Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Podsumowanie

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Streszczenie

Neurotrauma i choroby neurodegeneracyjne często skutkują trwałymi deficytami neurologicznymi z powodu ograniczonej zdolności ośrodkowego układu nerwowego (OUN) do zastępowania utraconych neuronów i regeneracji ścieżek aksonalnych. Jednak podczas rozwoju układu nerwowego migracja neuronów i wydłużenie aksonów często zachodzą wzdłuż ścieżek utworzonych przez inne komórki, zwanych "żywymi rusztowaniami". Dążąc do naśladowania tych mechanizmów i zaprojektowania strategii, która omija hamujące środowisko OUN, manuskrypt ten przedstawia protokół wytwarzania "żywych rusztowań" opartych na astrocytach inżynierii tkankowej. Aby stworzyć te konstrukty, zastosowaliśmy nowatorski schemat otaczania biomateriałów, aby skłonić astrocyty do samoorganizacji w gęste, trójwymiarowe wiązki dwubiegunowych, podłużnie wyrównanych somatów i procesów. Najpierw zmontowano puste w środku mikrokolumny hydrożelowe, a wewnętrzne światło pokryto kolagenową matrycą zewnątrzkomórkową. Zdysocjowane astrocyty kory mózgowej zostały następnie dostarczone do światła cylindrycznej mikrokolumny i przy krytycznej średnicy wewnętrznej <350 μm spontanicznie samoczynnie wyrównały się i skurczyły, tworząc długie przypominające włókna, składające się z gęstych wiązek wyrostków astrocytów i włókien kolagenowych o średnicy <150 μm, ale rozciągających się na kilka cm długości. Te zmodyfikowane żywe rusztowania wykazywały >97% żywotności komórek i składały się praktycznie wyłącznie z astrocytów wyrażających kombinację pośrednich białek włókien: kwaśnego białka glejowo-fibrylarnego (GFAP), wimentyny i nestyny. Stwierdzono, że te wyrównane sieci astrocytów zapewniają permisywny substrat dla przyczepiania neuronów i wyrównanego wydłużania neurytów. Co więcej, konstrukty te zachowują integralność i wyrównanie po wyekstrahowaniu z hydrożelowej obudowy, dzięki czemu nadają się do implantacji OUN. Te wstępnie uformowane konstrukty strukturalnie naśladują kluczowe elementy cytoarchitektoniczne naturalnie występujących "żywych rusztowań" glejowych in vivo. W związku z tym te zmodyfikowane żywe rusztowania mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych in vitro lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych po zwyrodnieniu OUN in vivo.

Wprowadzenie

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) ma ograniczoną zdolność do przeciwdziałania utracie i/lub dysfunkcji neuronów i ścieżek aksonalnych, które towarzyszą stanom takim jak urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), udar, uraz rdzenia kręgowego (SCI) i choroba neurodegeneracyjna^1,2,3,4,5. Neurogeneza w OUN jest ograniczona do ograniczonej liczby obszarów w mózgu, co utrudnia odbudowę utraconych neuronów^6,7. Dodatkowo, regeneracja utraconych szlaków aksonalnych w OUN jest niewystarczająca ze względu na brak ukierunkowanego prowadzenia, obecność inhibitorów wzrostu i astroglejozę reaktywną po uszkodzeniu tkanki nerwowej^2,8,9,10. Astrocyty zazwyczaj pełnią różne funkcje we wspomaganiu neuronów w homeostazie jonów, usuwaniu neuroprzekaźników, tworzeniu synaps i sprzężeniu nerwowo-naczyniowym¹¹. Niemniej jednak, nawet po łagodnym uszkodzeniu tkanki nerwowej, astrocyty mogą ulegać zmianom molekularnym, strukturalnym i funkcjonalnym, gdy przechodzą w stan przerostowy¹¹. W odpowiedzi na ciężką neurouraz zmiany te skutkują powstaniem blizny z półcieniem zawierającym migrujące reaktywne astrocyty i rdzeń uszkodzenia, który obejmuje leukocyty, które wyciekły z pękniętej bariery krew-mózg (BBB), mikroglej, oligodendrocyty i fibroblasty^11,12,13. Te reaktywne astrocyty osiągają morfologię nitkowatych, zdezorganizowanych procesów i wykazują zwiększoną ekspresję pośrednich białek filamentowych i proteoglikanów siarczanu chondroityny (CSPG), które utrudniają regenerację neuronów¹². Mimo że blizna glejowa początkowo pomaga przywrócić integralność BBB i uniknąć przenoszenia odpowiedzi zapalnej na otaczającą zdrową tkankę, służy jako fizyczna i biochemiczna bariera przed regeneracją aksonów^12,14,15,16. Na przykład aksony, które napotykają bliznę glejową, mają bulwiaste dystroficzne stożki wzrostu i zahamowany wzrost¹². Co więcej, dezorganizacja procesów astrocytarnych po urazie utrudnia rozbudowę regenerujących się aksonów¹⁷. Wynikiem tych cech hamujących objawia się często trwałe upośledzenie fizyczne i neurologiczne, na które cierpią pacjenci po ciężkich urazach neurologicznych, w tym TBI i SCI.

Niezależnie od zewnętrznych wyzwań stojących przed funkcjonalną regeneracją w OUN, wykazano, że aksony posiadają wewnętrzną zdolność do regeneracji. Na przykład dynamiczna natura dystroficznych stożków wzrostu stykających się z blizną glejową sugeruje, że te zakończenia zachowują swoją zdolność do rozciągania¹². W związku z tym uważa się, że główną przeszkodą w ponownym wzroście aksonów jest hamujące środowisko ośrodkowego układu nerwowego po urazie i że korzystne byłoby zapewnienie bardziej permisywnego środowiska poprzez zmniejszenie bliznowacenia glejowego i/lub zapewnienie mostów regeneracyjnych w poprzek blizny. Rzeczywiście, wcześniejsze badania wykazały, że neurony OUN były zdolne do wydłużania aksonów przez zmianę przy użyciu przeszczepów nerwów obwodowych jako mostów, które stanowią bardziej korzystne środowisko do regeneracji aksonów^12,18,19. Podjęto kilka innych strategii w celu wykorzystania tej szczątkowej zdolności regeneracyjnej. Na przykład manipulacja szlakami sygnalizacyjnymi wzrostu komórek w różnych modelach uszkodzeń doprowadziła do regeneracji aksonów i redukcji blizn glejowych^10,20,21. Ponadto badania wykazały, że leczenie chondroitynazą ABC, która rozszczepia większość łańcuchów cukrowych w CSPG, zmniejsza hamujące działanie CSPG wydzielanych przez reaktywne astrocyty²². Pomimo zachęcających wyników, podejścia te nie zapewniają ukierunkowanego kierowania stożkami wzrostu, co może potencjalnie skutkować nieprawidłową regeneracją¹², a także nie uwzględnia utraty neuronów. Podejścia oparte na komórkach zostały wykorzystane w próbach przezwyciężenia skutków blizny glejowej i uzupełnienia utraconych komórek, zwłaszcza neuronów. Niektóre grupy zdedyferencyfikowały reaktywne astrocyty do neuronów, podczas gdy inne przeszczepiły neuronalne komórki progenitorowe do zmian w OUN, aby ponownie zasiedlić obszar uszkodzenia i promować regenerację aksonów^23,24,25. Jednak sam przeszczep komórek macierzystych jest ograniczony przez niskie wskaźniki przeżycia, słabą integrację i skromną retencję w uszkodzonej tkance⁵. Co więcej, te strategie oparte na komórkach nie są w stanie przywrócić dalekosiężnych dróg aksonalnych, zwłaszcza w kontrolowany sposób. W związku z tym badane są biomateriały w połączeniu z innymi podejściami jako nośniki dostarczania różnych komórek nerwowych i progenitorowych oraz czynników wzrostu²⁶. Podejścia oparte na biomateriałach charakteryzują się wysokim stopniem kontroli projektowania w celu wytworzenia konstruktów, które naśladują specyficzne fizyczne, haptotaksyjne i chemotaksyjne sygnały obecne w trójwymiarowym (3D) mikrośrodowisku docelowej tkanki gospodarza^{27,28,29,30,31,32,33,34}. Rozmnażanie tych sygnałów środowiskowych jest niezbędne, aby przeszczepione komórki miały natywną morfologię, proliferację, migrację i sygnalizację, a także inne cechy neurobiologiczne²⁹. Pomimo tych korzystnych właściwości, konieczne jest wyjście poza tradycyjne rusztowania biomateriałowe z nasionami komórek, aby jednocześnie promować ukierunkowaną regenerację aksonów na duże odległości i zastępować utracone neurony.

