Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Summary

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Abstract

Technika zaciskania plastrów jest potężnym narzędziem do badania plastyczności neuronalnej wywołanej uczeniem się w określonych obszarach mózgu. Aby przeanalizować plastyczność wywołaną uczeniem motorycznym, przeszkoliliśmy szczury za pomocą zadania z przyspieszonym prętem wirnika. Szczury wykonywały zadanie 10 razy w odstępach 30-sekundowych przez 1 lub 2 dni. Wydajność uległa znacznej poprawie w dni treningowe w porównaniu z pierwszym badaniem. Następnie przygotowaliśmy ostre wycinki mózgu pierwszorzędowej kory ruchowej (M1) u niewyszkolonych i wyszkolonych szczurów. Analiza cęgów prądowych wykazała dynamiczne zmiany spoczynkowego potencjału błonowego, progu skoku, pohiperpolaryzacji i oporu błony w neuronach piramidowych warstwy II/III. Obecne wstrzyknięcie wywołało znacznie więcej skoków u szczurów trenowanych przez 2 dni niż u niewyszkolonych osób z grupy kontrolnej.

Aby przeanalizować plastyczność wywołaną uczeniem kontekstowym, przeszkoliliśmy szczury za pomocą zadania unikania hamowania (IA). Po doświadczeniu szoku stopy w ciemnej stronie pudełka, szczury nauczyły się go unikać, pozostając po oświetlonej stronie. Przygotowaliśmy ostre plastry hipokampa od szczurów nietrenowanych, trenowanych przez IA, niesparowanych i chodzących. Analizę napięcia cęgowego wykorzystano do sekwencyjnego rejestrowania miniaturowych pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych (mEPSC i mIPSC) z tego samego neuronu CA1. Znaleźliśmy różne średnie amplitudy mEPSC i mIPSC w każdym neuronie CA1, co sugeruje, że każdy neuron miał różne siły postsynaptyczne w synapsach pobudzających i hamujących. Co więcej, w porównaniu z niewyszkolonymi kontrolami, szczury wyszkolone przez IA miały wyższe amplitudy mEPSC i mIPSC, z dużą różnorodnością. Wyniki te sugerują, że uczenie się kontekstowe tworzy postsynaptyczną różnorodność zarówno w synapsach pobudzających, jak i hamujących w każdym neuronie CA1.

receptory AMPA lub GABA_A wydawały się pośredniczyć w prądach postsynaptycznych, ponieważ leczenie kąpielą CNQX lub bicukuliną blokowało odpowiednio zdarzenia mEPSC lub mIPSC. Technika ta może być wykorzystana do badania różnych rodzajów uczenia się w innych regionach, takich jak kora czuciowa i ciało migdałowate.

Introduction

Technika zaciskania kropek, opracowana przez Nehera i Sakmanna, była szeroko stosowana do eksperymentów elektrofizjologicznych¹. Technika zacisku krosowego dla całej komórki² może być używana do rejestrowania prądu lub napięcia wewnątrzkomórkowego za pomocą gigaomowego uszczelnienia błony komórkowej. Technika cęgów prądowych pozwala nam analizować różnice we właściwościach membrany, takich jak potencjał spoczynkowy, rezystancja i pojemność³. Technika zacisku napięcia pozwala nam analizować plastyczność synaptyczną wywołaną uczeniem się zarówno w synapsach pobudzających, jak i hamujących.

Główna kora ruchowa (M1) to centralny obszar, który jest niezbędny do wykonywania zręcznych ruchów dobrowolnych. Wcześniejsze badania elektrofizjologiczne wykazały rozwój plastyczności podobnej do długotrwałego wzmocnienia (LTP) w synapsach pobudzających warstwy II/III po wykwalifikowanym treningu motorycznym⁴. Co więcej, badania obrazowe in vivo wykazały ponadto przebudowę kolców dendrytycznych M1 po umiejętnym dochodzeniu do celu^5,6. Jednak plastyczność synaptyczna i wewnętrzna wywołana uczeniem się nie została wykazana w neuronach M1.

