Artykuł metodologiczny

Nowe metody badania kodowania smaku

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55868

⸱

29 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Max Planck Institute for Brain Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy trzy nowe metody do nauki kodowania smakowego. Posługując się prostym zwierzęciem, Manduca sexta (Manduca), opisujemy protokół preparacji, użycie zewnątrzkomórkowych tetrod do rejestrowania aktywności wielu neuronów receptorów smakowych oraz system dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów degustacji.

Streszczenie

Zmysł smaku pozwala zwierzętom wykrywać substancje chemiczne w środowisku, co prowadzi do zachowań krytycznych dla przetrwania. Kiedy neurony receptorów smakowych (GRN) wykrywają cząsteczki smakowe, kodują informacje o tożsamości i stężeniu smaku jako wzorce aktywności elektrycznej, które następnie rozchodzą się do neuronów podążających w mózgu. Wzorce te stanowią wewnętrzne reprezentacje degustatora, które następnie pozwalają zwierzęciu wybierać działania i tworzyć wspomnienia. Wykorzystanie stosunkowo prostych modeli zwierzęcych było potężnym narzędziem do badania podstawowych zasad kodowania sensorycznego. W tym miejscu proponujemy trzy nowe metody badania kodowania smakowego za pomocą Manduca sexta. W pierwszej kolejności przedstawiamy procedurę preparacyjną w celu odsłonięcia nerwów szczękowych i strefy podprzełykowej (SEZ), pozwalającą na rejestrację aktywności GRN z ich aksonów. Po drugie, opisujemy zastosowanie elektrod zewnątrzkomórkowych do rejestrowania aktywności wielu GRN poprzez umieszczenie drutów tetrodowych bezpośrednio w nerwie szczękowym. Po trzecie, prezentujemy nowy system do dostarczania i monitorowania, z dużą precyzją czasową, impulsów o różnych smakach. Metody te pozwalają na scharakteryzowanie odpowiedzi neuronalnych in vivo bezpośrednio z GRN przed, w trakcie i po dostarczeniu degustantów. Podajemy przykłady śladów napięcia zarejestrowanych z wielu GRN i przedstawiamy przykład, w jaki sposób technika sortowania szczytów może być zastosowana do danych w celu identyfikacji odpowiedzi poszczególnych neuronów. Wreszcie, aby zweryfikować nasze podejście do nagrywania, porównujemy nagrania zewnątrzkomórkowe uzyskane z GRN z tetrodami z nagraniami wewnątrzkomórkowymi uzyskanymi za pomocą ostrych elektrod szklanych.

Wprowadzenie

Systemy smakowe i węchowe generują wewnętrzne reprezentacje substancji chemicznych w środowisku, powodując percepcję smaków i zapachów. Te zmysły chemiczne są niezbędne do wywoływania wielu zachowań krytycznych dla przetrwania organizmu, od znajdowania partnerów i posiłków po unikanie drapieżników i toksyn. Proces rozpoczyna się, gdy chemikalia środowiskowe oddziałują z receptorami znajdującymi się w błonach plazmatycznych komórek receptorów czuciowych; Komórki te, bezpośrednio lub poprzez interakcje z neuronami, przekazują informacje o tożsamości i stężeniu substancji chemicznych na sygnały elektryczne. Sygnały te są następnie przekazywane do neuronów wyższego rzędu i do innych struktur mózgu. Wraz z postępem tych etapów, pierwotny sygnał zawsze ulega zmianom, które promują zdolność organizmu do wykrywania, rozróżniania, klasyfikowania, porównywania i przechowywania informacji sensorycznych oraz do wyboru odpowiedniego działania. Zrozumienie, w jaki sposób mózg przekształca informacje o substancjach chemicznych w środowisku, aby jak najlepiej wykonywać różnorodne zadania, jest podstawowym pytaniem w neurobiologii.

Kodowanie smakowe zostało uznane za stosunkowo proste: szeroko rozpowszechniony pogląd zakłada, że każda cząsteczka chemiczna, która wywołuje smak ("smak") naturalnie należy do jednej z około pięciu podstawowych jakości smakowych (tj. słodkiej, gorzkiej, kwaśnej, słonej i umami) 1. W owym "podstawowym ujęciu smakowym" zadaniem systemu smakowego jest ustalenie który z owych podstawowych smaków jest obecny. Co więcej, mechanizmy neuronalne leżące u podstaw podstawowej reprezentacji smaku w układzie nerwowym są niejasne i uważa się, że są regulowane przez "linię oznaczoną" 2,3,4,5,6 lub "wzorzec w poprzek włókna" 7,8 kod. W oznaczonym kodzie wiersza każda komórka czuciowa i każdy z jej neuronalnych zwolenników reaguje na pojedynczą jakość smaku, razem tworząc bezpośredni i niezależny kanał do wyższych ośrodków przetwarzania w ośrodkowym układzie nerwowym dedykowanych temu smakowi. W przeciwieństwie do tego, w kodzie wzoru włóknistego, każda komórka czuciowa może reagować na wiele cech smakowych, tak że informacje o degustacji są reprezentowane przez ogólną odpowiedź populacji neuronów czuciowych. Nie jest jasne, czy informacje smakowe są reprezentowane przez podstawowe gusta, przez oznaczone linie, czy przez jakiś inny mechanizm, i jest przedmiotem ostatnich badań 3,8,9,10,11,12. Nasze ostatnie badania sugerują, że system smakowy wykorzystuje czasoprzestrzenny kod populacji do generowania reprezentacji poszczególnych degustacji, a nie podstawowych kategorii smakowych 10.

Tutaj oferujemy 3 nowe narzędzia do pomocy w nauce kodowania smakowego. Po pierwsze, sugerujemy użycie Manduca sexta jako stosunkowo prostego organizmu modelowego podatnego na elektrofizjologiczne badanie smaku i opisujemy procedurę sekcji. Po drugie, sugerujemy użycie zewnątrzkomórkowych "tetrod" do rejestrowania aktywności poszczególnych GRN. I po trzecie, proponujemy nowe urządzenie do dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów smaku do zwierzęcia. Narzędzia te zostały zaadaptowane z technik stosowanych przez nasze laboratorium i inne do badania układu węchowego.

