Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55848

⸱

10 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 3School of Biomedical Engineering, Drexel University, 4Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 5Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Streszczenie

Neurotrauma i choroby neurodegeneracyjne często skutkują trwałymi deficytami neurologicznymi z powodu ograniczonej zdolności ośrodkowego układu nerwowego (OUN) do zastępowania utraconych neuronów i regeneracji ścieżek aksonalnych. Jednak podczas rozwoju układu nerwowego migracja neuronów i wydłużenie aksonów często zachodzą wzdłuż ścieżek utworzonych przez inne komórki, zwanych "żywymi rusztowaniami". Dążąc do naśladowania tych mechanizmów i zaprojektowania strategii, która omija hamujące środowisko OUN, manuskrypt ten przedstawia protokół wytwarzania "żywych rusztowań" opartych na astrocytach inżynierii tkankowej. Aby stworzyć te konstrukty, zastosowaliśmy nowatorski schemat otaczania biomateriałów, aby skłonić astrocyty do samoorganizacji w gęste, trójwymiarowe wiązki dwubiegunowych, podłużnie wyrównanych somatów i procesów. Najpierw zmontowano puste w środku mikrokolumny hydrożelowe, a wewnętrzne światło pokryto kolagenową matrycą zewnątrzkomórkową. Zdysocjowane astrocyty kory mózgowej zostały następnie dostarczone do światła cylindrycznej mikrokolumny i przy krytycznej średnicy wewnętrznej <350 μm spontanicznie samoczynnie wyrównały się i skurczyły, tworząc długie przypominające włókna, składające się z gęstych wiązek wyrostków astrocytów i włókien kolagenowych o średnicy <150 μm, ale rozciągających się na kilka cm długości. Te zmodyfikowane żywe rusztowania wykazywały >97% żywotności komórek i składały się praktycznie wyłącznie z astrocytów wyrażających kombinację pośrednich białek włókien: kwaśnego białka glejowo-fibrylarnego (GFAP), wimentyny i nestyny. Stwierdzono, że te wyrównane sieci astrocytów zapewniają permisywny substrat dla przyczepiania neuronów i wyrównanego wydłużania neurytów. Co więcej, konstrukty te zachowują integralność i wyrównanie po wyekstrahowaniu z hydrożelowej obudowy, dzięki czemu nadają się do implantacji OUN. Te wstępnie uformowane konstrukty strukturalnie naśladują kluczowe elementy cytoarchitektoniczne naturalnie występujących "żywych rusztowań" glejowych in vivo. W związku z tym te zmodyfikowane żywe rusztowania mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych in vitro lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych po zwyrodnieniu OUN in vivo.

Wprowadzenie

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) ma ograniczoną zdolność do przeciwdziałania utracie i/lub dysfunkcji neuronów oraz szlaków aksonalnych, które towarzyszą stanom takim jak urazy czaszkowo-mózgowe (TBI), udary, uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI) oraz choroby neurodegeneracyjne1,2,3,4,5. Neurogeneza w OUN jest ograniczona do niewielkiej liczby obszarów w mózgu, co utrudnia odtworzenie utraconych neuronów6,7. Ponadto regeneracja utraconych szlaków aksonalnych w OUN jest niewystarczająca ze względu na brak ukierunkowanego prowadzenia, obecność inhibitorów wzrostu oraz reaktywną astrogliozę następującą po uszkodzeniu tkanki nerwowej2,8,9,10. Astrocyty zazwyczaj pełnią różnorodne funkcje, wspomagając neurony w utrzymaniu homeostazy jonowej, usuwaniu neuroprzekaźników, tworzeniu synaps i sprzężeniu neuronaczyniowym11. Niemniej jednak, nawet po lekkim uszkodzeniu tkanki nerwowej, astrocyty mogą ulegać zmianom molekularnym, strukturalnym i funkcjonalnym w miarę przechodzenia w stan hipertroficzny11. W odpowiedzi na ciężką neurotraumę zmiany te prowadzą do powstania blizny z penumbrą zawierającą migrujące astrocyty reaktywne oraz rdzeniem zmiany, który obejmuje leukocyty przenikające przez przerwany barierę krew-mózg (BBB), mikroglej, oligodendrocyty i fibroblasty11,12,13. Astrocyty reaktywne te przyjmują morfologię włóknistych, zdezorganizowanych wypustek i wykazują zwiększoną ekspresję białek filamentów pośrednich oraz chondroitynosiarczanowych proteoglikanów (CSPGs), które utrudniają regenerację nerwową12. Chociaż blizna glejowa początkowo pomaga przywrócić integralność BBB i zapobiega przenoszeniu odpowiedzi zapalnej na otaczającą zdrową tkankę, służy ona jako fizyczna i biochemiczna bariera przeciwko regeneracji aksonów12,14,15,16. Na przykład aksony, które napotykają bliznę glejową, wykazują bulwiaste, dystroficzne stożki wzrostu i zahamowany wzrost12. Ponadto dezorganizacja wypustek astrocytarnych po urazie utrudnia wydłużanie się regenerujących aksonów17. Wynikiem tych cech hamujących są często trwałe upośledzenia fizyczne i neurologiczne, na które cierpią pacjenci po ciężkiej neurotraumie, w tym po TBI i SCI.

Niezależnie od zewnętrznych wyzwań stojących przed regeneracją funkcjonalną w OUN, wykazano, że aksony posiadają wewnętrzną zdolność do regeneracji. Na przykład dynamiczna natura dystroficznych stożków wzrostu w kontakcie z blizną glejową sugeruje, że zakończenia te zachowują zdolność do wydłużania się12. W związku z tym uważa się, że główną przeszkodą w odrostcie aksonów jest hamujące środowisko OUN po urazie i że korzystne byłoby zapewnienie bardziej sprzyjającego środowiska poprzez zmniejszenie bliznowacenia glejowego i/lub stworzenie regeneracyjnych mostków przez bliznę. Rzeczywiście, wcześniejsze badania wykazały, że neurony OUN były zdolne do wydłużania aksonów przez miejsce uszkodzenia z wykorzystaniem przeszczepów nerwów obwodowych jako mostków, które zapewniają korzystniejsze środowisko dla regeneracji aksonów12,18,19. Podjęto kilka innych strategii w celu wykorzystania tej szczątkowej zdolności regeneracyjnej. Na przykład manipulacja szlakami sygnałowymi wzrostu komórek w różnych modelach urazów doprowadziła do regeneracji aksonów i redukcji blizny glejowej10,20,21. Ponadto badania wykazały, że leczenie chondroitynazą ABC, która rozszczepia większość łańcuchów cukrowych w CSPGs, zmniejsza hamujący wpływ CSPGs wydzielanych przez reaktywne astrocyty22. Pomimo obiecujących wyników, podejścia te nie zapewniają ukierunkowanego prowadzenia stożków wzrostu, co może potencjalnie prowadzić do aberracyjnej regeneracji12, a także nie uwzględniają utraty neuronów. Podejścia oparte na komórkach były wykorzystywane w próbach przezwyciężenia skutków blizny glejowej i uzupełnienia utraconych komórek, w szczególności neuronów. Niektóre zespoły przeprowadziły dedyferencjację reaktywnych astrocytów w neurony, podczas gdy inne przeszczepiły neuralne komórki progenitorowe do uszkodzeń OUN, aby ponownie zasiedlić obszar urazu i promować regenerację aksonów23,24,25. Jednak sama transplantacja komórek macierzystych jest ograniczona przez niskie wskaźniki przeżywalności, słabą integrację i niewielką retencję w uszkodzonej tkance5. Co więcej, strategie oparte na komórkach nie przywracają długodystansowych traktów aksonalnych, zwłaszcza w sposób kontrolowany. Dlatego biomateriały w połączeniu z innymi podejściami są badane jako nośniki dla różnych komórek neuralnych, progenitorowych oraz czynników wzrostu26. Podejścia oparte na biomateriałach charakteryzują się wysokim stopniem kontroli nad projektem w celu tworzenia konstruktów naśladujących specyficzne sygnały fizyczne, haptotaktyczne i chemotaktyczne obecne w trójwymiarowym (3D) mikrośrodowisku docelowej tkanki gospodarza27,28,29,30,31,32,33,34. Odtworzenie tych sygnałów środowiskowych jest kluczowe, aby przeszczepione komórki prezentowały morfologię, proliferację, migrację i sygnalizację zbliżoną do naturalnej, obok innych cech neurobiologicznych29. Pomimo tych korzystnych właściwości, konieczny jest postęp wykraczający poza tradycyjne rusztowania biomateriałowe zasiewane komórkami, aby jednocześnie promować ukierunkowaną, długodystansową regenerację aksonów i zastąpić utracone neurony.

