Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Summary

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Abstract

Istnieje wiele bodźców biologicznych, które mogą wpływać na zachowanie komórek i różnicowanie komórek macierzystych. Ogólne podejścia do hodowli komórkowych opierają się na rozpuszczalnych czynnikach w pożywce w celu kontrolowania zachowania komórki. Jednak rozpuszczalne dodatki nie mogą naśladować pewnych motywów sygnalizacyjnych, takich jak czynniki wzrostu związane z macierzą, sygnalizacja komórka-komórka i przestrzenne sygnały biochemiczne, które mają powszechny wpływ na komórki. Ponadto właściwości biofizyczne matrycy, takie jak sztywność substratu, odgrywają ważną rolę w losie komórki, którym nie jest łatwo manipulować przy użyciu konwencjonalnych praktyk hodowli komórek. W tej metodzie opisujemy prosty protokół dostarczania wzorzystych bioaktywnych białek na syntetycznych hydrożelach z glikolu polietylenowego (PEG) przy użyciu fotochemii. Platforma ta pozwala na niezależną kontrolę sztywności podłoża i przestrzennych wskazówek biochemicznych. Hydrożele te mogą osiągać szeroki zakres fizjologicznie istotnych wartości sztywności. Dodatkowo, powierzchnie tych hydrożeli mogą być fotowzorcowane za pomocą bioaktywnych peptydów lub białek poprzez reakcje chemiczne tiol-en. Metody te zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania funkcji białka po unieruchomieniu powierzchni. Jest to wszechstronny protokół, który można zastosować do dowolnego białka lub peptydu w celu stworzenia różnorodnych wzorów. Wreszcie, komórki wysiane na powierzchni tych bioaktywnych hydrożeli mogą być monitorowane w czasie, ponieważ reagują na sygnały specyficzne przestrzennie.

Introduction

Istnieje wiele bodźców, które wpływają na zachowanie komórki. Ogólnie rzecz biorąc, typowe techniki hodowli komórek opierają się na rozpuszczalnych czynnikach w celu wywołania odpowiedzi komórkowych; Podejście to ma jednak swoje ograniczenia. Metody te nie są w stanie dokładnie przedstawić wszystkich motywów sygnalizacyjnych powszechnie występujących in vivo. Takie mechanizmy sygnalizacyjne obejmują sekwestrowane czynniki wzrostu, sygnalizację komórka-komórka i przestrzennie specyficzne sygnały biochemiczne. Co więcej, sztywność podłoża może odgrywać ważną rolę w zachowaniu komórek i różnicowaniu komórek macierzystych i nie jest łatwo manipulować przy użyciu typowych praktyk hodowli komórek^1,2. Podejścia oparte na biomateriałach oferują nową platformę do rozpoczęcia badań nad tymi mechanizmami sygnalizacyjnymi. W szczególności hydrożele są doskonałymi kandydatami do dostrajania sztywności podłoża^3,4, immobilizując białka i peptydy5^,6, oraz tworząc przestrzennie specyficzne wzorce^7,8.

Hydrożele są powszechnie używane jako rusztowania w inżynierii tkankowej ze względu na ich biofizyczne i biochemiczne podobieństwa z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)^9,10. Naturalne polimery są często wybierane na rusztowania, ponieważ są biokompatybilne i znajdują się w wielu tkankach organizmu. Ograniczeniem stosowania naturalnych polimerów jako substratów jest to, że brakuje w nich łatwych do manipulowania ugrupowań chemicznych do biokoniugacji. Z drugiej strony, syntetyczne hydrożele, takie jak PEG, są doskonałymi platformami dla ukierunkowanych chemii^11,12. Ponadto hydrożele PEG nie wywołują odpowiedzi komórkowej i dlatego są wykorzystywane jako obojętne szkielety do tworzenia bioaktywnych rusztowań.

Do tworzenia bioaktywnych hydrożeli stosuje się zarówno fotopolimeryzację, jak i reakcje chemiczne tiolowo-enowe. Te fotoreakcje wymagają fotoinicjatora i źródła światła UV. Kiedy fotoinicjatory są wprowadzane do światła UV, wiązania pękają, tworząc rodniki. Te rodniki są niezbędne do zainicjowania reakcji, ale mogą negatywnie wpływać na bioaktywność białka^12,13. Dlatego tak ważna jest optymalizacja czasu ekspozycji na fotoinicjator i promieniowanie UV w celu utrzymania bioaktywności białek.