Owady, takie jak muszka owocowa Drosophila melanogaster, szarańcza Schistocerca americana, a także Manduca sexta, przez dziesięciolecia dostarczały potężnych zasobów do zrozumienia podstawowych zasad dotyczących układu nerwowego, w tym kodowania sensorycznego (np. węch 13). U ssaków receptory smaku to wyspecjalizowane komórki, które komunikują się z neuronami poprzez złożone szlaki drugiego przekaźnika 1,14. U owadów jest prościej: ich receptorami smaku są neurony. Co więcej, szlaki smakowe ssaków w pobliżu peryferii są stosunkowo złożone, obejmują wiele, równoległych tras neuronowych, a dostęp do ważnych komponentów jest trudny, ponieważ znajdują się one w małych strukturach kostnych 15. Ścieżki smakowe owadów wydają się być prostsze. U owadów GRN są zawarte w wyspecjalizowanych strukturach znanych jako sensilla, znajdujących się w antenie, aparatach gębowych, skrzydłach i nogach 16,17. GRN bezpośrednio rzutują na strefę podprzełykową (SSE), strukturę, której rola została uznana za głównie smakową 17, i która zawiera neurony smakowe drugiego rzędu 10. Stamtąd informacja wędruje do ciała, aby kierować odruchami, i do wyższych obszarów mózgu, gdzie jest integrowana, przechowywana i ostatecznie kieruje wyborami behawioralnymi 16.

Konieczne jest scharakteryzowanie peryferyjnych reakcji smakowych, aby zrozumieć, w jaki sposób informacje o smaku są rozpowszechniane i przekształcane z punktu do punktu w całym układzie nerwowym. Najczęściej stosowaną metodą bezpośredniego monitorowania aktywności neuronalnej GRN u owadów jest technika zapisu końcówek 12,18,19,20,21,22,23. Polega to na umieszczeniu elektrody bezpośrednio na czujniku, z których wiele jest stosunkowo łatwo dostępnych. Degustator jest zawarty w elektrodzie, co pozwala na aktywację i zewnątrzkomórkowy pomiar odpowiedzi neuronalnych GRN w czułce. Ponieważ jednak degustant jest zawarty w elektrodzie, nie jest możliwe zmierzenie aktywności GRN przed dostarczeniem degustatora lub po jego usunięciu, ani wymiana degustantów bez wymiany elektrody 20. Inna metoda, technika nagrywania "ściany bocznej", została również wykorzystana do rejestrowania aktywności GRN. W tym przypadku elektroda rejestrująca jest umieszczana w podstawie czujnika smaku 24, a degustacje są dostarczane przez oddzielną szklaną kapilarnę na końcu sensillum. Obie techniki ograniczają zapis z GRN do określonego sensillum. W tym miejscu proponujemy nową technikę: nagrywanie z losowo wybranych aksonów GRN z różnych sensyli, przy jednoczesnym oddzielnym dostarczaniu sekwencji degustacji do trąbki. Zapisy aksonów uzyskuje się poprzez umieszczenie ostrych elektrod szklanych lub wiązek elektrod zewnątrzkomórkowych (tetrod) w nerwie, który przenosi aksony z GRN w trąbce do SSE 10. U Manduca aksony te przechodzą przez nerw szczękowy, o którym wiadomo, że jest czysto aferentny, co pozwala na jednoznaczne rejestrowanie reakcji sensorycznych 25. Ta metoda zapisu z aksonów pozwala przez ponad dwie godziny na stabilny pomiar odpowiedzi GRN przed, w trakcie i po serii prezentacji degustacyjnych.

Tutaj opisujemy procedurę preparacji w celu odsłonięcia nerwów szczękowych razem z SSE, która pozwala na jednoczesne rejestrowanie odpowiedzi wielu GRN i neuronów w SSE 10. Opisujemy również wykorzystanie zewnątrzkomórkowych nagrań GRN przy użyciu specjalnie wykonanej 4-kanałowej tetrody ze skrętu drutowego, która w połączeniu z metodą sortowania kolców pozwala na analizę wielu (w naszych rękach do sześciu) GRN jednocześnie. Następnie porównujemy nagrania wykonane tetrodami z nagraniami wykonanymi za pomocą ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych. Na koniec opisujemy nowy aparat do dostarczania bodźców smakowych. Nasz nowy aparat, zaadaptowany ze sprzętu od dawna używanego przez wielu badaczy do dostarczania substancji zapachowych w badaniach węchowych, oferuje korzyści w badaniu smaku: ulepsza poprzedni wielokanałowy system dostarczania, taki jak te opracowane przez Stürckowa i współpracowników (patrz referencje 26,27), nasz aparat osiąga precyzyjną kontrolę nad czasem dostarczania degustacji, zapewniając jednocześnie odczyt napięcia tego czasu; Pozwala też na szybkie, sekwencyjne dostarczanie wielu smacznych bodźców 10. Aparat kąpie trąbkę w stałym strumieniu czystej wody, do której mogą być dostarczane kontrolowane impulsy smaku. Każdy impuls smakowy przechodzi przez trąbkę, a następnie jest wypłukiwany. Degustatory zawierają niewielką ilość bezsmakowego barwnika spożywczego, dzięki czemu czujnik koloru może monitorować, z precyzyjnym wyczuciem czasu, przejście smaku przez trąbkę.

Protokół

Uwaga: Drobne, proszkowate łuski uwalniane przez Manduca mogą wywoływać reakcje alergiczne, dlatego zaleca się stosowanie laboratoryjnych rękawic ochronnych oraz maseczki ochronnej.

1. Disekcja Manduca sexta w celu odsłonięcia nerwów szczękowych i SEZ

  1. Wybierz odpowiednią ćmę dowolnej płci w oparciu o następujące cechy: trzy dni po wykluciu, ogólny zdrowy wygląd (skrzydła powinny być w pełni rozpostarte, a ssawka i czułki nienaruszone).
    1. Umieść ćmę pojedynczo w plastikowym kubku w celu transportu.
  2. Wsuń ćmę do rurki z polipropylenu.
    Uwaga: Zaleca się wykonywanie tego kroku w dygestorium, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się proszkowych łusek ćmy.
    1. Rurka powinna być nieco dłuższa niż ciało ćmy (Rysunek 1A). Rurkę można wykonać, odcinając fragment rurki z polipropylenu o pojemności 15 mL.
    2. Wsuwaj ćmę, aż głowa zostanie odsłonięta, a następnie wprowadź zgniecioną chusteczkę higieniczną do przeciwległego końca rurki, aby pomóc w unieruchomieniu ćmy (Rysunek 1A).
  3. Usuń owłosienie z odsłoniętej głowy ćmy (strona brzuszna i grzbietowa), wydmuchując na nią sprężone powietrze.
    1. Strumień powietrza można uzyskać, łącząc strzykawkę (1 mL z igłą, średnica wewnętrzna ok. 1,4 mm, po usunięciu ostrego czubka) ze źródłem sprężonego powietrza.
      Uwaga: Po usunięciu owłosienia wszystkie kolejne kroki mogą być wykonywane poza dygestorium.
  4. Po usunięciu większości owłosienia umieść rurkę w komorze mocującej stroną grzbietową głowy do góry, jak pokazano na Rysunku 1B.
    1. Na szalce Petriego użyj plasteliny, aby zbudować trójkątną podstawę o długości około 7 cm i wysokości 2,5 cm (Rysunek 1B).