Obiecujące alternatywne podejście opiera się na "żywych rusztowaniach" inżynierii tkankowej, które różnią się od innych podejść opartych na komórkach ze względu na obecność żywych komórek nerwowych z uformowaną cytoarchitekturą, która naśladuje natywną neuroanatomię i/lub mechanizmy rozwojowe, aby ułatwić ukierunkowaną wymianę, rekonstrukcję i regenerację obwodów neuronowych^4,35. Rozważania przy projektowaniu żywych rusztowań obejmują fenotypy i źródła komórek nerwowych, a także właściwości mechaniczne/fizyczne i sygnały biochemiczne dyktowane przez skład wszelkich towarzyszących biomateriałów³⁵. Po wytworzeniu in vitro, te żywe rusztowania mogą być wszczepione in vivo, aby przedstawić cząsteczki adhezyjne komórek oraz sygnały chemotaktyczne i neurotroficzne, aby aktywnie regulować migrację komórek nerwowych i wzrost aksonów w zależności od stanu i postępu procesów regeneracyjnych³⁵. Komórki glejowe mogą służyć jako podstawa dla zmodyfikowanej cytoarchitektury żywych rusztowań, ponieważ komórki te pośredniczą w różnych mechanizmach rozwojowych in vivo. Podczas rozwoju mózgu nowe neurony opierają się na podstawowych procesach rozszerzonych przez glej promieniowy od strefy komorowej w kierunku rozwijającej się płytki korowej jako żywe rusztowania dla ukierunkowanej migracji^36,37. Co więcej, wykazano, że rozszerzające się stożki wzrostu orientują się poprzez wyczuwanie przyciągających i odpychających sygnałów wywoływanych przez komórki glejowe, a tak zwane "pionierskie" aksony są sugerowane, aby docierały do właściwych celów, rozciągając się wzdłuż wstępnie wzorzystych rusztowań glejowych^35,38,39. Tak więc komórki glejowe są niezbędne do prowadzenia pionierskich aksonów, które później służą jako "żywe rusztowania" oparte na aksonach do kierowania projekcją aksonów "podążających". Co więcej, wykazano, że mechanizmy wzrostu za pośrednictwem gleju utrzymują się po urodzeniu, ponieważ neuroblasty podążają za rostralnym strumieniem migracyjnym (RMS), aby przejść ze strefy podkomorowej (SVZ), jednego z niewielu pozostałych obszarów neurogenezy w dorosłym mózgu, do opuszki węchowej (OB)⁴⁰. Te neuroblasty w RMS migrują w rurze glejowej (Rysunek 1A-1), która składa się z podłużnie wyrównanych procesów astrocytowych, poprzez bezpośrednie adhezje komórka-komórka i zlokalizowane rozpuszczalne czynniki^37,41. Wreszcie, podczas gdy uszkodzenie OUN u ssaków powoduje zakłócenie układu procesów astrocytowych, tworząc bliznę glejową, która fizycznie utrudnia regenerację aksonów¹⁷, wiele systemów innych niż ssaki nie ma tworzenia szkodliwej blizny glejowej. Komórki glejowe gatunków innych niż ssaki utrzymują bardziej zorganizowane, wyrównane wzorce, które są używane jako przewodniki po uszkodzonym regionie^17,42,43. Na przykład w modelach SCI u ssaków wykazano, że aksony rosną w ścisłym związku z mostami glejowymi przecinającymi zmianę, co sugeruje ważną rolę zorganizowanych rusztowań glejowych jako substratów ułatwiających regenerację aksonów i regenerację funkcjonalną (Rysunek 1A-2)^42,44,45. Rekapitulacja cech neuroanatomicznych i opisanych powyżej mechanizmów rozwojowych/regeneracyjnych może zaowocować nową klasą zaprojektowanych żywych rusztowań opartych na gleju, które mogą jednocześnie napędzać migrację niedojrzałych neuronów i odnajdywanie ścieżek aksonalnych w środowiskach, które w przeciwnym razie nie byłyby permisywne, potencjalnie łagodząc w ten sposób skutki zwyrodnienia neuronów i dróg aksonowych związanego z uszkodzeniem i chorobą OUN.