Obiecującym podejściem alternatywnym jest zastosowanie inżynieryjnych „żywych rusztowań” z tkanki nerwowej, które różnią się od innych metod opartych na komórkach obecnością żywych komórek nerwowych o uprzednio uformowanej cytoarchitekturze, naśladującej rodzimą neuroanatomię i/lub mechanizmy rozwojowe, aby ułatwić ukierunkowaną wymianę, rekonstrukcję i regenerację obwodów neuronalnych4,35. Projektowanie żywych rusztowań wymaga uwzględnienia fenotypów i źródeł komórek nerwowych, a także właściwości mechanicznych/fizycznych i sygnałów biochemicznych wynikających ze składu towarzyszących biomateriałów35. Po wytworzeniu in vitro, żywe rusztowania te mogą zostać zaimplantowane in vivo, aby prezentować cząsteczki adhezyjne komórek oraz sygnały chemotaktyczne i neurotroficzne, które aktywnie regulują migrację komórek nerwowych i wzrost aksonów w zależności od stanu i postępu procesów regeneracyjnych35. Komórki glejowe mogą stanowić podstawę inżynieryjnej cytoarchitektury żywych rusztowań, ponieważ komórki te pośredniczą w różnych mechanizmach rozwojowych in vivo. Podczas rozwoju mózgu nowe neurony wykorzystują wypustki podstawne rozciągane przez glej radialny z strefy komorowej w kierunku rozwijającej się płytki korowej jako żywe rusztowania dla ukierunkowanej migracji36,37. Co więcej, wykazano, że rozwijające się stożki wzrostu orientują się poprzez wykrywanie sygnałów przyciągających i odpychających generowanych przez glejowe komórki prowadzące, a sugeruje się, że tzw. aksony „pionierskie” docierają do właściwych celów, rozwijając się wzdłuż wstępnie uformowanych rusztowań glejowych35,38,39. Zatem komórki glejowe są niezbędne do prowadzenia aksonów pionierskich, które później służą jako oparte na aksonach „żywe rusztowania” kierujące projekcją aksonów „naśladowców”. Ponadto wykazano, że mechanizmy wzrostu pośredniczone przez glej utrzymują się w okresie postnatalnym, czego przykładem jest przemieszczanie się neuroblastów wzdłuż rostralnego strumienia migracyjnego (RMS) z strefy podkomorowej (SVZ), jednej z niewielu pozostałych obszarów neurogenezy w dorosłym mózgu, do opuszki węchowej (OB)40. Neuroblasty w RMS migrują wewnątrz rurki glejowej (Rycina 1A-1), która składa się z podłużnie ułożonych wypustek astrocytarnych, poprzez bezpośrednie adhezje międzykomórkowe i lokalne czynniki rozpuszczalne37,41. Wreszcie, podczas gdy uszkodzenia OUN u ssaków powodują zaburzenie organizacji wypustek astrocytarnych i tworzenie blizny glejowej, która fizycznie utrudnia regenerację aksonalną17, wiele systemów niessawich nie wykazuje formowania szkodliwej blizny glejowej. Zamiast tego, komórki glejowe gatunków niessawich utrzymują bardziej zorganizowane, wyrównane wzorce, które służą jako przewodniki przez uszkodzony obszar17,42,43. Na przykład w niessawich modelach urazów rdzenia kręgowego (SCI) wykazano, że aksony rosną w ścisłym powiązaniu z mostkami glejowymi przecinającymi miejsce uszkodzenia, co sugeruje ważną rolę zorganizowanych rusztowań glejowych jako podłoży ułatwiających regenerację aksonalną i powrót funkcji (Rycina 1A-2)42,44,45. Odtworzenie cech neuroanatomicznych oraz opisanych powyżej mechanizmów rozwojowych/regeneracyjnych może doprowadzić do stworzenia nowej klasy inżynieryjnych żywych rusztowań opartych na gleju, które mogą jednocześnie stymulować migrację niedojrzałych neuronów i wyznaczanie ścieżek aksonalnych przez środowiska w przeciwnym razie nieprzepuszczalne, potencjalnie łagodząc tym samym skutki degeneracji neuronów i szlaków aksonalnych związanych z urazami i chorobami OUN.

