Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja dynamiki mocy widmowej i tętna w podczerwieni u śpiących myszy

DOI:

10.3791/55863

⸱

2 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Fundamental Neurosciences, University of Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy eksperymentalne i analityczne procedury opisujące dynamikę czasową zmiennych neuronalnych i sercowych snu nie-REM u myszy, które modulują reakcję snu na bodźce akustyczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy stany czujności dominują w życiu ssaków: czuwanie, sen bez szybkich ruchów gałek ocznych (non-REM) i sen REM. W miarę jak u swobodnie poruszających się zwierząt identyfikuje się coraz więcej neuronalnych korelatów zachowania, ten potrójny podział staje się zbyt uproszczony. Podczas czuwania zespoły globalnych i lokalnych czynności korowych, wraz z parametrami obwodowymi, takimi jak średnica źrenic i równowaga współczulno-owagalna, określają różne stopnie pobudzenia. Nie jest jasne, w jakim stopniu sen tworzy również kontinuum stanów mózgu – w obrębie których stopień odporności na bodźce sensoryczne i pobudzenie, a być może także inne funkcje snu, zmieniają się stopniowo – oraz jak zmieniają się peryferyjne stany fizjologiczne. Badania rozwijające metody monitorowania wielu parametrów podczas snu, a także przypisywanie konstelacjom tych funkcjonalnych atrybutów, mają kluczowe znaczenie dla udoskonalenia naszego zrozumienia snu jako wielofunkcyjnego procesu, podczas którego musi zostać osiągniętych wiele korzystnych efektów. Identyfikacja nowych parametrów charakteryzujących stany snu otworzy możliwości dla nowych ścieżek diagnostycznych w zaburzeniach snu.

Przedstawiamy procedurę opisu dynamicznych zmian stanów snu myszy nie-REM poprzez połączone monitorowanie i analizę sygnałów elektroencefalogramu (EEG)/elektrokortykogramu (ECoG), elektromiogramu (EMG) i elektrokardiogramu (EKG) przy użyciu standardowych technik zapisu polisomnograficznego. Stosując to podejście, odkryliśmy, że sen myszy nie-REM jest zorganizowany w cykle skoordynowanych oscylacji nerwowych i sercowych, które generują kolejne 25-sekundowe interwały wysokiej i niskiej wrażliwości na bodźce zewnętrzne. Dlatego ośrodkowy i autonomiczny układ nerwowy są skoordynowane, aby tworzyć behawioralnie odrębne stany snu podczas skonsolidowanego snu nie-REM. Przedstawiamy manipulacje chirurgiczne do monitorowania polisomnograficznego (tj. EEG/EMG w połączeniu z EKG) w celu śledzenia tych cykli u swobodnie śpiącej myszy, analizy w celu ilościowego określenia ich dynamiki oraz protokołów stymulacji akustycznej w celu oceny ich roli w prawdopodobieństwie przebudzenia. Nasze podejście zostało już rozszerzone na sen człowieka i obiecuje rozwikłać powszechne zasady organizacji stanów snu innych niż REM u ssaków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sen ssaków to behawioralny stan odpoczynku i odporności na bodźce środowiskowe. Pomimo tej pozornej jednorodności, parametry polisomnograficzne i autonomiczne wskazują, że sen porusza się między jakościowo i ilościowo różnymi stanami neuronalnymi i somatycznymi w różnych skalach czasowych i przestrzennych1. W ciągu kilku minut do kilkudziesięciu minut następuje przełączanie między snem innym niż REM a uśpieniem REM. Senowi non-REM towarzyszy aktywność EEG o dużej amplitudzie i niskiej częstotliwości, ze szczytem widmowym około ~0,5 - 4 Hz, podczas gdy sen REM wykazuje regularną aktywność EEG w paśmie theta (6 - 10 Hz), wraz z atonią mięśniową2. W ramach snu non-REM ludzie przechodzą przez światło (S2) i głęboki sen wolnofalowy (SWS). Jak wskazuje ich nazwa, te dwa etapy wykazują niższe i wyższe progi pobudzenia3,4, odpowiednio, i różnią się przede wszystkim gęstością mocy korowego EEG o niskiej częstotliwości, określanej jako aktywność wolnofalowa (SWA; 0,75 - 4 Hz). Niejednorodność utrzymuje się w poszczególnych atakach S2 i SWS w skali czasowej od minuty do sekundy, co jest obszernie udokumentowane przez zmienną obecność SWA w trakcie ataku5,6, ale także przez EEG i rytmy potencjału pola o wyższych częstotliwościach, w tym fale wrzecionowe w paśmie sigma (10-15 Hz) i rytmy gamma (80 - 120 Hz) (dla przeglądu, Zobacz7,8,9,10).

