Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ratowanie i charakterystyka rekombinowanego wirusa z zakaźnego klonu wirusa Zika z Nowego Świata

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55857

⸱

7 czerwca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Division of Vector-Borne Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje odzyskiwanie zakaźnego wirusa Zika z dwuplazmidowego zakaźnego klonu cDNA.

Streszczenie

Zakaźne klony cDNA pozwalają na genetyczne manipulacje wirusa, ułatwiając w ten sposób pracę nad szczepionkami, patogenezą, replikacją, transmisją i ewolucją wirusa. Tutaj opisujemy budowę zakaźnego klonu wirusa Zika (ZIKV), który obecnie powoduje wybuch epidemii w obu Amerykach. Aby zapobiec toksyczności dla bakterii, która jest powszechnie obserwowana w przypadku plazmidów pochodzących z flawiwirusa, stworzyliśmy system dwuplazmidowy, który oddziela genom przy genie NS1 i jest bardziej stabilny niż pełnowymiarowe konstrukty, których nie można było skutecznie odzyskać bez mutacji. Po trawieniu i ligacji w celu połączenia dwóch fragmentów, wirusowy RNA o pełnej długości może zostać wygenerowany przez transkrypcję in vitro polimerazą RNA T7. Po elektroporacji transkrybowanego RNA do komórek odzyskano wirusa, który wykazywał podobną kinetykę wzrostu in vitro oraz fenotypy wirulencji i infekcji in vivo odpowiednio u myszy i komarów.

Wprowadzenie

Wirus Zika (ZIKV; Rodzina Flaviviridae: Rodzaj Flavivirus) to flawiwirus przenoszony przez komary, który przybył do Brazylii w latach 2013-14, a następnie został powiązany z masowym wybuchem choroby gorączkowej, która rozprzestrzeniła się w obu Amerykach1. Ponadto ZIKV wiąże się z ciężkimi skutkami choroby, takimi jak zespół Guillaina-Barrégo u dorosłych i małogłowie u płodów i noworodków2. Niewiele było wiadomo o ZIKV przed jego szybkim rozprzestrzenieniem się na półkuli zachodniej. Obejmowało to brak narzędzi molekularnych, co utrudniało badania mechanistyczne. Narzędzia molekularne do wykrywania wirusów, takie jak zakaźne klony cDNA, ułatwiają opracowywanie szczepionek i terapii przeciwwirusowych oraz pozwalają na ocenę czynników genetycznych wirusa związanych z różnicową patogenezą wirusa, odpowiedzią immunologiczną i ewolucją wirusa.

Zakaźne klony flawiwirusów są znane z tego, że są wysoce niestabilne u bakterii ze względu na tajemnicze prokariotry, obecne w ich genomach3. Zastosowano kilka podejść w celu złagodzenia tego problemu; w tym insercja powtórzeń tandemowych przed sekwencjami wirusa4, mutacja domniemanych sekwencji prokariotycznych prokariotycznych < klasa SUP = "xref">5, podział genomu na wiele plazmidów< klasa SUP = "xref">6, wektory o niskiej liczbie kopii (w tym sztuczne chromosomy bakteryjne)< klasa sup = "xref">7,< klasa sup="xref">8 oraz wprowadzenie intronów do genomu wirusa< klasa sup="xref">9. Dla ZIKV opisano jeden pełnowymiarowy system bez modyfikacji; Jednak ten klon wydawał się być osłabiony w hodowli komórkowej i u myszy10. Inne grupy wprowadziły introny do genomu ZIKV, co pozwoliło na zakłócenie niestabilnych sekwencji u bakterii, które mogą być splecione w komórkach ssaków in vitro w celu wytworzenia zakaźnego wirusa11,12. Dodatkowo, system oparty na PCR o nazwie Infectious-Subgenomic-Amplicons został z powodzeniem wykorzystany do uratowania prototypowego szczepu MR766 ZIKV13. Opisane tutaj podejście nie wymaga obcych sekwencji, ale raczej zaburza genom w regionie wysokiej niestabilności przy użyciu wielu plazmidów, co wcześniej było z powodzeniem stosowane w przypadku żółtej gorączki6, dengue14,15 i wirusy Zachodniego Nilu16. Co więcej, dodanie sekwencji rybozymu wirusa zapalenia wątroby typu D na końcach genomu wirusa ułatwia utworzenie autentycznego końca 3' bez konieczności dodawania miejsca linearyzacji. Dodatkowo, oba plazmidy są zbudowane w wektorze o niskiej liczbie kopii (pACYC177, ~15 kopii na komórkę) w celu złagodzenia wszelkich pozostałości toksyczności17. Wykryty wirus wykazuje profil wzrostu porównywalny z wirusem rodzicielskim w krzywych wzrostu in vitro w 8 liniach komórkowych obejmujących różne typy komórek pochodzących zarówno od ssaków, jak i owadów, i wykazuje identyczne profile chorobotwórcze u myszy oraz wskaźniki infekcji, rozprzestrzeniania się i transmisji u komarów18.