W tej metodzie, hydrożele są syntetyzowane poprzez fotopolimeryzację wzrostu łańcucha akrylanowo-akrylowego. Monomery PEG-diakrylanu (PEGDA) reagują ze sobą, tworząc rozgałęzione sieci polimerowe odpowiedzialne za strukturę hydrożelu. Stężenie monomerów PEGDA w roztworze prekursora żelu będzie kontrolować sztywność podłoża. Ze względu na mały rozmiar porów hydrożelu, białka ECM, takie jak fibronektyna, mogą być łatwo włączone do hydrożelu w celu przyłączenia komórek. Wreszcie, hydrożele te mogą być modelowane powierzchniowo za pomocą bioaktywnych peptydów lub białek za pomocą reakcji chemicznych tiol-en. W tym przypadku nieprzereagowane wolne akrylany w systemie hydrożelowym będą reagować z wolnymi tiolami znajdującymi się na białku lub peptydzie pod wpływem światła UV. Po unieruchomieniu białek lub peptydów na powierzchni hydrożelu, hydrożel może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni bez utraty bioaktywności. Zapewnia to wygodę, elastyczne planowanie eksperymentów i możliwość współpracy między laboratoriami. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta pozwala na biomechaniczną i przestrzenną kontrolę biochemiczną, niezależną od siebie, co daje możliwość wpływania na zachowanie komórek.

Protocol

1. Przygotowanie materiałów do syntezy hydrożelu

1. Przygotować roztwory podstawowe PEGDA, fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) i fibronektyny w sterylnych warunkach i na podstawie obliczeń (Tabela 1A).
   1. Odważyć i rozpuścić związki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Zazwyczaj należy utrzymywać stężenie roztworu roboczego PEGDA w zakresie od 50 do 200 mg/ml (5-20% wagowo-objętościowo). Odpipetować roztwór PEGDA przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji.
      UWAGA: Roztwory PEGDA należy przechowywać przykryte folią, aby chronić je przed światłem. Przygotuj świeży roztwór PEGDA (zalecany) do każdego eksperymentu.
   2. Odtworzyć białko fibronektyny w proszku zgodnie z zaleceniami producenta. Roztwór podstawowy fibronektyny należy utrzymywać w stężeniu 1 mg/ml, podzielić na 60–100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Przed użyciem rozmrozić podwielokrotności w temperaturze 4 °C przez kilka godzin lub przez noc. Jeśli białko nie jest jeszcze dostarczane w sterylnych warunkach, do sterylizacji należy użyć filtra strzykawkowego 0,22 μm.
      UWAGA: Fibronektyna służy do przyłączania komórek. Inne białka ECM mogą być podstawione.
   3. Odważyć LAP dla roztworu podstawowego i rozpuścić go w PBS; typowe stężenie podstawowe wynosi 25 mg/ml. Wykonaj sonizację, jeśli wystąpią jakiekolwiek problemy z rozpuszczeniem. Przepuść roztwór przez filtr 0,22 μm w celu sterylizacji. Przykryj LAP foliowym opakowaniem i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy.
      UWAGA: LAP jest fotoinicjatorem używanym do fotochemii.
2. Przygotuj sterylne szklane formy do szkiełek do tworzenia hydrożelu.
   1. Autoklawuj arkusz poliestru; jeden jest potrzebny do każdej formy żelowej. Namocz dwa szkiełka podstawowe i trzy plastikowe przekładki (o grubości 0,5 mm) dla każdej formy żelowej w 70% etanolu przez co najmniej 2 godziny, ale generalnie pozwól im namoczyć się przez noc. Namocz pięć spinaczy do każdego żelu w 70% etanolu na 10 minut przed użyciem.
   2. Umieść szkiełka podstawowe, przekładki i spinki do segregatora na małym autoklawizowanym arkuszu w kapturze do hodowli komórkowych, aby pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu przez kilka godzin.
   3. Przygotuj formy hydrożelowe, umieszczając plastikowe przekładki wokół krawędzi szkiełka. Umieść drugie szklane szkiełko na górze. Przymocuj przekładki szczelnie obok siebie za pomocą klipsów do segregatorów, po dwa z każdego dłuższego boku i jeden na górze.
      UWAGA: Jeśli nie zostanie prawidłowo zmontowany, roztwór żelu wycieknie.
   4. Przed użyciem wysterylizuj powierzchnię formy za pomocą okapu do hodowli komórkowych ze światłem UV przez 30 minut. W połowie odwróć formę, aby odsłonić obie powierzchnie.