Zamiast być subtelne, te zmiany zmieniają stan uśpienia u ludzi do skrajności spektrum. W przypadku snu innego niż REM wahają się one od przewagi SWA do stanów, które przybliżają aktywność podobną do czuwania, ponieważ zawierają znaczną część składników o wysokiej częstotliwości11,12. U gryzoni i kotów, chociaż sen nie-REM nie jest podzielony na etapy, krótki okres zwany snem pośrednim (IS) pojawia się przed rozpoczęciem snu REM13. Podczas IS inicjowane są cechy snu REM, takie jak aktywność theta hipokampa i fale ponto-genikulo-potyliczne, podczas gdy sygnatury snu inne niż REM, takie jak fale wrzecionowe i SWA, są nadal obecne, co wskazuje na mieszanie się tych dwóch stanów snu14,15. Niemniej jednak, IS może być funkcjonalnie odrębny, ponieważ jest modulowany przez leki przeciwdepresyjne16 oraz poprzez prezentację nowego obiektu podczas wcześniejszego przebudzenia17, i przyczynia się do ustawienia progu pobudzenia18. Co więcej, wykresy przestrzeni stanów parametrów EEG i EMG swobodnie poruszających się szczurów pokazują klaster punktów14, który jest ciągły między snem innym niż REM, snem REM i czuwaniem. Występują również sporadyczne spadki SWA, bez wchodzenia w stan czuwania lub snu REM, co prowadzi do znacznych wahań względnej obecności składników o niskiej i wysokiej częstotliwości podczas skonsolidowanego ataku snu bez fazy REM14,19,20. Wreszcie, zmienne proporcje rytmów SWA i wyższych częstotliwości podczas snu non-REM występują nie tylko w czasie, ale także pokazują regionalne różnice w amplitudzie i synchronizacji między obszarami korowymi19.

Sen ssaków nie-REM jest daleki od jednolitości. Nie jest jednak jasne, czy taka niejednorodność prowadzi do stanów różniących się funkcjami i atrybutami behawioralnymi. W kilku rodzajach zaburzeń snu ciągły sen jest zakłócany przez spontaniczne przebudzenia i niewłaściwe zachowania motoryczne. Co więcej, analizy spektralne wykazują zmiany we względnej obecności wyższych częstotliwości w EEG21 oraz w parametrach autonomicznych, takich jak tempo oddychania i bicie serca22. Uporządkowana sekwencja stabilnych stanów snu zostaje w ten sposób zaburzona, a elementy pobudzenia korowego i/lub autonomicznego wdzierają się w niekontrolowany sposób. Dlatego zrozumienie kontinuum stanów snu może mieć znaczenie dla choroby. Dodatkowo, zakłócenia snu spowodowane hałasem środowiskowym w środowiskach miejskich są związane z ogólnymi zagrożeniami dla zdrowia, co sprawia, że kluczowe jest zidentyfikowanie momentów zwiększonej wrażliwości podczas snu23.

Eksperymenty z pobudzeniem behawioralnym u śpiących ludzi wskazują, że najtrudniej jest obudzić się ze snu nie-REM zdominowanego przez SWA (etap S3), podczas gdy lekki sen non-REM (etap S2) i sen REM wykazują porównywalne i niższe progi pobudzenia4. Korowe przetwarzanie krótkich bodźców dźwiękowych różni się znacznie między fazą REM, S2 i S324,25, co wskazuje, że wzorce aktywności korowej specyficzne dla stanu modulują pierwsze etapy przetwarzania sensorycznego. W przypadku snu innego niż REM u ludzi skłonność do budzenia się w odpowiedzi na hałas zmienia się w zależności od obecności fal wrzecionowych i rytmów alfa w EEG26,27,28. Rytmiczności korowo-wzgórzowej podczas wrzecion towarzyszy zwiększone hamowanie synaps zarówno na poziomie wzgórza, jak i kory mózgowej, co uważa się za przyczynianie się do tłumienia przetwarzania sensorycznego7.

Jak są zorganizowane okresy snu odporne na hałas i wrażliwe i jakie są ich determinanty? Zarówno u myszy, jak i u ludzi zidentyfikowaliśmy ostatnio oscylację rytmów neuronalnych o 0,02 Hz i powolną podczerwienią. W zależności od fazy tej oscylacji 0,02 Hz, myszy wykazywały zmienną reaktywność na bodźce zewnętrzne, budząc się lub śpiąc w hałasie. Co ciekawe, oscylacja ta była skorelowana z szybkością bicia serca, co wskazuje, że autonomiczny układ nerwowy uczestniczy w modulacji podatności snu na bodźce zewnętrzne1. Rytmy hipokampa związane z pamięcią były również zorganizowane w tym rytmie i, co najbardziej uderzające, jego siła korelowała z jakością konsolidacji pamięci u ludzi. Oscylacja 0,02 Hz wydaje się być zatem zasadą organizującą sen nie-REM gryzoni i ludzi, która moduluje zarówno wrażliwość na środowisko, jak i przetwarzanie pamięci wewnętrznej. To ponownie podkreśla potrzebę wieloparametrycznej i ciągłej oceny stanów snu w celu rozpoznania ich funkcjonalności i zidentyfikowania miejsc o potencjalnej podatności.

Tutaj prezentujemy procedurę ekstrakcji kształtu fali tej dynamiki, w tym chirurgiczne wszczepienie implantacji myszom w celu połączonych pomiarów EEG/ECoG i EMG-EKG, ekspozycję na bodźce sensoryczne i procedury analizy. Procedura ta stanowi podstawę do postrzegania snu jako stale zmieniającego się, ale wysoce zorganizowanego stanu czujności, podczas którego sekwencyjnie wykonywane są różne podstawowe funkcje snu. Mówiąc bardziej ogólnie, procedura ta ma zastosowanie do podejść mających na celu wyodrębnienie cech spektralnych i autonomicznych, które poprzedzają wynik behawioralny podczas snu zarówno w stanie zdrowia, jak i choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Lozannie oraz Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires Kantonu de Vaud.

