Artykuł metodologiczny

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55844

⸱

30 czerwca 2017

 ,  , 
1Lawrence J. Ellison Institute for Transformative Medicine, University of Southern California (USC)

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Streszczenie

Procesy komórkowe są złożone i wynikają z wzajemnego oddziaływania między wieloma typami komórek i ich środowiskiem. Istniejące techniki biologii komórki często nie pozwalają na dokładną interpretację tej wzajemnej zależności. Stosując podejście oparte na obrazowaniu ilościowym, przedstawiamy protokół o wysokiej zawartości do charakteryzowania dynamicznych odpowiedzi fenotypowych (tj. zmian morfologii, proliferacji, apoptozy) heterogenicznych populacji komórek na zmiany bodźców środowiskowych. Podkreślamy naszą zdolność do rozróżniania typów komórek na podstawie intensywności fluorescencji lub nieodłącznych cech morfologii w zależności od zastosowania. Platforma ta pozwala na bardziej kompleksową charakterystykę reakcji subpopulacji na perturbacje przy jednoczesnym wykorzystaniu krótszego czasu, mniejszych ilości odczynników i mniejszego prawdopodobieństwa błędu niż tradycyjne testy biologii komórki. Jednak w niektórych przypadkach populacje komórek mogą być trudne do zidentyfikowania i ilościowego określenia na podstawie złożonych cech komórkowych i będą wymagały dodatkowego rozwiązywania problemów; Zwracamy uwagę na niektóre z tych okoliczności w protokole. Demonstrujemy tę aplikację za pomocą odpowiedzi na lek w modelu raka; Można go jednak z łatwością zastosować szerzej do innych procesów fizjologicznych. Protokół ten pozwala zidentyfikować subpopulacje w systemie kokultur i scharakteryzować szczególną reakcję każdej z nich na bodźce zewnętrzne.

Wprowadzenie

Testy oparte na komórkach były koniem pociągowym w podstawowych badaniach i opracowywaniu leków. Jednak ograniczenia tych standardowych testów stają się coraz bardziej widoczne wraz z rozbieżnością między danymi in vitro a danymi klinicznymi oraz nieuzyskaniem zatwierdzenia przez FDA większości leków. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę wykorzystania obrazowania ilościowego do jednoczesnej analizy fenotypów heterokomórkowych w odpowiedzi na odpowiednie, współwystępujące bodźce środowiskowe.

Tradycyjne testy komórkowe, które są używane do pomiaru żywotności komórek, obejmują: testy wykluczenia błękitu trypanowego, MTT/MTS i barwienie cytometrią przepływową Annexin V-FITC. Testy wykluczania błękitu trypanowego, choć proste i niedrogie, wymagają dużej liczby komórek, są czasochłonne i często wpływają na nie stronniczość użytkownika1. Testy MTT i MTS pośrednio mierzą żywotność komórek poprzez pomiary tempa metabolizmu mitochondriów. Jednak na aktywność metaboliczną komórek mogą wpływać różne warunki hodowli (takie jak pożywka lub stężenie tlenu), co prowadzi do niedokładnych wyników i uniemożliwia standaryzację między typami komórek i warunkami2,3. Inną poważną wadą tych technik jest ich niezdolność do rozróżnienia wielu typów komórek – większość systemów biologicznych jest heterokomórkowa. Chociaż metody cytometrii przepływowej mają zdolność rozróżniania wielu populacji komórek, wymagane są etykiety komórek, dynamiczne pobieranie próbek jest trudne, a w przypadku korzystania z przylegających komórek aplikacja ta staje się czasochłonna i podatna na błędy.

Inne ważne fenotypy komórkowe, w tym zmiany morfologiczne, występują w odpowiedzi na bodźce środowiskowe, ale nie są wychwytywane przez tradycyjne testy komórkowe. Profilowanie stanów komórek poprzez charakterystykę morfologiczną i mapowanie podobieństw między próbkami jest potężnym, bezstronnym narzędziem, które może dostarczyć nowatorskich spostrzeżeń w wielu aspektach badań podstawowych i translacyjnych, w tym podstawowej biologii komórki i odkrywania leków4. Ponadto wykazano, że morfologia komórek nowotworowych koreluje z podtypami nowotworów5 i agresywność6. W związku z tym bardzo interesujące jest badanie tych cech komórkowych i ich związku z określonymi zaburzeniami środowiskowymi. Dodatkowo można wykorzystać różnice w cechach morfologicznych do rozróżnienia subpopulacji w systemach kokulturowych. Znakowanie fluorescencyjne komórek ma wady (tj. zmiana wrodzonych właściwości komórek, jest czasochłonne) i dlatego korzystne są dodatkowe metody klasyfikacji typów komórek.