Nasza grupa badawcza zaprojektowała wcześniej wiele typów żywych rusztowań do rekonstrukcji i regeneracji traktów aksonalnych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) oraz obwodowym układzie nerwowym (OUNob) za pomocą odpowiednio mikrotkankowych inżynieryjnych sieci neuronalnych (micro-TENNs) oraz tkankowych inżynieryjnych przeszczepów nerwowych (TENGs)27,46,47,48. Obie strategie opierają się w założeniu na biomimetyce. Micro-TENNs są strukturami inspirowanymi anatomicznie, zaprojektowanymi w celu strukturalnego i funkcjonalnego zastąpienia traktów aksonalnych łączących odrębne populacje neuronalne mózgu. TENGs wykorzystują rozwojowy mechanizm regeneracji aksonalnej wspomaganej aksonami, czego przykładem jest wzrost aksonów „naśladowców” (follower) wzdłuż aksonów „pionierów” (pioneer), aby osiągnąć ukierunkowaną regenerację aksonów gospodarza35,46,48. Niedawno wykorzystaliśmy wszechstronność techniki żywych rusztowań, stosując schemat obudowy podobny do tego w micro-TENNs i czerpiąc inspirację z mechanizmów opartych na gleju obecnych podczas rozwoju. Opracowaliśmy konstrukty składające się z uporządkowanych wiązek astrocytarnych rozciągających się w kolagenowym świetle mikrokolumny hydrożelowej49. Te astrocytarne żywe rusztowania są tworzone poprzez najpierw wypełnienie zestawu rurki kapilarnej i igły do akupunktury płynną agarozą, aby stworzyć pusty w środku cylindryczny hydrożel o średnicy zewnętrznej (OD) i średnicy wewnętrznej (ID) odpowiadających odpowiednio średnicom rurki i igły. Po żelowaniu agarozy i wyjęciu mikrokolumny hydrożelowej z rurki kapilarnej, puste wnętrze jest powlekane kolagenem typu I, aby zapewnić środowisko sprzyjające adhezji astrocytów i tworzeniu uporządkowanych wiązek (Ryc. 1B-1). Następnie w świetle zasiewa się astrocyty kory mózgowej wyizolowane z postnatalnych szczurząt (Ryc. 1B-2). W przeciwieństwie do technik uporządkowania dwuwymiarowego (2D), które opierają się na stosowaniu pól elektrycznych, mikrowzorowanych rowków i wzorowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), uporządkowanie astrocytów w technice żywych rusztowań opiera się na samoorganizacji zgodnie z kontrolowanymi zmiennymi, takimi jak krzywizna podłoża (ID kolumny), gęstość komórek i stężenie kolagenu50,51,52. Astrocyty kurczą i przebudowują kolagen, przyjmując dwubiegunową, podłużnie uporządkowaną morfologię analogiczną do naturalnych rusztowań obserwowanych in vivo (Ryc. 1B-3). Rzeczywiście, aktywnie dążymy do wykorzystania tych struktur przypominających kable jako fizycznych podłoży do ukierunkowanego prowadzenia migrujących niedojrzałych neuronów, a także do wspomagania regeneracji aksonalnej przez niekorzystne środowisko uszkodzonego OUN, w szczególności przez ssaczą bliznę glejową (Ryc. 1C). W niniejszym artykule przedstawiona zostanie szczegółowa metoda wytwarzania astrocytarnych mikrokolumn, obrazy w kontraście fazowym i immunofluorescencyjne obrazujące oczekiwaną cytoarchitekturę oraz kompleksowa dyskusja na temat obecnych ograniczeń i przyszłych kierunków rozwoju tej techniki.

Schemat inspiracji neurobiologicznej: Mosty glejowe kierują regeneracją aksonów poprzez wytwarzanie mikrokolumn.
Rysunek 1: Inspiracja, protokół wytwarzania i proponowane zastosowania wyrównanych sieci astrocytarnych. (A) Inspiracja neurobiologiczna: (1) Neuroblasty pochodzące z neurogennej strefy podkomorowej (SVZ) wykorzystują podłużnie wyrównaną rurkę glejową w rostralnym strumieniu migracyjnym (RMS) do kierowanej migracji w stronę opuszki węchowej (OB); (2) Organizmy nie ssaki, takie jak płazy i ryby, mogą utrzymać regenerację po uszkodzeniu tkanki nerwowej częściowo dzięki tworzeniu mostu glejowego, który łączy końce zmiany (np. przerwanego rdzenia kręgowego) i służy jako rusztowanie dla prowadzenia regenerujących się aksonów. (B) Przegląd procesu wytwarzania: (1) konstrukcja mikrometrycznej, pustej mikrokolumny hydrożelowej z lumenem pokrytym ECM, (2) wysiew pierwotnych astrocytów korowych izolowanych z postnatalnych szczurząt, (3) samoorganizacja podłużnie zorientowanych wiązek w kulturze oraz (4) ekstrakcja wiązki z obudowy z biomateriału na potrzeby przyszłych badań nad implantacją. (C) Zastosowania in vivo: (1) Te żywe rusztowania mogą służyć jako inżynieryjne rurki glejowe dla kierowanej migracji neuronów z ośrodków neurogennych w celu ponownego zasiedlenia obszarów z niedoborem neuronów; (2) Odtworzenie mechanizmu rozwojowego prowadzenia aksonów pionierskich oraz regeneracyjnego mechanizmu mostów glejowych u organizmów nie ssaków może nadać tym rusztowaniom astrocytarnym zdolność do kierowania regeneracją aksonów przez nieprzychylne środowisko ssaczej blizny glejowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Pensylwanii oraz Centrum Medyczne ds. Weteranów Michaela J. Crescenza i przestrzegały wytycznych zawartych w Polityce Publicznej Służby Zdrowia NIH dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (2015).