Schemat anatomii owada, etykiety: ciało, głowa, czułek, ssawka; zamocowany na glinie modelarskiej, szalka Petriego.
Rycina 1Przygotowanie komory sekcyjnej do Manduca. (A) Ćma zostaje unieruchomiona w probówce. Głowa wystaje z jednego końca, natomiast drugi koniec jest zatkany papierową chusteczką. (B) Przedstawiono komorę sekcyjną wykonaną z szalki Petriego i plasteliny. Grzbietowa część głowy jest skierowana ku górze. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Należy chronić czułki i aparat gębowy.
    1. Przygotuj 3 małe probówki, odcinając końcówki pipet (końcówki żółte, 1-200 µL) za pomocą żyletki na 3 części o długości około 0,5 cm. Średnica wewnętrzna powinna być wystarczająco duża, aby antena i proboscis (trąbek) ściśle w nich pasowały.
    2. Przygotuj haczyk, wyginając drut (2 AWG, o długości około 7 cm). Rozwiń ssawkę ćmy, a następnie wprowadź ją do jednej z małych rurek, przeciągając drutem z haczykiem, aż rurka dotrze do proksymalnej części ssawki.
    3. Przymocuj małą probówkę za pomocą twardego wosku batikowego (używając np. elektrycznego woskownika stomatologicznego do topienia i nakładania wosku) do grzbietnej części torebki głowowej ćmy (Rycina 2A lewa).
    4. Każdą antenę należy umieścić w probówce, a następnie zabezpieczyć probówki woskiem batikowym, jak pokazano w Rysunek 2A (lewa). Należy uważać, aby nie uszkodzić czułków gorącym woskiem.
  2. Ustabilizuj mózg przeciwko przemieszczaniu, przecinając mięśnie pokrywające przednią powierzchnię mózgu (t. j. mięsień rozpłaszczający policzka).
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając nożyczek do mikrosekcji lub mini-siekiery wykonanej z odłamka żyletki przyklejonego do wykałaczki, otwórz torebkę głowową, wykonując niewielkie nacięcie tuż poniżej ssawki (Rycina 2A, lewy górny wstawka).
    2. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji przeciąć mięsień zwieracz policzka (rys. patrz w materiałach referencyjnych) 25). Ponieważ mięsień nie jest łatwo widoczny, w celu potwierdzenia jego przecięcia zaleca się przeprowadzenie następującego testu behawioralnego.
    3. Rozcieńczyć sacharozę w wodzie destylowanej, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 M.
    4. Za pomocą pipety nanieść około 200 µL roztworu sacharozy do dystalnych 2/3 proboscis i obserwować proboscis przez 5 min. Jeśli mięsień został prawidłowo przecięty, owad nie powinien być w stanie wysunąć ani poruszyć proboscis.
    5. Nałóż warstwę roztopionego wosku do techniki batik, aby uszczelnić otwór w torebce głownej.
  3. Odwróć owada tak, aby strona brzuszna kapsuły głowowej była skierowana do góry.
  4. Aby zapewnić perfuzję soli fizjologicznej w trakcie i po zabiegu sekcyjnym, należy utworzyć z wosku pierścień wokół brzusznej strony głowy, używając elektrycznego aplikatora do wosku: pod mikroskopem sekcyjnym należy rozpocząć tworzenie pierścienia, nakładając pierwszy rząd wosku wzdłuż przedniej części głowy, przesuwając się ku tyłowi. Trąbekle oraz rurki czułków powinny pozostać wewnątrz pierścienia (Rycina 2A prawo).
    1. Kontynuuj budowanie kubka na zewnątrz i w górę, aż osiągnie on poziom oczu.
  5. Używając pęsety, chwyć jeden z dwóch palpi labialnych, a następnie odsuń go na bok i przymocuj do kubka woskowego, dodając więcej roztopionego wosku. Postąp analogicznie z drugim palpem szczękowym (Rysunek 2A prawą).
  6. Uszczelnij wszelkie otwory w uchwycie woskowym i probówkach.
    Uwaga: Na tym etapie zastosowano żywicę epoksydową, ponieważ ułatwia ona uszczelnianie szczelin wosku i rurkach oraz pozwala uniknąć uszkodzeń anten i ssawki wywołanych działaniem ciepła.
    1. Użyj wykałaczki do wymieszania dwuskładnikowej żywicy epoksydowej w plastikowej miseczce do mieszania. Zachowaj miseczkę.
    2. Za pomocą wykałaczki nanieś cienką warstwę żywicy epoksydowej na zewnątrz i do wnętrza naczynia (Rysunek 2B).
    3. Wypełnić żywicą epoksydową pustą przestrzeń w probówkach zawierających aparat gębowny i czułki, a następnie wypełnić część probówki z polipropylenu otaczającą szyjkę odpowiednią ilością żywicy epoksydowej, aby mocno ją unieruchomić (Rycina 2B).
    4. Pozostawić żywicę epoksydową do wyschnięcia na około 20 min. Aby to sprawdzić, należy przetestować żywicę pozostałą w plastikowym naczyniu do mieszania, upewniając się, że jest ona stała i nie jest już lepka.
    5. Napełnić foremkę woskową za pomocą Manduca sól fizjologiczna 28 należy odczekać kilka minut, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Jeśli widoczny jest wyciek, należy spróbować go uszczelnić, nakładając więcej gorącego wosku i/lub żywicy epoksydowej.