Niedawno informowaliśmy, że zadanie pręta wirnika promowało dynamiczne zmiany w synapsach glutaminergicznym i GABA-ergicznych oraz zmieniało wewnętrzną plastyczność neuronów warstwy II/III M1⁷. W tym przypadku użyliśmy techniki slice patch clamp do zbadania plastyczności wywołanej uczeniem się. Technika ta może być również wykorzystana do badania innych rodzajów plastyczności zależnej od doświadczenia w innych obszarach mózgu. Na przykład, bodźce sensoryczne do kory beczkowej mogą wzmocnić bodźce pobudzające za pośrednictwem receptora AMPA do neuronów warstwy II/III⁸, a warunkowanie strachu sygnalizujące wzmacnia bodźce pobudzające do bocznych neuronów ciała migdałowatego, co jest wymagane dla pamięci strachu⁹. Co więcej, uczenie się kontekstowe tworzy różnorodność pod względem pobudzających i hamujących danych synaptycznych do neuronów CA1 hipokampa^10,11.

Protocol

Wszystkie procedury chirurgiczne związane z utrzymaniem zwierząt były zgodne z Wytycznymi do eksperymentów na zwierzętach Szkoły Medycznej Uniwersytetu Yamaguchi i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yamaguchi.

1. Zwierzęta

1. Stosować 4- do 5-tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley (w wieku pourodzeniowym od 28 do 31 dni).
2. Zwierzęta są trzymane w oddzielnych klatkach z tworzywa sztucznego (40 cm × 25 cm × 25 cm) utrzymywanych w stałej temperaturze (23 °C ± 1 °C) w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Daj szczurom ad libitum dostęp do wody i pożywienia.

2. Test pręta wirnika

1. Aby zbadać uczenie się umiejętności motorycznych, poddaj każdego szczura testowi pręta wirnika (średnica pręta 7 cm; szerokość toru 8,9 cm; wysokość upadku 26,7 cm) przez 1 lub 2 kolejne dni (Rysunek 1A w Kida et al., 2016⁷). Zadanie należy wykonać w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23 ± 1 °C). Nie przeszkadzaj szczurom ani nie dotykaj ich przed badaniem.
2. Ustaw pręt wirnika w tryb przyspieszenia, który zwiększa się liniowo od 4 obrotów/min do 40 obrotów/min (8 π/min do 80 π/min) w ciągu 5 minut.
3. Połóż szczura na spoczywającym obrotowym pręcie. Upewnij się, że wszystkie kończyny znajdują się na pręcie.
4. Zmierz opóźnienie, które ma spaść z obracającego się pręta, aby ocenić wydajność silnika.
5. Pozwól każdemu szczurowi na 10 prób (prób) w odstępach 30-sekundowych.
6. Jeśli szczur spadnie z obracającego się pręta, połóż go ponownie na pręcie po upływie 10-20 sekund.
7. Ofiarować szczura z przedawkowaniem pentobarbitalu (400 mg / kg) 30 minut po ostatniej próbie. Wstrzyknij niewyszkolonym szczurom kontrolnym taką samą dawkę znieczulenia w ich klatkach domowych.

