Nowe metody badania kodowania smakowego

Summary

Prezentujemy trzy nowe metody do nauki kodowania smakowego. Posługując się prostym zwierzęciem, Manduca sexta (Manduca), opisujemy protokół preparacji, użycie zewnątrzkomórkowych tetrod do rejestrowania aktywności wielu neuronów receptorów smakowych oraz system dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów degustacji.

Abstract

Zmysł smaku pozwala zwierzętom wykrywać substancje chemiczne w środowisku, co prowadzi do zachowań krytycznych dla przetrwania. Kiedy neurony receptorów smakowych (GRN) wykrywają cząsteczki smakowe, kodują informacje o tożsamości i stężeniu smaku jako wzorce aktywności elektrycznej, które następnie rozchodzą się do neuronów podążających w mózgu. Wzorce te stanowią wewnętrzne reprezentacje degustatora, które następnie pozwalają zwierzęciu wybierać działania i tworzyć wspomnienia. Wykorzystanie stosunkowo prostych modeli zwierzęcych było potężnym narzędziem do badania podstawowych zasad kodowania sensorycznego. W tym miejscu proponujemy trzy nowe metody badania kodowania smakowego za pomocą Manduca sexta. W pierwszej kolejności przedstawiamy procedurę preparacyjną w celu odsłonięcia nerwów szczękowych i strefy podprzełykowej (SEZ), pozwalającą na rejestrację aktywności GRN z ich aksonów. Po drugie, opisujemy zastosowanie elektrod zewnątrzkomórkowych do rejestrowania aktywności wielu GRN poprzez umieszczenie drutów tetrodowych bezpośrednio w nerwie szczękowym. Po trzecie, prezentujemy nowy system do dostarczania i monitorowania, z dużą precyzją czasową, impulsów o różnych smakach. Metody te pozwalają na scharakteryzowanie odpowiedzi neuronalnych in vivo bezpośrednio z GRN przed, w trakcie i po dostarczeniu degustantów. Podajemy przykłady śladów napięcia zarejestrowanych z wielu GRN i przedstawiamy przykład, w jaki sposób technika sortowania szczytów może być zastosowana do danych w celu identyfikacji odpowiedzi poszczególnych neuronów. Wreszcie, aby zweryfikować nasze podejście do nagrywania, porównujemy nagrania zewnątrzkomórkowe uzyskane z GRN z tetrodami z nagraniami wewnątrzkomórkowymi uzyskanymi za pomocą ostrych elektrod szklanych.

Introduction

Systemy smakowe i węchowe generują wewnętrzne reprezentacje substancji chemicznych w środowisku, powodując percepcję smaków i zapachów. Te zmysły chemiczne są niezbędne do wywoływania wielu zachowań krytycznych dla przetrwania organizmu, od znajdowania partnerów i posiłków po unikanie drapieżników i toksyn. Proces rozpoczyna się, gdy chemikalia środowiskowe oddziałują z receptorami znajdującymi się w błonach plazmatycznych komórek receptorów czuciowych; Komórki te, bezpośrednio lub poprzez interakcje z neuronami, przekazują informacje o tożsamości i stężeniu substancji chemicznych na sygnały elektryczne. Sygnały te są następnie przekazywane do neuronów wyższego rzędu i do innych struktur mózgu. Wraz z postępem tych etapów, pierwotny sygnał zawsze ulega zmianom, które promują zdolność organizmu do wykrywania, rozróżniania, klasyfikowania, porównywania i przechowywania informacji sensorycznych oraz do wyboru odpowiedniego działania. Zrozumienie, w jaki sposób mózg przekształca informacje o substancjach chemicznych w środowisku, aby jak najlepiej wykonywać różnorodne zadania, jest podstawowym pytaniem w neurobiologii.

Kodowanie smakowe zostało uznane za stosunkowo proste: szeroko rozpowszechniony pogląd zakłada, że każda cząsteczka chemiczna, która wywołuje smak ("smak") naturalnie należy do jednej z około pięciu podstawowych jakości smakowych (tj. słodkiej, gorzkiej, kwaśnej, słonej i umami) 1. W owym "podstawowym ujęciu smakowym" zadaniem systemu smakowego jest ustalenie który z owych podstawowych smaków jest obecny. Co więcej, mechanizmy neuronalne leżące u podstaw podstawowej reprezentacji smaku w układzie nerwowym są niejasne i uważa się, że są regulowane przez "linię oznaczoną" ^2,3,4,5^,6 lub "wzorzec w poprzek włókna" ^7,8 kod. W oznaczonym kodzie wiersza każda komórka czuciowa i każdy z jej neuronalnych zwolenników reaguje na pojedynczą jakość smaku, razem tworząc bezpośredni i niezależny kanał do wyższych ośrodków przetwarzania w ośrodkowym układzie nerwowym dedykowanych temu smakowi. W przeciwieństwie do tego, w kodzie wzoru włóknistego, każda komórka czuciowa może reagować na wiele cech smakowych, tak że informacje o degustacji są reprezentowane przez ogólną odpowiedź populacji neuronów czuciowych. Nie jest jasne, czy informacje smakowe są reprezentowane przez podstawowe gusta, przez oznaczone linie, czy przez jakiś inny mechanizm, i jest przedmiotem ostatnich badań ^{3,8,9,10,11,12}. Nasze ostatnie badania sugerują, że system smakowy wykorzystuje czasoprzestrzenny kod populacji do generowania reprezentacji poszczególnych degustacji, a nie podstawowych kategorii smakowych ¹⁰.

Tutaj oferujemy 3 nowe narzędzia do pomocy w nauce kodowania smakowego. Po pierwsze, sugerujemy użycie Manduca sexta jako stosunkowo prostego organizmu modelowego podatnego na elektrofizjologiczne badanie smaku i opisujemy procedurę sekcji. Po drugie, sugerujemy użycie zewnątrzkomórkowych "tetrod" do rejestrowania aktywności poszczególnych GRN. I po trzecie, proponujemy nowe urządzenie do dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów smaku do zwierzęcia. Narzędzia te zostały zaadaptowane z technik stosowanych przez nasze laboratorium i inne do badania układu węchowego.