2. Modyfikowanie białek za pomocą wolnego tiolu

1. Przygotować roztwory podstawowe, korzystając z obliczeń z arkusza kalkulacyjnego do przekształcania aminy w tiol na białkach (tabela 1A).
   1. Aby utworzyć bufor reakcyjny, dostosuj PBS do pH 8 i dodaj 5 mM EDTA. Pipetowany bufor reakcyjny do filtra strzykawkowego 0,22 μm w celu sterylizacji.
      UWAGA: EDTA jest ważny, ponieważ chroni tiole przed tworzeniem wiązań dwusiarczkowych. Grupy tiolowe muszą pozostać w swojej zredukowanej formie, aby zaszła reakcja.
   2. Odważyć 2-iminotiolan (odczynnik Trauta) i rozpuścić go w buforze reakcyjnym do uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml (14 mM). Przepuść roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy.
      UWAGA: 2-iminotiolan to cząsteczka, która reaguje z wolnymi aminami wystawionymi na działanie rozpuszczalnika na białka i przekształca je w wolne tiole.
   3. Rozpuść białko w buforze reakcyjnym w stężeniu od 0,1 do 1 mg/ml. O ile nie jest to wcześniej sterylne, pipetuj ten roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji.
      UWAGA: Białko to jest sygnałem biochemicznym, który zostanie wzorowany na powierzchni hydrożelu. Ponadto, chociaż stężenia białka mogą się różnić, wyższe stężenia są idealne dla silniejszych wzorców białkowych.
2. Białko należy przereagować z 2-iminotiolanem, mieszając ze sobą oba roztwory podstawowe; użyć Tabeli 1B w celu obliczenia prawidłowego stosunku objętości. Zazwyczaj stosuje się stosunek molowy 2-iminotiolanu do białka 8:1.
   UWAGA: W przypadku większych białek lub bardziej rozcieńczonych stężeń należy użyć wyższego stosunku molowego 2-iminotiolanu. Zapoznaj się z protokołem producenta¹⁵.
3. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyj odsalającej mikrokolumny wirowej, aby usunąć tiolowany produkt białkowy z pozostałych reagentów, postępując zgodnie z protokołem producenta¹⁶.
   UWAGA: Limit wykluczenia tej żywicy wynosi 5 KDa.
4. Użyj testu Ellmana, aby ilościowo zmierzyć liczbę wolnych tioli na białko. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla testu¹⁷.

3. Tworzenie hydrożelu

1. Stworzyć roztwór prekursora żelu na podstawie wartości obliczonych z tabeli 1C. Wymieszaj ze sobą objętości PEGDA, fibronektyny i LAP. Energicznie pipetować roztwór, aby uzyskać jednorodny roztwór, ale unikać tworzenia pęcherzyków. Roztwór należy chronić przed światłem.
2. Ostrożnie odpipetować roztwór prekursora żelu między dwoma szklanymi szkiełkami formy żelowej. Zazwyczaj do formy dodaje się objętość od 800 do 1,000 μl. Wystaw roztwór żelu w formie na działanie światła UV (długość fali: 365 nm, moc: 3-4 mW/cm²) przez 1-2 minuty, aby powstał hydrożel.
   UWAGA: Nie wystawiaj hydrożelu na długotrwałe działanie promieniowania UV, ponieważ ograniczy to możliwości modelowania białek powierzchniowych.
3. Zdejmij spinki do segregatora i delikatnie zdejmij górne szkiełko, wywierając przeciwny nacisk na dwie boczne przekładki.
4. Użyj odpowiedniej wielkości stempla do biopsji, aby wyciąć próbki hydrożelu. Z prostokąta żelu należy wyciąć wiele hydrożeli, które posłużą jako kontrpróby i próbki kontrolne.