1. Rozwój mikrokolumn hydrożelu agarozowego

  1. Przygotować 3% roztwór agarozy o stężeniu 3% wagowo-objętościowym (w/v), ważąc 3 g agarozy i przenosząc ją do sterylnej zlewki zawierającej 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. Dodaj sterylny pręt magnetyczny do zlewki i umieść go na powierzchni płyty grzejnej/mieszadła. Zlewkę należy przykryć, aby zapobiec odparowaniu jej zawartości w następnym kroku.
  2. Podgrzej agarozę i DPBS w temperaturze 100 °C i mieszaj z prędkością 60-120 obr./min. Dostosuj te ustawienia w razie potrzeby i stale monitoruj postęp procesu rozpuszczania, gdy roztwór początkowo zmienia się z nieprzezroczystego na przezroczysty wygląd, który oznacza, że agaroza została całkowicie rozpuszczona.
    Uwaga: Gorąca zlewka i roztwór są gorące!
  3. Gdy roztwór agarozy jest podgrzewany i mieszany, wyjmij cztery puste 10-centymetrowe szalki Petriego i dodaj 20 ml DPBS do dwóch z nich. Umieść igły do akupunktury (średnica: 300 μm, długość: 40 mm), szklane mikrolitrowe rurki kapilarne (średnica: 701,04 μm, długość: 65 mm, pojemność: 25,0 μl) oraz dozownik z żarówką wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego. Gdy płynny roztwór agarozy wyklaruje się, należy utrzymywać stałe ogrzewanie w temperaturze około 50 °C i mieszać, aby uniknąć żelowania agarozy.
  4. Wprowadź igłę do akupunktury do dolnego otworu dozownika z żarówką. Założyć rurkę kapilarną na igłę wystawioną na zewnątrz. Zabezpiecz rurkę kapilarną, wkładając jej część w gumową część cylindra dozownika bańki.
  5. Przenieść 1 ml płynnej agarozy za pomocą mikropipety na powierzchnię pustej szalki Petriego i umieścić jeden koniec rurki kapilarnej pionowo (z włożoną igłą) w kontakcie z agarozą, podczas gdy gumowa nasadka dozownika gruszki jest ściskana do środka. Powoli zwolnij nacisk na nasadkę dozownika żarówki, aby wciągnąć agarozę do rurki kapilarnej.
    UWAGA: Przenoszenie ciekłej agarozy do kapilar musi być wykonane szybko. Jeśli ciekła agaroza zostanie pozostawiona do ostygnięcia na powierzchni szalki Petriego przez wystarczająco długi czas (około 60 s), zaczyna żelować, uniemożliwiając odpowiednie zasysanie agarozy wzdłuż rurki kapilarnej.
  6. Umieść każdy zespół bańka-rurka-igła na wolnej szalce Petriego i pozwól, aby żel agarozowy wewnątrz kapilar zestalił się na 5 minut. Ostrożnie wyciągnij rurkę kapilarną rękami z gumowego korka w cylindrze dozownika bańki, pozostawiając igłę i żel agarozowy na miejscu wewnątrz probówki.
  7. Ręcznie wyjmij igłę do akupunktury, powoli wyciągając ją z rurki kapilarnej; nowo zestalony cylinder agarozy również wysuwa się z rurki w tej procedurze, nadal otaczając igłę. Delikatnie popchnij mikrokolumnę wzdłuż igły do akupunktury końcówką sterylnych kleszczyków, aby przesunąć ją do końca. Umieść igłę na otwartej szalce Petriego zawierającej DPBS i wepchnij mikrokolumnę do DPBS za pomocą kleszczy.
    UWAGA: Jeśli mikrokolumna agarozy pozostanie w szklanej rurce kapilarnej po wyjęciu igły do akupunktury, powoli wypchnij mikrokolumnę agarozy z rurki kapilarnej za pomocą igły o średnicy 25 mm do naczynia z DPBS.
  8. Sterylizuj mikroskalpele lub kleszcze za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami. Przygotuj 4% w/v agarozy, ważąc 4 g agarozy i przenosząc ją do 100 ml DPBS. Podgrzej i wymieszaj, jak wyjaśniono w kroku 1.2, aby uzyskać klarowny 4% płynny roztwór agarozy. Utrzymuj podgrzewanie i mieszanie roztworu w kolejnych krokach.
  9. Przenieść szalki Petriego zawierające mikrokolumny do okapu preparacyjnego i przenieść mikrokolumnę za pomocą drobnych kleszczyków na pustą szalkę Petriego. Wykorzystaj stereoskop do wskazówek wizualnych i mikroskalpel, aby przyciąć mikrokolumny na żądaną długość. Przyciąć oba końce, aby utworzyć skośne końce pod kątem 45o od poziomu, aby ułatwić obsługę mikrokolumn podczas ECM i dodawania komórek.
  10. Powtórz poprzedni krok dla trzech kolejnych mikrokolumn na tej samej szalce Petriego i ustaw cztery konstrukcje równolegle z odstępem <3 mm między każdym z cylindrów. Załadować 50 μl 4% roztworu agarozy za pomocą mikropipety i wlać smugę/linię cieczy na układ mikrokolumn, aby połączyć i związać konstrukty w grupy po cztery (zwane dalej "łodziami mikrokolumnowymi"). Unikaj przemieszczania się 4% agarozy na końce mikrokolumn, które mogą zatkać wnętrze, minimalizując odległość między konstrukcjami i szybko dodając agarozę cienką linią.
    UWAGA: Układanie grup czterech mikrokolumn w "łodzie" nie jest wymagane do wytworzenia rusztowań astrocytowych. Niemniej jednak łodzie służą przyspieszeniu procesu produkcji i oferują bezpieczniejszy sposób przenoszenia i obsługi mikrokolumn w późniejszych etapach.
  11. Pozwól łodzi z mikrokolumną ostygnąć przez 1-2 minuty, aby umożliwić żelowanie dodanych 4% agarozy. Podnieś łódkę z mikrokolumnami za pomocą drobnych kleszczy, łącząc 4% agarozy, a następnie przenieś mikrokolumny na drugą płytkę Petriego zawierającą DPBS, przygotowaną w kroku 1.1.3. Wyprodukuj więcej łodzi z pozostałymi mikrokolumnami zgodnie z potrzebami.
  12. Przenieść szalki Petriego zawierające mikrokolumny i/lub łódeczki do komory bezpieczeństwa biologicznego i sterylizować pod wpływem światła ultrafioletowego (UV) przez 30 minut
    Ostrzeżenie: Nosić odpowiednią ochronę, aby zapobiec ekspozycji na promieniowanie UV.
  13. Przechowywać szalki z łódeczkami z mikrokolumnami w DPBS w temperaturze 4 °C, jeżeli dodanie ECM i posiew komórek nie nastąpią bezpośrednio po tym, przez okres do 1 tygodnia. Powtórz kroki produkcji mikrokolumn, jeśli konstrukcje nie są używane w tym czasie.