Obrazowanie oparte na mikroskopii jest alternatywną metodą profilowania fenotypów komórkowych w sposób multipleksowany, ilościowy i solidny. W tym manuskrypcie stosujemy nasz potok obrazowania ilościowego, aby podkreślić dynamikę ewolucyjną heterogenicznych populacji komórek w guzie. Koncentrujemy się na interakcji między komórkami niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) a fibroblastami związanymi z rakiem (CAF), najbardziej rozpowszechnionym typem komórek zrębu występującym w nowotworach. CAF są zaangażowane w inicjację, progresję i odpowiedź terapeutyczną guza; dlatego wykonywanie testów fenotypowych na komórkach nowotworowych przy braku CAF może być mylące7,8,9. W szczególności oceniliśmy wpływ CAF na komórki nowotworowe w odpowiedzi na erlotynib, małą cząsteczkę ukierunkowaną na receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), który jest często stosowany w leczeniu klinicznym NSCLC. Do oceny wykorzystaliśmy platformę przesiewową o wysokiej zawartości i towarzyszące jej oprogramowanie do analizy obrazu; Próbując udostępnić tę metodologię innym badaczom, opracowaliśmy również porównywalny protokół downstream przy użyciu oprogramowania open source: CellProfiler10 i CellProfiler Analyst11. Większość opartych na obrazach testów przesiewowych o wysokiej zawartości jest analizowana za pomocą skomercjalizowanego oprogramowania specyficznego dla danego modelu urządzenia. Wyniki są trudne do powtórzenia w innych laboratoriach z innym oprogramowaniem, ponieważ podstawowe algorytmy są często zastrzeżone. Korzystając z tego potoku opartego na obrazie, zmierzono proliferację, śmierć i morfologię komórek każdej subpopulacji kultury heterokomórkowej w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne przy użyciu klasyfikacji opartej zarówno na fluorescencji, jak i morfologii. Poniższy protokół zapewnia solidną metodologię sondowania złożonych procesów komórkowych.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Tutaj badano fenotypowe odpowiedzi komórek NSCLC (H3255) na czynnik celujący w EGFR, erlotynib, podczas wspólnej hodowli z fibroblastami płuc (CCD-19Lu GFP). Dla tego samego zestawu danych przeprowadzono klasyfikację opartą na fluorescencji i morfologii dwóch populacji komórek (H3255 i CCD-19Lu GFP) w celu zilustrowania ich zgodności. Należy jednak zastosować tylko jedną metodę klasyfikacji, którą należy wybrać na podstawie zastosowania.

  1. Przygotuj 500 ml RPMI-1640 uzupełnionego 10% inaktywowanym termicznie FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
    UWAGA: Pożywkę wzrostową i suplementy można w razie potrzeby wymienić na inne typy komórek.
  2. Hodować komórki w 10 cm3 płytki jako czyste populacje w 5% CO2 w temperaturze 37 °C i pasować w odpowiednim stosunku co 3-4 dni.

2. Przygotowanie komórek

  1. Aby przygotować zawiesinę komórkową, usuń pożywkę komórkową i umyj komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS).
  2. Odessać z PBS, dodać 1 ml 0,05% trypsyny ogrzanej do 37 °C i inkubować przez 5 minut (lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do płytki) w temperaturze 37 °C.
  3. Aby zneutralizować trypsynę, dodaj 4 ml RPMI do płytek GFP H3255 i CCD-19Lu i odpipetuj roztwory komórek do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml pożywki RPMI w stożkowych probówkach, aby przygotować się do wysiewu.