4. Pomiary sztywności hydrożelu

1. Wykraść hydrożele za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 8 mm, aby uzyskać reometr z równoległą płytką 8 mm. Załadować jedną próbkę hydrożelu do reometru (patrz tabela materiałów).
2. Obniż równoległą geometrię płytki o średnicy 8 mm, aż zetknie się z powierzchnią żelu. W przypadku próbki hydrożelu o grubości 0,5 mm należy zachować odstęp 0,5 mm.
3. Wykonuj przemiatanie w czasie przez 5 minut przy 0,1% odkształceniu, częstotliwości 0,1 Hz i 37 °C. Uśrednij wartości G' przy każdym przemiataniu. Uruchom niezależne hydrożele dla powtórzeń każdej kompozycji.
   UWAGA: Wartości G' powinny być stabilne we wszystkich punktach czasowych; Jeśli tak nie jest, należy wykonać przemiatanie procentowe odkształcenia i częstotliwości, aby wybrać odpowiednie wartości14.

5. Wzorce białek

1. Przygotuj żądany wzór fotomaski za pomocą programu do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Wydrukuj fotomaskę na przezroczystym arkuszu za pomocą drukarki o wysokiej rozdzielczości. Namocz fotomaskę w 70% etanolu na 10 minut przed użyciem. Przed użyciem pozostaw fotomaskę do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli komórkowych.
2. Dodać tiolowany roztwór białka przygotowany w kroku 2 do powierzchni hydrożelu w celu nadania wzoru powierzchniowego. Odpipetować 1-2 μl/^cm2 tiolowanego roztworu białka na powierzchnię każdego żelu do wycinania.
   UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować objętość białka; Dodać tylko tyle, aby równomiernie pokryć całą powierzchnię próbki hydrożelu.
3. Ostrożnie umieść fotomaskę na powierzchni hydrożelu. Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza znalazły się między fotomaską a powierzchnią hydrożelu. Delikatnie dociśnij maskę, aby usunąć wszelkie tworzące się bąbelki.
4. Wystaw hydrożel na drugą rundę światła UV (długość fali: 365 nm, moc: 3-4 mW/cm²) przez 30-60 s.
   UWAGA: Ważne jest, aby wystawić wzór na działanie wystarczającej ilości światła UV, aby stworzyć silny wzór bez powodowania utraty funkcji białka.
5. Przemyj hydrożele PBS, aby usunąć nieprzereagowane gatunki i umieść każdy hydrożel w płytce studzienki. Zachowaj ostrożność podczas umieszczania żeli w każdej studzience; Upewnij się, że wzorzysta powierzchnia jest skierowana do góry. Umyć żele w PBS w temperaturze 4 °C; żele są stabilne przez co najmniej dwa tygodnie w temperaturze 4 °C.

6. Przygotowanie hydrożeli do wysiewu komórek

1. Przed wysiewem inkubować żele w podłożu podstawowym przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. W przypadku ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) należy użyć pożywki EGM-2 bez czynników wzrostu. Zminimalizuj objętość pożywki dodawanej do każdej studzienki, aby zapobiec unoszeniu się hydrożelu. W przypadku płytki 48-dołkowej należy użyć pożywki o objętości 250 μl.
2. Wiruj płytkę o masie 300 x g przez 3 minuty, aby upewnić się, że hydrożele znajdują się na dnie studzienki i nie unoszą się na wodzie. Zrób to bezpośrednio przed wysiewem komórek.

7. Wysiewanie komórek na hydrożelach

1. Stosuj standardowe sterylne procedury hodowli komórek ssaków do wysiewu komórek i procedur eksperymentalnych. Usunąć HUVEC z kolb do hodowli tkankowych przy użyciu standardowych protokołów odrywania komórek. Umyć naczynie do hodowli tkankowej sterylnym PBS i inkubować z trypsyną przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.
2. Zawiesinę komórek trypsynizowanych ugasić nadmiarem pożywki komórkowej lub roztworem neutralizatora trypsyny.
3. Odwirowywać zawiesinę komórkową w wirówce o sile 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad komórkowy.
4. Zawiesić osad komórkowy w podstawowym EGM-2 bez czynników wzrostu. Użyj hemocytometru do zliczania komórek.
5. Dodaj 75 000 komórek/^cm2 do każdej powierzchni hydrożelu, pipetując powoli do środka każdej studzienki, aby nie naruszyć żeli. Umieścić płytkę studzienkową w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Przez kilka dni okresowo wyjmuj naczynie do obserwacji.