2. Pierwotna hodowla komórkowa i izolacja

  1. Izolacja astrocytów korowych od młodych szczurów
    1. Przygotowując się do kolejnych kroków, dodaj 20 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do czterech 10-centymetrowych szalek Petriego, które posłużą jako zbiorniki dla wypreparowanych tkanek. Trzymaj wszystkie naczynia na lodzie. Sterylizuj czyste nożyczki chirurgiczne, kleszcze, mikroszpatułki i mikroskalpele w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
    2. Rozgrzej 0,25% trypsynę z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,15 mg/ml dezoksyrybonukleazy (DNazy) I w HBSS w temperaturze 37 °C. Ponadto należy podgrzać pożywkę do hodowli astrocytów w temperaturze 37 °C, która składa się ze zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z mieszanką składników odżywczych F-12 szynki i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    3. Znieczulenie szczeniąt szczurów Sprague-Dawley po urodzeniu 0 lub 1 dnia, wystawiając je na warunki hipotermii, i eutanazję przez dekapitację. Przypnij głowę do etapu za pomocą igły o średnicy 19 mm umieszczonej w pysku przed oczami.
    4. Wykonaj nacięcie skalpelem od środka od tyłu do przodu, od podstawy szyi do tuż za oczami. Wykonaj kolejne nacięcie idąc bocznie od bezpośrednio za oczami w dół, tworząc kształt litery T. Użyj cienkich kleszczy, aby odciągnąć skórę czaszki/czaszkę na bok.
    5. Trzymaj głowę za pysk (skierowaną do góry), umieszczając jeden ząb kleszczy w pysku zwierzęcia, a drugi na zewnętrznej powierzchni. Usuń mózg za pomocą sterylnej mikroszpatułki i umieść go na jednej z szalek Petriego wypełnionych schłodzonym HBSS. Umieść tę szalkę Petriego na lodzie natychmiast po tym i przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest używana.
    6. Umieść blok granitowy przechowywany wcześniej w temperaturze -20 °C poniżej stereoskopu wewnątrz okapu preparacyjnego. Umieść szalkę Petriego z tkanką mózgową na powierzchni bloku granitowego, aby zachować jego niską temperaturę podczas procedury preparacji. Użyj stereoskopu jako wizualnej wskazówki w kolejnych krokach.
    7. Jeśli opuszki węchowe pozostają nienaruszone, usuń je przez cięcie kleszczami lub mikroskalpelami. Ponadto za pomocą mikroskalpela usuń móżdżek i wykonaj nacięcie w linii środkowej oddzielające dwie półkule mózgowe. Przenieś półkule za pomocą kleszczy na szalkę Petriego zawierającą świeży, schłodzony HBSS.
    8. Wypreparuj struktury śródmózgowia od wnętrza półkul za pomocą mikroskalpela, aby uzyskać tylko oddzielone kory. Użyj cienkich kleszczy, aby oderwać opony mózgowe, strukturę przypominającą prześcieradło, od tkanki korowej i przenieść izolowaną korę na nową szalkę Petriego z zimnym HBSS. Użyj mikroskalpela, aby zmielić tkankę, aby w następnym kroku zwiększyć powierzchnię działania trypsyny.
    9. Za pomocą pipety Pasteura przenieś korę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA (8 korek w każdej probówce). Wystawić tkankę korową na działanie trypsyny-EDTA przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
    10. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usunąć trypsynę-EDTA i dodać 400 μl 0,15 mg/ml roztworu DNAzy I do probówki wirówkowej. Mieszaj probówkę lub wir, aż cała tkanka zostanie zdysocjowana i w płynie nie pozostaną żadne kawałki tkanki. Jeśli nie jest możliwe całkowite rozpuszczenie tkanki, usuń pozostałe fragmenty końcówką pipety Pasteura.
    11. Odwirować probówkę zawierającą zdysocjowany roztwór komórek o sile 200 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura, nie naruszając komórek. Dodać 1 ml pożywki do hodowli astrocytów (określonej w kroku 2.1.2) do probówki za pomocą mikropipety i zamieszać w celu ponownego zawieszenia i wytworzenia jednorodnego roztworu.
    12. Przenieść 10 ml pożywki do hodowli astrocytów za pomocą pipety serologicznej do kolby T-75. Dodać 250 μl 1 ml roztworu komórek (przygotowanego w kroku 2.1.11) za pomocą mikropipety do kolby, aby umieścić na kolbie komórki o wartości jednego mózgu młodego. Rozprowadzić rozładowany roztwór komórkowy równomiernie na pożywce hodowlanej i delikatnie poruszyć kolbę, aby jeszcze bardziej ułatwić równomierne rozprowadzenie.
    13. Wyhodować kolby posiane w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po osiągnięciu 24 i 72 godzin w hodowli należy mechanicznie wymieszać kolbę w celu odłączenia nieprzylegających typów komórek, takich jak neurony i oligodendrocyty.
    14. Następnie w każdym z tych punktów czasowych wykonaj zmianę nośnika. Trzymać kolbę pionowo, tak aby pożywka hodowlana leżała na dnie kolby, nie zakrywając przylegających komórek. Odessać pożywkę hodowlaną pipetą Pasteura, dociskając końcówkę pipety do dolnego rogu kolby, aby uniknąć ekstrakcji komórek. Umieścić kolbę w pierwotnym położeniu poziomym i delikatnie dodać 10 ml pożywki astrocytowej na komórki za pomocą pipety serologicznej.
    15. Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze po każdej zmianie pożywki. Po osiągnięciu 90% zbieżności należy ponownie mechanicznie wymieszać kolbę, aby usunąć wszelkie pozostałe nieprzylegające komórki.
    16. Przepasuj astrocyty, wyjmując pożywkę hodowlaną za pomocą próżni i pipety Pasteura. Dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej na przylegające komórki. Delikatnie wymieszać kolbę, aby upewnić się, że trypsyna pokrywa wszystkie komórki, i inkubować kolbę przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    17. Ugasić trypsynę, dodając 1 ml pożywki astrocytów do komórek za pomocą pipety serologicznej. Ekstrahować roztwór komórek z kolby za pomocą pipety serologicznej i przenieść go do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 3 minuty.
    18. Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej i ponownie zawiesić go w 1 ml pożywki do hodowli astrocytów. Poruszyć probówkę, aby upewnić się, że roztwór komórkowy jest jednorodny. Policz liczbę komórek w roztworze za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Kolba, która jest w 90% zlewająca, zwykle daje około 3 milionów astrocytów.
    19. Dodać 10 ml pożywki do hodowli astrocytów do kolby T-75. Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:4, przenosząc 250 μl roztworu komórkowego (etap 2.1.18) za pomocą mikropipety do kolby T-75 zawierającej już pożywkę hodowlaną. Delikatnie wymieszać, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek na całej powierzchni kolby.
    20. Powtórz kroki 2.1.16-2.1.19 za każdym razem, gdy zostanie osiągnięta 90% zbieżność w celu przejścia komórek.
  2. Izolacja neuronów korowych od płodów szczurów
    1. Postępuj zgodnie z podobnymi przygotowaniami, jak w krokach 2.1.1 i 2.1.2, z wyjątkiem tego, że wstępnie podgrzaną pożywką jest pożywka kohodowlana, składająca się z pożywki neuropodstawowej + 2% suplementu B-27 (dla neuronów) + 1% suplementu bez surowicy G-5 (dla astrocytów) + 0,25% L-glutaminy.
    2. Eutanazja zarodków w ciąży w czasie 18 dnia Sprague-Dawley szczurów z uduszeniem dwutlenkiem węgla i potwierdź śmierć przez ścięcie.
    3. Wyodrębnij płody szczurów i wypreparuj korę mózgową z reszty tkanki mózgowej na szalkach Petriego zawierających HBSS na powierzchni schłodzonego bloku granitowego, używając stereoskopu do wskazówek wizualnych i wysterylizowanych nożyczek, mikroskalpela i kleszczy53. Po kolejnym rozebraniu głów, mózgów, półkul mózgowych i kory mózgowej, przenieś każdą tkankę na nową szalkę Petriego wypełnioną HBSS.
    4. Zmiel tkankę korową na mniejsze fragmenty, aby zwiększyć powierzchnię trypsyny. Przenieść 4-6 kory mózgowej za pomocą pipety Pasteura do probówki z 5 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA i utrzymywać w temperaturze 37 °C w celu dysocjacji tkanki. Po 5-7 minutach ręcznie wymieszaj probówkę, aby wymieszać i zapobiec zbrylaniu się tkanki.
    5. Wyjmij probówkę z 37 °C po 10 minutach. Jak wyjaśniono wcześniej w kroku 2.1, wyekstrahuj trypsynę-EDTA i zastąp ją 1,8 ml roztworu DNAzy o stężeniu 0,15 mg/mL. Następnie wiruj tkankę, aż roztwór stanie się jednorodny, bez fragmentów tkanki unoszących się w płynie.
    6. Odwirować zdysocjowany roztwór tkankowy o stężeniu 200 x g przez 3 minuty. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić w 2 ml pożywki do współhodowli. Policz liczbę komórek w tym roztworze za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Zwykła wydajność wynosi 3,0-5,0 x 106 komórek / półkulę korową.
    7. Przygotować nowy roztwór komórkowy o gęstości 2,0-4,0 x 105 komórek/ml w pożywkach do kohodowli określonych powyżej.