3. Test unikania hamowania

1. Aby zbadać uczenie się kontekstowe, poddaj szczury testowi unikania hamowania (IA) (Rysunek 1D w Mitsushima et al., 2011, 2013^10,11) Unikaj wszelkich epizodycznych doświadczeń w dniu eksperymentu, takich jak kontakt z innymi, zmiana klatki lub sprzątanie. Zadanie należy wykonywać w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23 ± 1 °C).
   UWAGA: Aparat treningowy IA to dwukomorowe pudełko akrylowe (długość 33 cm; szerokość 58 cm; wysokość 33 cm). Ma podświetlaną bezpieczną stronę i ciemną stronę przeciwwstrząsową, które są oddzielone klapą (Rysunek 1D).
2. Umieść szczura po bezpiecznej (oświetlonej) stronie podświetlanego pudełka. Obchodzić się ze szczurem delikatnie, bez stresu.
3. Odczekaj krótki czas (10 do 20 s), aby zaaklimatyzować się szczura w środowisku.
4. Otwórz przesuwane drzwi, aby szczur mógł dowolnie wejść do ciemnego pudełka.
5. Zmierz opóźnienie (s), zanim szczur wejdzie w nową ciemną stronę pudełka. Opóźnienie pierwszej próby reprezentuje wydajność szczura przed treningiem.
6. Po wejściu na ciemną stronę zamknij drzwi i zastosuj wstrząs elektryczny (2 s, 1,6 mA) za pomocą stalowych prętów elektrycznych wbitych w podłogę skrzynki. Pozwól szczurom spacerowym eksplorować aparaturę treningową przez 1 minutę bez szoku. Trzymaj niesparowane szczury w oświetlonej klatce szokowej przez kilka dni i nagle poddaj szok bez epizodycznych doświadczeń. Obchodź się delikatnie, bez stresu w żadnych grupach.
7. Trzymaj każdego szczura w ciemnym pudełku przez 10 sekund przed powrotem do klatki domowej.
8. Po 30 minutach od wstrząsu stopy ponownie umieść szczura po oświetlonej stronie pudełka. Zmierz opóźnienie, aby przejść na ciemną stronę.
9. Wróć szczura do klatki domowej.
10. Po 60 minutach od wstrząsu należy złożyć ofiarę szczura z przedawkowaniem pentobarbitalu (400 mg/kg). Ze szczurem należy obchodzić się delikatnie i wstrzykiwać znieczulenie dootrzewnowo. U nieprzeszkolonych szczurów kontrolnych wstrzyknąć znieczulenie w ich domowych klatkach bez doświadczenia opisanego powyżej.

4. Bufor preparacyjny

1. Rozpuść kryształy 0,195 g NaH₂PO 4-2H ₂O, 0,188 g KCl, 0,074 g CaCl₂, 1,423 g MgCl_{2-6H 2}O i 12,579 g chlorku choliny w ultraczystej wodzie (900 ml do 950 ml). Patrz tabela 1.
2. Rozpuść kryształy 2.340 g kwasu askorbinowego, 0.342 g soli sodowej kwasu pirogronowego, 2.100 g_NaHCO3 i 4.500 g glukozy.
3. Dodaj wodę do 1000 ml. Zakres osmolalności będzie wynosił od 290 mOsm/L do 300 mOsm/L. Dostosuj osmolalność, dodając ultraczystą wodę, jeśli jest poza zakresem.
4. Roztwór należy rozpylać z mieszaniną 5% CO₂ / 95% O₂ w lodowatych temperaturach przez 5 minut przed użyciem.

5. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)

1. Rozpuść kryształy 0,186 g KCl, 6,700 g NaCl i 0,156 g NaH₂PO 4-2H₂O w ultraczystej wodzie (900 ml do 950 ml). Patrz tabela 2.
2. Bąbelkować mieszaniną gazów przez 5 minut.
3. Rozpuścić kryształy 1.800 g glukozy i 2.184 g_NaHCO3, a następnie dodać 4 ml MgCl₂ i 4 ml CaCl₂ z 1 M roztworów podstawowych.
4. Dodaj wodę do 1000 ml. Zakres osmolalności będzie wynosił od 290 mOsm/L do 295 mOsm/L. Dostosuj osmolalność, dodając ultraczystą wodę, jeśli przekracza zakres.
5. Przed użyciem przemyć bąbelki z mieszaniną gazów.