1. Chirurgia zapisów EEG/EMG-EKG

  1. Trzymanie i selekcja zwierząt.
    1. Zwierzęta (C57Bl/6J, 7 - 9 tygodni, 25 - 30 g) należy trzymać w cyklu ciemnym/jasnym 12:12 godzin, w pojedynczych pomieszczeniach i w standardowych warunkach (40% wilgotności, 22 °C), z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum.
    2. Używaj tylko mężczyzn, aby uniknąć wszelkich wpływów cyklu hormonalnego na sen.
  2. Przygotowanie elektrod.
    1. Zbuduj elektrody EEG/ECoG (użyte w kroku 1.3.11) z kawałków złotego drutu o długości ~0,5 cm (75% Au, 13% Ag i 12% Cu; średnica: 0,2 mm), z których każdy jest przylutowany na pozłacanej stalowej (3 mm długości, 1,1 mm średnicy u podstawy; patrz Rysunek 1). Przygotuj 2 elektrody EEG na zwierzę i oczyść je w 70% etanolu.
    2. Przygotuj elektrody EMG-EKG ze złotymi drutami o długości 3 - 4 cm (75% Au, 13% Ag i 12% Cu; średnica: 0,2 mm). Zegnij druty pod kątem 90° 1 cm od jednego końca i przygotuj cewkę (1 - 2 mm ø) na drugim końcu (Rysunek 1). Pomiędzy dwoma końcami zegnij drut, aby utworzyć małą krzywiznę, która odpowiada profilowi powierzchni kości między móżdżkiem a lambdą.
      1. Przygotuj 2 elektrody EMG-EKG na zwierzę.
    3. Przygotuj 6-kanałowe złącze głowicy żeńsko-męskiej (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, rozmiar: 5 mm x 8 mm x 9 mm, rozmiar pinu: 5 mm; patrz Rysunek 1).
      1. Zakryj złącze u podstawy zarówno pinów żeńskich, jak i męskich taśmą.
      2. Dodaj niewielką ilość drutu lutowniczego do końcówek 4 z 6 męskich pinów, aby pomóc w elektrod EEG i EMG-EKG podczas operacji (patrz krok 1.3.16).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie miejsc do wszczepienia elektrody EEG i EMG na czaszce myszy.
Czaszkojomie #1 i #2 znajdują się ~2 mm bocznie do linii środkowej i ~2 mm rostralnie do bregmy. Czaszkojomie #3 i #4 znajdują się ~2 mm rostralnie do lambdy i są odpowiednio 4 i 2 mm bocznie do linii środkowej. Dwie elektrody EEG, wykonane z przylutowania złotego drutu do górnej części pozłacanej stalowej (#2 i #4) znajdują się na prawej półkuli. 2 lewe (#1 i #3) służą jako podpory. Należy pamiętać, że elektrody EMG-EKG nie powinny stykać się z tymi 2 nośnymi. Elektrody EMG-ECG to złote druty o długości 3 - 4 cm, wygięte pod kątem 90° powyżej 1 cm na ich końcach rostralnych i zwinięte (1 - 2 mm ø) na końcach ogonowych. 2 elektrody EEG i 2 elektrody EMG są podłączone do złącza głowicy 2 x 3-kanałowej poprzez przylutowanie jednego przewodu do jednego kołka narożnego, jak pokazano liniami przerywanymi. Więcej szczegółowych informacji na temat tych elektrod i ich implantacji można znaleźć w 29. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Chirurgia implantacji.
    1. Znieczulić zwierzę w komorze indukującej izofluran (4 - 5% izofluranu +O2 w dawce 1 - 2 l/min przez 3 - 4 min). Wstrzyknąć 5 μg/g karprofenu dootrzewnowo (i.p.) podczas wyjmowania myszy z komory, przed utrwaleniem stereotaktycznym.
    2. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami, aby zamocować mysz na aparacie stereotaktycznym. Utrzymać znieczulenie izofluranem przez maskę gazową (3% izofluranu +O2 podczas utrwalania w tempie 1 l/min). Utrzymuj temperaturę ciała przez cały czas trwania zabiegu na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej.
      1. Chroń oczy przed wysuszeniem, stosując maść z witaminą A. Sprawdź poziom tolerancji chirurgicznej zwierzęcia, badając odruch wycofania łapy.
    3. Zamocuj głowę, umieszczając pręty uszne na czaszce, odwróconymi końcami, a nie końcówkami (bez wchodzenia do kanałów słuchowych)29. Ustaw pasek ustny (jak zwykle), aby zapewnić poziomość głowy.
      UWAGA: Fiksacja minimalizuje uszkodzenia uszu, co jest ważne dla eksperymentów z pobudzeniem akustycznym (patrz sekcja 4 tej procedury).
    4. Monitoruj oddech zwierzęcia podczas zabiegu, który powinien utrzymywać się na poziomie ~2 - 3 oddechów/2 s. W razie potrzeby wyreguluj stężenie izofluranu w dozowniku gazu; powinno ono stopniowo zmniejszać się podczas zabiegu, z 3% podczas stabilizacji do 1,0 - 1,5% pod koniec zabiegu.
    5. Wstrzykiwać 100 μl 0,9% NaCl i.p. raz na godzinę za pomocą bardzo cienkiej strzykawki insulinowej, aby utrzymać nawodnienie zwierzęcia.
    6. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest oświetlona jasnym źródłem światła.
    7. Oczyść obszar 70% EtOH i środkiem dezynfekującym na bazie jodu (mokre futro zapobiega przedostawaniu się włosów do okna operacyjnego).
    8. Podnieś skórę na środku czaszki za pomocą kleszczy Adson i delikatnie przetnij uniesioną część skóry wzdłuż linii środkowej, od czubka szyi do poziomu oczu, za pomocą cienkich nożyczek. Usuń skórę głowy (~1 cm przednio-tylna, ~0,5 - 0,8 cm boczna).
      1. Upewnij się, że okno jest wystarczająco duże (w obie strony), aby wyraźnie zobaczyć szczeliny bregma i lambda czaszki. Przymocuj skórę po obu stronach za pomocą serrefines buldoga, aby zapewnić dostęp do kości.