Nasza grupa badawcza wcześniej zaprojektowała wiele typów żywych rusztowań do rekonstrukcji i regeneracji dróg aksonalnych w OUN i obwodowym układzie nerwowym (PNS) za pomocą mikrotkanek i mikrotkanek inżynieryjnych sieci neuronowych (mikro-TENNs) i tkankowych przeszczepów nerwowych (TENG), odpowiednio^27,46,47,48. Obie strategie są z natury oparte na biomimikry. Mikro-TENNY to inspirowane anatomią struktury zaprojektowane w celu strukturalnego i funkcjonalnego zastąpienia dróg aksonalnych łączących różne populacje neuronów w mózgu. TENG wykorzystują mechanizm rozwojowy regeneracji aksonów wspomaganej aksonami, czego przykładem jest "podążający" wzrost aksonów wzdłuż "pionierskich" aksonów, aby osiągnąć ukierunkowaną regenerację aksonów gospodarza^35,46,48. Niedawno wykorzystaliśmy wszechstronność techniki żywego rusztowania, wykorzystując podobny schemat obudowy jak mikro-TENN i szukając inspiracji w mechanizmach opartych na gleju obecnych w trakcie rozwoju. W tym miejscu opracowaliśmy konstrukty składające się z wyrównanych wiązek astrocytarnych obejmujących kolagenowe światło mikrokolumny hydrożelowej⁴⁹. Te astrocytyczne żywe rusztowania są opracowywane przez uprzednie wypełnienie zespołu rurki kapilarnej i igły do akupunktury ciekłą agarozą, aby utworzyć pusty cylindryczny hydrożel o średnicy zewnętrznej (OD) i średnicy wewnętrznej (ID) odpowiadającej odpowiednio średnicom rurki i igły. Po żelowaniu agarozy i ekstrakcji mikrokolumny hydrożelowej z rurki kapilarnej, puste wnętrze jest pokryte kolagenem typu I, aby zapewnić środowisko sprzyjające adhezji astrocytów i wyrównanemu tworzeniu pęczka (Rysunek 1B-1). Następnie światło jest obsiewane astrocytami kory mózgowej wyizolowanymi od pourodzeniowych szczeniąt szczurów (Ryc. 1B-2). W przeciwieństwie do dwuwymiarowych (2D) technik wyrównywania, które opierają się na zastosowaniu pól elektrycznych, rowków mikrowzorcowych i wzorców białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), wyrównanie astrocytów w technice żywego rusztowania opiera się na samoorganizacji zgodnie z kontrolowanymi zmiennymi, takimi jak krzywizna podłoża (ID kolumny), gęstość komórek i stężenie kolagenu^50,51,52. Astrocyty kurczą się i przebudowują kolagen oraz uzyskują dwubiegunową, podłużnie wyrównaną morfologię analogiczną do naturalnych rusztowań obserwowanych in vivo (Ryc. 1B-3). Rzeczywiście, aktywnie dążymy do wykorzystania tych przypominających struktur jako fizycznych substratów do ukierunkowanego kierowania migrującymi niedojrzałymi neuronami, a także ułatwiania regeneracji aksonów przez niekorzystne środowisko uszkodzonego OUN, w szczególności blizny glejowej ssaków (Rysunek 1C). W tym artykule przedstawiona zostanie szczegółowa metoda wytwarzania mikrokolumn astrocytowych, obrazy kontrastu fazowego i immunofluorescencji oczekiwanej cytoarchitektury oraz obszerna dyskusja na temat obecnych ograniczeń i przyszłych kierunków tej techniki.

Rysunek 1: Inspiracja, protokół produkcji i proponowane zastosowania dla wyrównanych sieci astrocytowych. (A) Inspiracja neurobiologiczna: (1) Neuroblasty pochodzące z neurogennej strefy podkomorowej (SVZ) wykorzystują podłużnie wyrównaną rurkę glejową w rostralnym strumieniu migracyjnym (RMS) do ukierunkowanej migracji w kierunku opuszki węchowej (OB); (2) Zwierzęta inne niż ssaki, takie jak i ryby, mogą podtrzymać regenerację po uszkodzeniu tkanki nerwowej, częściowo z powodu utworzenia mostu glejowego, który łączy końce zmiany (np. przecięty rdzeń kręgowy) i służy jako rusztowanie do prowadzenia regenerujących się aksonów. (B) Przegląd produkcji: (1) budowa mikronowej, pustej mikrokolumny hydrożelowej ze światłem pokrytym ECM, (2) wysiewanie pierwotnych astrocytów korowych wyizolowanych z postnatalnych młodych szczurów, (3) samoorganizacja podłużnie zorientowanych wiązek w hodowli oraz (4) ekstrakcja wiązki z obudowy biomateriału do przyszłych badań implantacyjnych. (C) Zastosowania in vivo: (1) Te żywe rusztowania mogą służyć jako zmodyfikowane rurki glejowe do ukierunkowanej migracji neuronów z ośrodków neurogennych w celu ponownego zasiedlenia regionów z niedoborem neuronów; (2) Rekapitulacja mechanizmu rozwojowego pionierskiego kierowania aksonami i mechanizmu regeneracyjnego mostków glejowych u zwierząt innych niż ssaki może wyposażyć te rusztowania astrocytarne w zdolność kierowania regeneracją aksonów w nieprzepuszczalnym środowisku blizny glejowej ssaków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Pensylwanii oraz Centrum Medyczne ds. Weteranów Michaela J. Crescenza i przestrzegały wytycznych zawartych w Polityce Publicznej Służby Zdrowia NIH dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (2015).