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak hodować zakaźne plazmidy klonów, generować pełnowymiarowe wirusowe RNA (genom wirusa) in vitro i odzyskiwać zakaźnego wirusa w hodowli komórkowej. Po pierwsze, opisujemy namnażanie plazmidów w bakteriach lub amplifikację bez bakterii za pomocą amplifikacji toczącego się koła (RCA). Następnie pokazujemy, w jaki sposób dwa plazmidy są trawione, a następnie ligowane razem, aby wytworzyć wirusa o pełnej długości. Na koniec opisujemy produkcję transkrybowanego RNA i jego późniejszą elektroporację do komórek Vero, a następnie miareczkowanie odzyskanego wirusa (Rysunek 1). Opisane podejście jest szybkie, co pozwala na odtworzenie zapasów zakaźnych wirusów w ciągu 1-2 tygodni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transformacja i odzyskiwanie zakaźnych plazmidów klonów

  1. Przekształć oba plazmidy (oddzielnie) przy użyciu komercyjnego protokołu transformacji (np. NEB 5 Minute Transformation Protocol) z pewnymi modyfikacjami. Oba plazmidy zawierają gen kodujący oporność na ampicylinę, dlatego do selekcji należy użyć ampicyliny lub karbenicyliny. Preferowana jest karbenicylina, ponieważ jest bardziej stabilna.
    1. Wyjmij komórki (patrz tabela materiałów) z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrażaj na lodzie przez 5-10 minut. Wstępnie ciepły bulion lizogeniczny (LB) (zawierający 10 g/l NaCl i 25 μg/ml karbenicyliny; zwany LB-carb) i bulion z represją katabolitu (SOC (bez antybiotyków) - przychodzący z komórkami) w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać od 100 pg-10 ng do 1 μl plazmidowego DNA do probówki zawierającej 50 μl kompetentnych komórek; delikatnie wymieszać, przesuwając probówkę.
    3. Inkubować probówki na lodzie przez 5 minut.
    4. Rurki szoku cieplnego w temperaturze 42 °C przez 30 s w łaźni wodnej. Wróć do lodu na 2 minuty bezpośrednio po szoku cieplnym.
    5. Odpipetować 950 μl SOC o temperaturze pokojowej do każdej probówki i wymieszać pipetując. Rozprowadzić 100 μl mieszaniny bakteryjnej na płytce LB-carb i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (około 12-14 godzin).
  2. Wyjąć płytki z inkubatora w temperaturze 37 °C po 12-14 godzinach inkubacji. Umieść talerze w ciemnej szufladzie w temperaturze pokojowej, aby kolonie mogły dalej rosnąć (około 8-9 godzin).
  3. Używając 5 ml bulionu Terrific (TB, zawierającego 25 μg/ml karbenicyliny, zwanego TB-carb), hoduj 5-10 małych kolonii na każdy plazmid przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce bakteryjnej (około 14-16 godzin).
    UWAGA: Małe kolonie są wskaźnikiem, że plazmid jest nienaruszony; Kolonie z plazmidami zawierającymi delecje, rearanżacje lub mutacje (zwane tutaj zdarzeniami niestabilności) będą rosły szybciej, a tym samym będą większe. Dlatego należy starać się wybierać najmniejsze rodziny na talerzu, a konkretnie nie wybierać największych obecnych kolonii. Niektóre kolonie średniej wielkości mogą być również wybierane pod kątem kompletności. Zastosowana niższa temperatura zmniejsza prawdopodobieństwo przerostu komórek (OD600 powyżej 0,6-0,8). Ponieważ większość badaczy wykonuje wzrost z dnia na dzień, pozwala to na większą kontrolę i zmniejsza ryzyko przerostu.
  4. Sprawdź płynne kultury pod kątem zmętnienia (okołoOD 600 0,6-0,8). Umieść wszystkie mętne rurki w temperaturze 4 °C i pozwól, aby inne rurki stały się mętne poprzez dłuższy wzrost.
    UWAGA: Nie hoduj bakterii do wartości OD600 większych niż zalecane, ponieważ mogą wystąpić przypadki niestabilności plazmidu.
  5. Wyodrębnij plazmidowe DNA z bakterii za pomocą komercyjnego zestawu do miniprzygotowania plazmidu (patrz tabela materiałów). Eluować w 15 μl wstępnie podgrzanego (do temperatury 70 °C w bloku grzewczym) buforu elucyjnego. Pozostawić bufor elucyjny do inkubacji na kolumnie przez 5 minut przed odwirowaniem.
    UWAGA: Zachowaj co najmniej 1 ml tej kultury starterowej w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania w następnym kroku.
  6. Strawić 10 μl odzyskanych plazmidów, aby ocenić, czy podczas hodowli wystąpiły zdarzenia niestabilności plazmidu.
    UWAGA: Trawić p1 z SalI/NheI i p2 z BamHI/HindIII w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Potwierdź obecność prawidłowych prążków po trawieniu (Rysunek 2a) za pomocą elektroforezy żelowej i przejdź do kroku 2. Jeśli przygotowujesz plazmidowe DNA przez amplifikację toczącego się koła (RCA), zachowaj część eluatu miniprepu, aby służyła jako matryca.