    9. Usuń tkankę spojówkową (okostną), ostrożnie drapiąc skalpelem. Oczyść obszar środkiem dezynfekującym na bazie jodu i osusz czaszkę wacikiem antyseptycznym.
    10. Za pomocą ostrego ostrza skalpela (rozmiar 15) podrap czaszkę, aby uzyskać oczyszczoną i zmatowioną powierzchnię kości. Używając tylko końcówki skalpela, zdrap siatkę rowków przypominającą siatkę, w odległości ~1 - 2 mm między rowkami.
      UWAGA: Poprawia to mocowanie dwuskładnikowego kleju epoksydowego do czaszki w kroku 1.3.15.
    11. Użyj mikrowiertła o rozmiarze wiertła 1/005, aby wykonać 4 kraniotomię (~0,7 mm ø) w czaszce w określonych miejscach (Rysunek 1; zobacz także krok 1.3.11.3.). Zdmuchnij pył kostny za pomocą pipety Pasteura i wyczyść wszelkie krwawienia wacikami antyseptycznymi.
      1. Jeśli wystąpi krwawienie, upewnij się, że zostało całkowicie zatrzymane przed wznowieniem procesu. Użyj gąbki hemostatycznej, aby przyspieszyć hemostazę.
      2. Użyj dwóch kraniotomii na prawej półkuli, aby wprowadzić elektrody śrubowe (kraniotomia #2 i #4).
      3. Użyj dwóch kraniotomii na lewej półkuli, aby wprowadzić kotwiące, które ustabilizują implant (kraniotomia #1 i #3).
        UWAGA: Aby zwiększyć stabilność, użyto do 4 kotwiących29.
        UWAGA: Dokładne współrzędne stereotaktyczne to: 2 mm od linii środkowej na obu półkulach i 2 mm rostral od bregma (kraniotomia #1 i #2), 2 mm rostral od lambda i 4 mm boczno-lewo od linii środkowej (kraniotomia #3), 2 mm rostral od lambdy i 2 mm boczno-prawe od linii środkowej (kraniotomia #4). Zobacz Rysunek 1.
    12. Na lewej półkuli wkręć dwie pozłacane przez kraniotomię, aby uzyskać wsparcie.
      1. Zamocuj w hemostatycznym zacisku i przytrzymaj ją pionowo nad kraniotomią. Ostrożnie podejdź do dolnej części na górze kraniotomii. Obróć go, nie odbiegając od pozycji pionowej.
        UWAGA: Tylko 1,5 obrotu jest wystarczające, aby uzyskać dobrą stabilność mechaniczną i wysokiej jakości sygnały, jednocześnie minimalizując nacisk na leżącą pod spodem tkankę25.
      2. Po prawej stronie przekręć wcześniej przygotowane elektrody (opisane w kroku 1.2.1.) przez kraniotomię.
    13. Za pomocą kleszczy ostrożnie unieś granicę skóry z mięśni szyi. Włóż przewody EMG-EKG ze zwiniętymi końcami do wnętrza mięśni (lewej i prawej). Przyklej środkowe części do czaszki tak, aby lewe EMG-EKG wychodziło obok tylnej lewej kotwiącej, podczas gdy prawe EMG-EKG znajdowało się obok przedniej lewej kotwiącej.
    14. Aby wykryć sygnały EKG z serca podczas snu, należy upewnić się, że przewody EMG-EKG są wprowadzone do mięśnia na głębokość ~0,8 - 1 cm, tak aby ich pętle kończyły się jak najdalej od siebie.
    15. Użyj szpatułki pokrytej dwuskładnikowym klejem epoksydowym, aby nałożyć klej na czaszkę między i wokół nich. Pozostaw do wyschnięcia w świetle, ale chroń oczy zwierzęcia przed nadmiernym wyładowaniem atmosferycznym.
      UWAGA: Podstawy muszą być zakryte, a tylko przewody powinny być dostępne wychodzące z kleju.
    16. Upewnij się, że klej wypełnia przestrzeń między dwiema elektrodami EMG-ECG wystającymi z powierzchni, tak aby nie było kontaktu elektrycznego między nimi a nośnymi. Zwróć szczególną uwagę, aby nie przykleić skóry do czaszki; Skóra powinna swobodnie poruszać się po kleju.
    17. Przewody EEG i EMG-EKG należy wyciąć tak, aby wychodziły z kleju na ~0,5 mm. cztery styki w rogu złącza przygotowanego w kroku 1.2.3. do czterech drutów wychodzących z kleju (Rysunek 1).
      1. Staraj się umieścić styki złącza tak blisko, jak to możliwe, aby zminimalizować wysokość implantu; użyj małego zacisku krokodylkowego przymocowanego do uchwytu stereotaktycznego, który utrzymuje pozycję złącza. Zminimalizuj czas kontaktu z grotem lutowniczym, ponieważ szybko nagrzewa to.
    18. Wypełnij przestrzeń między klejem a łącznikiem cementem dentystycznym, aby pokryć lutowane części. Twórz gładkie twarze i unikaj ostrych krawędzi, które mogłyby zranić zwierzę. Ponadto unikaj dotykania skóry, ponieważ prowadzi to do swędzenia.
    19. Usuń serfineny buldoga. W razie potrzeby zamknij ranę za pomocą sterylnej nici do szycia (wchłanialnego włókna szyjącego) z przodu i z tyłu łącznika, tworząc proste, przerywane wzory zamykania i dwa kwadratowe węzły (igła 5-0 FS-3, filament 45 cm).
    20. Monitoruj zwierzę, aż w pełni się obudzi. Zważ zwierzę po operacji i zwróć je do klatki domowej w celu rekonwalescencji.
  2. Opieka pooperacyjna i podłączenie do systemu.
    1. Monitoruj zwierzę codziennie przez tydzień. Zwróć uwagę na utratę wagi, zmniejszoną lub nieprawidłową aktywność oraz oznaki infekcji. Postępuj zgodnie z procedurą punktacji ustaloną przez organy weterynaryjne.
    2. 5-6 dni po zabiegu podłącz nagrywający do złącza głowy zwierzęcia, pozostawiając je w klatce domowej. Odczekaj dodatkowe 4 - 5 dni przed rozpoczęciem nagrywania, aby zwierzę przyzwyczaiło się do tego stanu i spało naturalnie.