Owady, takie jak muszka owocowa Drosophila melanogaster, szarańcza Schistocerca americana, a także Manduca sexta, przez dziesięciolecia dostarczały potężnych zasobów do zrozumienia podstawowych zasad dotyczących układu nerwowego, w tym kodowania sensorycznego (np. węch ¹³). U ssaków receptory smaku to wyspecjalizowane komórki, które komunikują się z neuronami poprzez złożone szlaki drugiego przekaźnika ^1,14. U owadów jest prościej: ich receptorami smaku są neurony. Co więcej, szlaki smakowe ssaków w pobliżu peryferii są stosunkowo złożone, obejmują wiele, równoległych tras neuronowych, a dostęp do ważnych komponentów jest trudny, ponieważ znajdują się one w małych strukturach kostnych ¹⁵. Ścieżki smakowe owadów wydają się być prostsze. U owadów GRN są zawarte w wyspecjalizowanych strukturach znanych jako sensilla, znajdujących się w antenie, aparatach gębowych, skrzydłach i nogach ^16,17. GRN bezpośrednio rzutują na strefę podprzełykową (SSE), strukturę, której rola została uznana za głównie smakową ¹⁷, i która zawiera neurony smakowe drugiego rzędu ¹⁰. Stamtąd informacja wędruje do ciała, aby kierować odruchami, i do wyższych obszarów mózgu, gdzie jest integrowana, przechowywana i ostatecznie kieruje wyborami behawioralnymi ¹⁶.

Konieczne jest scharakteryzowanie peryferyjnych reakcji smakowych, aby zrozumieć, w jaki sposób informacje o smaku są rozpowszechniane i przekształcane z punktu do punktu w całym układzie nerwowym. Najczęściej stosowaną metodą bezpośredniego monitorowania aktywności neuronalnej GRN u owadów jest technika zapisu końcówek ^{12,18,19,20,21,22,23}. Polega to na umieszczeniu elektrody bezpośrednio na czujniku, z których wiele jest stosunkowo łatwo dostępnych. Degustator jest zawarty w elektrodzie, co pozwala na aktywację i zewnątrzkomórkowy pomiar odpowiedzi neuronalnych GRN w czułce. Ponieważ jednak degustant jest zawarty w elektrodzie, nie jest możliwe zmierzenie aktywności GRN przed dostarczeniem degustatora lub po jego usunięciu, ani wymiana degustantów bez wymiany elektrody ²⁰. Inna metoda, technika nagrywania "ściany bocznej", została również wykorzystana do rejestrowania aktywności GRN. W tym przypadku elektroda rejestrująca jest umieszczana w podstawie czujnika smaku ²⁴, a degustacje są dostarczane przez oddzielną szklaną kapilarnę na końcu sensillum. Obie techniki ograniczają zapis z GRN do określonego sensillum. W tym miejscu proponujemy nową technikę: nagrywanie z losowo wybranych aksonów GRN z różnych sensyli, przy jednoczesnym oddzielnym dostarczaniu sekwencji degustacji do trąbki. Zapisy aksonów uzyskuje się poprzez umieszczenie ostrych elektrod szklanych lub wiązek elektrod zewnątrzkomórkowych (tetrod) w nerwie, który przenosi aksony z GRN w trąbce do SSE ¹⁰. U Manduca aksony te przechodzą przez nerw szczękowy, o którym wiadomo, że jest czysto aferentny, co pozwala na jednoznaczne rejestrowanie reakcji sensorycznych ²⁵. Ta metoda zapisu z aksonów pozwala przez ponad dwie godziny na stabilny pomiar odpowiedzi GRN przed, w trakcie i po serii prezentacji degustacyjnych.

Tutaj opisujemy procedurę preparacji w celu odsłonięcia nerwów szczękowych razem z SSE, która pozwala na jednoczesne rejestrowanie odpowiedzi wielu GRN i neuronów w SSE ¹⁰. Opisujemy również wykorzystanie zewnątrzkomórkowych nagrań GRN przy użyciu specjalnie wykonanej 4-kanałowej tetrody ze skrętu drutowego, która w połączeniu z metodą sortowania kolców pozwala na analizę wielu (w naszych rękach do sześciu) GRN jednocześnie. Następnie porównujemy nagrania wykonane tetrodami z nagraniami wykonanymi za pomocą ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych. Na koniec opisujemy nowy aparat do dostarczania bodźców smakowych. Nasz nowy aparat, zaadaptowany ze sprzętu od dawna używanego przez wielu badaczy do dostarczania substancji zapachowych w badaniach węchowych, oferuje korzyści w badaniu smaku: ulepsza poprzedni wielokanałowy system dostarczania, taki jak te opracowane przez Stürckowa i współpracowników (patrz referencje ^26,27), nasz aparat osiąga precyzyjną kontrolę nad czasem dostarczania degustacji, zapewniając jednocześnie odczyt napięcia tego czasu; Pozwala też na szybkie, sekwencyjne dostarczanie wielu smacznych bodźców ¹⁰. Aparat kąpie trąbkę w stałym strumieniu czystej wody, do której mogą być dostarczane kontrolowane impulsy smaku. Każdy impuls smakowy przechodzi przez trąbkę, a następnie jest wypłukiwany. Degustatory zawierają niewielką ilość bezsmakowego barwnika spożywczego, dzięki czemu czujnik koloru może monitorować, z precyzyjnym wyczuciem czasu, przejście smaku przez trąbkę.

Protocol

Uwaga: Drobne, sproszkowane łuski uwalniane przez Manduca mogą być alergizujące, dlatego zaleca się stosowanie laboratoryjnych rękawic ochronnych i maski na twarz.

1. Sekcja Manduca sexta w celu ujawnienia nerwów szczękowych i SSE

1. Wybierz odpowiednią dowolnej płci na podstawie następujących cech: trzy dni po wykwitu z ogólnym zdrowym wyglądem (skrzydła powinny być w pełni rozciągnięte, a trąbka i czułki powinny być nienaruszone).
   1. Umieść pojedynczo w plastikowym kubku do transportu.
2. Włóż do rurki polipropylenowej.
   Ostrzeżenie: Zalecamy wykonanie tej czynności w dygestorium, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się sproszkowanych łusek.
   1. Rurka powinna być nieco dłuższa niż ciało (Rysunek 1A). Rurkę można wykonać poprzez przecięcie rurki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
   2. Popchnij, aż głowa zostanie odsłonięta i włóż zwiniętą w kłębek bibułę do drugiego końca tuby, aby pomóc utrzymać w bezruchu (Rysunek 1A).
3. Usuń włosy z odsłoniętej głowy (brzusznej i grzbietowej), wdmuchując na nią powietrze pod ciśnieniem.
   1. Strumień powietrza można uzyskać, podłączając strzykawkę (1 ml z igłą, średnica wewnętrzna około 1,4 mm, z usuniętą ostrą końcówką) do źródła powietrza pod ciśnieniem.
      Uwaga: Po usunięciu włosów wszystkie poniższe czynności można wykonać na zewnątrz dygestorium.
4. Gdy większość włosów zostanie usunięta, umieść rurkę w komorze podtrzymującej z grzbietową częścią głowy skierowaną do góry, jak pokazano na Rysunek 1B.
   1. Na szalce Petriego użyj plasteliny, aby zbudować trójkątną podstawę o długości około 7 cm i wysokości 2,5 cm (Rysunek 1B).