3. Rozwój astrocytowych wewnątrz mikrokolumn

  1. Produkcja rdzenia ECM
    UWAGA: ECM musi zostać dodany do wnętrza mikrokolumn hydrożelowych w tym samym dniu, w którym zostanie przeprowadzone wysiewanie komórek.
    1. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego przygotuj 1 mg/ml roztwór kolagenu typu I z ogona szczura w pożywce do kohodowli w sterylnej probówce do mikrowirówki. Probówkę do mikrowirówki z roztworem ECM należy utrzymywać na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest ona używana.
    2. Przenieść 1-2 μl roztworu ECM za pomocą mikropipety na pasek papierka lakmusowego, aby oszacować jego pH. Dodać 1 μl 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) lub kwasu solnego (HCl) za pomocą mikropipety, aby odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć pH roztworu ECM, a następnie pipetować w górę i w dół do homogenizacji. Sprawdź nowe pH za pomocą paska papierka lakmusowego i dodaj więcej kwasu lub zasady, w zależności od potrzeb, aż pH ustabilizuje się w zakresie 7,2-7,4.
    3. Przenieść szalki Petriego z kroku 1.2 do okapu preparacyjnego i przenieść 4-5 mikrokolumn lub łódkę ze sterylnymi drobnymi kleszczami na pustą, sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 lub 60 mm. Korzystając ze stereoskopu jako wskazówki, umieść końcówkę mikropipety o pojemności 10 μl na jednym końcu każdej mikrokolumny i odsysaj, aby opróżnić światło DPBS i pęcherzyki powietrza. Potwierdź brak pęcherzyków powietrza za pomocą stereoskopu, aby upewnić się, że ECM dodany w następnym kroku może swobodnie przepływać przez światło.
    4. Napełnij mikropipetę P10 roztworem ECM, przyłóż końcówkę o pojemności 10 μl do jednego końca mikrokolumn hydrożelowych i dostarcz roztwór wystarczający do wypełnienia światła (około 3-5 μl), obserwując wejście ECM za pomocą stereoskopu. Odpipetować mały zbiornik (2-4 μl) roztworu ECM na obu końcach mikrokolumny.
      UWAGA: Zawsze zarządzaj 4-5 mikrokolumnami lub jedną łodzią na raz, aby zapobiec długotrwałemu wysychaniu konstrukcji, ponieważ może to spowodować zgniecenie struktury mikrokolumny. Całkowicie wysuszone mikrokolumny mocno przylegają do powierzchni szalek Petriego, co uniemożliwia ich wykorzystanie do wysiewu komórek. Nadmierne ilości pożywek do kokultur (jako środek hydratacji) nie mogą być dodawane do mikrokolumn, ponieważ może to spowodować wypływ ECM podczas okresu inkubacji opisanego poniżej.
    5. Odpipetować pożywki do współhodowli w pierścieniu wokół szalki Petriego, aby zapewnić zlewozmywak, aby zapobiec wysychaniu kolumn podczas inkubacji. Inkubować szalkę Petriego zawierającą mikrokolumny zawierające ECM w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę w celu pobudzenia polimeryzacji kolagenu przed dodaniem neuronów i/lub astrocytów.
      UWAGA: ECM powinien tworzyć warstwę pokrywającą wewnętrzną powierzchnię pustego światła, a nie solidny rdzeń ECM obejmujący wnętrze, które można obserwować za pomocą stereoskopu. Jeśli ECM tworzy rdzeń, kontynuuj okres inkubacji, aż pozostanie tylko warstwa. Po utworzeniu tej warstwy roztwór komórek astrocytów może wypełnić wnętrze mikrokolumny na etapach posiewu.
    6. W okresie inkubacji należy przygotować roztwór komórek astrocytów (jak opisano poniżej).
  2. Wysiewanie astrocytów i neuronów w mikrokolumnach
    1. Przejść przez platerowane astrocyty (między czwartym a dwunastym pasażem), jak wyjaśniono w krokach 2.1.16-2.1.19. Po zliczeniu liczby komórek w kolbie przygotować roztwór komórek o gęstości 9,0-12,0 x 105 komórek/ml roztwór zawieszony w pożywce do hodowli komórkowych.
    2. Za pomocą stereoskopu umieść końcówkę mikropipety P10 na jednym końcu mikrokolumn i przenieś wystarczającą ilość roztworu komórkowego (~5 μl) do światła, aby całkowicie go wypełnić. Podobnie jak w przypadku ECM, dodaj małe zbiorniki roztworu komórkowego na obu końcach każdej mikrokolumny.
    3. Inkubować posiane mikrokolumny na szalkach Petriego w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę, aby ułatwić przyłączenie astrocytów do ECM. Jeśli neurony nie zostaną dodane do mikrokolumn, przejdź do kroku 3.2.5.
    4. Po początkowym okresie inkubacji dodać 1-2 μl roztworu neuronu korowego otrzymanego w kroku 2.2.7 do obu końców mikrokolumn za pomocą mikropipety, obserwując pod stereoskopem. Upewnij się, że w naczyniach znajduje się wystarczająca ilość pożywki, aby uniknąć wysuszenia, i ponownie inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić adhezję neuronów.
      UWAGA: Roztwór neuronu korowego można również dodać 1-2 dni po utworzeniu pęczka Legendy, wykonując krok 3.2.4 po ostrożnym usunięciu pożywki hodowlanej z płytki Petriego za pomocą mikropipety.
    5. Po okresie inkubacji ostrożnie napełnić szalki Petriego zawierające posiane mikrokolumny 3 lub 6 ml pożywki do współhodowli odpowiednio na szalki Petriego o średnicy 35 lub 60 mm. Utrzymuj platerowane mikrokolumny w kulturze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby ułatwić samoorganizację wyrównanych wiązek astrocytów, które po 6-10 godzinach powinny utworzyć wiązkę, przypominającą strukturę.
  3. Stabilizacja architektury astrocytów
    UWAGA: Po utworzeniu wiązek, około 6-12 godzin hodowli konstruktów, należy wykonać następujące kroki, aby zapobiec zapadnięciu się wyrównanej struktury rusztowań astrocytowych.
    1. W sterylnej probówce do mikrowirówki przygotuj 3 mg/ml roztworu I kolagenu z ogona szczura w pożywce do kohodowli. Dostosować pH roztworu do 7.2-7.4 zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.1.2. Utrzymuj zapas kolagenu i pożywkę do kokultury na lodzie, gdy nie są używane, i zawsze umieszczaj przygotowany roztwór kolagenu na lodzie.
    2. Usuń pożywkę z szalek Petriego zawierających rusztowania astrocytarne za pomocą mikropipety, pozostawiając trochę pożywki po bokach szalki, aby stworzyć zlewozmywak wilgoci, który zapewni nawodnienie mikrokolumn. Umieść naczynie pod stereoskopem, aby pomóc w wizualizacji.
    3. Za pomocą mikropipety weź 2-3 μl roztworu kolagenu i rozprowadź na każdy koniec mikrokolumn, używając stereoskopu do wizualnej orientacji. Upewnij się, że naczynie ma wystarczającą ilość mediów po bokach, aby działały jak zlew wilgoci wokół krawędzi naczynia. Inkubować szalki Petriego z mikrokolumnami przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w nawilżonym inkubatorze, aby przyspieszyć żelowanie nowo dodanego kolagenu.
    4. Powoli dodać 3 lub 6 ml pożywek do współhodowli (odpowiednio dla szalek Petriego o średnicy 35 lub 60 mm) do szalek Petriego za pomocą pipety i hodować szalki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 oC i 5% CO2 .

4. Ekstrakcja wiązek astrocytarnych z wnętrza hydrożelu

  1. Sterylizuj szklane szkiełka nakrywkowe w autoklawie. Przygotować roztwór poli-L-lizyny (PLL) o stężeniu 20 μg/ml w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych.
  2. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego ręcznie przenieś wysterylizowane szklane szkiełka nakrywkowe na sterylną szalkę Petriego o średnicy 10 cm i dodaj wystarczającą ilość roztworu PLL, aby przykryć szkiełka nakrywkowe.
  3. Inkubować szkiełka nakrywkowe, pokryte roztworem PLL, przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu pokrycia powierzchni. Roztwór PLL usunąć pipetą Pasteura po 30 minutach. Spłucz trzy razy, dodając do szkiełka nakrywkowego wodę z kultur komórkowych i usuwając ją pipetą Pasteura.
  4. Po utworzeniu wyrównanego pęczka glejowego delikatnie przenieś mikrokolumnę na sterylną szalkę Petriego za pomocą sterylnych drobnych kleszczyków i dodaj małą pulę 10 μl pożywki do kohodowli za pomocą mikropipety, aby zapobiec odwodnieniu i zapewnić zdrowie wiązki. Wyodrębnij wiązkę astrocytarną z mikrokolumny hydrożelowej, delikatnie pociągając z jednego końca sterylnymi kleszczami chirurgicznymi, używając stereoskopu do wskazówek wizualnych.
  5. Trzymając wiązkę astrocytarną za pomocą kleszczy, zamontuj ją na szkiełku nakrywkowym pokrytym PLL. Napraw i poplam zgodnie z poniższym protokołem.