3. Poszycie komórek

  1. Policz komórki, aby ustandaryzować wysiew.
    1. Odwróć probówki, aby wymieszać komórki w roztworze. Pobrać pipetą 10 μl zawiesiny każdej komórki do probówki mikrowirówkowej i dodać 10 μl błękitu trypanowego.
    2. Odpipetować 10 μl tego roztworu do szkiełka do liczenia komórek i włożyć do automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Można stosować inne metody zliczania komórek (np. hemocytometr).
    3. Powtórz liczbę komórek co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy uzyskana liczba będzie spójna.
  2. Komórki nasienne na płytce wielodołkowej
    UWAGA: Liczba płytek do wysiewu zależy od liczby punktów czasowych, które zostaną zobrazowane. Alternatywnie, jedna płytka może być ponownie obrazowana w czasie, jeśli komórki są transdukowane histonem-2B-GFP (lub innymi stabilnymi barwnikami jądrowymi lentiwirusa, które zapewniają odpowiednią segmentację jądrową).
    1. Wysiewaj łącznie 1,500 komórek/studzienkę w 100 μl RPMI. Przygotuj trzy zawiesiny komórkowe do pokrycia trzech populacji komórek: H3255, CCD-19Lu GFP i 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Wykonaj każdy z nich w trzech egzemplarzach z identycznymi ustawieniami płytek dla każdego punktu czasowego.
      UWAGA: Początkowe gęstości wysiewu powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej i rozmiaru płytki.
    2. Komórki nasienne w 3 x 96-dołkowych płytkach za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

4. Dawkowanie leków

  1. Dodać DMSO do proszku erlotynibu, aby uzyskać końcowy roztwór podstawowy erlotynibu o stężeniu 10 mM.
    UWAGA: Lek można zastąpić według uznania.
  2. Rozcieńczyć lek pożywką do hodowli komórkowych do 2x końcowego stężenia o najwyższym stężeniu końcowym przy 10 μM i seryjnie rozcieńczyć czterokrotnie w stosunku 1:10, co daje w sumie pięć stężeń leku i brak kontroli leku.
    UWAGA: Jeśli stężenie DMSO jest równe lub przekracza 0,1% v/v przy najwyższej dawce leku, kontrola bez leku powinna zawierać równoważną ilość DMSO, aby zapewnić, że obserwowane efekty nie są spowodowane toksycznością DMSO.
  3. Odpipetować 100 μl roztworu leku do odpowiedniego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie leku 1x rozcieńczonego w pożywce.

5. Akwizycja obrazu

UWAGA: Obrazy zostały pozyskane w dniach 0, 2 i 3. W zależności od typów komórek i badanych procesów komórkowych można badać inne pożądane punkty czasowe.

  1. Wybarwiaj komórki, aby przygotować się do obrazowania.
    1. Uzupełnić roztwór barwnika w następujących końcowych stężeniach.
      1. Do klasyfikacji na podstawie fluorescencji należy przygotować 5 μg/ml barwienia jądrowego i 5 μM barwienia martwych komórek w PBS (patrz tabela materiałów).
      2. Do klasyfikacji opartej na morfologii należy przygotować 5 μg/ml barwienia jądrowego, 5 μM barwienia martwych komórek i 5 μM barwienia komórek w PBS (patrz tabela materiałów).
    2. Dodaj 20 μl roztworu barwnika do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Optymalizuj i pozyskuj obrazy.
    1. Wyjąć płytkę dołka z inkubatora, przetrzeć spód płytki 70% EtOH i umieścić płytkę w komorze obrazowania.
    2. W zakładce "Konfiguracja" kliknij przycisk "+" w sekcji "Wybór kanału", aby dodać odpowiednie kanały do obrazu (np. jasne pole, plama jądrowa, plama martwych komórek, sygnały GFP i RFP).
    3. Kliknij "Wybór układu" i wykonuj zdjęcia testowe ze stosem z co 2 μm, zaczynając od 0 μm i kończąc na 20 μm, aby zidentyfikować płaszczyznę ostrości. Wprowadź tę odległość dla każdego kanału w polu "Wysokość".
    4. Kliknij "Migawka" pod każdym kanałem, aby ocenić intensywność i zoptymalizować czas ekspozycji. W razie potrzeby wprowadź wyższe lub niższe wartości w polu "Czas".
    5. Po prawej stronie ekranu zaznacz odpowiednie dołki (do zobrazowania) na schemacie tablicy. Na poniższym schemacie studni zaznacz dwadzieścia pięć pól, które mają zostać zobrazowane w podobny sposób.
    6. W sekcji "Uruchom eksperyment" zidentyfikuj tabliczkę w "Nazwa tablicy" po lewej stronie i kliknij przycisk "Start" (poniżej), aby uruchomić protokół akwizycji obrazu z obiektywem 10X w celu wygenerowania obrazów TIFF w skali szarości w wyżej wymienionych kanałach.
      UWAGA: Instrukcje krok po kroku dotyczące protokołu obrazowania mogą się różnić w zależności od instrumentu, ale wartości parametrów powinny być nadal zoptymalizowane.
    7. Powtórz obrazowanie w drugim i trzecim dniu.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Wszystkie analizy obrazów zostały przeprowadzone przy użyciu zastrzeżonego oprogramowania. Ponieważ jednak nie jest to publicznie dostępna, porównywalne analizy zaprojektowano również dla CellProfiler 2.2 i CellProfiler Analyst 2.0, z krótkim protokołem wymienionym poniżej i szczegółowym protokołem dostarczonym jako materiał uzupełniający (obrazy testowe są już załadowane do potoków w celu przetestowania przepływu pracy). Obrazy z tego eksperymentu zostały pogrupowane razem dla każdego dołka, tak aby każdy studzienek mógł być ładowany indywidualnie. Poniższe potoki CellProfiler zawierają wyrażenie regularne, które analizuje informacje o metadanych z każdej nazwy pliku obrazu i umożliwia dalsze grupowanie obrazów według kanałów.