2. Przygotowanie wystarczającej ilości plazmidowego DNA do ligacji

UWAGA: Podwiązanie i późniejsza elektroporacja wymaga wystarczającej ilości plazmidowego DNA, które musi być wygenerowane za pomocą maxiprep lub RCA. Podczas gdy maxiprep jest tradycyjnie stosowanym podejściem, RCA ma tę zaletę, że nie wymaga bakterii, eliminując w ten sposób potencjalną toksyczność wywołaną plazmidem u bakterii, która może prowadzić do zdarzeń niestabilności.

  1. Wykonaj następującą procedurę maxiprep.
    1. Dla każdego plazmidu, który wykazał prawidłowy wzorzec trawienia enzymem restrykcyjnym w poprzedniej sekcji, dodaj 500 μl kultury starterowej do 1 l bulionu TB-Carb (25 μg/ml karbenicyliny) i wstrząsaj przez noc w temperaturze 30 °C (około 14-16 godzin, okołoOD 600 0,6-0,8).
      UWAGA: Nie pozwól, aby kultura urosła powyżej tej wartości OD600. Spowoduje to potencjalnie zdarzenia niestabilności w plazmidach.
    2. Zbierz bakterie i wykonaj maxipreps zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
  2. Korzystając z zapisanego narzędzia miniprep z kroku 1.6, wykonaj następujące czynności dla procedury RCA.
    1. Przenieść 1 μl plazmidowego DNA do probówki zawierającej 50 μl buforu do próbki.
    2. Próbkę poddać denaturacji termicznej w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C aż do momentu, gdy będzie gotowa do użycia.
    3. Przygotuj komercyjny premiks amplifikacyjny (patrz tabela materiałów). Połączyć 50 μl buforu reakcyjnego z 2 μl mieszaniny enzymów w probówce umieszczonej na lodzie.
      UWAGA: Premiks amplifikacyjny należy przechowywać na lodzie do czasu, aż będzie gotowy do użycia. Wygodne jest przygotowanie mieszanki wzorcowej poprzez połączenie wystarczającej ilości odczynników do wymaganej liczby reakcji amplifikacji. Wszelkie niewykorzystane resztki premiksu należy wyrzucić.
    4. Przenieść 50 μl przygotowanego premiksu amplifikacyjnego do denaturowanej próbki.
    5. Inkubować probówki reakcyjne w temperaturze 30 °C przez 18 godzin.
    6. Inkubować probówki w temperaturze 65 °C przez 10 minut w celu inaktywacji polimerazy DNA ø29.
    7. Probówki reakcyjne należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
      UWAGA: W tym momencie plazmidowe DNA przygotowane obiema metodami powinno zostać określone ilościowo (przy użyciu absorbancji przy 260 nm), a genom ZIKV powinien zostać całkowicie zsekwencjonowany metodą Sangera, aby potwierdzić, że podczas przygotowania nie wystąpiły żadne zdarzenia niestabilności (delecje i rearanżacje).
powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
Nazwa podkładuSekwencja (5' - 3')
ZIKV PRVABC59 1Dla.AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC
ZIKV Zachowany 632Dla.GCCCTATGCTGGATGAGG powiedział:
Konserwowany ZIKV 692Rev.GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG powiedział:
ZIKV Zachowany 1313Rev.CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA powiedział:
ZIKV Zachowany 1201Dla.CCAACACAAGGTGAAGCCTAC
ZIKV Zachowany w 1663 r.GCAGACACCGGAACTCCACACT
ZIKV Konserwowany 2008Dla.CAGATGGCGGTGGACATGC powiedział:
ZIKV Zachowany 2350Rev.GTGAGAACCAGAGGACATTCCTCC
ZIKV Konserwowany 2605Dla.TACAAGTACCATCCTGACTCCC
Konserwowany ZIKV 3499Rev.GCCTTATCTCCATTCCATACCA powiedział:
Zachowany ZIKV 3961Rev.TTGCCAACCAGGCCAAAG
ZIKV Konserwowany 4132Dla.CATTTGTCATGGCCCTGG
ZIKV Zachowany 4561Rev.CTATTGGGTTCATGCCACAGAT powiedział:
ZIKV Zachowany 4665Dla.GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT
Zachowany ZIKV 5189Rev.AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG
ZIKV Konserwowany 5219Dla.GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA
Konserwowany ZIKV 6086Rev.CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC powiedział:
ZIKV Konserwowany 6119Dla.GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG
Konserwowany ZIKV 6721Rev.CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC
ZIKV Konserwowany 6769Dla.CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC
Konserwowany ZIKV 7209Rev.ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA
ZIKV Konserwowany 7343Dla.GTTGTGGATGGAATAGTGGT powiedział:
ZIKV Konserwowany 8243Dla.TGCCCATACACCAGCACTATGA TGCC (TGCC)
ZIKV PRVABC59 8893Rev.TGCATTGCTACGAACCTTGTTG powiedział:
ZIKV zachował 9133DLA.AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA
ZIKV PRVABC59 9673Rev.AACGCAATCATCTCCACTGACT (AACGCAATCATCTCCACTGACT)
ZIKV Konserwowany 9686Dla.GATGATAGGTTTGCACATGCC
Zachowany ZIKV 10321Rev.GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT
ZIKV Konserwowany 10455Dla.CAGGAGAAGCTGGGAAACC
ZIKV Zachowany 10621Rev.CAGATTGAAGGGGGGGGAAGGTC powiedział:

Tabela 1: Startery do sekwencjonowania klonów cDNA. Plazmidy można sekwencjonować całkowicie z wymienionymi starterami. Startery oznaczone jako "konserwatywne" wskazują, że prawdopodobnie są w stanie sekwencjonować/amplifikować wszystkie genotypy ZIKV. Startery oznaczone jako "PRVABC59" są specyficzne dla tego szczepu, ale mogą również działać dla innych azjatyckich szczepów genotypowych i prawdopodobnie innych genotypów.