1. Rozwój mikrokolumn hydrożelu agarozowego

1. Przygotować 3% roztwór agarozy o stężeniu 3% wagowo-objętościowym (w/v), ważąc 3 g agarozy i przenosząc ją do sterylnej zlewki zawierającej 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. Dodaj sterylny pręt magnetyczny do zlewki i umieść go na powierzchni płyty grzejnej/mieszadła. Zlewkę należy przykryć, aby zapobiec odparowaniu jej zawartości w następnym kroku.
2. Podgrzej agarozę i DPBS w temperaturze 100 °C i mieszaj z prędkością 60-120 obr./min. Dostosuj te ustawienia w razie potrzeby i stale monitoruj postęp procesu rozpuszczania, gdy roztwór początkowo zmienia się z nieprzezroczystego na przezroczysty wygląd, który oznacza, że agaroza została całkowicie rozpuszczona.
   Uwaga: Gorąca zlewka i roztwór są gorące!
3. Gdy roztwór agarozy jest podgrzewany i mieszany, wyjmij cztery puste 10-centymetrowe szalki Petriego i dodaj 20 ml DPBS do dwóch z nich. Umieść igły do akupunktury (średnica: 300 μm, długość: 40 mm), szklane mikrolitrowe rurki kapilarne (średnica: 701,04 μm, długość: 65 mm, pojemność: 25,0 μl) oraz dozownik z żarówką wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego. Gdy płynny roztwór agarozy wyklaruje się, należy utrzymywać stałe ogrzewanie w temperaturze około 50 °C i mieszać, aby uniknąć żelowania agarozy.
4. Wprowadź igłę do akupunktury do dolnego otworu dozownika z żarówką. Założyć rurkę kapilarną na igłę wystawioną na zewnątrz. Zabezpiecz rurkę kapilarną, wkładając jej część w gumową część cylindra dozownika bańki.
5. Przenieść 1 ml płynnej agarozy za pomocą mikropipety na powierzchnię pustej szalki Petriego i umieścić jeden koniec rurki kapilarnej pionowo (z włożoną igłą) w kontakcie z agarozą, podczas gdy gumowa nasadka dozownika gruszki jest ściskana do środka. Powoli zwolnij nacisk na nasadkę dozownika żarówki, aby wciągnąć agarozę do rurki kapilarnej.
   UWAGA: Przenoszenie ciekłej agarozy do kapilar musi być wykonane szybko. Jeśli ciekła agaroza zostanie pozostawiona do ostygnięcia na powierzchni szalki Petriego przez wystarczająco długi czas (około 60 s), zaczyna żelować, uniemożliwiając odpowiednie zasysanie agarozy wzdłuż rurki kapilarnej.
6. Umieść każdy zespół bańka-rurka-igła na wolnej szalce Petriego i pozwól, aby żel agarozowy wewnątrz kapilar zestalił się na 5 minut. Ostrożnie wyciągnij rurkę kapilarną rękami z gumowego korka w cylindrze dozownika bańki, pozostawiając igłę i żel agarozowy na miejscu wewnątrz probówki.
7. Ręcznie wyjmij igłę do akupunktury, powoli wyciągając ją z rurki kapilarnej; nowo zestalony cylinder agarozy również wysuwa się z rurki w tej procedurze, nadal otaczając igłę. Delikatnie popchnij mikrokolumnę wzdłuż igły do akupunktury końcówką sterylnych kleszczyków, aby przesunąć ją do końca. Umieść igłę na otwartej szalce Petriego zawierającej DPBS i wepchnij mikrokolumnę do DPBS za pomocą kleszczy.
   UWAGA: Jeśli mikrokolumna agarozy pozostanie w szklanej rurce kapilarnej po wyjęciu igły do akupunktury, powoli wypchnij mikrokolumnę agarozy z rurki kapilarnej za pomocą igły o średnicy 25 mm do naczynia z DPBS.
8. Sterylizuj mikroskalpele lub kleszcze za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami. Przygotuj 4% w/v agarozy, ważąc 4 g agarozy i przenosząc ją do 100 ml DPBS. Podgrzej i wymieszaj, jak wyjaśniono w kroku 1.2, aby uzyskać klarowny 4% płynny roztwór agarozy. Utrzymuj podgrzewanie i mieszanie roztworu w kolejnych krokach.
9. Przenieść szalki Petriego zawierające mikrokolumny do okapu preparacyjnego i przenieść mikrokolumnę za pomocą drobnych kleszczyków na pustą szalkę Petriego. Wykorzystaj stereoskop do wskazówek wizualnych i mikroskalpel, aby przyciąć mikrokolumny na żądaną długość. Przyciąć oba końce, aby utworzyć skośne końce pod kątem 45^o od poziomu, aby ułatwić obsługę mikrokolumn podczas ECM i dodawania komórek.
10. Powtórz poprzedni krok dla trzech kolejnych mikrokolumn na tej samej szalce Petriego i ustaw cztery konstrukcje równolegle z odstępem <3 mm między każdym z cylindrów. Załadować 50 μl 4% roztworu agarozy za pomocą mikropipety i wlać smugę/linię cieczy na układ mikrokolumn, aby połączyć i związać konstrukty w grupy po cztery (zwane dalej "łodziami mikrokolumnowymi"). Unikaj przemieszczania się 4% agarozy na końce mikrokolumn, które mogą zatkać wnętrze, minimalizując odległość między konstrukcjami i szybko dodając agarozę cienką linią.
    UWAGA: Układanie grup czterech mikrokolumn w "łodzie" nie jest wymagane do wytworzenia rusztowań astrocytowych. Niemniej jednak łodzie służą przyspieszeniu procesu produkcji i oferują bezpieczniejszy sposób przenoszenia i obsługi mikrokolumn w późniejszych etapach.
11. Pozwól łodzi z mikrokolumną ostygnąć przez 1-2 minuty, aby umożliwić żelowanie dodanych 4% agarozy. Podnieś łódkę z mikrokolumnami za pomocą drobnych kleszczy, łącząc 4% agarozy, a następnie przenieś mikrokolumny na drugą płytkę Petriego zawierającą DPBS, przygotowaną w kroku 1.1.3. Wyprodukuj więcej łodzi z pozostałymi mikrokolumnami zgodnie z potrzebami.
12. Przenieść szalki Petriego zawierające mikrokolumny i/lub łódeczki do komory bezpieczeństwa biologicznego i sterylizować pod wpływem światła ultrafioletowego (UV) przez 30 minut
    Ostrzeżenie: Nosić odpowiednią ochronę, aby zapobiec ekspozycji na promieniowanie UV.
13. Przechowywać szalki z łódeczkami z mikrokolumnami w DPBS w temperaturze 4 °C, jeżeli dodanie ECM i posiew komórek nie nastąpią bezpośrednio po tym, przez okres do 1 tygodnia. Powtórz kroki produkcji mikrokolumn, jeśli konstrukcje nie są używane w tym czasie.