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie open source: "CellProfiler" i "CellProfiler Analyst". Zaakceptuj wszystkie domyślne opcje i dodatki podczas instalacji.
  2. Klasyfikuj kultury heterokomórkowe do subpopulacji.
    1. Otwórz program 'CellProfiler', kliknij 'Plik'| 'Import Pipeline'| 'From File' i wybierz odpowiedni plik ("Fluorescence_Classification.cppipe" do klasyfikacji opartej na fluorescencji lub "Morphology_Classification.cppipe" do klasyfikacji opartej na morfologii).
      UWAGA: Pliki te zawierają protokoły podstawowego przetwarzania obrazu i segmentacji jąder/komórek. Ze względu na nierównomierne zabarwienie Hoechsta obecne w tych komórkach, jądra zostały podzielone na segmenty i powiększone, a następnie wykorzystane do zamaskowania obrazu, aby umożliwić segmentację jąder o mniejszej intensywności.
      1. Wybierz potok klasyfikacji oparty na fluorescencji, aby sklasyfikować komórki jako H3255 lub CCD-19Lu na podstawie intensywności eGFP i obliczyć cechy morfologii.
        UWAGA: Komórki CCD-19Lu transdukowano za pomocą GFP.
      2. Wybierz potok klasyfikacji oparty na morfologii, aby podzielić jądra i komórki na segmenty oraz obliczyć cechy morfologii.
        UWAGA: Do klasyfikacji potrzebna jest dalsza analiza w programie "CellProfiler Analyst". Martwe komórki są klasyfikowane za pomocą klasyfikacji opartej na fluorescencji.
    2. Kliknij "Wyświetl ustawienia wyjściowe" w lewym dolnym rogu ekranu. Wybierz lokalizację plików graficznych do analizy ("Domyślny folder wejściowy") i miejsce docelowe wyodrębnionych danych ("Domyślny folder wyjściowy").
    3. Kliknij "Analizuj obrazy", aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy kliknij "OK" i przejdź do "Domyślnego folderu wyjściowego", aby wyświetlić obliczone dane.
      UWAGA: Przykładowe wartości parametrów i obrazy są dostępne w pliku uzupełniającym 1-CellProfilerProtocol.pdf.
    4. W przypadku klasyfikacji opartej na morfologii (tylko) wykonaj następujące czynności.
      1. Otwórz oprogramowanie 'CellProfiler Analyst', wybierz plik właściwości bazy danych wygenerowany w CellProfiler i kliknij 'Otwórz'.
      2. Kliknij zakładkę "Klasyfikator" w lewym górnym rogu ekranu. Aby wywołać losowe obrazy komórek z eksperymentu, kliknij "Pobierz"; Obrazy pojawią się w oknie Niesklasyfikowane.
    5. Ręcznie sklasyfikuj komórki jako dodatnie (H3255) lub ujemne (CCD-19Lu), zaznaczając i przeciągając komórki do odpowiedniego kosza (patrz Plik uzupełniający 2-Pipeline.pdf: Rysunek B). Po sklasyfikowaniu co najmniej 50 komórek na subpopulację kliknij "Trenuj klasyfikator", a następnie kliknij "Sprawdź postęp".
      UWAGA: Komórki są klasyfikowane za pomocą nadzorowanego przez użytkownika algorytmu losowego uczenia maszynowego lasu12. Jeśli dokładność nie przekracza zatwierdzonego progu (>90%), może być konieczne cofnięcie się i optymalizacja segmentacji komórek w programie "CellProfiler" lub komórki mogą nie być idealne do klasyfikacji według morfologii.
    6. Kliknij "Oceń wszystko", aby wygenerować tabelę z liczbą komórek dla każdej subpopulacji.