Rysunek 1: Przygotowanie komory preparacyjnej dla Manduca. (A) jest unieruchomiona w tubie. Głowa jest odsłonięta na jednym końcu, podczas gdy drugi koniec jest zatknięty bibułą. (B) Pokazana jest komora prosektoryjna wykonana z płytki Petriego i plasteliny. Grzbietowa część głowy skierowana jest do góry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Chroń anteny i trąbkę.
   1. Przygotuj 3 małe tubki, przecinając końcówkę pipety (żółte końcówki, 1-200 μl) żyletką na 3 części o długości około 0,5 cm. Średnica wewnętrzna powinna być na tyle duża, aby antena i trąbka mogły dobrze przylegać.
   2. Przygotuj haczyk, zginając drut (22 AWG, o długości około 7 cm). Rozciągnij trąbkę, a następnie włóż ją do jednej z małych rurek, przeciągając ją za pomocą drucianego haka, aż rurka dotrze do bliższej części trąbki.
   3. Przymocuj małą rurkę mocnym woskiem batikowym (używając na przykład elektrycznego wosku dentystycznego do stopienia i skierowania wosku) do grzbietowej części torebki głowy (Rysunek 2A po lewej).
   4. Umieść każdą antenę w tubie i zabezpiecz rurki woskiem batiku, jak pokazano na Rysunek 2A (po lewej). Uważaj, aby nie uszkodzić anten gorącym woskiem.
6. Ustabilizuj mózg przed ruchem, przecinając mięśnie, które pokrywają przednią powierzchnię mózgu (tj. mięsień kompresora policzkowego).
   1. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek do mikropreparacji lub mini-siekiery wykonanej z wióra brzytwy przyklejonego do wykałaczki, aby otworzyć torebkę głowy, wykonując małe nacięcie tuż pod trąbką (Rysunek 2A, lewa górna wstawka).
   2. Użyj nożyczek do mikropreparacji, aby przeciąć mięsień kompresora policzkowego (ilustracje znajdują się w odnośniku ²⁵). Ponieważ mięsień nie jest łatwo widoczny, zaleca się wykonanie następującego testu behawioralnego, aby potwierdzić, że został przecięty.
   3. Rozcieńczyć sacharozę w wodzie destylowanej, aby uzyskać 1 M roztwór.
   4. Za pomocą pipety dostarczyć około 200 μl roztworu sacharozy do dystalnej 2/3 trąbki i obserwować trąbkę przez 5 minut. Jeśli mięsień został prawidłowo przecięty, owad nie powinien być w stanie wyprostować ani przesunąć trąbki.
   5. Nałożyć warstwę stopionego wosku batikowego, aby uszczelnić otwór w kapsule na głowę.
7. Odwróć owada tak, aby brzuszna strona torebki głowy była teraz skierowana do góry.
8. Aby perfuzjować sól fizjologiczną podczas i po zabiegu sekcji, zbuduj miseczkę woskową wokół brzusznej strony głowy za pomocą elektrycznego woskarza: Pod mikroskopem preparacyjnym rozpocznij budowanie kubka, nakładając pierwszy rząd wosku wzdłuż przodu głowy, przesuwając się w kierunku tyłu. Trzymaj rurki trąbki i anteny wewnątrz kubka (Rysunek 2A po prawej).
   1. Kontynuuj budowanie kubka na zewnątrz i w górę, aż osiągnie poziom oczu.
9. Użyj kleszczy, aby wziąć jeden z dwóch palpów wargowych, a następnie umieść go z boku i zabezpiecz w miseczce woskowej, dodając więcej stopionego wosku. Zrób to samo z drugim palpem szczęki (Rysunek 2A po prawej).
10. Uszczelnij wszelkie otwory w pojemniku na wosk i probówkach.
    Uwaga: Na tym etapie stosuje się żywicę epoksydową, ponieważ pomaga ona łatwo uszczelnić szczeliny w wosku i rurkach oraz zapobiega uszkodzeniom anten i trąbki związanym z ciepłem.
    1. Użyj wykałaczki, aby wymieszać dwuskładnikową żywicę epoksydową w plastikowym naczyniu do mieszania. Zachowaj naczynie do miksowania.
    2. Użyj wykałaczki, aby nałożyć cienką warstwę żywicy epoksydowej na zewnątrz i wewnątrz kubka (Rysunek 2B).
    3. Wypełnij pustą przestrzeń w probówkach, które zawierają trąbkę i czułki, żywicą epoksydową i wypełnij część rurki polipropylenowej otaczającej szyjkę wystarczającą ilością żywicy epoksydowej, aby utrzymać ją mocno na miejscu (Rysunek 2B).
    4. Pozostaw żywicę epoksydową do wyschnięcia na około 20 minut. Aby to sprawdzić, przetestuj żywicę epoksydową pozostałą w plastikowym naczyniu do mieszania, aby upewnić się, że jest stała i nie jest już lepka.
    5. Napełnij pojemnik na wosk solą fizjologiczną Manduca ²⁸ i odczekaj kilka minut, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Jeśli widoczny jest wyciek, spróbuj go uszczelnić, nakładając więcej gorącego wosku i/lub żywicy epoksydowej.

