To badanie przedstawia technikę izolacji neuronów od noworodków myszy WT. Wymaga starannego wypreparowania rdzenia kręgowego od noworodka myszy, a następnie oddzielenia neuronów od tkanki rdzenia kręgowego poprzez mechaniczne i enzymatyczne rozszczepienie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla neuronów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli neuronów rdzenia kręgowego. Neurony są pozyskiwane od noworodków myszy C57BL/6 i izolowane w 1-3 dniu po urodzeniu. Do jednego eksperymentu zbiera się miot myszy, zwykle 4-10 młodych urodzonych z jednej pary hodowlanej, a rdzenie kręgowe pobiera się indywidualnie od każdej myszy po eutanazji izofluranem. Kręgosłup jest wycinany, a następnie rdzeń kręgowy jest uwalniany z kolumny. Rdzenie kręgowe są następnie mielone w celu zwiększenia powierzchni dostarczania enzymatycznej proteazy, która umożliwia uwolnienie neuronów i innych komórek z tkanki. Następnie stosuje się rozcieranie w celu uwolnienia komórek do roztworu. Roztwór ten jest następnie frakcjonowany w gradiencie gęstości w celu oddzielenia różnych komórek w roztworze, co pozwala na wyizolowanie neuronów. Z jednej grupy miotu można wyizolować około 1-2,5 x 106 neuronów. Neurony są następnie wysiewane do studzienek pokrytych czynnikami adhezyjnymi, które pozwalają na prawidłowy wzrost i dojrzewanie. Neurony potrzebują około 7 dni, aby osiągnąć dojrzałość w pożywce wzrostowej i hodowlanej, a następnie mogą być wykorzystane do leczenia i analizy.
Wprowadzenie
Zrozumienie patologii rdzenia kręgowego wymaga użycia różnych modeli, zarówno na poziomie makroskopowym, jak i mikroskopowym. Duże i małe modele zwierzęce1,2,3 są używane do badań in vivo chorób i urazów rdzenia kręgowego. Podczas gdy badanie tych zagadnień in vivo ma swoje zalety, analiza rdzenia kręgowego ogranicza się do homogenatu całego rdzenia kręgowego lub do wycinków tkanek4. Stwarza to pewną niejednoznaczność podczas próby wyizolowania określonych reakcji i celów w rdzeniu kręgowym wśród rezydujących neuronów i otaczającego g....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka i postępowanie z zwierzętami w niniejszej procedurze były prowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Kolorado.
1. Przygotowanie roztworów
- Przygotować i przechowywać wszystkie roztwory w odpowiednich temperaturach, zgodnie z Tabelą 1.
2. Powlekanie dołków i szkiełek
UWAGA: Neurony nie przylegają dobrze do powierzchni plastikowych ani szklanych.
- Na dzień przed izolacją neuronów, pokryj dołki sterylnej 24-dołkowej płytki....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując tę technikę, z jednego miotu (4-10 szczeniąt) można wyizolować od 1 do 2,5 106 neuronów odpowiednich do wysiania na płytki hodowlane. Zazwyczaj 4-8 dołków wysiewa się w stężeniu wspomnianym powyżej (tj. 300 000 komórek/mL). Rycina 3 przedstawia wygląd neuronów przy tym stężeniu po tygodniu hodowli w mikroskopii świetlnej przy małym (a) i dużym (b) powiększeniu. Byliśmy jednak w stanie hodować komó.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Technika ta pozwala na wiarygodną hodowlę neuronów rdzenia kręgowego. Po osiągnięciu biegłości w technice zajmuje to około 3,5 godziny. Udało nam się przeprowadzić izolację neuronów z 2 oddzielnych miotów (łącznie 16 myszy) w ciągu około 4 godzin. Kluczowym krokiem w realizacji tego celu jest możliwość sprawnego wydobycia rdzenia kręgowego od myszy. Wydajność pozwala na posiew kilku dołków i możliwość testowania neuronów w różnych warunkach. Udało nam się leczyć neurony po osiągnięciu dojrzałości i wiarygodnie ocenić eks.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hibernate A Medium - 500 ml | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 ml | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Suplement 50X - 10 ml | Thermo-Fisher | 17504044 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 | |
| Papaina, liofilizowany - 100 mg | Worthington | LS003119 http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html | |
| Neurobasal A Medium - 500 ml | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL) - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mysia Laminina - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Błękit trypanowy - 20 ml | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 ml | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimetylosilan ( DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US Szklana Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Żarówka do pipet - 5 ml | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 BRAND® szalka Petriego, szkło - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterylna 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US Hemacytometr Haussera (szklana komora licząca) | Fischer Scientific | 02-671-6 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 Szkiełka podstawowe - 12 mm sterylne szkło nakrywkowe - niepowlekane | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit - 100 &mikro; L | Abcam | ab177487 | Po utrwaleniu w paraformaldehydzie (PFA) i zablokowaniu 5% BSA, komórki na 12 mm szkiełku nakrywkowym inkubowano w przeciwciałie rozcieńczonym w stosunku 1:200 przez 18 godzin w 4 stopniach; C |
| MAP-2 Mysie przeciwciało monoklonalne - 50 &mikro; L | Abcam | ab11267 | Po utrwaleniu w paraformaldehydzie i zablokowaniu 5% BSA, komórki na 12 mm szkiełku nakrywkowym inkubowano w przeciwciałie rozcieńczonym w stosunku 1:500 przez 18 godzin w 4 &stopniach; Z |
Bibliografia
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