Eksperyment z anatomii owadów; wosk i żywica epoksydowa w widoku grzbietowym i brzusznym; identyfikacja mięśni.
Rycina 2Przygotowywanie Manduca do sekcji. (A) Czułki i proboscis są zabezpieczone wewnątrz małych rurek wykonanych z końcówek pipet przeciętych na trzy fragmenty o długości około 0,5 cm. (Lewy panel, duże zdjęcie) Rurki są mocowane za pomocą roztopionego wosku batikowego naniesionego wokół grzbietowej części głowy. (Lewy panel, wstawka) Aby usunąć mięsień zwężacz gęby, stronę grzbietową torebki głowowej otwiera się, wykonując małe nacięcie wskazane linią przerywaną na dużym zdjęciu. (Prawy panel) Wokół strony brzusznej głowy tworzy się woskowy kubek, który służy jako rezerwuar do perfuzji soli fizjologicznej podczas procedury sekcyjnej i eksperymentów rejestracyjnych. (B) Żywicy epoksydowej używa się do uszczelniania szczelin między podstawą woskowego kubka a grzbietową częścią głowy (panel lewy) oraz między woskiem a rurkami zawierającymi czułki i chلقnięć, w tym otworami rurek (panel prawy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą nożyczek do mikrodissekcji, odetnij palpy gębowe.
  2. Użyj nożyczek do mikrodisekcji lub mini-siekiery, aby otworzyć stronę brzuszną torebki głowy, wykonując cztery nacięcia: dwa nacięcia wzdłuż kutykuli otaczającej każde oko, od tyłu do przodu, jedno nacięcie w kutykuli wzdłuż tyłu głowy oraz jedno nacięcie w kutykuli wzdłuż przodu głowy w pobliżu trąbki (Rycina 3A).
  3. Ostrożnie odsunąć kutykulę za pomocą szczypców mikrodisekcyjnych, aby odsłonić mózg.
  4. Używając dwóch ostrych pęset do mikrosekcji, powoli i ostrożnie usuń tkankę tłuszczową oraz tchawicę pokrywającą SEZ. Unikaj uszkodzenia mózgu lub nerwów (np. nerwu szczękowego, nerwu wzrokowego, połączeń szyjnych). Płucz mózg, często wymieniając roztwór soli fizjologicznej, i regularnie koryguj ustawienie światła w celu poprawy widoczności. Uwaga: Może to być krytyczny etap sekcji; łatwo jest nieumyślnie uszkodzić nerw szczękowy poprzez jego szarpanie lub zmiażdżenie.
    Uwaga: Na tym etapie SEZ oraz nerwy szczękowe powinny być wyraźnie widoczne (Rysunek 3B-3C). Jednakże mózg i nerwy szczękowe są pokryte cienką osłoną.
  5. Aby usunąć osłonkę, należy zastąpić sól fizjologiczną w naczyniu woskowym 10% (w/v) roztworem kolagenazy/dispazy w soli fizjologicznej i pozostawić go na 5 min. Następnie, po kilkukrotnym wypłukaniu mózgu solą fizjologiczną, ostrożnie usunąć osłonkę za pomocą superprecyzyjnej pęsety do mikrosekcji, wyciągając ją z obszaru SEZ przez nerwy szczękowe.
  6. Rozpocząć perfuzję kubka woskowego świeżym roztworem soli fizjologicznej. Umieścić rurkę z linii kroplówki z solą fizjologiczną w kubku woskowym i zamocować ją tam za pomocą roztopionego wosku.

Anatomia aparatów gębowych owadów; diagram z podpisami oraz mikrografie przedstawiające MxNs i SEZ; analiza mikroskopowa.
Rysunek 3: Manduca Procedura sekcji. (APo usunięciu palp gębowych torebka głowy jest otwierana poprzez wykonanie czterech nacięć zgodnie z linią przerywaną.B) Powiększony obraz mózgu po otwarciu torebki głownej i usunięciu tkanki tłuszczowej oraz tchawki, umożliwiający wizualizację nerwów szczękowych (MxNs) i strefy podprzełykowej (SEZ, termin odnoszący się do obszaru mózgu pod przełykiem). Nerwy szczękowe przenoszą aksony z neuronów receptorów smakowych (GRNs) w trąbce do SEZ. (C) Schemat Manduca mózg Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

2. System podawania bodźca smakowego

  1. System podawania tastantu składa się z czterech głównych elementów: źródła wody, rozdzielacza tastantów, czujnika koloru oraz miejsca, w którym znajduje się proboscis, a wszystkie są połączone sztywną plastikową rurką (Rycina 4A-4B). Aby zbudować ten system, należy postępować zgodnie z krokami przedstawionymi na Rycynie 4B. Należy użyć sztywnej plastikowej rurki o długości około 6 cm (średnica wewnętrzna ID 0,3 cm).
  2. Za pomocą lutownicy należy wykonać mały otwór w rurce w miejscu, w którym zostanie umieszczony proboscis (Rycina 4A-4B).
  3. Aby zapewnić, że proboscis różnych osobników zawsze znajdzie się w tym samym miejscu, w rurce należy zamocować plastikowy materiał sitowy (siatka o rozmiarze oczek około 0,1 cm) (Rycina 4A-4B). Przy użyciu żyletki lub narzędzia rotacyjnego należy przeciąć sztywną rurkę około 5 mm powyżej otworu na proboscis. Umieścić siatkę pomiędzy dwoma odcinkami rurki. Zabezpieczyć siatkę i ponownie połączyć rurki, nakładając żywicę epoksydową na zewnątrz rurek. Pozostawić żywicę do wyschnięcia na około 20 min.
  4. Do podawania tastantu należy użyć ciśnieniowego systemu perfuzyjnego z taką liczbą rurek z tastantami, jaka jest wymagana, połączonych z rozdzielaczem (patrz poniżej). Za pomocą lutownicy należy wykonać mały otwór w sztywnej rurce około 1 cm powyżej siatki. Wprowadzić rurkę wyjściową z systemu perfuzyjnego (ID 0,86 mm) do sztywnej rurki i zabezpieczyć ją tam za pomocą żywicy epoksydowej (Rycina 4A-4B).
  5. Należy użyć pompy perystaltycznej do podawania stałego przepływu (~40 mL/min) wody destylowanej. Połączyć ją za pomocą silikonowego wężyka z sztywną rurką (Rycina 4A-4C). Drugi koniec sztywnej rurki należy połączyć z innym wężykiem silikonowym, aby skierować wypływ do dużego pojemnika na odpady (Rycina 4A-4C).
  6. Aby podać tastant, należy wtrysnąć sprężone powietrze do rozdzielacza systemu perfuzyjnego. Można to osiągnąć, na przykład, używając pompy pneumatycznej (10 p.s.i.) sterowanej przez impuls napięcia o określonym czasie trwania, aby wtrysnąć sprężone powietrze do rurki rozdzielacza zawierającej pożądany tastant. Impuls o czasie trwania 1s wyrzuca około 0,5 mL tastantu.

3. Przygotowanie tastantu i monitorowanie jego podawania

  1. Rozcieńczyć substancję smakową w wodzie destylowanej do pożądanego stężenia. Należy pamiętać, że substancja smakowa zostanie dodatkowo rozcieńczona przez strumień wody. Zmierzyliśmy, że stężenie końcowe docierające do aparat proboscis wynosi 77% stężenia początkowego (patrz referencje 10,29).
  2. Do każdego roztworu substancji smakowej dodać sztuczny barwnik spożywczy, aby umożliwić określenie dokładnego momentu przejścia substancji smakowej przez aparat proboscis. Stwierdziliśmy, że zielony barwnik (patrz Lista Materiałów) w stężeniu 0,05% w/v nie aktywuje GRN u Manduca.
  3. Użyć czujnika koloru (patrz Tabela 1) do wykrywania barwnika spożywczego w roztworach substancji smakowej. Użyć lutownicy, aby wykonać otwór obok siatki i 0,5 cm poniżej rurki wylotowej systemu perfuzji (Rycina 4A-4B). Połączyć czujnik z sztywną rurką i zabezpieczyć go w tym miejscu, nakładając żywicę epoksydową na zewnątrz.
    1. Rejestrować wyjściowe napięcie czujnika koloru jako sygnał analogowy wraz z sygnałami fizjologicznymi (patrz sekcja 4). Sygnał napięcia z czujnika koloru może być wzmocniony za pomocą wzmacniacza DC podłączonego do czujnika (Rycina 4A).
  4. Upewnić się, że czujnik koloru działa, podając substancję smakową i rejestrując wyjściowe napięcie czujnika. Sygnał wywołany przez barwnik powinien przekraczać poziom szumów.
    1. Dostosować stały przepływ wody tak, aby sygnał był jak najbliższy przebiegowi prostokątnemu.
      Uwaga: Przy podawaniu kilku substancji smakowych w sekwencji należy pamiętać, że pierwsza próba z nową substancją będzie składać się z mieszaniny nowej i poprzedniej substancji smakowej. Z tego powodu nie analizowaliśmy tych pierwszych prób.