6. Roztwory wewnątrzkomórkowe

1. W przypadku zapisów cęgowych prądowych (Tabela 3) rozpuść 0,0746 g KCl, 6,089 g K-glukonianu, 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA i 500 μl MgCl₂ z 1 M roztworu podstawowego w 180 ml ultraczystej wody (dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH).
   1. Dodać 0,4408 g Na_2-ATP, 0,0418 g Na_3-GTP i 0,510 g Na-fosfokreatyny. Dodaj wodę do 200 ml i dostosuj pH do 7,35 za pomocą KOH.
   2. Dostosuj osmolalność do około 290 mOsm/L, dodając ultraczystą wodę.
   3. Przechowywać w postaci 1 ml porcji w zamrażarce (-30 °C).
2. W przypadku zapisów cęgowych (Tabela 4) rozpuść 5,244 g CsMeSO₃, 0,672 g CsCl, 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA i 500 μl MgCl₂ z 1 M roztworów podstawowych w 180 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą CsOH. W przypadku zapisów mEPSP i mIPSP należy użyć zmodyfikowanego stężenia 5,814 g CsMeSO₃ i 0,252 g CsCl, aby dostosować potencjał odwrócenia odpowiedzi receptora GABA_A¹¹.
   1. Dodać 0,4408 g Na_2-ATP, 0,0418 g Na_3-GTP i 0,510 g Na-fosfokreatyny. Dodaj wodę do 200 ml i dostosuj pH do 7,35 za pomocą CsOH.
   2. Dostosuj osmolalność do około 290 mOsm/L, dodając ultraczystą wodę.
   3. Przechowywać w postaci 1 ml porcji w zamrażarce (-30 °C).

7. Przygotowanie plastra

1. Przed złożeniem w ofierze schłodź wszystkie narzędzia do preparowania kruszonym lodem (Rysunek 2A). Dodaj około 500 ml zimnej wody do pojemnika z kruszonym lodem, aby zwiększyć powierzchnię kontaktu. Ta procedura została opisana wcześniej^10,11,12.
   UWAGA: Narzędzia tutaj to: duże nożyczki, nożyczki do tęczówki, szpatułka, mikroszpatułka, kleszcze, pęseta, zlewka ze stali nierdzewnej o pojemności 200 ml, ostrze do przycinania mózgu, strzykawka do perfuzji serca o pojemności 120 ml wypełniona buforem preparacyjnym potraktowanym mieszaniną gazów, silikonowa rurka (20 cm) połączona ze spłaszczoną igłą o rozmiarze 18, nierdzewny etap preparacji mózgu (grubość = 3 mm, φ = 12 cm) oraz stolik montażowy dla wibratomu (φ = 5 cm).
2. Poświęć szczura 30 minut po zakończeniu paradygmatu behawioralnego, znieczulając go przedawkowaniem pentobarbitalu (400 mg / kg masy ciała). Szybko przygotuj plasterki, aby upewnić się, że są one tak zdrowe, jak to tylko możliwe^10,11,12. Protokół ekstrakcji mózgu spełnia wszystkie normy weterynaryjne obowiązujące na naszej uczelni.
3. Napełnij strzykawkę o pojemności 120 ml lodowatym buforem do rozwarstwiania (Tabela 1) z bąbelkami 5% mieszaniny gazów CO₂ / 95% O_{2 .} Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza przed perfuzją.
4. Po odsłonięciu serca wbij igłę w tylną część lewej komory.
5. Wykonaj perfuzję przezsercową mózgu ręcznie za pomocą strzykawki. Większe szczury wymagają większego buforu preparacyjnego do perfuzji. Zanurz mózg w lodowatym buforze preparacyjnym na 5 minut. Podczas zanurzania należy w sposób ciągły bąbelkować bufor
.
6. Przytnij tylną stronę mózgu pod kątem równoległym do dendrytycznej orientacji docelowego obszaru korowego za pomocą ostrza. Ponieważ mózg stoi na etapie sekcji z odciętym końcem na dole, kąt początkowy określa kąt wszystkich kolejnych wycinków mózgu. Ten krok jest niezwykle ważny (Rysunek 2B). Nieprawidłowy kąt może przeciąć docelowe neurony piramidowe.
   UWAGA: Narzędzia tutaj to: ostrze do przycinania mózgu, bibuła filtracyjna (φ = 10 cm), nierdzewny etap preparacji mózgu (grubość = 3 mm, φ = 12 cm), szpatułka, superglue, zakraplacz i stolik montażowy do wibratomu (φ = 5 cm).
7. Wytnij wycinki mózgu koronalnego o grubości 350 μm za pomocą wibratomu. Napełnij komorę rozwarstwiania lodowatym buforem z bąbelkami mieszaniny gazów 5% CO₂ / 95% O₂ (Rysunek 2C). Bąbelkuj bufor w sposób ciągły podczas wycinka mózgu.
8. Przytnij obrzeża obszaru docelowego za pomocą nożyczek do przysłony.
9. Delikatnie umyj przycięte plastry w temperaturze pokojowej aCSF z bąbelkami 5% CO₂ / 95% O₂ (tabela 2).
10. Trzymaj przycięte plasterki w komorze interfejsu, aż do momentu wykonania nagrania (Rysunek 2D i E). Inkubacja przez 1 godzinę w komorze poprawia stan komórek, ale fenotypy zmieniają się, jeśli plastry są inkubowane dłużej niż 10 godzin. Zamknij pokrywę komory, aby zamknąć gazy i małe krople cieczy aCSF.