3. Przygotowanie transkrybowanego RNA in vitro

  1. Ustaw reakcję trawienia DNA przygotowanego przez maxiprep lub RCA.
    1. Do mineralizacji p1 wymieszać 10 μl 10x buforu reakcyjnego, 3 μl ApaLI, 3 μl BamHI-HF, 3 μl rSAP lub i 3,3 μg p1 DNA. Dodać ddH2O do 100 μl.
    2. Do trawienia p2 wymieszaj 10 μl 10x buforu reakcyjnego, 3 μl ApaLI, 3 μl EcoRI-HF i 13,3 μg p2 DNA. Dodać ddH2O do 100 μl.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
    4. Oczyść za pomocą dostępnego w handlu żelu i zestawu do czyszczenia PCR (patrz tabela materiałów). Eluować w 30 μl buforu elucyjnego wstępnie podgrzanego do temperatury 70 °C w bloku grzewczym (inkubować kolumnę przez 5 minut przed wirowaniem).
      UWAGA: Zachowaj 1 μl, aby później działać na żelu.
  2. Przygotuj reakcję podwiązania.
    1. Połącz 10 μl 10x buforu reakcyjnego ligacji DNA T4, 3 μl ligazy DNA T4 (400 U/μL), 29 μl oczyszczonego p1 i 29 μl oczyszczonego p2. Dodać ddH2O do 100 μl.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub 16 °C przez noc.
    3. Oczyść za pomocą dostępnego w handlu żelu i zestawu do czyszczenia PCR (patrz tabela materiałów). Eluować w 10 μl buforu elucyjnego wstępnie podgrzanego do temperatury 70 °C w bloku grzewczym (inkubować kolumnę przez 5 minut przed wirowaniem).
      UWAGA: Zachowaj 1 μl, aby później działać na żelu.
  3. Uruchom niestrawione plazmidy, strawione plazmidy i ligację na żelu agarozowym. Produkt ligacji powinien mieć pasmo o wyższej masie cząsteczkowej (około 11 kb) niż każdy z trawionych plazmidów samodzielnie, co wskazuje, że ligacja zakończyła się sukcesem (Rysunek 2b).
  4. Ustaw reakcję transkrypcyjną T7 in vitro.
    1. Połącz 10 μl 2x ARCA/NTP Mix, 2 μl mieszaniny polimerazy T7 RNA i 8 μl oczyszczonej reakcji ligacji, aby uzyskać końcową objętość 20 μL.
      UWAGA: ARCA zawarta w mieszance jest analogiem nasadki, który jest włączony wyłącznie we właściwej orientacji. Standardowe analogi czapek mogą spowodować, że tylko ~50% transkryptów będzie miało czapeczkę we właściwej orientacji.
    2. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    3. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru UV. Opcjonalnie uruchom denaturujący żel agarozowy, aby potwierdzić długość transkryptu RNA.

4. Ratowanie zakaźnego wirusa za pomocą elektroporacji

  1. dni przed elektroporacją przygotować 1 kolbę T182 komórek Vero (dopuszczalne jest między T150 a T182; hodowane w DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) na konstrukt do odzyskania. Dołącz 1 T182 jako symulowaną kontrolę transfekcji. Komórki powinny być używane przy zbieganiu 70-80%.