Schemat pompy perystaltycznej z perfuzją 16-kanałową do badań nad smakiem, czujnikiem koloru oraz układem elektrod.
Rycina 4System podawania bodźców dotykowych. (A) Schemat aparatury wykorzystywanej do podawania i monitorowania czasowych impulsów substancji smakowych do trąbki zwierzęcia. Główne komponenty układu oznaczono czerwonymi numerami. Stały przepływ wody destylowanej przez trąbkę jest utrzymywany przez pompę perystaltyczną połączoną silikonowym przewodem z sztywną rurką plastikową (1), w której umieszczana jest trąbka (6). Substancje smakowe zawierające niewielką ilość bezsmakowego barwnika są podawane za pomocą ciśnieniowego, 16-kanałowego systemu perfuzji. Zbiorniki zawierające substancje smakowe są połączone z rozdzielaczem (2), który jest przymocowany do sztywnej rurki powyżej otworu, w którym umieszcza się trąbkę (5). Do systemu perfuzji wtryskiwane jest sprężone powietrze z pompy pneumatycznej w celu szybkiego podania substancji smakowej, przy czym czas podania jest kontrolowany przez dedykowane oprogramowanie. Do monitorowania podawania substancji smakowych służy czujnik koloru (3). Czujnik jest połączony z sztywną rurką w sąsiedztwie trąbki i poniżej wylotu systemu perfuzji substancji smakowych. Sygnał napięciowy z czujnika koloru jest wzmacniany przez wzmacniacz prądu stałego (DC). Czerwona linia na wstawce obok wzmacniacza przedstawia sygnał koloru zarejestrowany za pomocą dedykowanego oprogramowania do akwizycji danych; gwałtowny wzrost i spadek sygnału odzwierciedlają odpowiednio dopływ i wypłukanie substancji smakowej. Trąbkę ćmy umieszcza się w otworze (5) znajdującym się bezpośrednio pod czujnikiem koloru. Nad otworem umieszczono siatkę (4), aby zapewnić, by trąbki różnych osobników były zawsze pozycjonowane w tym samym miejscu. Druga strona sztywnej rurki jest połączona z kolejnym silikonowym przewodem w celu odprowadzenia cieczy do pojemnika na odpady (7). (B) Rysunek przedstawiający główne elementy systemu podawania substancji smakowej połączone z sztywną plastikową rurką, oznaczone czerwonymi numerami zgodnie z panelem A: źródło wody (6), przewody wylotowe kolektora substancji smakowej (2), czujnik koloru (3), siatkę (4) oraz otwór, w który należy wprowadzić cewkę gębową (5), a wszystko to połączone w sztywnej plastikowej rurce (1). (C) Umiejscowienie Manduca Przedstawiono proces przygotowania układu. Dystalna część 2/3 trąbki ćmy zostaje wprowadzona do otworu (5) w sztywnej plastikowej rurce (1). Trąbkę unieruchamia się za pomocą wosku dentystycznego i żywicy epoksydowej, co pokazano na wstawce. Dopływ wody do sztywnej rurki oraz odpływ do pojemnika na odpady oznaczono odpowiednio numerami 6 i 7. Numer 2 wskazuje rurkę wyjściową kolektora substancji smakowych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Zewnątrzkomórkowe rejestrowanie tetrodą w celu monitorowania aktywności GRN wywołanej bodźcami smakowymi

  1. Umieść preparat ćmy na platformie pod stereomikroskopem na stole wibroizolacyjnym (Rysunek 4C).
  2. Wprowadź dystalną dwie trzecie ssawki ćmy do sztywnej rurki systemu podawania substancji smakowych (Rysunek 2B). Aby to zrobić, wyprostuj ssawkę ćmy, a następnie wprowadź ją do otworu sztywnej rurki, delikatnie przesuwając ją za pomocą pęsety anatomicznej. Uszczelnij ssawkę w tym miejscu miękkim woskiem dentystycznym, a następnie warstwą żywicy epoksydowej, aby zapobiec wyciekom (Rysunek 4C, wlot).
  3. Podłącz linię perfuzji solnej do torebki głowowej i ustaw przepływ perfuzji na stałą wartość około 0,04 L/h.
  4. Zanurz elektrodęziemną (t.j. srebrny drut chlorkowany) w kąpieli solnej (Rysunek 5A).
  5. Użyj wykonanej na zamówienie tetrody z kręconego drutu, zbudowanej zgodnie z procedurą wykonania opisaną w 30 (sugeruje się użycie 4 przewodów elektrodowych, aby uzyskać dobrze izolowane jednostki i dopasować je do nerwu). Przed eksperymentem poddaj elektrodę galwanostegowaniu zgodnie z krokami opisanymi w 30.
  6. Użyj manualnego mikromanipulatora, aby ustawić tetrodę blisko nerwu szczękowego. Przesuwaj tetrodę do przodu, aż zacznie wnikać do nerwu (Rysunek 5).
  7. Odczekaj co najmniej 10 min po umieszczeniu tetrody, aby pozwolić jej ustabilizować się wewnątrz nerwu przed rozpoczęciem rejestracji.
  8. Wzmocnij sygnał (30x) i zastosuj filtr pasmowo-przepustowy ustawiony w zakresie 0,3-6 kHz. Rejestruj sygnał z częstotliwością próbkowania 40 kHz przy użyciu oprogramowania do akwizycji danych.
  9. Po zakończeniu eksperymentu umieść preparat ćmy w zamrażarce.