2. Podstawowa punktacja danych EEG/EMG-EKG do określania stanu czujności

  1. Rejestruj dane EEG i EMG-EKG przez 48 godzin za pomocą komercyjnego oprogramowania polisomnograficznego (np. Somnologica, SleepSign lub Sirenia). Użyj typowych ustawień, takich jak wzmocnienie 2,000x; częstotliwość próbkowania 2 000 Hz podczas akwizycji, próbkowanie zmniejszone do 200 Hz po akwizycji; oraz filtr górnoprzepustowy 0,7 Hz do EEG i filtr górnoprzepustowy 10 Hz do EMG-EKG.
  2. Eksportuj dane w formacie pliku ".edf".
  3. Otwórz pliki ".edf" za pomocą specjalnie napisanego (np. w Matlabie) oprogramowania, które półautomatycznie klasyfikuje każdą 4-sekundową epokę jako sen przebudzony, sen nie-REM, sen REM i odpowiadające im artefakty.
    UWAGA: Alternatywnie dostępnych jest kilka półautomatycznych programów do oceniania. W tej procedurze opisano niektóre z podstawowych kroków, które należy wykonać, aby skonfigurować punktację za pomocą używanego tutaj oprogramowania do oceniania; Inne półautomatyczne systemy punktacji mogą być oparte na innych parametrach.
  4. Za pomocą oprogramowania rozdziel pliki ".edf" w 4 razy po 12 godzin nagrań.
    1. Usuń artefakty, które powstają w wyniku aktywności EMG -EKG obecnej w sygnale EEG lub z nieprzypisywanego stanu zachowania1,29.
    2. Obliczyć średnią bezwzględnych wartości EEG (średnia EEG) i EMG (średnia EMG) w ciągu 12 godzin zapisów odpowiednio z EEG i zapisów EMG-EKG.
    3. Określ średnie wartości EEG/EMG dla każdej epoki 4 s (epoka EEG/epoka EMG).
    4. Klasyfikuj epoki jako "Czuwanie", gdyśrednia epoki EEGśrednia epoki EMG>EMG, oraz jako "sen nie-REM", gdyśrednia epoki EEG>EEG i średnia epoki EMG.
    5. Epoki, które nie spełniają tych kryteriów, należy sklasyfikować za pomocą algorytmu korygującego opartego na poprzednich i kolejnych epokach.
    6. Klasyfikuj epoki jako sen REM, gdyśrednia EEGEpochśrednia EMG Epoch
    7. Uściślij punkty krytyczne, takie jak przejścia ze snu innego niż REM do czuwania, epoki snu REM i mikropobudzenia podczas snu innego niż REM. Sprawdź wzrokowo punktację, aby upewnić się, że prawidłowo określa stan czujności29,30.
      UWAGA: Zawsze przeprowadzaj końcową kontrolę wzrokową i walidację punktacji.