8. Zacisk krosowy na całe ogniwo

UWAGA: Nagrania całych komórek wymagają wzmacniacza i filtra dolnoprzepustowego, który jest ustawiony na częstotliwość graniczną 5 kHz. Sygnały są digitalizowane i przechowywane w komputerze PC. Przechowywane dane są analizowane w trybie offline (Rysunek 3A).

1. Utwórz szklane elektrody za pomocą poziomego ściągacza. Napełnij elektrody odpowiednim roztworem (tabele 3 i 4) za pomocą zwykłej strzykawki z polietylenu o pojemności 1 ml przymocowanej do drobnej szklanej rurki i filtra 0,22 μm.
2. Przed kontaktem z kuwetą należy utrzymać nadciśnienie i wyregulować prąd pipety do zera.
3. Po utworzeniu uszczelki gigaomowej zastosuj podciśnienie, aby rozerwać błonę komórkową (konfiguracja całej komórki w Rysunek 3F).

9. Analiza cęgów prądowych

1. Właściwości błony komórkowej
   1. Napełnij pipety rejestrujące plastry roztworem wewnątrzkomórkowym do zapisów cęgowych prądu (Tabela 3). Rezystancja pipety wynosi od 4 MΩ do 7 MΩ w aCSF.
   2. Po pęknięciu membrany należy utrzymać napięcie membrany na poziomie -60 mV w trybie V-CLAMP. Następnie przełącz się z trybu "kąpieli" na tryb "komórki" w teście membranowym za pomocą oprogramowania do pomiaru wewnętrznych właściwości komórki, takich jak pojemność błony, rezystancja i stała czasowa.
2. Aktualne badanie dotyczące iniekcji
   1. Po zarejestrowaniu wewnętrznych właściwości ogniwa należy przełączyć tryb z V-CLAMP na TRACK (I = 0) / I-CLAMP NORMAL dla wtrysku prądu. Należy pamiętać, że potencjał złącza cieczowego nie powinien być korygowany¹⁰.
   2. Wstrzyknij prąd do ogniwa na 300 ms. Zmieniaj natężenie prądu krok po kroku od -100 pA do +550 pA ze wzrostem o 50 pA. Policz liczbę skoków (potencjałów czynnościowych) wywołanych przez obecne wstrzyknięcia.
   3. Zmierzyć minimalne napięcie potrzebne do wywołania potencjału czynnościowego (jest to napięcie progowe).
   4. Oblicz amplitudę po hiperpolaryzacji jako różnicę między napięciem w momencie inicjacji skoku a najniższym napięciem osiągniętym podczas hiperpolaryzacji⁷.