Układ do rejestracji aktywności neuronalnej u owada z zastosowaniem tetrody, elektrod oraz schemat SEZ do badań elektrofizjologicznych.
Rycina 5Rejestracja tetrodowa z GRNs. (A(duży obraz) Do wprowadzenia skręconej elektrody tetrodowej do nerwu szczękowego (MxN) w celu rejestracji aktywności GRN używa się mikromanipulatora. W kąpieli solnej umieszczono srebrową elektrodę odniesienia z chlorkiem, zgodnie z przedstawionym schematem.A, wstawka) Powiększony obraz mózgu przedstawiający tetrodę w nerwie szczękowym. Wskazano również strefę pod przełykową (SEZ). (B) Schemat Manduca mózg zorientowany zgodnie z rys. A. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wyniki

Aktywność GRN można rejestrować za pomocą pozakomórkowej elektrody tetrodowej przed, w trakcie i po podaniu substancji smakowej (Rysunek 6A i 6C). Rysunek 6A (panele środkowy i dolny) przedstawia przefiltrowane (300-6 0 Hz) zapisy napięcia zarejestrowane przez każdy z czterech przewodów umieszczonych w nerwie szczękowym, gdzie można zaobserwować sygnały o różnych amplitudach odzwierciedlające potencjały czynnościowe (strzałki). Impuls substancji smakowej (1 M sacharozy) o czasie trwania 1 s podano 2 s po rozpoczęciu eksperymentu; początek i koniec stymulacji monitorowano za pomocą czujnika koloru (Rysunek 6A, panel górny). Substancja smakowa wywoła kolce, które można zaobserwować w każdym z czterech kanałów (Rysunek 6A, panel środkowy). GRN można zidentyfikować i odróżnić od mechanosensorów (tutaj nieprzedstawionych), gdy reagują one na niektóre substancje smakowe, a na inne nie 10.

Aby zidentyfikować i wyizolować odpowiedzi pojedynczych neuronów z rejestracji tetrodowych, przeprowadziliśmy poza liniową segregację impulsów (spike sorting), korzystając z zestawu funkcji opracowanych na podstawie metod Pouzata 31 oraz Kleinfelda 32,3 (metody te opisano w cytowaniach: 10,29). Rysunek 6B przedstawia przykład segregacji impulsów zastosowanej do danych pokazanych na Rysunku 6A, w której zidentyfikowano trzy dobrze odseparowane jednostki.

Wykresy rastrowe z Rysunku 6C przedstawiają odpowiedzi trzech wyizolowanych jednostek z Rysunku 6B na sześć różnych substancji smakowych (1 M sacharozy, maltozy i NaCl; 100 mM kofeiny oraz 10 mM berberyny i lobeliny) podawanych sekwencyjnie (pokazano 4 próby/substancja). Jak pokazano na Rysunku 6C, zarejestrowane GRN wykazują różny poziom aktywności bazowej, od stanu ciszy (GRN 1) po aktywność niską lub umiarkowaną (GRN 2 i 3). Po podaniu substancji smakowej GRN wykazują zróżnicowane wzorce aktywności i różną selektywność względem bodźców. Na przykład GRN 1 reagowała tylko na sacharozę, podczas gdy GRN 2 reagowała na maltozę i NaCl seriami impulsów (bursts), a na lobelinę impulsami jedynie na początku stymulacji. Ponadto niektóre odpowiedzi są zsynchronizowane z czasem trwania bodźca (np. odpowiedź GRN 1 na sacharozę), podczas gdy inne trwają dłużej niż czas podawania bodźca (np. odpowiedź GRN 3 na berberynę) lub zawierają zarówno komponenty pobudzające, jak i hamujące (np. Rysunek 7, odpowiedzi GRN 2 na NaCl i sacharozę). Więcej informacji na temat zróżnicowanej wrażliwości i wzorców aktywności GRN znajduje się w literaturze 10.

Aby zwalidować zastosowanie tetrody i technik sortowania impulsów (spike-sorting) do rejestracji GRN z nerwu szczękowego, przeprowadzono rejestracje wewnątrzkomórkowe z aksonów GRN u innych zwierząt, wykorzystując konwencjonalne ostre elektrody szklane (oporność 80-120 MΩ). Stwierdzono, że wzorce aktywności uzyskane za pomocą rejestracji wewnątrzkomórkowych były podobne do odpowiedzi zaobserwowanych przy użyciu techniki tetrody (Rysunek 7). Ślady napięcia w zielonej ramce w Panelu A zostały zarejestrowane wewnątrzkomórkowo z GRN 1 podczas 5 następujących po sobie prób prezentacji sacharozy, a te same odpowiedzi przedstawiono jako wykresy rastrowe w panelu B. (Należy zauważyć, że ten typ odpowiedzi odpowiada odpowiedzi uzyskanej za pomocą tetrod i przedstawionej na Rysunku 6C). GRN 2, rejestrowany ostrymi elektrodami wewnątrzkomórkowymi, wykazuje szerszy wzorzec odpowiedzi.