Rysunek 2: Przygotowanie manduca do sekcji. (A) Anteny i trąbki są chronione wewnątrz małych probówek wykonanych z końcówek pipet pociętych na trzy części o długości około 0,5 cm. (Lewy panel, duży obraz) Tuby zabezpieczone są roztopionym woskiem batikowym nakładanym w okolicach grzbietowej części głowy. (Lewy panel, wstawka) Aby usunąć mięsień kompresora policzkowego, grzbietową stronę torebki głowy otwiera się, wykonując małe nacięcie, jak wskazuje przerywana linia na dużym obrazie. (Prawy panel) Woskowy kubek jest budowany wokół brzusznej strony głowy jako zbiornik na perfundowaną sól fizjologiczną podczas procedury preparacji i nagrywania eksperymentów. (B) Żywica epoksydowa służy do uszczelniania szczelin między podstawą miseczki woskowej a grzbietową częścią głowy (lewy panel) oraz między woskiem a rurkami zawierającymi czułki i trąbkę, w tym otwory rurek (prawy panel). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

11. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek do mikropreparacji, aby odciąć palpy wargowe.
12. Użyj nożyczek do mikropreparacji lub mini-siekiery, aby otworzyć brzuszną stronę torebki głowy, wykonując cztery cięcia: dwa nacięcia wzdłuż naskórka, który otacza każde oko od tyłu do przodu, jedno nacięcie na naskórku z tyłu głowy i jedno nacięcie na naskórku z przodu głowy w pobliżu trąbki (Ryc. 3A).
13. Delikatnie odciągnij naskórek za pomocą kleszczy do mikropreparacji, aby odsłonić mózg.
14. Za pomocą dwóch ostrych kleszczyków do mikropreparacji powoli i ostrożnie usuwamy tkankę tłuszczową oraz tchawicę pokrywającą SSE. Unikaj uszkodzeń mózgu lub nerwów (np. nerwu szczękowego, nerwu wzrokowego, łącznika szyjnego). Płucz mózg, często wymieniając roztwór soli fizjologicznej i często dostosowuj światło, aby poprawić widoczność. Uwaga: To może być najbardziej krytyczna część sekcji; Łatwo jest przypadkowo uszkodzić nerw szczękowy, ciągnąc go lub miażdżąc.
    Uwaga: W tym momencie SSE i nerwy szczękowe powinny być wyraźnie widoczne (Rysunek 3B-3C). Jednak mózg i nerwy szczękowe są pokryte cienką osłonką.
15. Aby usunąć osłonkę, zastąp sól fizjologiczną w pojemniku na wosk 10% (w/v) kolagenazy/dypazy rozpuszczonej w soli fizjologicznej i pozostaw ją na miejscu na 5 minut. Następnie, po kilkukrotnym przepłukaniu mózgu solą fizjologiczną, delikatnie usuń osłonkę za pomocą bardzo drobnych kleszczy do mikropreparacji, ciągnąc osłonkę od SSE przez nerwy szczękowe.
16. Zacznij perfować kubek woskowy świeżą solą fizjologiczną. Umieść probówkę z linii kroplowej soli fizjologicznej do kubka na wosk i zabezpiecz ją tam stopionym woskiem.

Rysunek 3: Procedura preparacji Manduca. (A) Usunięto palpy wargowe, torebkę głowy otwiera się, wykonując cztery cięcia, jak wskazuje przerywana linia. (B) Powiększony obraz mózgu po otwarciu torebki głowy i usunięciu tkanki tłuszczowej oraz tchawicy, umożliwiający wizualizację nerwów szczękowych (MxN) i strefy podprzełykowej (SEZ, termin odnoszący się do obszaru mózgu pod przełykiem). Nerwy szczękowe przenoszą aksony z neuronów receptora smakowego (GRN) w trąbce do SSE. (C) Schemat mózgu Manduca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. System dostarczania Tastant

1. System dostarczania degustacji składa się z czterech głównych elementów: źródła wody, kolektora smakowego, czujnika koloru i miejsca, w którym znajduje się trąbka, wszystkie połączone ze sztywną rurką z tworzywa sztucznego (Rysunek 4A-4B). Aby zbudować ten system, postępuj zgodnie z krokami pokazanymi w Rysunek 4B. Użyj sztywnej plastikowej rurki o długości około 6 cm (ID 0,3 cm).
2. Użyj lutownicy, aby zrobić mały otwór w rurce, w której zostanie umieszczona trąbka (Rysunek 4A-4B).
3. Aby upewnić się, że trąbki różnych zwierząt są zawsze umieszczane w tym samym miejscu, przymocuj plastikowy materiał sitowy (siatka, rozmiar otworu około 0,1 cm) do rurki (Rysunek 4A-4B). Za pomocą żyletki lub narzędzia obrotowego przeciąć sztywną rurkę około 5 mm powyżej otworu trąbki. Umieść siatkę między dwoma kawałkami rurki. Zabezpiecz siatkę i ponownie podłącz rurki, nakładając żywicę epoksydową na zewnątrz rurek. Pozostaw żywicę epoksydową do wyschnięcia na około 20 minut.
4. Do dostarczania degustacji należy użyć ciśnieniowego systemu perfuzyjnego z tyloma rurkami, ile potrzeba, połączonych w kolektor (patrz poniżej). Za pomocą lutownicy wykonaj mały otwór w sztywnej rurce około 1 cm nad siatką. Włóż rurkę wyjściową z systemu perfuzyjnego (ID 0,86 mm) do sztywnej rurki i zabezpiecz ją tam, nakładając żywicę epoksydową (Rysunek 4A-4B).
5. Użyj pompy perystaltycznej, aby zapewnić stały przepływ (~40 ml/min) wody destylowanej. Podłącz go za pomocą silikonowej rurki do sztywnej rurki (Rysunek 4A-4C). Podłącz drugą stronę sztywnej rurki do innej rurki silikonowej, aby skierować wyjście do dużego pojemnika na odpady (Rysunek 4A-4C).
6. Aby dostarczyć degustant, należy wstrzyknąć sprężone powietrze do kolektora systemu perfuzyjnego. Można to osiągnąć na przykład za pomocą pompy pneumatycznej (10 psi) sterowanej przez wejście impulsu napięciowego z określonym czasem w celu wtryskiwania sprężonego powietrza do rurki kolektora zawierającej żądany smak. Impuls 1s wyrzuca około 0,5 ml degustacji.