  2. Gdy komórki są gotowe, umieść 12 ml/reakcję DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES w łaźni wodnej podgrzanej do 37°C.
  3. Odłączyć komórki przez trypsynizację za pomocą standardowego protokołu i odzyskać komórki w pożywce z 10% FBS w celu inaktywacji trypsyny; odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Umyć komórki w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), granulowaniu komórek w temperaturze 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, w sumie trzy płukania.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 200 μL RPMI 1640 + 10 mM HEPES (sterylne) na # próbek. Przenieść 200 μl zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki. Komórki powinny mieć wymiary ~0,5 x 107 komórek/ml.
  6. Do każdego zestawu komórek dodać 20 μl wody (pozorowana kontrola negatywna) lub 20 μl RNA (najlepiej 5-10 μg) wytworzonego w kroku 3.4. Delikatnie wymieszaj, przesuwając probówkę i przenieś zawartość probówki do kuwety do elektroporacji o szczelinie 2 mm.
  7. Ustaw elektroporator na 170 V LV, omega (rezystancja) na 0 i 950 μF (w przybliżeniu na 625 V/cm i stałą czasową 20 ms dla innych maszyn). Ustaw rezystancję na najniższe dostępne ustawienie, 0 lub ∞, jeśli jest dostępne.
  8. Wykonaj jednokrotny impuls i natychmiast dodaj 600 μl DMEM +15 %FBS +10 mM HEPES, który został podgrzany w kroku 4.2. Dokładnie wypłucz wnętrze kuwety, aby usunąć wszystkie komórki. Dodać komórki do kolby do hodowli tkankowej T75 zawierającej 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki. Wyjmij dodatkowe nośniki z kuwety za pomocą zakraplacza dołączonego do kuwety. Uważaj, aby zachować sterylność.
  9. Zawirować kolbę w celu wymieszania pożywki i komórek i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  10. Następnego dnia sprawdź żywotność komórek i rób to codziennie, aż zaobserwuje się 50-75% śmierci komórek. Śmierć komórki obserwuje się przez porównanie z próbą kontroli elektroporowanej.
    UWAGA: Efekt cytopatyczny ZIKV (CPE) jest dość wyraźny w komórkach Vero, powodując zaokrąglone komórki, które odrywają się i unoszą w pożywce hodowlanej. Zaobserwowaliśmy, że zakres 8-10 dni jest idealny do zbiorów.
  11. Zebrać supernatant do stożkowej probówki i odwirować w celu usunięcia resztek komórkowych w temperaturze >3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Usunąć sklarowany supernatant do nowej probówki i uzupełnić o końcowe stężenie 20% FBS (ze 100% zapasu). Dodatkowo dodać sterylny HEPES w końcowym stężeniu 10 mM jako środek buforowy, aby zachować zakaźność wirusa podczas zamrażania (z 1 M sterylnego wywaru).
  13. Wymieszać wirusa przez wirowanie i porcjować do fiolek z zakrętką. Przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