2. Pierwotna hodowla komórkowa i izolacja

1. Izolacja astrocytów korowych od młodych szczurów
   1. Przygotowując się do kolejnych kroków, dodaj 20 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do czterech 10-centymetrowych szalek Petriego, które posłużą jako zbiorniki dla wypreparowanych tkanek. Trzymaj wszystkie naczynia na lodzie. Sterylizuj czyste nożyczki chirurgiczne, kleszcze, mikroszpatułki i mikroskalpele w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
   2. Rozgrzej 0,25% trypsynę z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,15 mg/ml dezoksyrybonukleazy (DNazy) I w HBSS w temperaturze 37 °C. Ponadto należy podgrzać pożywkę do hodowli astrocytów w temperaturze 37 °C, która składa się ze zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z mieszanką składników odżywczych F-12 szynki i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
   3. Znieczulenie szczeniąt szczurów Sprague-Dawley po urodzeniu 0 lub 1 dnia, wystawiając je na warunki hipotermii, i eutanazję przez dekapitację. Przypnij głowę do etapu za pomocą igły o średnicy 19 mm umieszczonej w pysku przed oczami.
   4. Wykonaj nacięcie skalpelem od środka od tyłu do przodu, od podstawy szyi do tuż za oczami. Wykonaj kolejne nacięcie idąc bocznie od bezpośrednio za oczami w dół, tworząc kształt litery T. Użyj cienkich kleszczy, aby odciągnąć skórę czaszki/czaszkę na bok.
   5. Trzymaj głowę za pysk (skierowaną do góry), umieszczając jeden ząb kleszczy w pysku zwierzęcia, a drugi na zewnętrznej powierzchni. Usuń mózg za pomocą sterylnej mikroszpatułki i umieść go na jednej z szalek Petriego wypełnionych schłodzonym HBSS. Umieść tę szalkę Petriego na lodzie natychmiast po tym i przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest używana.
   6. Umieść blok granitowy przechowywany wcześniej w temperaturze -20 °C poniżej stereoskopu wewnątrz okapu preparacyjnego. Umieść szalkę Petriego z tkanką mózgową na powierzchni bloku granitowego, aby zachować jego niską temperaturę podczas procedury preparacji. Użyj stereoskopu jako wizualnej wskazówki w kolejnych krokach.
   7. Jeśli opuszki węchowe pozostają nienaruszone, usuń je przez cięcie kleszczami lub mikroskalpelami. Ponadto za pomocą mikroskalpela usuń móżdżek i wykonaj nacięcie w linii środkowej oddzielające dwie półkule mózgowe. Przenieś półkule za pomocą kleszczy na szalkę Petriego zawierającą świeży, schłodzony HBSS.
   8. Wypreparuj struktury śródmózgowia od wnętrza półkul za pomocą mikroskalpela, aby uzyskać tylko oddzielone kory. Użyj cienkich kleszczy, aby oderwać opony mózgowe, strukturę przypominającą prześcieradło, od tkanki korowej i przenieść izolowaną korę na nową szalkę Petriego z zimnym HBSS. Użyj mikroskalpela, aby zmielić tkankę, aby w następnym kroku zwiększyć powierzchnię działania trypsyny.
   9. Za pomocą pipety Pasteura przenieś korę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA (8 korek w każdej probówce). Wystawić tkankę korową na działanie trypsyny-EDTA przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
   10. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usunąć trypsynę-EDTA i dodać 400 μl 0,15 mg/ml roztworu DNAzy I do probówki wirówkowej. Mieszaj probówkę lub wir, aż cała tkanka zostanie zdysocjowana i w płynie nie pozostaną żadne kawałki tkanki. Jeśli nie jest możliwe całkowite rozpuszczenie tkanki, usuń pozostałe fragmenty końcówką pipety Pasteura.
   11. Odwirować probówkę zawierającą zdysocjowany roztwór komórek o sile 200 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura, nie naruszając komórek. Dodać 1 ml pożywki do hodowli astrocytów (określonej w kroku 2.1.2) do probówki za pomocą mikropipety i zamieszać w celu ponownego zawieszenia i wytworzenia jednorodnego roztworu.
   12. Przenieść 10 ml pożywki do hodowli astrocytów za pomocą pipety serologicznej do kolby T-75. Dodać 250 μl 1 ml roztworu komórek (przygotowanego w kroku 2.1.11) za pomocą mikropipety do kolby, aby umieścić na kolbie komórki o wartości jednego mózgu młodego. Rozprowadzić rozładowany roztwór komórkowy równomiernie na pożywce hodowlanej i delikatnie poruszyć kolbę, aby jeszcze bardziej ułatwić równomierne rozprowadzenie.
   13. Wyhodować kolby posiane w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po osiągnięciu 24 i 72 godzin w hodowli należy mechanicznie wymieszać kolbę w celu odłączenia nieprzylegających typów komórek, takich jak neurony i oligodendrocyty.
   14. Następnie w każdym z tych punktów czasowych wykonaj zmianę nośnika. Trzymać kolbę pionowo, tak aby pożywka hodowlana leżała na dnie kolby, nie zakrywając przylegających komórek. Odessać pożywkę hodowlaną pipetą Pasteura, dociskając końcówkę pipety do dolnego rogu kolby, aby uniknąć ekstrakcji komórek. Umieścić kolbę w pierwotnym położeniu poziomym i delikatnie dodać 10 ml pożywki astrocytowej na komórki za pomocą pipety serologicznej.
   15. Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze po każdej zmianie pożywki. Po osiągnięciu 90% zbieżności należy ponownie mechanicznie wymieszać kolbę, aby usunąć wszelkie pozostałe nieprzylegające komórki.
   16. Przepasuj astrocyty, wyjmując pożywkę hodowlaną za pomocą próżni i pipety Pasteura. Dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej na przylegające komórki. Delikatnie wymieszać kolbę, aby upewnić się, że trypsyna pokrywa wszystkie komórki, i inkubować kolbę przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   17. Ugasić trypsynę, dodając 1 ml pożywki astrocytów do komórek za pomocą pipety serologicznej. Ekstrahować roztwór komórek z kolby za pomocą pipety serologicznej i przenieść go do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 3 minuty.
   18. Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej i ponownie zawiesić go w 1 ml pożywki do hodowli astrocytów. Poruszyć probówkę, aby upewnić się, że roztwór komórkowy jest jednorodny. Policz liczbę komórek w roztworze za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
       UWAGA: Kolba, która jest w 90% zlewająca, zwykle daje około 3 milionów astrocytów.
   19. Dodać 10 ml pożywki do hodowli astrocytów do kolby T-75. Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:4, przenosząc 250 μl roztworu komórkowego (etap 2.1.18) za pomocą mikropipety do kolby T-75 zawierającej już pożywkę hodowlaną. Delikatnie wymieszać, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek na całej powierzchni kolby.
   20. Powtórz kroki 2.1.16-2.1.19 za każdym razem, gdy zostanie osiągnięta 90% zbieżność w celu przejścia komórek.
2. Izolacja neuronów korowych od płodów szczurów
   1. Postępuj zgodnie z podobnymi przygotowaniami, jak w krokach 2.1.1 i 2.1.2, z wyjątkiem tego, że wstępnie podgrzaną pożywką jest pożywka kohodowlana, składająca się z pożywki neuropodstawowej + 2% suplementu B-27 (dla neuronów) + 1% suplementu bez surowicy G-5 (dla astrocytów) + 0,25% L-glutaminy.
   2. Eutanazja zarodków w ciąży w czasie 18 dnia Sprague-Dawley szczurów z uduszeniem dwutlenkiem węgla i potwierdź śmierć przez ścięcie.
   3. Wyodrębnij płody szczurów i wypreparuj korę mózgową z reszty tkanki mózgowej na szalkach Petriego zawierających HBSS na powierzchni schłodzonego bloku granitowego, używając stereoskopu do wskazówek wizualnych i wysterylizowanych nożyczek, mikroskalpela i kleszczy⁵³. Po kolejnym rozebraniu głów, mózgów, półkul mózgowych i kory mózgowej, przenieś każdą tkankę na nową szalkę Petriego wypełnioną HBSS.
   4. Zmiel tkankę korową na mniejsze fragmenty, aby zwiększyć powierzchnię trypsyny. Przenieść 4-6 kory mózgowej za pomocą pipety Pasteura do probówki z 5 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA i utrzymywać w temperaturze 37 °C w celu dysocjacji tkanki. Po 5-7 minutach ręcznie wymieszaj probówkę, aby wymieszać i zapobiec zbrylaniu się tkanki.
   5. Wyjmij probówkę z 37 °C po 10 minutach. Jak wyjaśniono wcześniej w kroku 2.1, wyekstrahuj trypsynę-EDTA i zastąp ją 1,8 ml roztworu DNAzy o stężeniu 0,15 mg/mL. Następnie wiruj tkankę, aż roztwór stanie się jednorodny, bez fragmentów tkanki unoszących się w płynie.
   6. Odwirować zdysocjowany roztwór tkankowy o stężeniu 200 x g przez 3 minuty. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić w 2 ml pożywki do współhodowli. Policz liczbę komórek w tym roztworze za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Zwykła wydajność wynosi 3,0-5,0 x 10⁶ komórek / półkulę korową.
   7. Przygotować nowy roztwór komórkowy o gęstości 2,0-4,0 x 10⁵ komórek/ml w pożywkach do kohodowli określonych powyżej.