Wyniki

Wygenerowano zestaw obrazów składający się z 25 pól/studzienkę, 54 studzienek/płytkę (3 populacje komórek x 6 stężeń leku x 3 powtórzenia), na trzech płytkach, co dało łącznie 4 050 pojedynczych obrazów. Zestawy obrazów wygenerowane w trakcie eksperymentu przeanalizowano za pomocą autorskiego oprogramowania (patrz tabela materiałów), aby wyodrębnić różne właściwości ilościowe komórek (t.j. morfologię, fluorescencję), które następnie posłużyły do klasyfikacji subpopulacji komórek. Jednakże ze względu na ograniczony dostęp do stosowanego oprogramowania komercyjnego, stworzono porównywalne potoki analizy w programach CellProfiler i CellProfiler Analyst.

Klasyfikacja heterokomórkowa na subpopulacje

Jądra komórkowe zidentyfikowano i poddano segmentacji na podstawie barwienia DNA (w tym przypadku Hoechst), a populacje komórek sklasyfikowano albo na podstawie fluorescencji, albo morfologii (Rycina 1). W przypadku klasyfikacji opartej na fluorescencji, fibroblasty (CCD-19Lu) zostały wcześniej transdukowane lentiwirusem GFP. Dla każdego jądra zmierzono poziomy intensywności GFP; te, których wartości obliczono powyżej przyjętego progu (opartego na sygnale tła), zaklasyfikowano jako CCD-19Lu, natomiast wartości poniżej progu zidentyfikowano jako komórki nowotworowe (H325). W klasyfikacji opartej na morfologii komórki zostały wcześniej zabarwione nietoksycznym barwnikiem komórkowym (patrz tabela materiałów), co posłużyło do identyfikacji i segmentacji cytoplazmy. Algorytm uczenia maszynowego wytrenowano na ~50-10 komórkach z każdej populacji. Zidentyfikowano cechy morfologiczne, które istotnie różniły się między populacjami, a następnie wykorzystano je do zaprojektowania liniowego klasyfikatora pozwalającego odróżnić komórki CCD-19Lu od H325. Protokoły klasyfikacji fluorescencyjnej i morfologicznej były zgodne w 97,4% (n = 1403) przy rozróżnianiu dwóch populacji komórek w warunkach nieleczonych oraz w 92,5% (n = 916) w warunkach leczenia lekiem (1 µM erlotynibu) (Rycina 2).

Analizy fenotypowe subpopulacji

Oprócz rozróżniania typów komórek, dążyliśmy do scharakteryzowania właściwości fenotypowych każdej subpopulacji. Multipleksowanie analiz pozwala zaoszczędzić czas i odczynniki, zwiększa spójność oraz dostarcza dodatkowych informacji na temat badanego układu. Istnieje wiele potencjalnych parametrów fenotypowych, które należy wybierać w zależności od stawianych pytań badawczych. W niniejszej pracy badano zmiany w morfologii komórek i ich żywotności w odpowiedzi na leczenie erlotinibem. Po trzech dniach podawania leku zaobserwowano zmniejszenie powierzchni jądra oraz zwiększenie powierzchni komórek H3255 (Ryc. 3A). Stwierdzono, że średnia różnica w powierzchni jądra między populacjami „bez leku” a „leczonymi” jest statystycznie istotna w dwustronnym teście t typu 2 (równe wariancje) (p = 7,92 x 10-16). Hipotezą jest, że obserwacja ta stanowi odpowiedź komórkową na stres wywołany leczeniem farmakologicznym.

Interesujące jest również zbadanie, czy lek wywołuje efekt cytotoksyczny (t.j. wzrost liczby martwych komórek w czasie) czy cytostatyczny (t.j. spadek liczby nowych komórek w czasie), ponieważ ma to istotny wpływ kliniczny. Na przykład efekt cytostatyczny leku indukuje zatrzymanie wzrostu, ale nie eliminuje komórek z guza, w związku z czym istnieje możliwość ponownego zainicjowania proliferacji komórek nowotworowych po odstawieniu leku. Działanie leków często zależy od kontekstu, stężenia i typu komórek. Wcześniej zaobserwowaliśmy, że erlotynib wywołuje odpowiedź cytotoksyczną w jednym typie komórek, podczas gdy w innym wykazuje odpowiedź cytostatyczną13.