5. Miareczkowanie odzyskanego wirusa

  1. Wysiewać odpowiednią liczbę 6- lub 12-dołkowych płytek komórek Vero na dzień przed miareczkowaniem.
  2. Usuń wirusa z zamrażarki i wykonaj seryjne 10-krotne rozcieńczenia w DMEM+ 2%FBS w probówkach lub płytkach 96-dołkowych.
    UWAGA: Oczekiwane miano od odzyskanych klonów wynosi od 1 x 106 do 5 x 107 PFU/ml.
  3. Dodać 200 lub 400 μl każdego rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach do dołka na płytce 12- lub 6-dołkowej.
  4. Umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i kołysz co 15 minut, co daje łącznie ~1-1,5 godziny okresu adsorpcji.
  5. Usuń inokulum wirusa i dodaj 1 ml (12-dołkowej) lub 2 ml (6-dołkowej) nakładki DMEM-Tragacanth do każdej studzienki.
    UWAGA: Możliwe jest tutaj użycie agarozy, agaru, metylocelulozy lub innych pożywek nakładkowych.
  6. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 dni. Czas prawidłowego tworzenia się płytki nazębnej będzie się różnił w zależności od zastosowanej nakładki.
  7. Aby utrwalić komórki, wyjmij płytki z inkubatora i delikatnie zanurz kantację w środku dezynfekującym.
  8. Dodaj wystarczającą ilość 20% etanolu/0,1% fioletu krystalicznego (CV) do każdej studzienki, aby pokryć i zawirować, aby wymieszać.
    UWAGA: Istnieje wiele innych utrwalaczy, które można tutaj zastosować. Dodatkowo, jeśli używasz nakładki agarozowej lub agarowej, drugą nakładkę można użyć w połączeniu z neutralną czerwienią, aby uwidocznić blaszki bez fiksacji. W poprzednich badaniach wykazano, że 20% etanol jest skuteczny w inaktywacji wirusów otoczkowych; Nie używaj tej ilości w przypadku wirusów bezotoczkowych, ponieważ nie zostaną one dezaktywowane19.
  9. Inkubować płytki przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej (w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II); wyrzucić CV (zgodnie z lokalnymi przepisami) i umyć płytki wodą z kranu.
  10. Poczekaj, aż płytki wyschną i ręcznie policz blaszki.
    UWAGA: Numer referencyjny 20 może być używany jako dodatkowe odniesienie do wykonywania testów płytki nazębnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany tutaj protokół umożliwia odzyskanie zakaźnego wirusa Zika pochodzącego z klona infekcyjnego. Manipulowanie dwu-plazmidowym systemem klonowania infekcyjnego jest proste, jeśli przeprowadza się je z należytą starannością, w przeciwieństwie do wersji pełnowymiarowych, które są wysoce niestabilne (dane nieprzedstawione). Po trawieniu i ligacji dwóch odrębnych fragmentów, RNA z czapeczką jest wytwarzane za pomocą transkrypcji in vitro z użyciem polimerazy T7, a następnie elekt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metodę odzyskiwania dwuczęściowego zakaźnego systemu klonów cDNA dla ZIKV. Wcześniej opisane klony ZIKV cierpią na osłabienie lub wymagają dodania intronów, co zwiększa plazmidy i uniemożliwia ratowanie w komórkach owadów. Zakaźny wirus można odzyskać za pomocą systemu klonów dwuplazmidowych w komórkach ssaków lub owadów (dane nie pokazane). Ponadto wirus odzyskany z tego systemu zachowuje się podobnie do wirusa typu dzikiego w kilku liniach komórkowych, w modelu myszy z obniżoną odpornością i u k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Kristen Bullard-Feibelman, Milenie Veselinovic i Claudii Rückert za pomoc w scharakteryzowaniu wirusa pochodzącego od klonu. Prace te były częściowo wspierane przez granty z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych, NIH w ramach grantów AI114675 (BJG) i AI067380 (GDE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NEB Stable CompetentE. coliNew England BioLabsC3040H
Karbenicylina, sól disodowaróżne