5. Immunocytochemia do badań in vitro

UWAGA: W tym badaniu, głównymi przeciwciałami były królicze antyglejowe kwaśne białko fibrylarne (GFAP) (1:500), mysie anty-β-tubulina III (1:500), króliczy anty-kolagen I (1:500), mysia anty-nestyna (1:200) i królicza anty-wimentyna (1:100). Drugorzędowymi przeciwciałami były przeciwciała przeciwko osłom 568, przeciwko ośłowi przeciwko królikowi 568, przeciwko ośłowi 488 i przeciwko osłom 568 (1:500 dla wszystkich). We wszystkich przypadkach dodaj wystarczającą objętość każdego roztworu, aby całkowicie pokryć mikrokolumny.

  1. Przygotować 4% objętościowo-objętościowy (v/v) roztwór formaldehydu w 1x DPBS w dygestoriach chemicznych.
    UWAGA: formaldehyd jest związkiem toksycznym, o którym wiadomo, że jest rakotwórczy i należy go wyrzucić do osobnego pojemnika. Zawsze manipuluj tym związkiem wewnątrz okapu chemicznego i używaj środków ochrony osobistej (PPE), takich jak fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice.
  2. W przypadku mikrokolumn należy odrzucić pożywki hodowlane z szalek Petriego zawierających konstrukty za pomocą pipety Pasteura, nie odsysając przypadkowo cylindrów hydrożelowych. Dodać wystarczającą ilość roztworu formaldehydu, aby pokryć mikrokolumny lub zamontowane szkiełka nakrywkowe (które pozostają na szalkach Petriego) i inkubować przez 35 minut w temperaturze 18-24 °C.
  3. Ekstrahować 4,0% roztwór formaldehydu ze stałych mikrokolumn lub szkiełek nakrywkowych za pomocą pipety serologicznej. Przepłukać zamocowane mikrokolumny trzykrotnie PBS, szybko dodając i usuwając PBS dwukrotnie, a następnie pozostawiając je do namoczenia przez 10 minut po raz trzeci.
  4. Rozpuść normalną surowicę końską (NHS) w PBS o stężeniu 4% v/v. Przygotuj roztwór z niejonowym detergentem o stężeniu 0,3% v/v, używając roztworu NHS jako rozpuszczalnika.
  5. Usunąć PBS z szalek Petriego zawierających mikrokolumny lub szkiełka nakrywkowe za pomocą pipety. Dodać wystarczającą ilość 0,3% roztworu detergentu, aby pokryć mikrokolumny/szkiełka nakrywkowe przez 60 minut w temperaturze 18-24 °C, aby przepuszczalność komórek.
  6. Wyjmij roztwór detergentu i szybko spłucz dwa razy PBS i trzy razy mocząc przez 5 minut. Oblicz wymaganą objętość 4% NHS i każdego z przeciwciał pierwotnych, aby przygotować roztwór o pożądanym stężeniu przeciwciał.
  7. Usunąć PBS z szalek Petriego i dodać wystarczającą ilość roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego w 4% NHS-DPBS), aby pokryć mikrokolumny lub wyekstrahowane wiązki astrocytów. Inkubować przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 4 °C.
  8. Wyjmij roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i szybko spłucz dwa razy PBS i trzy razy mocząc przez 5 minut każdy. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych, w ciemności, z każdym przeciwciałem obecnym w rozcieńczeniu 1:500 w 4,0% roztworze NHS.
  9. Inkubować komórki z roztworem przeciwciała drugorzędowego przez 2 godziny w temperaturze 18–24 °C. Przez cały czas inkubacji przykrywać szalki Petriego zawierające mikrokolumny folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.
  10. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała i dodać roztwór Hoechsta (1:10 000) na 10 minut w temperaturze 18-24 °C w celu wybarwienia jąder.
    UWAGA: Hoechst jest znanym mutagenem, który powinien być traktowany jako czynnik rakotwórczy. Dlatego należy go wyrzucić do osobnego pojemnika, a podczas obchodzenia się z tym środkiem należy zawsze używać środków ochrony osobistej.
  11. Płukać PBS pięć razy, za każdym razem przez 5-10 minut. Następnie zabarwione mikrokolumny przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS i przykryć folią aluminiową. W przypadku zamontowanych wiązek astrocytów, dodaj kroplę wodnego podłoża montażowego do wiązki, umieść kolejne szklane szkiełko nakrywkowe na stałym pęczku i uszczelnij oba szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci w celu długotrwałego przechowywania i późniejszego obrazowania.