8. Ocena bioaktywności

1. Hodowla E. coli przez noc w zawiesinie w bulionie LB w zawiesinie orbitalnej w temperaturze 37 °C i 200 obr./min. Odwirować kulturę E. coli, zdekantować i rozpuść osad komórkowy w minimalnej objętości PBS. Odważyć lizozym i rozpuścić w roztworze podstawowym w stężeniu 1 mg/ml.
2. Odpipetować niewielką objętość (25 μl) roztworu podstawowego lizozymu do probówek do mikrowirówek. Dodaj różne poziomy fotoinicjatora LAP (0-12 mM) i wystaw próbki na działanie 1 minuty światła UV. W oddzielnej grupie dodaj taką samą ilość LAP (2 mM) do roztworu lizozymu i wystaw próbki na działanie różnych czasów świecenia promieniami UV (0-4 min). Uwzględnij powtórzenia dla każdego zabiegu.
3. Dodać równą objętość stężonego roztworu E. coli do każdej próbki lizozymu, aby uzyskać końcowe stężenie białka lizozymu wynoszące 0,5 mg/ml. Mieszaninę roztworów inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Daje to czas funkcjonalnemu lizozymowi na lizę ściany komórkowej bakterii i uwolnienie białek do roztworu.
4. Do kontroli pozytywnej należy użyć lizozymu niepoddanego działaniu substancji inkubowanego z E. coli; należy uznać to za pomiar w 100% bioaktywny. Roztwór lizozymu inkubowany z samym PBS należy stosować jako kontrolę ujemną.
5. Odwiruj próbki, aby usunąć resztki komórek i zachować supernatant. Uruchom test Bradforda, aby określić ilościowo całkowite stężenie białka w supernatancie w celu zmierzenia ilości lizatu bakteryjnego.
6. Uruchom test Bradforda zgodnie z protokołem producenta¹⁸. Obliczyć krotną zmianę stężenia białka w porównaniu z kontrolą ujemną.

Results

Protokół tworzenia bioaktywnych wzorów na powierzchni hydrożeli PEG jest zilustrowany w Rysunek 1. Opracowano arkusz kalkulacyjny do obliczenia objętości i stężenia dla każdego roztworu podstawowego (tabela 1A). Białka, które mają być unieruchomione na powierzchni hydrożelu, są modyfikowane za pomocą 2-iminotiolanu (Rysunek 1B). Reakcję tę przeprowadza się przy użyciu objętości z tabeli 1B...

Discussion

Protokół ten zapewnia metodę tworzenia bioaktywnych wzorców białek do zastosowań biologicznych. Istnieje kilka modyfikacji, które można wprowadzić, aby dostosować ten protokół do różnych eksperymentów. Po pierwsze, wymagania dotyczące przyłączenia komórek będą się różnić dla różnych typów komórek. Jeśli początkowo zaobserwuje się słabe przyleganie komórek do żeli, zaleca się zwiększenie stężenia białka ECM w roztworze prekursorowym. Zamiast fibronektyny można stosować inne białka ECM, w tym różne rodzaje kolagenu, lamini...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diakrylan (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Może być również syntetyzowany lub kupowany za pośrednictwem innych sprzedawców. Można stosować różne masy cząsteczkowe.
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)			Syntetyzowany w laboratorium
Fibronektyna	Corning	356008	Można stosować inne białka przyczepu komórkowego, takie jak laminina, matrigel
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Sigma	D8537-500ML
	Photomask FineLine Imaging	n/a	Niestandardowe wydruki na przezroczystych arkuszach o wysokiej rozdzielczości DPI.
Spinacze do segregatorów	Różni dostawcy Kompaktowe
źródło światła UV (365nm)	UVP	UVP-21	Można stosować inne źródła światła UV, wymagana jest kalibracja mocy.
2-iminotiolan (Pierce Traut' s odczynnik)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Odczynnik: DTNB; 5,5-ditio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy)	Thermo Sci.	22582
ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)W eksperymentach		liczbę pasaży
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 bez czynników wzrostu. Do utrzymania komórek użyto pełnej pożywki EGM-2
0,25% Trypsyna EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralizator trypsyny	Life Tech	R-002-100
Wirówka	Różne Venders
Hemocytometr	Hausser Sci. Jasna linia
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0,22 i mikro; m filtr	Cell Treat	229743
1mL Szklana strzykawka
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Sci.	12-550C
Przekładki plastikowe	Różne Sprzedawcy		Grubość 0,5 mm
70% Etanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Odczynnik Bradford	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Kolumny Microspin	Thermo Sci.
AR-G2 rehometer	TA Instruments