3. Rozwój astrocytowych wewnątrz mikrokolumn

1. Produkcja rdzenia ECM
   UWAGA: ECM musi zostać dodany do wnętrza mikrokolumn hydrożelowych w tym samym dniu, w którym zostanie przeprowadzone wysiewanie komórek.
   1. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego przygotuj 1 mg/ml roztwór kolagenu typu I z ogona szczura w pożywce do kohodowli w sterylnej probówce do mikrowirówki. Probówkę do mikrowirówki z roztworem ECM należy utrzymywać na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest ona używana.
   2. Przenieść 1-2 μl roztworu ECM za pomocą mikropipety na pasek papierka lakmusowego, aby oszacować jego pH. Dodać 1 μl 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) lub kwasu solnego (HCl) za pomocą mikropipety, aby odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć pH roztworu ECM, a następnie pipetować w górę i w dół do homogenizacji. Sprawdź nowe pH za pomocą paska papierka lakmusowego i dodaj więcej kwasu lub zasady, w zależności od potrzeb, aż pH ustabilizuje się w zakresie 7,2-7,4.
   3. Przenieść szalki Petriego z kroku 1.2 do okapu preparacyjnego i przenieść 4-5 mikrokolumn lub łódkę ze sterylnymi drobnymi kleszczami na pustą, sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 lub 60 mm. Korzystając ze stereoskopu jako wskazówki, umieść końcówkę mikropipety o pojemności 10 μl na jednym końcu każdej mikrokolumny i odsysaj, aby opróżnić światło DPBS i pęcherzyki powietrza. Potwierdź brak pęcherzyków powietrza za pomocą stereoskopu, aby upewnić się, że ECM dodany w następnym kroku może swobodnie przepływać przez światło.
   4. Napełnij mikropipetę P10 roztworem ECM, przyłóż końcówkę o pojemności 10 μl do jednego końca mikrokolumn hydrożelowych i dostarcz roztwór wystarczający do wypełnienia światła (około 3-5 μl), obserwując wejście ECM za pomocą stereoskopu. Odpipetować mały zbiornik (2-4 μl) roztworu ECM na obu końcach mikrokolumny.
      UWAGA: Zawsze zarządzaj 4-5 mikrokolumnami lub jedną łodzią na raz, aby zapobiec długotrwałemu wysychaniu konstrukcji, ponieważ może to spowodować zgniecenie struktury mikrokolumny. Całkowicie wysuszone mikrokolumny mocno przylegają do powierzchni szalek Petriego, co uniemożliwia ich wykorzystanie do wysiewu komórek. Nadmierne ilości pożywek do kokultur (jako środek hydratacji) nie mogą być dodawane do mikrokolumn, ponieważ może to spowodować wypływ ECM podczas okresu inkubacji opisanego poniżej.
   5. Odpipetować pożywki do współhodowli w pierścieniu wokół szalki Petriego, aby zapewnić zlewozmywak, aby zapobiec wysychaniu kolumn podczas inkubacji. Inkubować szalkę Petriego zawierającą mikrokolumny zawierające ECM w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 1 godzinę w celu pobudzenia polimeryzacji kolagenu przed dodaniem neuronów i/lub astrocytów.
      UWAGA: ECM powinien tworzyć warstwę pokrywającą wewnętrzną powierzchnię pustego światła, a nie solidny rdzeń ECM obejmujący wnętrze, które można obserwować za pomocą stereoskopu. Jeśli ECM tworzy rdzeń, kontynuuj okres inkubacji, aż pozostanie tylko warstwa. Po utworzeniu tej warstwy roztwór komórek astrocytów może wypełnić wnętrze mikrokolumny na etapach posiewu.
   6. W okresie inkubacji należy przygotować roztwór komórek astrocytów (jak opisano poniżej).
2. Wysiewanie astrocytów i neuronów w mikrokolumnach
   1. Przejść przez platerowane astrocyty (między czwartym a dwunastym pasażem), jak wyjaśniono w krokach 2.1.16-2.1.19. Po zliczeniu liczby komórek w kolbie przygotować roztwór komórek o gęstości 9,0-12,0 x 10⁵ komórek/ml roztwór zawieszony w pożywce do hodowli komórkowych.
   2. Za pomocą stereoskopu umieść końcówkę mikropipety P10 na jednym końcu mikrokolumn i przenieś wystarczającą ilość roztworu komórkowego (~5 μl) do światła, aby całkowicie go wypełnić. Podobnie jak w przypadku ECM, dodaj małe zbiorniki roztworu komórkowego na obu końcach każdej mikrokolumny.
   3. Inkubować posiane mikrokolumny na szalkach Petriego w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 1 godzinę, aby ułatwić przyłączenie astrocytów do ECM. Jeśli neurony nie zostaną dodane do mikrokolumn, przejdź do kroku 3.2.5.
   4. Po początkowym okresie inkubacji dodać 1-2 μl roztworu neuronu korowego otrzymanego w kroku 2.2.7 do obu końców mikrokolumn za pomocą mikropipety, obserwując pod stereoskopem. Upewnij się, że w naczyniach znajduje się wystarczająca ilość pożywki, aby uniknąć wysuszenia, i ponownie inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ , aby umożliwić adhezję neuronów.
      UWAGA: Roztwór neuronu korowego można również dodać 1-2 dni po utworzeniu pęczka Legendy, wykonując krok 3.2.4 po ostrożnym usunięciu pożywki hodowlanej z płytki Petriego za pomocą mikropipety.
   5. Po okresie inkubacji ostrożnie napełnić szalki Petriego zawierające posiane mikrokolumny 3 lub 6 ml pożywki do współhodowli odpowiednio na szalki Petriego o średnicy 35 lub 60 mm. Utrzymuj platerowane mikrokolumny w kulturze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} aby ułatwić samoorganizację wyrównanych wiązek astrocytów, które po 6-10 godzinach powinny utworzyć wiązkę, przypominającą strukturę.
3. Stabilizacja architektury astrocytów
   UWAGA: Po utworzeniu wiązek, około 6-12 godzin hodowli konstruktów, należy wykonać następujące kroki, aby zapobiec zapadnięciu się wyrównanej struktury rusztowań astrocytowych.
   1. W sterylnej probówce do mikrowirówki przygotuj 3 mg/ml roztworu I kolagenu z ogona szczura w pożywce do kohodowli. Dostosować pH roztworu do 7.2-7.4 zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.1.2. Utrzymuj zapas kolagenu i pożywkę do kokultury na lodzie, gdy nie są używane, i zawsze umieszczaj przygotowany roztwór kolagenu na lodzie.
   2. Usuń pożywkę z szalek Petriego zawierających rusztowania astrocytarne za pomocą mikropipety, pozostawiając trochę pożywki po bokach szalki, aby stworzyć zlewozmywak wilgoci, który zapewni nawodnienie mikrokolumn. Umieść naczynie pod stereoskopem, aby pomóc w wizualizacji.
   3. Za pomocą mikropipety weź 2-3 μl roztworu kolagenu i rozprowadź na każdy koniec mikrokolumn, używając stereoskopu do wizualnej orientacji. Upewnij się, że naczynie ma wystarczającą ilość mediów po bokach, aby działały jak zlew wilgoci wokół krawędzi naczynia. Inkubować szalki Petriego z mikrokolumnami przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w nawilżonym inkubatorze, aby przyspieszyć żelowanie nowo dodanego kolagenu.
   4. Powoli dodać 3 lub 6 ml pożywek do współhodowli (odpowiednio dla szalek Petriego o średnicy 35 lub 60 mm) do szalek Petriego za pomocą pipety i hodować szalki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 ^oC i 5% CO₂ .