zestawy miniprzygotowawcze plazmidu ZyppyD4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep KitZymo ResearchD4202
SalI-HFNew England BioLabsR3138S20 000 jednostek/ml
NheI-HFNew England BioLabsR3131S20 000 jednostek/ml
ApaLINew England BioLabsR0507S10 000 jednostek/ml
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S20 000 jednostek/ml
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S20 000 jednostek/ml
HindIII-HFNew England BioLabsR3104S20 000 jednostek/ml
illustra TempliPhi 100 Amplifikacja ZestawGE Healthcare Life Sciences25640010
NucleoSpin Żel i PCR do czyszczeniaMacherey-Nagel740609.5
Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP)New England BioLabsM0371S1,000 jednostek/ml
fosfatazy alkalicznej, jelita cielęcych ()Nowa Anglia BioLabsM0290S10 000 jednostek/ml
DNA T4 LigazaNew England BioLabsM0202S400 000 jednostek/ml
HiScribe T7 ARCA mRNA KitNew England BioLabsE2065S
Komórki VeroATCCCCL-81
ECM 630 Wysokoprzepustowy system elektroporacjiBTX45-0423Inne maszyny są dopuszczalne.
LB Rosół z agarem (Miller)SigmaL3147Może być również domowej roboty.
Wspaniały rosółSigmaT0918Może być również domowej roboty.
229693Petri Celltreat
VWR International60818-576
T75Kolby Celltreat229340
T182Celltreat229350
1x PBSCorning21-040-CV
RPMI 1640 z L-glutaminąCorning10-040-CV
DMEM z L-glutaminą i 4,5 g/Lglukozy Corning10-017-CV
Surowica bydlęca płodu (FBS)Atlas BiologicalsFP-0500-A
Tragakant w proszkuMP BioMP 104792
Crystal VioletAmresco0528-1006
Płytka
Celltreat229106
płytka 12-dołkowaCelltreat229111
Sekwencjonowanie OligosIDTpatrz tabela 1
Qubit 3.0ThermoFisherQubit 3.0inne metody są dopuszczalne.
Dopuszczalne są inne metodyQubit dsDNA BR Assay KitThermoFisherQ32850
Zestaw do oznaczania kubitowego RNA HSThermoFisherQ32852dopuszczalne są inne metody.
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy IIróżni sięnie dotyczyJest to konieczne do pracy z żywymi wirusami.
Research Probówki do hodowli 6-dołkowa VWR International BDH1156-1LP zdenaturowana etanolem .

Bibliografia

  1. Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
  2. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
  3. Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197(2011).
  4. Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
  5. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  6. Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
  7. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  8. Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
  9. Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
  10. Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
  11. Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
  12. Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
  13. Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
  14. Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
  15. Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486(2012).
  16. Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
  17. Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
  18. Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
  19. Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
  20. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065(2014).
  21. Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
  22. Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System dwuplazmidowytranskrypcja wirusowego RNArekonwalescencja po elektroporacjikom rki Verotest plackowykinetyka wzrostuzaka enie myszytransmisja przez komary
Ratowanie i charakterystyka rekombinowanego wirusa z zakaźnego klonu wirusa Zika z Nowego Świata
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.