3. Analiza oscylacji w podczerwieni dla EEG i bicia serca

  1. Do tej analizy wybierz tylko napady snu inne niż REM trwające ≥ 96 s (tj. co najmniej 24 epoki po 4 s); patrz Rysunek 2.
    UWAGA: Niestandardowe procedury są dostępne na żądanie1.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Określanie dynamiki mocy sigma podczas niezakłóconego snu non-REM.
(A) Góra, ślady EEG (czarne) i EMG-EKG (szare) podczas pierwszych 100 minut fazy świetlnej w jednej myszy. Stany czujności są oznaczone kolorowym paskiem umieszczonym na górze nieprzetworzonych śladów. Środkowy, typowy przykład ciągłego (>96-s) napadu snu non-REM. Dół, losowo wybrany, 16-sekundowy interwał, który ilustruje podział na 4-sekundowe epoki. Poniższy krok analizy jest pokazany tylko dla tych czterech epok, ale jest ważny dla każdej epoki zawartej w walce. (B) U góry, cztery kolejne FFT wygenerowane z epok 4-s pokazanych w dolnym panelu A. Pasmo sigma (10-15 Hz) jest zacieniowane na czerwono. U góry po prawej, wstawka 1 s z ostatniej epoki pokazująca fale R obecne w kwadratowym sygnale EMG-EKG. Dół, przebieg w czasie mocy sigma wydobytej z odpowiedniego widma powyżej. Przerywane linie ilustrują kontynuację wartości mocy przed i po czterech atakach innych niż REM wybranych do wyświetlenia. (C) Znormalizowane przebiegi czasu mocy sigma (czerwony) i bicia serca (w BPM) (szary), z częścią zilustrowaną w (B) znajdującą się pomiędzy pionowymi liniami przerywanymi. Poniżej znajduje się odpowiedni przefiltrowany sygnał EEG w paśmie sigma (10 - 15 Hz). (D) Wynik FFT obliczony na przebiegu mocy sigma w czasie pokazanym w (C), wykazujący dominujący pik przy 0,016 Hz. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wyodrębnij wartości mocy dla mocy widmowej pasma częstotliwości sigma (10-15 Hz) w przedziałach 4-s ( Rysunek 2A i B) za pomocą obliczeń szybkich transformat Fouriera (FFT)1.
  2. Oblicz bazową moc widmową dla snu innego niż REM, uśredniając wartości w każdym przedziale częstotliwości dla wszystkich epok snu innego niż REM (artefakty i epoki przejścia między stanami czujności są wyłączone z tego uśredniania). Znormalizuj wartości mocy sigma każdej epoki do średniej mocy pasma sigma podczas snu innego niż REM w interesującym Cię okresie. Wykres w czasie (Rysunek 2C).
  3. Oblicz FFT przebiegu czasu mocy sigma z okienkiem Hamminga, aby ujawnić składowe częstotliwości oscylacyjnej dynamiki mocy (Rysunek 2D)1.
  4. Zauważ, że ponieważ napady snu inne niż REM mają różny czas trwania, wynikające z nich FFT mają różne rozdzielczości częstotliwości. Interpoluj, aby dostosować rozdzielczość do najwyższej uzyskanej z najdłuższego okresu snu bez fazy REM i uśrednić FFT wszystkich napadów.
  5. Kontynuuj te analizy, aby opisać zależności fazowe między dynamiką sygnałów EEG i EKG.
  6. Wyodrębnij dane dotyczące bicia serca z kwadratu sygnału EMG-EKG po filtrowaniu górnoprzepustowym 30 Hz, stosując odpowiednie procedury do wykrywania piku załamka R.
    UWAGA: Ograniczenie minimalnego odstępu czasu między dwiema kolejnymi falami R do 80 ms pomaga uniknąć pojawiania się sporadycznych artefaktów szczytowych spowodowanych drganiami mięśni1.
  7. Zmierz interwały RR i oblicz średnie tętno w uderzeniach na minutę (BPM) co 4 sekundy (Rysunek 2B i C).

4. Narażenie na hałas

  1. Generuj szumy (tj. biały szum) za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania. Ustaw czas trwania na 20 s, a intensywność na 90 dB SPL (mierzone wewnątrz klatki). Odtwarzaj dźwięki przez standardowe aktywne głośniki1.
  2. Po operacji, podczas przyzwyczajania się do warunków nagrywania, odtwarzaj eksperymentalne dźwięki losowo, kilka razy w ciągu dnia i w różnych momentach1.
  3. W warunkach eksperymentalnych (podczas nagrywania danych EEG/EMG/EKG) odtwarzaj szum pseudolosowo przez pierwsze 100 minut po nadejściu światła (ZT0). Aby odtworzyć dźwięk, spełnij następujące warunki1:
    1. Upewnij się, że mysz była w trybie uśpienia innym niż REM przez > 40 s.
    2. Upewnij się, że poprzednia ekspozycja miała miejsce wcześniej niż 4 minuty wcześniej.
      UWAGA: Daje to ~15 ekspozycji na sesję.
  4. Zaznacz początek czasu nagrywania i początek każdej ekspozycji na hałas. Utrzymuj eksperymentatora ślepego na skład spektralny snu nie-REM podczas zabiegu.
  5. Pozyskaj wszystkie dane za pomocą oprogramowania polisomnograficznego1,29.