6. Test żywotności z barwieniem żywych żywych zwierząt (Calcein-AM/ethidium Homodimer)

  1. Przygotować roztwór odczynnika, dodając 5 μl kalceiny AM (4 mM w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO)) i 20 μl homodimeru etydyny-1 (EthD-1) (2 mM w DMSO/H2O 1:4 v/v) do 10 ml 1x DPBS. Przykryj roztwór folią aluminiową lub przechowuj w ciemności, aby chronić go przed światłem.
  2. Odessać pożywkę z płytki Petriego zawierającej posiane mikrokolumny za pomocą pipety Pasteura i dodać tyle roztworu (przygotowanego powyżej), aby pokryć konstrukcje. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , przykrywając szalkę Petriego w celu ochrony roztworu przed światłem.
  3. Usunąć roztwór za pomocą mikropipety lub pipety Pasteura. Spłucz 2-3 razy DPBS, jak wyjaśniono w kroku 5.3. Zalej szalki Petriego DPBS w zależności od wielkości naczynia. Zobrazuj komórki bezpośrednio po tym za pomocą epifluorescencji lub obrazowania konfokalnego.
    UWAGA: Konwersja przepuszczalnej przez błonę kalceiny AM do kalceiny przez metabolicznie aktywne komórki daje zieloną fluorescencję kalceiny. Martwe komórki są oznaczane jako komórki z naruszoną błoną, które umożliwiają wejście EthD-1 do komórki i wiązanie się z kwasami nukleinowymi, powodując czerwoną fluorescencję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Początkowo do monitorowania przebiegu adhezji astrocytów, formowania się pęczków oraz ogólnej stabilności cytoarchitektury w funkcji czasu wykorzystano mikroskopię w kontraście fazowym. 1 h po wysianiu astrocyty znajdowały się w całym świetle mikrokolumn i miały morfologię sferyczną (Rysunek 2A). W 5 h astrocyty zaczęły wydłużać wypustki i kurczyć się, natomiast do 8 h komórki wykazały pełną morfologię z wypustkami i utworzyły struktury przypominające kable, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu z bardziej wspierającym środowiskiem, jakim jest PNS, OUN jest szczególnie ograniczony w radzeniu sobie ze szkodliwymi konsekwencjami neurourazów i neurodegeneracji. Po poważnym uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego ssaków powstaje blizna glejowa, składająca się z rdzenia komórek zwłóknieniowych i zapalnych otoczonych gęstą siatką zdezorganizowanych reaktywnych astrocytów, które wydzielają proteoglikany hamujące wzrost aksonów14. Blizna ta działa jako fizyczna i biochemiczna przesz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [Therapeutic Pipeline Program #9998 (Cullen)], Penn Medicine Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation [Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna)], Departament ds. Weteranów [RR&D Merit Review #B1097-I (Cullen)], oraz U.S. Army Medical Research and Materiel Command [#W81XWH-13-207004 (Cullen) i W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła do akupunktury (300 &mikro; m średnicy)Lhasa MedicalHS.30x40Średnica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru światła mikrokolumny.
szalka PetriegoFisher08772B
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Invitrogen14200075
Polistyrenowa jednorazowa pipeta serologicznaFisher13-678-11D
AgarozaSigmaA9539-50G
Szklana rurka kapilarna z mikrolitrami (701 i mikro; m)Fisher21-170JŚrednica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru powłoki mikrokolumny.
Dozownik do żarówek MicrocapFisher21-170JŻarówka jest dostarczana z rurkami microcap.
Płyta grzejnaFisherSP88857200
Listwa magnetycznaFisher1451352
MikropipetaSigmaZ683884-1EA
Igła o rozmiarze 25 mmFisher14-826-49
MikroskalpelRoboz ChirurgiczneRS-6270
NożyczkiNarzędzia do nauki14081-09
KleszczeWorld Precision Instruments501985
Sterylizator gorących koralikówSigmaZ378550-1EA
StereoskopNikonSMZ800N
MikroszpatułkaFisherS50821
Ogon szczura typu Ikolagen Corning354236Utrzymuj na poziomie 4 º C i usuwaj tylko wtedy, gdy jest to potrzebne. Używaj lodu, aby utrzymać jego temperaturę podczas użytkowania.
Probówka do mikrowirówekFisher02-681-256
Wodorotlenek sodu (NaOH)FisherSS2661
Kwas solny (HCl)FisherSA48-1
Papierek lakmusowyFisher09-876-18
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)Invitrogen14170112Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
0,25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Bydlęca deoksyrybonukleaza trzustkowa (Dnaza) ISigma10104159001Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z mieszanką składników odżywczych F-12 szynkiGibco11330-032Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11195Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Dzień po urodzeniu 0 lub dzień 1 Szczenięta szczura Sprague DawleyCharles RiverSzczep 001
Neurobazalny neuron embrionalny podłożepodstawowe Invitrogen21103049Sklep pod adresem 4º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
B-27 surowica bez suplementuInvitrogen12587010Sklep pod adresem -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
L-glutaminaInvitrogen35050061Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Suplement astrocytowy G5Invitrogen17503012
Sprague Dawley dzień zarodka 18 szczuryCharles RiverStrain 001
Pipeta PasteuraFisher22-042816
Probówka wirówkowa 15 mlEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
WirówkaFisher05-413-115
HemocytometrFisher02-671-6
InkubatorFisher13 998 076
Formaldehyd 40%FisherF77P-4Formaldehyd jest toksycznym związkiem, o którym wiadomo, że jest rakotwórczy i należy go wyrzucić do osobnego pojemnika.
Szkiełko nakrywkoweFisher12-548-5M
Lakier do paznokciMikroskopia elektronowa Sciences (EMS)72180
Fluoromont medium montażoweSouthern Biotech0100-01
Poly-L-lizynaSigmaP4707
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Normalna surowica koniaGibco16050-122
Królicze przeciwciało pierwotne przeciwko glejowemu kwasowemu białku fibrylarnemu (GFAP)MilliporeAB5804Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-beta-tubuliny IIISigmaT8578Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Przeciwciało pierwotne przeciwko kolagenowi króliczemu Abcamab34710Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Królik anty-vimentinMilliporeAB3400Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Mysz anty-nestinMilliporeAB5326Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom osła 568InvitrogenA10037Przechowywać w 4ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi 568InvitrogenA10042Przechowywać w 4ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi 488InvitrogenA21206Przechowywać w 4ºC.
Hoechst 33342, TrihydrochlorideInvitrogenH3570Przechowywać w 4ºC. Hoechst jest znanym mutagenem, który powinien być traktowany jako czynnik rakotwórczy. Dlatego należy go wyrzucić do osobnego pojemnika.
Calcein AMSigmaC13594 mM w bezwodnym DMSO
Ethidium homodimer-1Life TechnologiesE11692 mM w DMSO/H2O 1:4 (v / v)
Dimetylosulfotlan (DMSO)Sigma276855
A1RSI Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyNikonSłuży do wykonywania konfokalnych rekonstrukcji znakowanych immunologicznie.
Mikroskop Eclipse Ti-SNikonSłuży do wykonywania zdjęć z kontrastem fazowym. Z cyfrową akwizycją obrazu za pomocą aparatu QiClick połączonego z oprogramowaniem Nikon Elements Basic Research (4.10.01).

Bibliografia

  1. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  2. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  3. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  4. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  5. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  6. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  7. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  8. Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  9. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  10. Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  11. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
  12. Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
  13. Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79 (2), 77-89 (2010).
  14. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146-156 (2004).
  15. Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22 (2), 68-76 (2013).
  16. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  17. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  18. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  19. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  20. Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58 (4), 423-433 (2010).
  21. Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7 (1), 66-72 (2014).
  22. Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 306-316 (2011).
  23. Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
  24. Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22 (12), 2187-2201 (2013).
  25. Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  26. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  27. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  28. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  29. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  30. Morrison, B. I. III, Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  31. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  32. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  33. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  34. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).
  35. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  36. Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20 (4), 327-348 (2010).
  37. Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67 (2), 213-223 (2010).
  38. Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127 (2), 393-402 (2000).
  39. Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27 (11), 655-661 (2004).
  40. Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21 (11), 1534-1550 (2011).
  41. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487 (4), 407-427 (2005).
  42. Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
  43. Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164 (1-2), 61-68 (1979).
  44. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  45. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32 (22), 7477-7492 (2012).
  46. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  47. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  48. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  49. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  50. Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2 (2), 93-103 (2006).
  51. Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
  52. Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28 (36), 5498-5508 (2007).
  53. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  54. Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32 (510), 1220-1229 (2014).
  55. Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50 (3), 187-197 (2005).
  56. Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101 (3), 794-805 (2007).
  57. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  58. Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22 (10), 1077-1084 (2001).
  59. Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213 (2), 281-292 (2008).
  60. Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33 (3), 376-382 (2005).
  61. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  62. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2016).
  63. McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  64. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  65. Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274 (1), 79-86 (1983).
  66. Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (11), 7205-7209 (1981).
  67. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  68. Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9 (7), 7200-7208 (2013).
  69. Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11 (9), 1611-1617 (2005).
  70. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  71. Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70 (12), 826-841 (2010).
  72. Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443 (3), 237-249 (2002).
  73. Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11 (1), 17-24 (2014).
  74. Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
  75. Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2 (1), 56-67 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rusztowania inżynierii tkankowejmikokolumna hydrożelowasamozorganizacja astrocytówpowlekanie kolagenemobrazowanie konfokalneekspresja GFAPwzrost neurytówregeneracja OUNżywe rusztowania
Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.