3. Przygotowanie i monitorowanie degustacji Dostawa degustacji

1. Rozcieńczyć degustator w wodzie destylowanej do pożądanego stężenia. Należy pamiętać, że degustator zostanie dodatkowo rozcieńczony przez strumień wody. Zmierzyliśmy, że końcowe stężenie docierające do trąbki wynosi 77% początkowego stężenia (patrz referencje ^10,29).
2. Dodaj sztuczny barwnik spożywczy do każdego roztworu degustacyjnego, aby umożliwić określenie dokładnego czasu, w którym degustator przechodzi przez trąbkę. Odkryliśmy, że zielony barwnik (patrz Lista materiałów) w stężeniu 0,05% w/v nie aktywuje Manduca GRNs.
3. Użyj czujnika koloru (patrz Tabela 1), aby wykryć zabarwienie żywności w roztworach degustacyjnych. Użyj lutownicy, aby zrobić otwór przylegający do siatki i 0,5 cm poniżej rurki wyjściowej systemu perfuzyjnego (Rysunek 4A-4B). Podłącz czujnik do sztywnej rurki i zabezpiecz go tam, nakładając żywicę epoksydową na zewnątrz.
   1. Zapisać napięcie wyjściowe czujnika koloru jako sygnał analogowy wraz z sygnałami fizjologicznymi (patrz rozdział 4). Sygnał napięciowy czujnika koloru może być wzmocniony za pomocą wzmacniacza prądu stałego podłączonego do czujnika (Rysunek 4A).
4. Upewnij się, że czujnik koloru działa, dostarczając degustację i rejestrując napięcie wyjściowe czujnika. Sygnał generowany przez barwnik powinien przekraczać poziom szumu.
   1. Dostosuj stałe natężenie przepływu wody, aby sygnał był jak najbardziej zbliżony do kwadratu.
      Uwaga: W przypadku dostarczania wielu degustacji po kolei, należy pamiętać, że pierwsza próba z nowym degustatorem będzie składać się z mieszanki nowego i poprzedniego degustatora. Z tego powodu nie analizowaliśmy tych pierwszych badań.

Rysunek 4: System dostarczania degustacji. (A) Schemat aparatury używanej do dostarczania i monitorowania impulsów degustacyjnych do trąbki zwierzęcia. Główne elementy systemu są oznaczone czerwonymi numerami. Stały przepływ wody destylowanej jest utrzymywany przez trąbkę przez pompę perystaltyczną połączoną z rurką silikonową do sztywnej rurki z tworzywa sztucznego (1), w której ma być umieszczona trąbka (6). Degustatory zawierające niewielką ilość bezsmakowego barwnika dostarczane są za pomocą ciśnieniowego 16-kanałowego systemu perfuzyjnego. Zbiorniki zawierające degustatory są podłączone do kolektora (2), który jest przymocowany do sztywnej rurki, nad otworem, w którym ma być umieszczona trąbka (5). Sprężone powietrze z pompy pneumatycznej jest wtryskiwane do systemu perfuzyjnego w celu szybkiego dostarczenia smaku, z czasem kontrolowanym przez niestandardowe oprogramowanie. Czujnik koloru (3) służy do monitorowania podawania degustacji. Czujnik jest podłączony do sztywnej rurki przylegającej do trąbki i poniżej wylotu systemu perfuzyjnego Tastant. Sygnał napięciowy czujnika koloru jest wzmacniany przez wzmacniacz prądu stałego. Czerwona ścieżka na wstawce obok wzmacniacza ilustruje kolorowy sygnał zarejestrowany za pomocą niestandardowego oprogramowania do akwizycji danych; Szybki wzrost i spadek sygnału odzwierciedla odpowiednio nadejście i wypłukanie Tastanta. Trąbkę umieszcza się w otworze (5) znajdującym się tuż pod czujnikiem koloru. Nad otworem umieszcza się siatkę (4), aby zapewnić, że trąbki różnych zwierząt są zawsze umieszczane w tym samym miejscu. Druga strona sztywnej rurki jest połączona z inną rurką silikonową, aby skierować wyjście do pojemnika na odpady (7). (B) Obraz przedstawiający główne elementy systemu dostarczania degustacji podłączone do sztywnej rurki z tworzywa sztucznego, które są oznaczone czerwonymi liczbami, jak pokazano na panelu A: źródło wody (6), rurka wyjściowa kolektora degustacyjnego (2), czujnik koloru (3), siatka (4) i otwór, w który ma być włożona trąbka (5), wszystkie połączone w sztywną rurkę z tworzywa sztucznego (1). (C) Pokazane jest umiejscowienie preparatu Manduca w zestawie. Dystalne t2/3 trąbki wprowadza się do otworu (5) w sztywnej plastikowej rurce (1). Trąbka jest zabezpieczona na miejscu woskiem dentystycznym i żywicą epoksydową, jak pokazano na wkładce. Dopływ wody do sztywnej rury i jej wyprowadzenie do zbiornika na odpady są oznaczone odpowiednio cyframi 6 i 7. Liczba 2 oznacza rurkę wyjściową kolektora detalicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zewnątrzkomórkowy zapis tetrody w celu monitorowania aktywności wywołanej przez degustacje z GRN

1. Umieść preparat na mole na platformie pod mikroskopem stereoskopowym na stole do izolowania drgań (Rysunek 4C).
2. Umieść dystalne dwie trzecie trąbki w sztywnej rurce systemu dostarczania degustacji (Rysunek 2B). Aby to zrobić, rozciągnij trąbkę, a następnie włóż ją do otworu sztywnej rurki, delikatnie przepychając ją za pomocą kleszczy opatrunkowych. Uszczelnij trąbkę miękkim woskiem dentystycznym, a następnie warstwą żywicy epoksydowej, aby uniknąć wycieków (Rysunek 4C, wlot).
3. Podłącz linię perfuzyjną soli fizjologicznej do kapsułki głowicy i ustaw przepływ perfuzji na stałą szybkość około 0,04 l/h.
4. Zanurz elektrodę uziemiającą (tj. drut chlorkowanego srebra) w kąpieli solankowej (Rysunek 5A).
5. Użyj specjalnie wykonanej tetrody ze skręconego drutu, zbudowanej zgodnie z procedurą produkcyjną opisaną w ³⁰ (sugeruje się, aby 4 druty elektrodowe były dobrze izolowane i pasowały do nerwu). Przed eksperymentem należy nagalwanizować elektrodę, postępując zgodnie z krokami opisanymi w ³⁰.
6. Użyj ręcznego mikromanipulatora, aby ustawić tetrodę blisko nerwu szczękowego. Przesuwaj tetrodę, aż zacznie wchodzić w nerw (Rysunek 5).
7. Odczekaj co najmniej 10 minut po umieszczeniu tetrody, aby umożliwić jej ustabilizowanie się w nerwie przed nagraniem.
8. Wzmocnij sygnał (3000x) i użyj filtra pasmowo-przepustowego ustawionego w zakresie 0,3-6 kHz. Uzyskaj sygnał z częstotliwością próbkowania 40 kHz za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.
9. Po zakończeniu eksperymentu umieść preparat na mole w zamrażarce.