5. Retrospektywna analiza snu na podstawie wyniku zachowania podczas ekspozycji na hałas

  1. Ręcznie oceniaj ślady EEG/EMG -EKG w rozdzielczości 4-s, bez znajomości czasów ekspozycji na szum1.
  2. Użyj niestandardowego skryptu, aby wyodrębnić dane o ekspozycji na EEG/EMG -EKG/hałas1.
  3. Wynik jako sen, gdy zarówno sygnały EEG, jak i EMG pozostają niezmienione podczas ekspozycji na hałas (ryc. 3A). Rozważ przebudzenie, gdy amplituda EEG maleje, a częstotliwość EEG wzrasta, w połączeniu z wykrytą aktywnością mięśniową na elektrodzie EMG-EKG (Rysunek 3B).
  4. Odrzuć próby, w których zwierzęta obudziły się w okresie przed bodźcem lub w ciągu pierwszych 4 sekund ekspozycji na hałas (Rysunek 3D).
  5. Zdefiniuj wskaźnik powodzenia pobudzenia jako odsetek prób wybudzenia we wszystkich uwzględnionych badaniach ("Pobudka" i "Przesypianie").
  6. We wszystkich uwzględnionych próbach zbadaj dynamikę mocy sigma w okresie przed bodźcem (Rysunek 3E)1.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wyniki behawioralne w odpowiedzi na pojawienie się hałasu: reprezentatywne wyniki, które zostały zachowane lub wykluczone z analizy.
(A-D) Surowe ślady sygnałów EEG () i odpowiadających im sygnałów EMG-EKG (szary) przez 40 s przed wystąpieniem szumu i podczas 20 s szumu, reprezentowane przez obszar zacieniony na niebiesko. Stany czujności są oznaczone kodem kolorystycznym. Aby zilustrować dane, które zostały uwzględnione w analizie, pokazano reprezentatywne zdarzenia "Sleep-through" (A) i "Wake-up" (B). Wyniki, które zostały odrzucone, zawierały przejścia do snu REM (C) i przedwczesną reakcję "przebudzenia" (D). Na wstawce widoczny jest rozszerzony fragment śladów EEG i EMG-EKG charakterystycznych dla snu REM. (E) Typowe przykłady dynamiki mocy sigma w oknie 40-sekundowym przed pojawieniem się hałasu podczas zdarzenia "Sleep-through" (po lewej) i "Wake-up" (po prawej). Surowy ślad EEG przefiltrowany pasmowo-przepustowo dla pasma sigma pokazano powyżej. Niebieski obszar reprezentuje początek hałasu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2A (górny panel) pokazuje 100-minutowe odcinki spontanicznych zachowań związanych ze snem i czuwaniem, rejestrowane przez elektrody polisomnograficzne wszczepione zgodnie z opisem (patrz Rysunek 1). Wzrosty i spadki amplitudy EEG i EMG przy początku snu innego niż REM są wyraźnie widoczne. Przerywany sen REM charakteryzuje się spadkiem amplitudy EEG i dalszym spadkiem tonu EMG, który nie jest widoczny w te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak ustalić ciągły profil czasowy snu innego niż REM, który integruje zmienne EEG, EMG i EKG. Jest to pierwszy krok w kierunku opracowania integracyjnego opisu snu myszy, który może pomóc w zidentyfikowaniu wcześniej nierozpoznanej skali czasowej, w której organizowana jest wysoka i niska odporność na hałas podczas snu innego niż REM1. Podobna struktura czasowa została również opisana w ludzkim śnie nie-REM za pomocą analogicznej analizy1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium za ich wkład w napisanie i uważne przeczytanie tego manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni Paulowi Frankenowi za inspirujące dyskusje, dr Gisèle Ferrand za pomocne komentarze na temat protokołu chirurgicznego oraz dr Jean-Yves Chatton za dostarczenie oryginalnych plików wykonywalnych Labview do ekspozycji na hałas. Finansowanie zostało zapewnione przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty 31003A_146244 i 31003A_166318) oraz Etat de Vaud.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-składnikowy klej epoksydowyHenkelLoctite EA 3450
Wchłanialne włókno szyjące (Prolen)Ethicon5-0 FS-3
Kleszcze AdsonFST11006-12
Wacik antyseptycznyVWR149-0332
Attane IsofluranePiramalIsofluran 250mL
Złącza 3 x 2-kanałoweENA AG2.316Raster 2,54 x 2,54 mm; rozmiar 5 x 8 x 9 mm; rozmiar pinu 5 mm; http://www.ena.ch/
KomutatorDragonfly Model#SL-10
Wzmacniacz EMBLAEMBLACienkie
nożyczkiFST14108-09
Śruba stalowa z płaskim pozłacanaJ.I. MorrisFF00CE125https://jimorrisco.com/
Złoty drutCMSAT.69 5grhttp://www.cmsa.ch/en/
Gąbka hemostatycznaPfizerGelfoam
środek dezynfekujący na bazie jodu (Betadine)Mundipharmastandardowy roztwór 60mL
Komet stal wiertnicza 1/005PM104UNOR AG22310
Oprogramowanie do analizy MatlabMathWorksR2016bhttps://ch.mathworks.com/products/matlab.html
MicrodrillFine Science Tools96758
Uchwyt głowicy do znieczulenia gazem dla myszyKopf InstrumentsModel 923-BMaść http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/
okulistycznaPharmamedicaVITA-POS
Paladur (płyn)UNOR AG2260215do cementu dentystycznego
Palavit (proszek)UNOR AG5410929do cementu dentystycznego
Rama stereotaktyczna dla małych zwierzątKopf InstrumentsModel 930http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/
Drut lutowniczyRegulator temperatury Stannol593072
- Mini sonda doodbytniczaPhymep4090502http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/
Regulator temperatury - poduszka grzewczaPhymep4090205http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/
Wzmacniacz

