Method Article

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

DOI:

10.3791/55873

⸱

September 15th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele bodźców biologicznych, które mogą wpływać na zachowanie komórek i różnicowanie komórek macierzystych. Ogólne podejścia do hodowli komórkowych opierają się na rozpuszczalnych czynnikach w pożywce w celu kontrolowania zachowania komórki. Jednak rozpuszczalne dodatki nie mogą naśladować pewnych motywów sygnalizacyjnych, takich jak czynniki wzrostu związane z macierzą, sygnalizacja komórka-komórka i przestrzenne sygnały biochemiczne, które mają powszechny wpływ na komórki. Ponadto właściwości biofizyczne matrycy, takie jak sztywność substratu, odgrywają ważną rolę w losie komórki, którym nie jest łatwo manipulować przy użyciu konwencjonalnych praktyk hodowli komórek. W tej metodzie opisujemy prosty protokół dostarczania wzorzystych bioaktywnych białek na syntetycznych hydrożelach z glikolu polietylenowego (PEG) przy użyciu fotochemii. Platforma ta pozwala na niezależną kontrolę sztywności podłoża i przestrzennych wskazówek biochemicznych. Hydrożele te mogą osiągać szeroki zakres fizjologicznie istotnych wartości sztywności. Dodatkowo, powierzchnie tych hydrożeli mogą być fotowzorcowane za pomocą bioaktywnych peptydów lub białek poprzez reakcje chemiczne tiol-en. Metody te zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania funkcji białka po unieruchomieniu powierzchni. Jest to wszechstronny protokół, który można zastosować do dowolnego białka lub peptydu w celu stworzenia różnorodnych wzorów. Wreszcie, komórki wysiane na powierzchni tych bioaktywnych hydrożeli mogą być monitorowane w czasie, ponieważ reagują na sygnały specyficzne przestrzennie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele bodźców, które wpływają na zachowanie komórki. Ogólnie rzecz biorąc, typowe techniki hodowli komórek opierają się na rozpuszczalnych czynnikach w celu wywołania odpowiedzi komórkowych; Podejście to ma jednak swoje ograniczenia. Metody te nie są w stanie dokładnie przedstawić wszystkich motywów sygnalizacyjnych powszechnie występujących in vivo. Takie mechanizmy sygnalizacyjne obejmują sekwestrowane czynniki wzrostu, sygnalizację komórka-komórka i przestrzennie specyficzne sygnały biochemiczne. Co więcej, sztywność podłoża może odgrywać ważną rolę w zachowaniu komórek i różnicowaniu komórek macierzystych i nie jest łatwo manipulować przy użyciu ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów do syntezy hydrożelu

  1. Przygotować roztwory podstawowe PEGDA, fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) i fibronektyny w sterylnych warunkach i na podstawie obliczeń (Tabela 1A).
    1. Odważyć i rozpuścić związki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Zazwyczaj należy utrzymywać stężenie roztworu roboczego PEGDA w zakresie od 50 do 200 mg/ml (5-20% wagowo-objętościowo). Odpipetować roztwór PEGDA przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji.
      UWAGA: Roztwory PEGDA należy przechowywać przykryte folią, aby chronić je przed światłem. Przygotuj świeży roztwór PEGDA....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół tworzenia bioaktywnych wzorów na powierzchni hydrożeli PEG jest zilustrowany w Rysunek 1. Opracowano arkusz kalkulacyjny do obliczenia objętości i stężenia dla każdego roztworu podstawowego (tabela 1A). Białka, które mają być unieruchomione na powierzchni hydrożelu, są modyfikowane za pomocą 2-iminotiolanu (Rysunek 1B). Reakcję tę przeprowadza się przy użyciu objętości z tabeli 1B.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia metodę tworzenia bioaktywnych wzorców białek do zastosowań biologicznych. Istnieje kilka modyfikacji, które można wprowadzić, aby dostosować ten protokół do różnych eksperymentów. Po pierwsze, wymagania dotyczące przyłączenia komórek będą się różnić dla różnych typów komórek. Jeśli początkowo zaobserwuje się słabe przyleganie komórek do żeli, zaleca się zwiększenie stężenia białka ECM w roztworze prekursorowym. Zamiast fibronektyny można stosować inne białka ECM, w tym różne rodzaje kolagenu, lamini.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było głównie wspierane przez granty z American Heart Association Scientist Development Grant (12SDG12050083 dla G.D.), National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 dla G.D.) oraz National Science Foundation (CBET-1263455 i CBET-1350240 dla G.D.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEG-diakrylan (PEGDA)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-3400Może być również syntetyzowany lub kupowany za pośrednictwem innych sprzedawców. Można stosować różne masy cząsteczkowe.
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)Syntetyzowany w laboratorium
FibronektynaCorning356008Można stosować inne białka przyczepu komórkowego, takie jak laminina, matrigel
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)SigmaD8537-500ML
Photomask FineLine Imagingn/aNiestandardowe wydruki na przezroczystych arkuszach o wysokiej rozdzielczości DPI.
Spinacze do segregatorówRóżni dostawcy Kompaktowe
źródło światła UV (365nm)UVPUVP-21Można stosować inne źródła światła UV, wymagana jest kalibracja mocy.
2-iminotiolan (Pierce Traut' s odczynnik)Thermo Sci.26101
Ellman' s Odczynnik: DTNB; 5,5-ditio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy)Thermo Sci.22582
ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)W eksperymentachliczbę pasaży
EGM-2 MediaLonzaCC31-56, CC-3162EGM-2 bez czynników wzrostu. Do utrzymania komórek użyto pełnej pożywki EGM-2
0,25% Trypsyna EDTALife Tech25200-056
Neutralizator trypsynyLife TechR-002-100
WirówkaRóżne Venders
HemocytometrHausser Sci. Jasna linia
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichE6758
0,22 i mikro; m filtrCell Treat229743
1mL Szklana strzykawka
Szkiełka mikroskopoweFisher Sci.12-550C
Przekładki plastikoweRóżne SprzedawcyGrubość 0,5 mm
70% EtanolBICCA2546.70-1
Bio-shieldBio-shield19-150-0010
Odczynnik Bradford BIO-RAD
- Sephadex G-25GE Healthcare95016-754
Kolumny MicrospinThermo Sci.
AR-G2 rehometerTA Instruments
wykorzystano Lonza między 6-10Żywica odsalająca PI69725

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
  2. Evans, N. D., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogel PatterningPhotochemistry TechniqueBioactive ProteinsPEG HydrogelsThiol ene ChemistrySubstrate StiffnessSpatial CuesProtein ImmobilizationCell MigrationVEGF Patterning

Related Articles