10. Analiza cęgów napięciowych

1. Stosunek AMPA/NMDA
   UWAGA: Stosunek AMPA/NMDA jest konwencjonalnym sposobem oceny plastyczności postsynaptycznej w glutaminergicznym synapsie pobudzającym^7,8,9,10,11. Należy jednak pamiętać, że równoczesny wzrost obu składników może nie zmienić ratio¹³.
   1. Przeprowadzić fuzję komory rejestracyjnej roztworem fizjologicznym bąbelkowym mieszaniną gazów i utrzymać temperaturę na poziomie od 22 °C do 25 °C. Dodać 0,1 mM pikrotoksyny do roztworu, aby zablokować odpowiedź GABA_A, w której pośredniczy i dodać 4 μM 2-chloroadenozyny, aby ustabilizować wywołaną odpowiedź neuronalną¹⁴.
   2. Napełnij pipety do zapisu plastrów roztworem wewnątrzkomórkowym do zapisów cęgowych (Tabela 4). Sprawdź rezystancję pipety rejestrującej w aCSF. Rezystancja wynosi od 4 MΩ do 7 MΩ.
   3. W celu nagrania w warstwie II/III neuronów piramidowych w M1, należy umieścić bipolarną elektrodę stymulującą wolfram 200 μm do 300 μm bocznie od komórek, które mają być rejestrowane, poniżej powierzchni pial w obszarze reprezentacji kończyny przedniej (2 mm bocznie do linii środkowej)^15,16,17.
   4. W celu nagrania w neuronie piramidowym CA1 należy umieścić elektrodę stymulującą od 200 μm do 300 μm boczną (włókno poboczne Schaffera) lub przyśrodkową (ścieżka skroniowo-amonowa) do komórek, które zostaną zarejestrowane (Rysunek 3B).
   5. Zwiększ intensywność bodźca aż do odpowiedzi synaptycznej > 10 pA.
   6. Oblicz stosunek AMPA/NMDA jako stosunek prądu szczytowego mierzonego przy -60 mV do prądu mierzonego przy +40 mV po 150 ms po wystąpieniu bodźca. Należy pamiętać, że w celu obliczenia stosunku należy uśrednić od 50 do 100 śladów.
2. Miniaturowe nagrania prądów postsynaptycznych
   Uwaga: Uważa się, że miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC) odpowiadają reakcjom wywołanym przez presynaptyczne uwolnienie pojedynczego pęcherzyka glutaminianu¹⁸. W przeciwieństwie do tego, uważa się, że miniaturowe hamujące prądy postsynaptyczne (mIPSC) odpowiadają reakcjom wywołanym przez presynaptyczne uwolnienie pojedynczego pęcherzyka GABA¹⁸. Wzrost amplitudy mEPSC i mIPSC odzwierciedla wzmocnienie transmisji postsynaptycznej, podczas gdy wzrost częstości zdarzeń odzwierciedla wzrost liczby funkcjonalnych synaps lub prawdopodobieństwo uwolnienia presynaptycznego¹¹.
   1. Napełnij pipetę rejestrującą plaster zmodyfikowanym roztworem wewnątrzkomórkowym (Tabela 4), aby dostosować potencjał odwrócenia prądu, w którym pośredniczy receptor GABA_A, do -60 mV.
   2. Dodać 0,5 μM tetrodotoksyny do kąpieli, aby zablokować spontaniczne potencjały czynnościowe.
   3. Utrzymaj napięcie na poziomie -60 mV, aby rejestrować zdarzenia mEPSC przez 5 minut.
   4. Zmień potencjał podtrzymania na 0 mV, aby rejestrować zdarzenia mIPSC przez 5 minut. Ponieważ neurony M1 wykazują nieco wyższy potencjał odwrócenia dla prądów za pośrednictwem receptora AMPA, mIPSC neuronów M1 są rejestrowane przy +15 mV z 0,1 mM APV.
   5. Poczekaj kilka minut, aż prąd się ustabilizuje.
   6. Nagrywaj zdarzenia mIPSC przez 5 minut.
   7. Wykrywaj miniaturowe zdarzenia za pomocą oprogramowania i używaj zdarzeń powyżej 10 pA do analizy. Policz liczbę zdarzeń mEPSC lub mIPSC przez 5 minut, aby określić częstotliwość. Uśrednij amplitudy zdarzeń, aby uzyskać średnią amplitudę.
   8. Sprawdzić, czy kąpiel w kąpieli z użyciem 10 μM CNQX czy 10 μM metiodku bicukuliny blokuje odpowiednio zdarzenia mEPSC i mIPSCs.
3. Analiza impulsów sparowanych
   UWAGA: Plastyczność presynaptyczną można analizować za pomocą analizy impulsów sparowanych. Wzrost częstości parowanych impulsów sugeruje spadek prawdopodobieństwa uwalniania presynaptycznego glutaminianu lub GABA^7,10,11.
   1. Aby przeanalizować synapsy pobudzające, dodaj 0,1 mM pikrotoksyny i zarejestruj odpowiedź przy -60 mV. Chociaż do kąpieli dodaliśmy 4 μM 2-chloroadenozynę, musimy pamiętać, że lek wpływa na prawdopodobieństwo uwolnienia presynaptycznego¹⁴ .
   2. Aby przeanalizować synapsy hamujące, dodaj 0,1 mM APV i 4 μM 2-chloroadenozynę do kąpieli i zarejestruj odpowiedź przy 0 mV. W neuronach M1 zarejestruj odpowiedź przy +15 mV.
   3. Zastosuj sparowane impulsy z interwałem między bodźcami wynoszącym 100 ms lub 200 ms.
   4. Zapisać 50-100 sekwencyjnych śladów przy każdym potencjale utrzymywania i uśrednić wartości.
   5. Oblicz sparowany stosunek impulsów jako stosunek drugiego piku do pierwszego piku prądu postsynaptycznego.