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lecci, S., et al. Coordinated infra-slow neural and cardiac oscillations mark fragility and offline periods in mammalian sleep. Sci Adv. 3 (2), 1602026(2017).
  2. Rechtschaffen, A., Kales, A. A manual of standardized terminology, techniques and scoring system for sleep of human subjects. U.S. Department of Health, Education, and Welfare. , Washington, DC. (1968).
  3. Blake, H., Gerard, R. W. Brain potentials during sleep. Am J Physiol. 119, 692-703 (1937).
  4. Rechtschaffen, A., Hauri, P., Zeitlin, M. Auditory awakening threshold in REM and NREM sleep stages. Percept Mot Skills. 22 (3), 927-942 (1966).
  5. Achermann, P., Borbély, A. A. Low-frequency (< 1 Hz) oscillations in the human sleep electroencephalogram. Neuroscience. 81 (1), 213-222 (1997).
  6. Aeschbach, D., Borbély, A. A. All-night dynamics of the human sleep EEG. J. Sleep Res. 2 (2), 70-81 (1993).
  7. Astori, S., Wimmer, R. D., Lüthi, A. Manipulating sleep spindles--expanding views on sleep, memory, and disease. Trends Neurosci. 36 (12), 738-748 (2013).
  8. Brown, R. E., Basheer, R., McKenna, J. T., Strecker, R. E., McCarley, R. W. Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev. 92 (3), 1087-1187 (2012).
  9. Buzsáki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  10. Rasch, B., Born, J. About sleep's role in memory. Physiol Rev. 93 (2), 681-766 (2013).
  11. Halász, P., Bòdizs, R. Dynamic structure of NREM sleep. , Springer. (2013).
  12. Terzano, M. G., Parrino, L., Spaggiari, M. C. The cyclic alternating pattern sequences in the dynamic organization of sleep. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 69 (5), 437-447 (1988).
  13. Gottesmann, C. Detection of seven sleep-waking stages in the rat. Neurosci Biobehav Rev. 16 (1), 31-38 (1992).
  14. Benington, J. H., Kodali, S. K., Heller, H. C. Scoring transitions to REM sleep in rats based on the EEG phenomena of pre-REM sleep: an improved analysis of sleep structure. Sleep. 17 (1), 28-36 (1994).
  15. Sullivan, D., Mizuseki, K., Sorgi, A., Buzsáki, G. Comparison of sleep spindles and theta oscillations in the hippocampus. J Neurosci. 34 (2), 662-674 (2014).
  16. Vas, S., et al. Differential adaptation of REM sleep latency, intermediate stage and theta power effects of escitalopram after chronic treatment. J Neural Transm (Vienna). 120 (1), 169-176 (2013).
  17. Schiffelholz, T., Aldenhoff, J. B. Novel object presentation affects sleep-wake behavior in rats. Neurosci Lett. 328 (1), 41-44 (2002).
  18. Wimmer, R. D., et al. Sustaining sleep spindles through enhanced SK2-channel activity consolidates sleep and elevates arousal threshold. J Neurosci. 32 (40), 13917-13928 (2012).
  19. Fernandez, L. M. J., et al. Highly dynamic spatiotemporal organization of low-frequency activities during behavioral states in the mouse cerebral cortex. Cereb Cortex. , (2016).
  20. Franken, P. Long-term vs. short-term processes regulating REM sleep. J Sleep Res. 11 (1), 17-28 (2002).
  21. Feige, B., et al. The microstructure of sleep in primary insomnia: an overview and extension. Int J Psychophysiol. 89 (2), 171-180 (2013).
  22. Parrino, L., Halasz, P., Tassinari, C. A., Terzano, M. G. CAP, epilepsy and motor events during sleep: the unifying role of arousal. Sleep Med Rev. 10 (4), 267-285 (2006).
  23. Akinseye, O. A., et al. Sleep as a mediator in the pathway linking environmental factors to hypertension: a review of the literature. Int J Hypertens. 2015, 926414(2015).
  24. Campbell, K., Muller-Gass, A. The extent of processing of near-hearing threshold stimuli during natural sleep. Sleep. 34 (9), 1243-1249 (2011).
  25. Nir, Y., Vyazovskiy, V. V., Cirelli, C., Banks, M. I., Tononi, G. Auditory responses and stimulus-specific adaptation in rat auditory cortex are preserved across NREM and REM sleep. Cereb Cortex. 25 (5), 1362-1378 (2015).
  26. Dang-Vu, T. T., et al. Interplay between spontaneous and induced brain activity during human non-rapid eye movement sleep. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (37), 15438-15443 (2011).
  27. Elton, M., et al. Event-related potentials to tones in the absence and presence of sleep spindles. J Sleep Res. 6 (2), 78-83 (1997).
  28. McKinney, S. M., Dang-Vu, T. T., Buxton, O. M., Solet, J. M., Ellenbogen, J. M. Covert waking brain activity reveals instantaneous sleep depth. PLoS One. 6 (3), 17351(2011).
  29. Mang, G. M., Franken, P. Sleep and EEG phenotyping in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 2 (1), 55-74 (2012).
  30. Borbély, A. A., Tobler, I., Hanagasioglu, M. Effect of sleep deprivation on sleep and EEG power spectra in the rat. Behav Brain Res. 14 (3), 171-182 (1984).
  31. Jurysta, F., et al. The impact of chronic primary insomnia on the heart rate--EEG variability link. Clin Neurophysiol. 120 (6), 1054-1060 (2009).
  32. Silvani, A., Calandra-Buonaura, G., Benarroch, E. E., Dampney, R. A. L., Cortelli, P. Bidirectional interactions between the baroreceptor reflex and arousal: an update. Sleep Med. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza EEG i ECoGmonitorowanie EMG i ECGzapis polisomnograficznycykle snu non REMprotok stymulacji akustycznejdynamika mocy pasma sigma

Powiązane artykuły