Tradycyjne testy żywotności podają względną liczbę komórek, a zatem nie rozróżniają między zatrzymaniem wzrostu a śmiercią komórkową. W niniejszej pracy martwe komórki zidentyfikowano na podstawie barwienia jodkiem propidylożym (Rycina 3B). Zaobserwowano zarówno efekty cytotoksyczne, jak i cytostatyczne erlotynibu w komórkach H3255, objawiające się zwiększeniem liczby zgonów oraz zmniejszeniem liczby podziałów po zastosowaniu leku (Rycina 3C). Warto zauważyć, że liczba martwych komórek spada po pierwszym dniu, co prawdopodobnie wynika z usuwania szczątków komórkowych. Komórki CCD-19Lu nie były pod wpływem leku. Dodatkową zaletą tej platformy jest generowanie danych ilościowych. Na przykład w naszym eksperymencie z ko-kulturą, początkowa subpopulacja 1 18 (75,8%) komórek H325 wzrosła do 2 817 (87,9%) lub spadła do 396 (57,2%) po trzech dniach odpowiednio bez lub z zastosowaniem erlotynibu (Rycina 4). Ponieważ jesteśmy w stanie uzyskać rzeczywistą liczbę komórek zamiast względnego procentu (jak w metodach cytometrii przepływowej), wyciągamy wniosek, że zmiana składu podczas leczenia lekiem wynika ze spadku liczby komórek H325, a nie ze wzrostu liczby komórek CCD-19Lu. Należy zauważyć, że wskaźniki śmiertelności mogą być niedoszacowane ze względu na usuwanie szczątków komórkowych, co jest trudne do oceny eksperymentalnej i prawdopodobnie różni się w zależności od typu komórek.

Schemat blokowy klasyfikacji komórek; mikroskopia, segmentacja, morfologia, analiza fluorescencji.
Rysunek 1: Przegląd protokołu analizy obrazu. Dwa potencjalne potoki analizy obrazu w dalszych etapach procesu, służące do klasyfikacji populacji heterokomórkowych przy użyciu klasyfikacji opartej na morfologii lub klasyfikacji opartej na fluorescencji. Skala = 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza działania leku; schemat przedstawiający morfologię, klasyfikacje fluorescencji: wyniki zgodności.
Rysunek 2: Zgodność między klasyfikacją opartą na morfologii a klasyfikacją opartą na fluorescencji. (A) Wykres zgodności obrazujący nakładanie się dwóch protokołów klasyfikacji. Te same komórki zostały sklasyfikowane jako H325 przy użyciu klasyfikacji opartej zarówno na morfologii, jak i na fluorescencji. Oba protokoły były zgodne w przypadku 97,4% (n = 1403) komórek nieleczonych oraz 92,5% (n = 916) komórek leczonych erlotinibem (Uwaga: biały obszar jest zbyt mały, aby był widoczny). (BObrazy 10X przedstawiające przykłady dobrej i słabej zgodności między klasyfikacją opartą na fluorescencji a klasyfikacją opartą na morfologii. Białe strzałki wskazują komórki, które zostały niespójnie sklasyfikowane pomiędzy platformami. Obraz wejściowy: niebieski – jądra komórkowe (Hoechst); zielony – CCD19Lu (GFP). Obrazy klasyfikacji: czerwony – H325; zielony – CCD-19Lu. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza komórek pod wpływem leku: Wykresy pudełkowe jąder komórkowych i powierzchni komórek (A); mikroskopia fluorescencyjna przeżywalności komórek z zastosowaniem barwnika do komórek martwych (B); wykresy liniowe obrazujące wzrost/śmierć komórek (C).
Rycina 3: Multiple pomiary fenotypowe z pojedynczego układu eksperymentalnego. (ACechy morfologiczne, takie jak jądra i powierzchnia komórki, obliczono na poziomie pojedynczych komórek w obecności i pod nieobecność leku. Uwaga: powierzchnie komórek mniejsze niż 100 µm2 uznano za zanieczyszczenia i wykluczono z analiz. Wykres pudełkowy przedstawia medianę wraz z zakresami pierwszego i trzeciego kwartyla oraz słupkami błędów dla 95% przedziału ufności. (B) Komórki H3255 (niebieskie) i CCD-19Lu (zielone) poddano ko-kulturze, a martwe komórki zidentyfikowano na podstawie intensywności barwienia jodkiem propidium (czerwone) i obrazowano przy użyciu obiektywu 10X. Pasek skali = 1 mm (panel górny); 100 µm (dolne zdjęcia). (CObliczono całkowitą liczbę żywych i martwych komórek w ciągu trzech dni, z zastosowaniem leku lub bez niego, wykazując wyraźny spadek liczby żywych komórek oraz wzrost liczby martwych komórek po dodaniu erlotynibu. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej obliczony na podstawie trzech powtórzeń. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Mikroskopia, hodowla komórkowa, odpowiedź na lek, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wykresy kołowe, H325, CCD-19Lu.
Rysunek 4: Dynamika subpopulacji w czasie. Reprezentatywne obrazy 10X studni zawierających komórki H325 (niebieskie) i CCD-19Lu (zielone) w dniu 0. lub dniu 3., z lekiem i bez leku. Policzono komórki należące do każdej subpopulacji, a proporcjonalne wykresy kołowe przedstawiają rzeczywistą zmianę składu populacji w poszczególnych próbkach. Paski skali = 1 mm (panele środkowe, pokazane w panelu skrajnie lewym), 1 mm (obraz górny), 100 µm  (dolne obrazy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisany powyżej protokół ulepsza obecne testy biologii komórki, zapewniając bardziej wszechstronny wgląd w dynamikę fenotypową wielu typów komórek w odpowiedzi na zakłócenia środowiskowe przy użyciu zredukowanych odczynników i czasu. Główną zaletą tego eksperymentalnego projektu jest możliwość analizowania wielu fenotypów za pomocą jednej konfiguracji i generowania danych ilościowych charakteryzujących te fenotypy na poziomie pojedynczej komórki. Jedną z technicznych zalet tej platformy jest łatwość początkowego rozwiązywania problemów w porównaniu z innymi testami. Ponieważ ta metoda jest oparta na obrazie, można wizualizować studnie pod kątem pozornego wysiewu nad/niedostatecznego. Wskazane jest, aby komórki znajdowały się w fazie wzrostu wykładniczego przez cały czas trwania eksperymentu i nie były ograniczone przez ograniczenia żywieniowe lub przestrzenne, ani nie były zakłócone przez starzenie się z powodu rzadkiego wysiewu. W przeciwnym razie wskaźniki urodzeń i zgonów mogą nie być powtarzalne między eksperymentami. Dla porównania, CellPD jest publicznie dostępnym programem do obliczania współczynników urodzeń i zgonów14. Dodatkowo można zwizualizować, czy do każdej studzienki dodano odpowiednie stężenia barwników. Problemy z pipetowaniem w pojedynczej studzience mogą powodować błędną segmentację i zniekształcone dane, ale można je łatwo wykryć za pomocą wyżej wymienionego protokołu.