4. Ekstrakcja wiązek astrocytarnych z wnętrza hydrożelu

1. Sterylizuj szklane szkiełka nakrywkowe w autoklawie. Przygotować roztwór poli-L-lizyny (PLL) o stężeniu 20 μg/ml w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych.
2. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego ręcznie przenieś wysterylizowane szklane szkiełka nakrywkowe na sterylną szalkę Petriego o średnicy 10 cm i dodaj wystarczającą ilość roztworu PLL, aby przykryć szkiełka nakrywkowe.
3. Inkubować szkiełka nakrywkowe, pokryte roztworem PLL, przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu pokrycia powierzchni. Roztwór PLL usunąć pipetą Pasteura po 30 minutach. Spłucz trzy razy, dodając do szkiełka nakrywkowego wodę z kultur komórkowych i usuwając ją pipetą Pasteura.
4. Po utworzeniu wyrównanego pęczka glejowego delikatnie przenieś mikrokolumnę na sterylną szalkę Petriego za pomocą sterylnych drobnych kleszczyków i dodaj małą pulę 10 μl pożywki do kohodowli za pomocą mikropipety, aby zapobiec odwodnieniu i zapewnić zdrowie wiązki. Wyodrębnij wiązkę astrocytarną z mikrokolumny hydrożelowej, delikatnie pociągając z jednego końca sterylnymi kleszczami chirurgicznymi, używając stereoskopu do wskazówek wizualnych.
5. Trzymając wiązkę astrocytarną za pomocą kleszczy, zamontuj ją na szkiełku nakrywkowym pokrytym PLL. Napraw i poplam zgodnie z poniższym protokołem.

5. Immunocytochemia do badań in vitro

UWAGA: W tym badaniu, głównymi przeciwciałami były królicze antyglejowe kwaśne białko fibrylarne (GFAP) (1:500), mysie anty-β-tubulina III (1:500), króliczy anty-kolagen I (1:500), mysia anty-nestyna (1:200) i królicza anty-wimentyna (1:100). Drugorzędowymi przeciwciałami były przeciwciała przeciwko osłom 568, przeciwko ośłowi przeciwko królikowi 568, przeciwko ośłowi 488 i przeciwko osłom 568 (1:500 dla wszystkich). We wszystkich przypadkach dodaj wystarczającą objętość każdego roztworu, aby całkowicie pokryć mikrokolumny.

1. Przygotować 4% objętościowo-objętościowy (v/v) roztwór formaldehydu w 1x DPBS w dygestoriach chemicznych.
   UWAGA: formaldehyd jest związkiem toksycznym, o którym wiadomo, że jest rakotwórczy i należy go wyrzucić do osobnego pojemnika. Zawsze manipuluj tym związkiem wewnątrz okapu chemicznego i używaj środków ochrony osobistej (PPE), takich jak fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice.
2. W przypadku mikrokolumn należy odrzucić pożywki hodowlane z szalek Petriego zawierających konstrukty za pomocą pipety Pasteura, nie odsysając przypadkowo cylindrów hydrożelowych. Dodać wystarczającą ilość roztworu formaldehydu, aby pokryć mikrokolumny lub zamontowane szkiełka nakrywkowe (które pozostają na szalkach Petriego) i inkubować przez 35 minut w temperaturze 18-24 °C.
3. Ekstrahować 4,0% roztwór formaldehydu ze stałych mikrokolumn lub szkiełek nakrywkowych za pomocą pipety serologicznej. Przepłukać zamocowane mikrokolumny trzykrotnie PBS, szybko dodając i usuwając PBS dwukrotnie, a następnie pozostawiając je do namoczenia przez 10 minut po raz trzeci.
4. Rozpuść normalną surowicę końską (NHS) w PBS o stężeniu 4% v/v. Przygotuj roztwór z niejonowym detergentem o stężeniu 0,3% v/v, używając roztworu NHS jako rozpuszczalnika.
5. Usunąć PBS z szalek Petriego zawierających mikrokolumny lub szkiełka nakrywkowe za pomocą pipety. Dodać wystarczającą ilość 0,3% roztworu detergentu, aby pokryć mikrokolumny/szkiełka nakrywkowe przez 60 minut w temperaturze 18-24 °C, aby przepuszczalność komórek.
6. Wyjmij roztwór detergentu i szybko spłucz dwa razy PBS i trzy razy mocząc przez 5 minut. Oblicz wymaganą objętość 4% NHS i każdego z przeciwciał pierwotnych, aby przygotować roztwór o pożądanym stężeniu przeciwciał.
7. Usunąć PBS z szalek Petriego i dodać wystarczającą ilość roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego w 4% NHS-DPBS), aby pokryć mikrokolumny lub wyekstrahowane wiązki astrocytów. Inkubować przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 4 °C.
8. Wyjmij roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i szybko spłucz dwa razy PBS i trzy razy mocząc przez 5 minut każdy. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych, w ciemności, z każdym przeciwciałem obecnym w rozcieńczeniu 1:500 w 4,0% roztworze NHS.
9. Inkubować komórki z roztworem przeciwciała drugorzędowego przez 2 godziny w temperaturze 18–24 °C. Przez cały czas inkubacji przykrywać szalki Petriego zawierające mikrokolumny folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.
10. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała i dodać roztwór Hoechsta (1:10 000) na 10 minut w temperaturze 18-24 °C w celu wybarwienia jąder.
    UWAGA: Hoechst jest znanym mutagenem, który powinien być traktowany jako czynnik rakotwórczy. Dlatego należy go wyrzucić do osobnego pojemnika, a podczas obchodzenia się z tym środkiem należy zawsze używać środków ochrony osobistej.
11. Płukać PBS pięć razy, za każdym razem przez 5-10 minut. Następnie zabarwione mikrokolumny przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS i przykryć folią aluminiową. W przypadku zamontowanych wiązek astrocytów, dodaj kroplę wodnego podłoża montażowego do wiązki, umieść kolejne szklane szkiełko nakrywkowe na stałym pęczku i uszczelnij oba szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci w celu długotrwałego przechowywania i późniejszego obrazowania.