Schemat analizy odpowiedzi neuronalnej; dane elektrofizjologiczne z pomiarami w mikrowoltach i czasem wystąpienia impulsów (spike timings).
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki rejestracji z nerwu szczękowego przy użyciu tetrod elektrozewnątrzkomórkowych. (A) Przedstawiono przefiltrowane (300–60 Hz) przebiegi napięcia zarejestrowane przez każdy z czterech przewodów w obrębie nerwu szczękowego (panel środkowy). W okresie wskazanym czerwonym cieniowaniem w panelu środkowym podano 1-sekundowy impuls substancji smakowej. Początek i koniec stymulacji monitorowano za pomocą czujnika koloru, co wskazano za pomocą czerwonego przebiegu napięcia w panelu górnym, a w panelu środkowym obszar ten oznaczono czerwonym cieniowaniem. Poziome linie przerywane oznaczają wartości +50 (góra), 0 (środek) i -50 (dół) µVPrzedstawiono powiększenie surowych zapisów napięcia odpowiadających obszarowi wewnątrz pionowych linii przerywanych (panel dolny). Przykłady impulsów wskazano strzałkami.B) Przykład sortowania impulsów (spike sorting) zastosowanego do danych przedstawionych na panelu A. Kształty fal zarejestrowane na każdym z czterech elektrod zewnątrzkomórkowych (1-4) zostały zidentyfikowane jako pochodzące od trzech różnych GRN (jednostek 1-3) przyczyniających się do zarejestrowanych sygnałów. Dla trzech jednostek przedstawiono poszczególne zdarzenia (kolorowe cienkie linie) oraz średnią (gruba czarna linia). Aby wiarygodnie zidentyfikować niezależne jednostki przy użyciu metody sortowania impulsów, należy wziąć pod uwagę szereg kryteriów statystycznych (patrz literatura) 10,29). (C) Wykresy rastrowe przedstawiające odpowiedzi trzech wyizolowanych jednostek na sekwencję sześciu różnych substancji smakowych (pokazano 4 próby/substancja). Okres podawania substancji smakowej (1 s) jest zaznaczony obszarem zacienionym na czerwono. Stężenia substancji smakowych wynosiły odpowiednio 1 M (sacharoza, maltoza, NaCl), 10 mM (kofeina) oraz 10 mM (beryna i lobelina). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy napięcie-czas w elektrofizjologii; odpowiedzi GRN na H2O, sacharozę, NaCl; analiza aktywności neuronalnej.
Rysunek 7Rejestracje wewnątrzkomórkowe z aksonów GRN. (A, zielony panel) Zapisy napięcia zarejestrowane z GRN przy użyciu szklanych mikroelektrod wewnątrzkomórkowych (oporność 80–120 MΩ) umieszczonych w nerwie szczękowym, wywołane 5 następującymi po sobie stymulacjami 1 M sacharozą (Suc).B) Wykresy rastrowe odpowiedzi dwóch sieci neuronów zmysłu smaku (GRN), w tym odpowiedzi przedstawione na panelu A (panel w zielonej ramce), na dwa różne substancje smakowe podawane sekwencyjnie (10 mM – kolor czcionki szary; 1 M – kolor czcionki czarny), zarejestrowane za pomocą szklanych mikroelektrod wewnątrzkomórkowych umieszczonych w nerwie szczękowym (pokazano 7 prób/substancję smakową i 3 próby/wodę). Czas podawania substancji smakowej zaznaczono czerwonym cieniowaniem w obu panelach. Początek i koniec stymulacji monitorowano za pomocą czujnika koloru, co wskazują czerwone ślady napięcia u dołu każdego panelu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Opisane tu metody pozwalają na nagrania in vivo ze stosunkowo prostego zwierzęcia, Manduca sexta, w celu scharakteryzowania aktywności wielu, losowo wybranych GRN przez długi czas (przez ponad 2 godziny), przed, w trakcie i po podaniu degustacyjnym. Metody te pozwalają również na szybkie, sekwencyjne dostarczanie wielu bodźców degustacyjnych z precyzyjną kontrolą czasową, co jest przydatne do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw reprezentacji degustacji. Protokół ten został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób odpowiedzi GRN na degustatory są przekształcane, gdy są one przesyłane do ich postsynaptycznych neuronów docelowych (np. w SSE) poprzez monitorowanie GRN jednocześnie z monosynaptycznie połączonymi interneuronami 10. Dodatkowo, metody te mogą być dostosowane do potrzeb eksperymentatora, co pozwala na realizację złożonych paradygmatów w celu zbadania podstawowych aspektów kodowania smakowego.

Na początku naszych badań jednym z problemów technicznych, z którymi czasami musieliśmy się rozwiązywać, była niemożność wykrycia sygnałów impulsowych z nerwu szczękowego za pomocą drutów tetrodowych. Możliwe przyczyny tego są różne, ponieważ protokół sekcji jest trudny i konieczna jest pewna praktyka, aby uzyskać dobre przygotowanie. Po pierwsze, podczas sekcji nerwy szczękowe są łatwe do uszkodzenia, zwłaszcza podczas usuwania osłonki otaczającej tkankę nerwową. Po drugie, jeśli osłonka nie zostanie całkowicie usunięta, druty tetrody mogą nie być w stanie uzyskać dostępu do nerwu. W obu przypadkach rozpoczęcie nowego przygotowania jest często najłatwiejszym sposobem rozwiązania tych problemów. Po trzecie, może wystąpić problem z drutami tetrody. Można to sprawdzić, mierząc impedancję przewodów, która powinna wynosić ~270 kΩ przy 1kHz. Jeśli wartość impedancji przekracza ~300 kΩ, należy galwanizować przewody złotem, aby uzyskać pożądaną impedancję (patrz odniesienie 30). Po czwarte, sprzęt może być źle podłączony lub źle się zachowywać.

Innym możliwym problemem jest to, że sygnały impulsowe są rejestrowane, ale neuron(y) wydają się nie reagować na degustacje. Może to być spowodowane tym, że zarejestrowane neurony są niewrażliwe na dostarczony zestaw degustacji. Należy również pamiętać, że oprócz aksonów GRN, nerw szczękowy przenosi również włókna mechanosensoryczne. W ten sposób możliwe jest nagrywanie z neuronów mechanosensorycznych zamiast lub oprócz GRN. Jednak system dostarczania degustacji został zaprojektowany tak, aby zapewnić stały mechaniczny sygnał wejściowy przez cały czas trwania eksperymentu, co sprawia, że jest mało prawdopodobne, aby reakcje na degustację były zakłócone przez reakcje na mechaniczny składnik jego podania. Neurony, które reagują na niektóre, ale nie na inne smaki, lub w różny sposób na różne smaki, można jednoznacznie sklasyfikować jako GRN. Zalecamy stosowanie świeżo rozcieńczonych degustatorów, aby uniknąć różnic w stężeniu lub składzie degustacji spowodowanych degradacją związku lub odparowaniem rozpuszczalnika. Zalecamy również regularne czyszczenie systemu, aby uniknąć zanieczyszczenia przewodów i/lub przeszkód.

Innym możliwym problemem technicznym jest niekorzystny stosunek sygnału do szumu. Problem ten można często rozwiązać, ponownie chlorując lub regulując położenie elektrody uziemiającej kąpieli. Inne rozwiązania mogą wymagać ekranowania i zminimalizowania długości każdego połączenia elektrycznego w aparacie.

Na koniec należy zauważyć, że prawidłowa analiza danych uzyskanych za pomocą nagrań tetrody wymaga starannego sortowania spajków. Stwierdziliśmy, że w pełni zautomatyzowane metody są na ogół niewystarczające. Zalecamy zapoznanie się z literaturą dotyczącą sortowania spajków przed analizą danych tetrody 10,29,31,32,33.