Niestety, nie wszystkie typy komórek mogą być podatne na tę aplikację. Ważne jest, aby móc dokładnie segmentować jądra i komórki, dlatego analiza komórek, które organizują się w bardziej kuliste lub zbite struktury, może nie być odpowiednia. W przypadku niektórych komórek korzystne może być również użycie sitka komórkowego przed wysiewem, aby zapewnić wstępny wysiew pojedynczych komórek. Ponadto technika klasyfikatora liniowego ma zastosowanie tylko do typów komórek, które można łatwo odróżnić na podstawie cech morfologicznych.

Aby protokół był skuteczny, ważne jest, aby najpierw zoptymalizować warunki obrazowania, ponieważ ważność dalszych analiz zależy od jakości obrazów. Podczas gdy w tym przypadku przeprowadziliśmy eksperymenty przy użyciu platformy przesiewowej o wysokiej zawartości, akwizycję obrazu można również przeprowadzić za pomocą dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego (chociaż zautomatyzowana platforma obrazowania jest idealna do podejść o wysokiej przepustowości). Obrazy testowe powinny być wykonywane przed każdym punktem czasowym obrazowania, aby upewnić się, że nie ma problemów z mikroskopem lub protokołem. Stosunek sygnału do szumu powinien być wysoki, szczególnie dla kanałów, które będą wykorzystywane do segmentacji (tj. jądra, barwienia komórek). Dodatkowo ważne jest, aby obrazować w optymalnej płaszczyźnie ostrości. Jeśli obrazy są nieostre, segmentacja staje się znacznie trudniejsza, a obliczone cechy morfologiczne będą prawdopodobnie niedokładne. Różnice w oświetleniu między polami mogą również powodować problemy z segmentacją obrazu. Duże różnice w jasności utrudniają automatyczny wybór wartości progowych. Dodatkowo, jeśli między komórkami występują niejednorodne intensywności fluorescencji, pojedyncza wartość progowa może nie wystarczyć do segmentacji wszystkich komórek na obrazie. W tej analizie problemy te zostały przezwyciężone poprzez stworzenie masek wokół jaśniejszych i ciemniejszych populacji komórek oraz segmentację każdej populacji osobno.