Rysunek 5: Nagrywanie tetrody z GRNs. (A, duży obraz) Mikromanipulator służy do umieszczania tetrody ze skręconego drutu w nerwie szczękowym (MxN) w celu rejestrowania aktywności GRNs. Elektrodę uziemiającą z chlorkiem srebra umieszcza się w kąpieli solankowej, jak pokazano. (A, wstawka) Powiększony obraz mózgu pokazujący tetrodę w nerwie szczękowym. Wskazana jest również strefa podprzełykowa (SSE). (B) Schemat mózgu Manduca zorientowanego jak na A. Kliknij tutaj aby oglądnąć większą wersję tego rysunku.

Results

Aktywność GRN może być rejestrowana za pomocą zewnątrzkomórkowej elektrody tetrodowej przed, w trakcie i po porodzie degustacyjnym (Rysunek 6A i 6C). Rysunek 6A (środkowy i dolny panel) pokazuje przefiltrowane (300-6 000 Hz) ślady napięcia zarejestrowane przez każdy z czterech przewodów umieszczonych w nerwie szczękowym, gdzie można zaobserwować sygnały o różnych amplitudach odzwierciedlające potencjały czynnościowe (strzałki). Impuls smaku 1 s (1 M sacharozy) został dostarczony 2 s po rozpoczęciu eksperymentu; początek i przesunięcie bodźca było monitorowane przez czujnik koloru (Rysunek 6A, górny panel). Skoki wywołane degustacją, które można zaobserwować w każdym z czterech kanałów (Rysunek 6A, środkowy panel). GRN można zidentyfikować i odróżnić od mechanosensorów (żaden nie jest tutaj pokazany), gdy reagują na niektóre degustacje, a na inne nie ¹⁰.

Aby zidentyfikować i wyizolować odpowiedzi pojedynczych neuronów z nagrań tetrody, przeprowadziliśmy sortowanie impulsów off-line za pomocą zestawu niestandardowych funkcji opartych na metodach ^{31 Pouzata} i ^32,33 (te metody są opisane w tych cytatach: ^10,29). Rysunek 6B pokazuje przykład sortowania spajków zastosowanego do danych pokazanych w Rysunek 6A, w którym znaleziono trzy dobrze odizolowane jednostki.

Wykresy rastrowe z Rysunku 6C przedstawiają reakcje trzech izolowanych jednostek na Rysunku 6B na sześć różnych degustacji (1 M sacharozy, maltozy i NaCl; 100 mM kofeiny i 10 mM berberyny i płata) dostarczonych kolejno (pokazano 4 próby/degustację). Jak pokazano na rysunku 6C, zarejestrowane GRN mają różne poziomy aktywności wyjściowej, od cichych (GRN 1) do niskich lub umiarkowanych (GRN 2 i 3). Po rozpoczęciu degustacji GRN wykazują zróżnicowane wzorce aktywności i wykazują różną selektywność w stosunku do degustatorów. Na przykład GRN 1 zareagował tylko na sacharozę, podczas gdy GRN 2 zareagował na maltozę i NaCl wybuchem kolców, a na płat impulsem tylko na początku bodźca. Ponadto niektóre odpowiedzi są zablokowane w czasie bodźca (np. odpowiedź GRN 1 na sacharozę), podczas gdy inne odpowiedzi trwają dłużej niż czas trwania bodźca (np. odpowiedź GRN 3 na berberynę) lub zawierają zarówno składniki pobudzające, jak i hamujące (np. Figura 7 GRN 2 odpowiedzi na NaCl i sacharozę). Aby uzyskać więcej informacji na temat różnych czułości i wzorców aktywności GRN, zobacz odniesienie ¹⁰.

Aby potwierdzić użycie technik tetrody i sortowania kolców do rejestrowania GRN z nerwu szczękowego, przeprowadziliśmy wewnątrzkomórkowe zapisy z aksonów GRN u innych zwierząt przy użyciu konwencjonalnych elektrod z ostrego szkła (rezystancja 80-120 MΩ). Odkryliśmy, że wzorce aktywności uzyskane przy użyciu zapisów wewnątrzkomórkowych były podobne do odpowiedzi obserwowanych przy użyciu techniki tetrody (Ryc. 7). Ślady napięcia w zielonym polu w panelu A zostały zarejestrowane wewnątrzkomórkowo z GRN 1 podczas 5 kolejnych prób prezentacji sacharozy, a te same odpowiedzi są pokazane jako wykresy rastrowe w panelu B. (Zauważ, że ten typ odpowiedzi jest zgodny z tą uzyskaną za pomocą tetrod i pokazaną w Rysunek 6C.) GRN 2, zarejestrowany za pomocą ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych, wykazuje szerszy wzorzec odpowiedzi.

Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki z nagrań nerwu szczękowego z tetrodami zewnątrzkomórkowymi. (A) Pokazane są przefiltrowane (300-6 000 Hz) ślady napięcia zarejestrowane przez każdy z czterech przewodów w nerwie szczękowym (środkowy panel). Impuls smaku o długości 1 s został zastosowany w okresie wskazanym przez czerwone cieniowanie w środkowym panelu. Początek i przesunięcie bodźca było monitorowane przez czujnik koloru, jak wskazuje czerwony ślad napięcia na górnym panelu i jest oznaczone na środkowym panelu przez obszar zacieniony na czerwono. Przerywane linie poziome oznaczają +50 (góra), 0 (środek) i -50 (dół) μV. Pokazane jest powiększenie ścieżek napięcia surowego odpowiadającego obszarowi wewnątrz pionowych linii przerywanych (dolny panel). Przykłady kolców są oznaczone strzałkami. (B) Przykład sortowania wartości szczytowych zastosowanego do danych pokazanych w panelu A. Przebiegi zarejestrowane na każdym z czterech przewodów zewnątrzkomórkowych (1-4) są identyfikowane z trzema różnymi GRN (jednostkami 1-3) przyczyniającymi się do rejestrowanych sygnałów. Poszczególne zdarzenia (kolorowe cienkie linie) i średnia (gruba linia) są pokazane dla trzech jednostek. Należy wziąć pod uwagę szereg kryteriów statystycznych, aby wiarygodnie zidentyfikować niezależne jednostki przy użyciu metody sortowania szczytowego (patrz referencje ^10,29). (C) Wykresy rastrowe reprezentujące reakcje trzech wyizolowanych jednostek na sekwencję sześciu różnych degustacji (pokazano 4 próby/degustację). Czas dostarczania degustacji (1 s) jest oznaczony obszarem zacienionym na czerwono. Stężenia degustatorów wynosiły 1 M (sacharoza, maltoza, NaCl), 100 mM (kofeina) i 10 mM (berberyna i płat). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Wewnątrzkomórkowe nagrania z aksonów GRN. (A, panel z zielonym polem) Ślady napięcia zarejestrowane z GRN z ostrymi szklanymi elektrodami wewnątrzkomórkowymi (rezystancja 80 - 120 MΩ) umieszczonymi w nerwie szczękowym, wywołane przez 5 kolejnych stymulacji 1 M sacharozą (Suc). (B) Wykresy rastrowe odpowiedzi dwóch GRN, w tym odpowiedzi pokazane w panelu A (panel z zieloną ramką), na dwie różne degustacje dostarczone w sekwencji (100 mM szary kolor czcionki; 1 M kolor czcionki) zarejestrowane za pomocą ostrych szklanych elektrod wewnątrzkomórkowych umieszczonych w nerwie szczękowym (pokazano 7 prób/degustację i 3 próby/wodę). Czas dostawy Tastant jest oznaczony czerwonymi kolorami w obu panelach. Początek i przesunięcie bodźca było monitorowane przez czujnik koloru, na co wskazują czerwone ślady napięcia na dole każdego panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisane tu metody pozwalają na nagrania in vivo ze stosunkowo prostego zwierzęcia, Manduca sexta, w celu scharakteryzowania aktywności wielu, losowo wybranych GRN przez długi czas (przez ponad 2 godziny), przed, w trakcie i po podaniu degustacyjnym. Metody te pozwalają również na szybkie, sekwencyjne dostarczanie wielu bodźców degustacyjnych z precyzyjną kontrolą czasową, co jest przydatne do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw reprezentacji degustacji. Protokół ten został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób odpowiedzi GRN na degustatory są przekształcane, gdy są one przesyłane do ich postsynaptycznych neuronów docelowych (np. w SSE) poprzez monitorowanie GRN jednocześnie z monosynaptycznie połączonymi interneuronami ¹⁰. Dodatkowo, metody te mogą być dostosowane do potrzeb eksperymentatora, co pozwala na realizację złożonych paradygmatów w celu zbadania podstawowych aspektów kodowania smakowego.

Na początku naszych badań jednym z problemów technicznych, z którymi czasami musieliśmy się rozwiązywać, była niemożność wykrycia sygnałów impulsowych z nerwu szczękowego za pomocą drutów tetrodowych. Możliwe przyczyny tego są różne, ponieważ protokół sekcji jest trudny i konieczna jest pewna praktyka, aby uzyskać dobre przygotowanie. Po pierwsze, podczas sekcji nerwy szczękowe są łatwe do uszkodzenia, zwłaszcza podczas usuwania osłonki otaczającej tkankę nerwową. Po drugie, jeśli osłonka nie zostanie całkowicie usunięta, druty tetrody mogą nie być w stanie uzyskać dostępu do nerwu. W obu przypadkach rozpoczęcie nowego przygotowania jest często najłatwiejszym sposobem rozwiązania tych problemów. Po trzecie, może wystąpić problem z drutami tetrody. Można to sprawdzić, mierząc impedancję przewodów, która powinna wynosić ~270 kΩ przy 1kHz. Jeśli wartość impedancji przekracza ~300 kΩ, należy galwanizować przewody złotem, aby uzyskać pożądaną impedancję (patrz odniesienie ³⁰). Po czwarte, sprzęt może być źle podłączony lub źle się zachowywać.

Innym możliwym problemem jest to, że sygnały impulsowe są rejestrowane, ale neuron(y) wydają się nie reagować na degustacje. Może to być spowodowane tym, że zarejestrowane neurony są niewrażliwe na dostarczony zestaw degustacji. Należy również pamiętać, że oprócz aksonów GRN, nerw szczękowy przenosi również włókna mechanosensoryczne. W ten sposób możliwe jest nagrywanie z neuronów mechanosensorycznych zamiast lub oprócz GRN. Jednak system dostarczania degustacji został zaprojektowany tak, aby zapewnić stały mechaniczny sygnał wejściowy przez cały czas trwania eksperymentu, co sprawia, że jest mało prawdopodobne, aby reakcje na degustację były zakłócone przez reakcje na mechaniczny składnik jego podania. Neurony, które reagują na niektóre, ale nie na inne smaki, lub w różny sposób na różne smaki, można jednoznacznie sklasyfikować jako GRN. Zalecamy stosowanie świeżo rozcieńczonych degustatorów, aby uniknąć różnic w stężeniu lub składzie degustacji spowodowanych degradacją związku lub odparowaniem rozpuszczalnika. Zalecamy również regularne czyszczenie systemu, aby uniknąć zanieczyszczenia przewodów i/lub przeszkód.

Innym możliwym problemem technicznym jest niekorzystny stosunek sygnału do szumu. Problem ten można często rozwiązać, ponownie chlorując lub regulując położenie elektrody uziemiającej kąpieli. Inne rozwiązania mogą wymagać ekranowania i zminimalizowania długości każdego połączenia elektrycznego w aparacie.

Na koniec należy zauważyć, że prawidłowa analiza danych uzyskanych za pomocą nagrań tetrody wymaga starannego sortowania spajków. Stwierdziliśmy, że w pełni zautomatyzowane metody są na ogół niewystarczające. Zalecamy zapoznanie się z literaturą dotyczącą sortowania spajków przed analizą danych tetrody 10,29,31,32,33^.