Można zastosować alternatywy dla naszego protokołu sekcji. Tutaj opisaliśmy rozwarstwienie przez brzuszną część głowy, zapewniając dostęp do nerwów szczękowych i SSE, ale możliwe jest również uzyskanie dostępu do tych struktur poprzez preparację przez stronę grzbietową. Stwierdziliśmy, że przygotowanie od strony grzbietowej nie jest optymalne do wykonywania nagrań z tych struktur smakowych ze względu na ich głębokie położenie, ale to przygotowanie ma tę zaletę, że umożliwia nagrania ze struktur wyższego rzędu, takich jak ciało grzyba, obszar, który jest związany z integracją wielozmysłową, uczeniem się asocjacyjnym i przetwarzaniem pamięci 34. Skupiliśmy się na wykorzystaniu elektrod tetrodowych do nagrywania z nerwu szczękowego, ale, jak zilustrowaliśmy, do tego celu można również użyć standardowych wewnątrzkomórkowych ostrych elektrod. Ponadto obie techniki można łączyć w celu jednoczesnego wykonywania nagrań z wielu obszarów mózgu 10. Literatura neurobiologiczna oferuje wiele przykładów modeli bezkręgowców, które okazały się potężnymi narzędziami do ujawniania podstawowych zasad przetwarzania sensorycznego, takich jak kodowanie węchowe, które mają zastosowanie zarówno do owadów, jak i kręgowców 35,36,37,38,39. Mamy nadzieję, że nasze metody doprowadzą do fundamentalnych nowych spostrzeżeń na temat kodowania smakowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z NIH-NICHD dla M.S. Dziękujemy G. Doldowi i T. Talbotowi z NIH-NIMH Instrumentation Core Facility za pomoc w zaprojektowaniu systemu dostarczania degustacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sekcja i przygotowanie próbki
Probówka polipropylenowa, 15 ml FalconFisher Scientific14-959-53A
Igła, krótki skos, 19 G x 1 - 1/2"   MONOJET888200144Do nakładania powietrza w celu usunięcia włosów z.
Modelina Clay-van Aken Plastalina DickBlick33268
szalka Petriego -100 x 15 mm VWR International89000-304
Końcówka do pipet (1 - 200 &mikro; L)USA Scientific1111-0806
ŻyletkaTechni EdgeTE05-071
Standardowy przewód połączeniowy 22 AWGAlphaWire1551Do wkładania trąbki do końcówki pipety.
Wosk batikowyŻakard7946000
Wosk elektrycznyAlmore International66000
Myscroscope stereoLeicaMZ75
Dumont #1 kleszcze (grube) World Precision Instruments500335Do usuwania tkanki tłuszczowej i nienerwowej.
Kleszcze tytanowe Dumont #5 (cienkie) World Precision Instruments14096Do usuwania tkanki tłuszczowej i nienerwowej.
Kleszczyki do #5SF Dumont (bardzo cienkie)World Precision Instruments500085Do usuwania tkanki nerwowej.
Nożyczki Vannas (cienkie)World Precision Instruments500086Do usuwania naskórka.
Kolagenaza/DyspazaSigma-Aldrich11097113001
EpoksydPermatex84101
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Saline Perfusion System
Zestaw przedłużający z regulatorem przepływu  B Braun Medical Inc.V5200
IV z miejscem wstrzyknięcia Y  B Braun Medical Inc.V1402
NazwaFirma>Numer katalogowyKomentarze
Tastant System dostarczania
Białe przezroczyste rurki nylonowe OD 1/4", ID 1/8"SmallParts Inc.B001JJT4SASztywna rura, która łączy cztery główne elementy systemu.
LutownicaSpecjaliści od obwodówZD200BK
Narzędzie obrotowe-DremelDremel4200
Siatka polipropylenowa, rozmiar otworu (rozmiar otworu 0,1 x 0,13 cm) Siatka przemysłowaXN5170Do zapewnienia, że trąby różnych zwierząt są umieszczone w tym samym miejscu.
Ciśnieniowy 16-kanałowy system perfuzyjny Narzędzia biologicznePS-16HDo degustacji. System ten obejmuje zawory zaciskowe, przewody, kolektor, cylindry roztworu, sterownik zaworu i akcesoria montażowe.
Rurki polipropylenowe, ID 0,034", ID 0,050"Becton, Dickinson & Co427421Rurka wyjściowa z systemu perfuzyjnego.
Pneumatyczne PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820Do sterowania kanałem wyjściowym systemu perfuzyjnego. 
System oprogramowania do akwizycji danych, karta DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4National InstrumentsLabVIEW 2011Do sterowania pompą pico w celu dostarczania degustacji i rejestrowania sygnałów z czujnika koloru.
Compulab 3 Pompa perystaltyczna ManostatSigmaP1366Do pompowania wody.
Rurka silikonowa, ID 1/16" OD 1/8"Cole-ParmerWU-95802-02Do podłączenia źródła wody do rurki pompy perystaltycznej, a rurki wylotowej pompy do sztywnej rurki systemu dostarczania.
Czujnik koloru - cyfrowy czujnik światłowodowyKeyence  FS-V31MDo monitorowania dostawy degustacyjnej. 
Jednostka światłowodowa z czujnikiem koloru odblaskowymKeyenceFU35-FZDo podłączenia czujnika koloru.
Peryferia dentystyczne WoskHenry-Schein Dental6652151Aby zabezpieczyć trąbkę w sztywnej rurce.
o pojemności 3,7 lDo dostarczania wody do systemu i zbierania odpadów wodnych.
Szybki zielony FCF SigmaF7258
Kleszcze opatrunkowe 25,5 cmWPI500364Do wprowadzania trąbki na mole do otworu trąbki w sztywnej rurce.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt do elektrofizjologii
D.C. wzmacniaczBrown-Lee440
LampaSchottSchott Fostec Źródło światła DCR 2
Mikromanipulator ręcznyMikromanipulatorLeicaDo precyzyjnego wprowadzania tetrod do mózgu zwierzęcia. Manipulator musi umożliwiać drobne i zgrubne ruchy w osiach x, y i z.
StereomikroskopLeicaMZ75
Stół z izolacją drgań (stół laboratoryjny MICRO-g)Oscyloskop TMC63-541
Tektronix 
16-kanałowy przedwzmacniacz i wzmacniacz16-kanałowy MA-800 Amplifier System Komputer B.E.S 2013
Delloptiplex 780Poniżej przedstawiono minimalne zalecane wymagania. Pamięć RAM: 3,32 GHz, 3 GB. Procesor: Intel Core  2 Duet. Karta graficzna: zintegrowana Intel GMA X4500.
System oprogramowania do akwizycji danych, karta DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4National InstrumentsLabVIEW 2011Do sterowania pompą pico w celu dostarczania degustacyjnego oraz do rejestrowania sygnałów z czujnika koloru i elektrody.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tastants
KAcSigma-AldrichP5708
LiClSigma-AldrichL9650
NaClSigma-Aldrich73575
SacharozaSigma-Aldrich84097
Zestaw do podawania Dwa pojemniki TDS2014

Bibliografia

  1. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
  2. Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
  3. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  4. Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
  5. Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
  6. Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
  7. Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
  8. Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
  9. Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  10. Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
  11. Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597(2012).
  12. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
  13. Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
  16. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
  17. Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
  18. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  19. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
  20. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355(2014).
  21. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  22. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
  23. Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
  24. Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922(1959).
  25. Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
  26. Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
  27. Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
  28. Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
  29. Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
  30. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
  31. Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
  32. Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
  33. Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
  34. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  35. Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
  36. Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
  37. Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
  38. Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
  39. Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony receptorowe smakuManduca sextarejestracje pozakom rkowerejestracje tetrodowesystem podawania substancji smakowychstrefa pod prze ykiemods oni cie nerwu szcz kowegotechnika sortowania impuls wrejestracje in vivometody kodowania smakowego
Nowe metody badania kodowania smaku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.