6. Test żywotności z barwieniem żywych żywych zwierząt (Calcein-AM/ethidium Homodimer)

1. Przygotować roztwór odczynnika, dodając 5 μl kalceiny AM (4 mM w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO)) i 20 μl homodimeru etydyny-1 (EthD-1) (2 mM w DMSO/H₂O 1:4 v/v) do 10 ml 1x DPBS. Przykryj roztwór folią aluminiową lub przechowuj w ciemności, aby chronić go przed światłem.
2. Odessać pożywkę z płytki Petriego zawierającej posiane mikrokolumny za pomocą pipety Pasteura i dodać tyle roztworu (przygotowanego powyżej), aby pokryć konstrukcje. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} przykrywając szalkę Petriego w celu ochrony roztworu przed światłem.
3. Usunąć roztwór za pomocą mikropipety lub pipety Pasteura. Spłucz 2-3 razy DPBS, jak wyjaśniono w kroku 5.3. Zalej szalki Petriego DPBS w zależności od wielkości naczynia. Zobrazuj komórki bezpośrednio po tym za pomocą epifluorescencji lub obrazowania konfokalnego.
   UWAGA: Konwersja przepuszczalnej przez błonę kalceiny AM do kalceiny przez metabolicznie aktywne komórki daje zieloną fluorescencję kalceiny. Martwe komórki są oznaczane jako komórki z naruszoną błoną, które umożliwiają wejście EthD-1 do komórki i wiązanie się z kwasami nukleinowymi, powodując czerwoną fluorescencję.

Wyniki

Początkowo mikroskopia z kontrastem fazowym była używana do monitorowania postępu adhezji astrocytów i tworzenia wiązek oraz ogólnej stabilności cytoarchitektury w funkcji czasu. Po 1 godzinie od posiewu w świetle mikrokolumn znaleziono astrocyty o sferycznej morfologii (Rysunek 2A). Po 5 godzinach astrocyty zaczęły wydłużać procesy i kurczyć się, podczas gdy po 8 godzinach komórki wykazywały pełną morfologię zawierającą proces i tworzyły struktury przypominające zorie...

Dyskusja

W porównaniu z bardziej wspierającym środowiskiem, jakim jest PNS, OUN jest szczególnie ograniczony w radzeniu sobie ze szkodliwymi konsekwencjami neurourazów i neurodegeneracji. Po poważnym uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego ssaków powstaje blizna glejowa, składająca się z rdzenia komórek zwłóknieniowych i zapalnych otoczonych gęstą siatką zdezorganizowanych reaktywnych astrocytów, które wydzielają proteoglikany hamujące wzrost aksonów¹⁴. Blizna ta działa jako fizyczna i biochemiczna przesz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła do akupunktury (300 &mikro; m średnicy)	Lhasa Medical	HS.30x40	Średnica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru światła mikrokolumny.
szalka Petriego	Fisher	08772B
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polistyrenowa jednorazowa pipeta serologiczna	Fisher	13-678-11D
Agaroza	Sigma	A9539-50G
Szklana rurka kapilarna z mikrolitrami (701 i mikro; m)	Fisher	21-170J	Średnica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru powłoki mikrokolumny.
Dozownik do żarówek Microcap	Fisher	21-170J	Żarówka jest dostarczana z rurkami microcap.
Płyta grzejna	Fisher	SP88857200
Listwa magnetyczna	Fisher	1451352
Mikropipeta	Sigma	Z683884-1EA
Igła o rozmiarze 25 mm	Fisher	14-826-49
Mikroskalpel	Roboz Chirurgiczne	RS-6270
Nożyczki	Narzędzia do nauki	14081-09
Kleszcze	World Precision Instruments	501985
Sterylizator gorących koralików	Sigma	Z378550-1EA
Stereoskop	Nikon	SMZ800N
Mikroszpatułka	Fisher	S50821
Ogon szczura typu I	kolagen Corning	354236	Utrzymuj na poziomie 4 º C i usuwaj tylko wtedy, gdy jest to potrzebne. Używaj lodu, aby utrzymać jego temperaturę podczas użytkowania.
Probówka do mikrowirówek	Fisher	02-681-256
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Fisher	SS2661
Kwas solny (HCl)	Fisher	SA48-1
Papierek lakmusowy	Fisher	09-876-18
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)	Invitrogen	14170112	Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
0,25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Bydlęca deoksyrybonukleaza trzustkowa (Dnaza) I	Sigma	10104159001	Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z mieszanką składników odżywczych F-12 szynki	Gibco	11330-032	Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Dzień po urodzeniu 0 lub dzień 1 Szczenięta szczura Sprague Dawley	Charles River	Szczep 001
Neurobazalny neuron embrionalny podłoże	podstawowe Invitrogen	21103049	Sklep pod adresem 4º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
B-27 surowica bez suplementu	Invitrogen	12587010	Sklep pod adresem -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
L-glutamina	Invitrogen	35050061	Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Suplement astrocytowy G5	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley dzień zarodka 18 szczury	Charles River	Strain 001
Pipeta Pasteura	Fisher	22-042816
Probówka wirówkowa 15 ml	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Wirówka	Fisher	05-413-115
Hemocytometr	Fisher	02-671-6
Inkubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyd 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyd jest toksycznym związkiem, o którym wiadomo, że jest rakotwórczy i należy go wyrzucić do osobnego pojemnika.
Szkiełko nakrywkowe	Fisher	12-548-5M
Lakier do paznokci	Mikroskopia elektronowa Sciences (EMS)	72180
Fluoromont medium montażowe	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lizyna	Sigma	P4707
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normalna surowica konia	Gibco	16050-122
Królicze przeciwciało pierwotne przeciwko glejowemu kwasowemu białku fibrylarnemu (GFAP)	Millipore	AB5804	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-beta-tubuliny III	Sigma	T8578	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Przeciwciało pierwotne przeciwko kolagenowi króliczemu Abcam		ab34710	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Królik anty-vimentin	Millipore	AB3400	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Mysz anty-nestin	Millipore	AB5326	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom osła 568	Invitrogen	A10037	Przechowywać w 4ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi 568	Invitrogen	A10042	Przechowywać w 4ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi 488	Invitrogen	A21206	Przechowywać w 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Przechowywać w 4ºC. Hoechst jest znanym mutagenem, który powinien być traktowany jako czynnik rakotwórczy. Dlatego należy go wyrzucić do osobnego pojemnika.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM w bezwodnym DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM w DMSO/H2O 1:4 (v / v)
Dimetylosulfotlan (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Nikon		Służy do wykonywania konfokalnych rekonstrukcji znakowanych immunologicznie.
Mikroskop Eclipse Ti-S	Nikon		Służy do wykonywania zdjęć z kontrastem fazowym. Z cyfrową akwizycją obrazu za pomocą aparatu QiClick połączonego z oprogramowaniem Nikon Elements Basic Research (4.10.01).