Podczas gdy fenotypy badane w tym protokole ograniczają się do charakterystyki żywej, martwej i morfologicznej, można je łatwo rozszerzyć w celu zbadania innych cech. Na przykład funkcjonalne badania genetyczne mogą być dodawane z RNAi, nadekspresją lub innymi zaburzeniami chemicznymi.

W niniejszej pracy zademonstrowano możliwości protokołu do pomiaru odpowiedzi komórek niedrobnokomórkowego raka płuca na erlotynib w obecności i bez CAF. Jest to jednak tylko jeden z wielu typów komórek i parametrów mikrośrodowiskowych, które można przetestować. Rozszerzyliśmy ten protokół, aby można go było stosować z innymi typami komórek i badaniami leków, w tym komórkami pierwotnymi wyizolowanymi z guzów pacjentów13,15.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Cancer Institute (NCI) Granty U54CA143798 i U54CA143907 na założenie Centrów Nauk Fizycznych i Onkologii (PS-OCs) odpowiednio w Instytucie Raka Dana-Farber i Uniwersytecie Południowej Kalifornii. S.M. Mumenthaler otrzymał nagrodę PS-OC transnetwork, która wspierała niektóre z tych prac.

Chcielibyśmy wyrazić naszą najgłębszą wdzięczność naszym filantropijnym sympatykom, szczególnie rodzinie Stephensonów, Emmetowi, Toni i Tessie, za ich darowiznę platformy Operetta HCS. Chcielibyśmy również podziękować J. Foo za wskazówki oraz członkom zespołu Centrum Stosowanej Medycyny Molekularnej: D. Agusowi za wskazówki kliniczne i mentoring, K. Patschowi za konstruktywne dyskusje na temat projektu eksperymentalnego, R. Rawatowi za pomoc w protokołach analizy obrazu, J. Katzowi za pomoc techniczną przy Operetce oraz P. Macklinowi i D. Rudermanowi za pomocne dyskusje i informacje zwrotne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI-1640Pożywka do hodowli komórkowychCorning10-040-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini100-106średni suplement
Penicylina/streptomycynaGibco15-140-122średni suplement
TC20Licznik komórek1450102 Biorad
Szkiełka z błękitem trypanowymKomórka 1450003 Biorad szkiełka licznikowe
Płytki 96-dołkoweCorning3904przezroczyste dolne czarne płytki
ErlotinibLC LaboratoriesE-4007
DMSOVWR317275-100MLroztwór do ponownego zawieszenia leku
HoechstInvitrogenH21491barwnik jądrowy
Jodek propidyny (PI)InvitrogenP1304MPbarwienie martwych komórek
Cell Tracker Orange CMRALife TechnologiesC34551barwienie całych komórek
System obrazowania o wysokiej zawartości OperetkaPerkin Elmer
CellProfilerBroad Instituewersja 2.2.0 (rev 9969f42)http://cellprofiler.org/releases/
Inkubatordo hodowli komórkowychOdpowiedni będzie każdy inkubator do hodowli komórkowych - komórki hodowano pod 37 & ordm; C przy 5% CO2,
15 mL Probówki stożkowe FalconFalcon14-959-53A
10 cm2 płytki do hodowli komórkowychTPP93040

Bibliografia

  1. Kanemura, Y., et al. Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity. J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).
  2. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  3. Hsu, S., et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes. J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).
  4. Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. Applications in image-based profiling of perturbations. Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).
  5. Sero, J. E., et al. Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells. Mol Syst Biol. 11 (3), 790(2015).
  6. Chen, J. F., et al. Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases. Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).
  7. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  8. Paraiso, K. H., Smalley, K. S. Fibroblast-mediated drug resistance in cancer. Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).
  9. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  10. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  11. Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9, 482(2008).
  12. Dao, D., et al. CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets. Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).
  13. Garvey, C. M., et al. A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics. Sci Rep. 6, 29752(2016).
  14. Juarez, E. F., et al. Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD. BMC Syst Biol. 10 (1), 92(2016).
  15. Mumenthaler, S. M., et al. The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells. Cancer Inform. 14, Suppl 4. 19-31 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Klasyfikacja kom rekIntensywno fluorescencjiCechy morfologiczneProtok wysokoprzepustowej analizy obrazuBod ce rodowiskoweAnaliza odpowiedzi na lekAnaliza w programie CellProfilerCharakterystyka subpopulacji
Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.