Można zastosować alternatywy dla naszego protokołu sekcji. Tutaj opisaliśmy rozwarstwienie przez brzuszną część głowy, zapewniając dostęp do nerwów szczękowych i SSE, ale możliwe jest również uzyskanie dostępu do tych struktur poprzez preparację przez stronę grzbietową. Stwierdziliśmy, że przygotowanie od strony grzbietowej nie jest optymalne do wykonywania nagrań z tych struktur smakowych ze względu na ich głębokie położenie, ale to przygotowanie ma tę zaletę, że umożliwia nagrania ze struktur wyższego rzędu, takich jak ciało grzyba, obszar, który jest związany z integracją wielozmysłową, uczeniem się asocjacyjnym i przetwarzaniem pamięci ³⁴. Skupiliśmy się na wykorzystaniu elektrod tetrodowych do nagrywania z nerwu szczękowego, ale, jak zilustrowaliśmy, do tego celu można również użyć standardowych wewnątrzkomórkowych ostrych elektrod. Ponadto obie techniki można łączyć w celu jednoczesnego wykonywania nagrań z wielu obszarów mózgu ¹⁰. Literatura neurobiologiczna oferuje wiele przykładów modeli bezkręgowców, które okazały się potężnymi narzędziami do ujawniania podstawowych zasad przetwarzania sensorycznego, takich jak kodowanie węchowe, które mają zastosowanie zarówno do owadów, jak i kręgowców 35,36,37,38,39. Mamy nadzieję, że nasze metody doprowadzą do fundamentalnych nowych spostrzeżeń na temat kodowania smakowego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sekcja i przygotowanie próbki
Probówka polipropylenowa, 15 ml Falcon	Fisher Scientific	14-959-53A
Igła, krótki skos, 19 G x 1 - 1/2"	MONOJET	888200144	Do nakładania powietrza w celu usunięcia włosów z.
Modelina Clay-van Aken Plastalina	DickBlick	33268
szalka Petriego -100 x 15 mm	VWR International	89000-304
Końcówka do pipet (1 - 200 &mikro; L)	USA Scientific	1111-0806
Żyletka	Techni Edge	TE05-071
Standardowy przewód połączeniowy 22 AWG	AlphaWire	1551	Do wkładania trąbki do końcówki pipety.
Wosk batikowy	Żakard	7946000
Wosk elektryczny	Almore International	66000
Myscroscope stereo	Leica	MZ75
Dumont #1 kleszcze (grube)	World Precision Instruments	500335	Do usuwania tkanki tłuszczowej i nienerwowej.
Kleszcze tytanowe Dumont #5 (cienkie)	World Precision Instruments	14096	Do usuwania tkanki tłuszczowej i nienerwowej.
Kleszczyki do #5SF Dumont (bardzo cienkie)	World Precision Instruments	500085	Do usuwania tkanki nerwowej.
Nożyczki Vannas (cienkie)	World Precision Instruments	500086	Do usuwania naskórka.
Kolagenaza/Dyspaza	Sigma-Aldrich	11097113001
Epoksyd	Permatex	84101
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Saline Perfusion System
Zestaw przedłużający z regulatorem przepływu	B Braun Medical Inc.	V5200
IV z miejscem wstrzyknięcia Y	B Braun Medical Inc.	V1402
Nazwa	Firma	>Numer katalogowy	Komentarze
Tastant System dostarczania
Białe przezroczyste rurki nylonowe OD 1/4", ID 1/8"Small	Parts Inc.	B001JJT4SA	Sztywna rura, która łączy cztery główne elementy systemu.
Lutownica	Specjaliści od obwodów	ZD200BK
Narzędzie obrotowe-Dremel	Dremel	4200
Siatka polipropylenowa, rozmiar otworu (rozmiar otworu 0,1 x 0,13 cm)	Siatka przemysłowa	XN5170	Do zapewnienia, że trąby różnych zwierząt są umieszczone w tym samym miejscu.
Ciśnieniowy 16-kanałowy system perfuzyjny	Narzędzia biologiczne	PS-16H	Do degustacji. System ten obejmuje zawory zaciskowe, przewody, kolektor, cylindry roztworu, sterownik zaworu i akcesoria montażowe.
Rurki polipropylenowe, ID 0,034", ID 0,050"	Becton, Dickinson & Co	427421	Rurka wyjściowa z systemu perfuzyjnego.
Pneumatyczne PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820	Do sterowania kanałem wyjściowym systemu perfuzyjnego.
System oprogramowania do akwizycji danych, karta DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4	National Instruments	LabVIEW 2011	Do sterowania pompą pico w celu dostarczania degustacji i rejestrowania sygnałów z czujnika koloru.
Compulab 3 Pompa perystaltyczna Manostat	Sigma	P1366	Do pompowania wody.
Rurka silikonowa, ID 1/16" OD 1/8"	Cole-Parmer	WU-95802-02	Do podłączenia źródła wody do rurki pompy perystaltycznej, a rurki wylotowej pompy do sztywnej rurki systemu dostarczania.
Czujnik koloru - cyfrowy czujnik światłowodowy	Keyence	FS-V31M	Do monitorowania dostawy degustacyjnej.
Jednostka światłowodowa z czujnikiem koloru odblaskowym	Keyence	FU35-FZ	Do podłączenia czujnika koloru.
Peryferia dentystyczne Wosk	Henry-Schein Dental	6652151	Aby zabezpieczyć trąbkę w sztywnej rurce.
		o pojemności 3,7 l	Do dostarczania wody do systemu i zbierania odpadów wodnych.
Szybki zielony FCF	Sigma	F7258
Kleszcze opatrunkowe 25,5 cm	WPI	500364	Do wprowadzania trąbki na mole do otworu trąbki w sztywnej rurce.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt do elektrofizjologii
D.C. wzmacniacz	Brown-Lee	440
Lampa	Schott	Schott Fostec Źródło światła DCR 2
Mikromanipulator ręczny	Mikromanipulator	Leica	Do precyzyjnego wprowadzania tetrod do mózgu zwierzęcia. Manipulator musi umożliwiać drobne i zgrubne ruchy w osiach x, y i z.
Stereomikroskop	Leica	MZ75
Stół z izolacją drgań (stół laboratoryjny MICRO-g)	Oscyloskop TMC	63-541
	Tektronix
16-kanałowy przedwzmacniacz i wzmacniacz	16-kanałowy MA-800 Amplifier System	Komputer B.E.S 2013
Dell		optiplex 780	Poniżej przedstawiono minimalne zalecane wymagania. Pamięć RAM: 3,32 GHz, 3 GB. Procesor: Intel Core  2 Duet. Karta graficzna: zintegrowana Intel GMA X4500.
System oprogramowania do akwizycji danych, karta DAQ LabVIEW PCI-MIO-16E-4	National Instruments	LabVIEW 2011	Do sterowania pompą pico w celu dostarczania degustacyjnego oraz do rejestrowania sygnałów z czujnika koloru i elektrody.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tastants
KAc	Sigma-Aldrich	P5708
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650
NaCl	Sigma-Aldrich	73575
Sacharoza	Sigma-Aldrich	84097