkubator do hodowli komórkowych - komórki hodowano pod 37 & ordm; C przy 5% CO2,
15 mL Probówki stożkowe Falcon	Falcon	14-959-53A
10 cm2 płytki do hodowli komórkowych	TPP	93040