Results

Jak opisaliśmy niedawno⁷, trening prętów wirnika (Rysunek 1A) wywołał dynamiczne zmiany w wewnętrznej plastyczności neuronów piramidowych warstwy M1 II/III. Pomiar opóźnienia do momentu, gdy szczury spadną z obracającego się pręta, pozwala nam oszacować wykwalifikowaną wydajność uczenia się szczura. Dłuższe opóźnienie wskazuje na lepszą wydajność silnika. W pierwszym dniu treningu szczury poprawiły wydajność pręta wirnika, aż do zakończenia próby. W drugim dniu szczury osiągnęły prawie asymptotyczne poziomy w uśrednionych wynikach sesji (Rysunek 1B). W porównaniu z opóźnieniem w pierwszym badaniu, analiza post-hoc wykazała znaczną poprawę w końcowych próbach w dniach treningowych (Rysunek 1C).

Rysunek 4A pokazuje przykład analizy cęgów prądowych, w której właściwości neuronów zmieniły się po nauczeniu się umiejętności motorycznych. Zastrzyki prądów 400 pA i 500 pA były potrzebne do indukcji potencjałów czynnościowych odpowiednio w grupie nietrenowanej i u szczurów trenowanych w ciągu 1 dnia. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie tylko prądu o natężeniu 150 pA było wystarczające do wywołania potencjałów czynnościowych u szczurów trenowanych przez 2 dni. Zależność między aktualną intensywnością a liczbą potencjałów czynnościowych jest pokazana w Rysunek 4B. Zaledwie 50 pA prądu wystarczyło, aby wywołać skoki u szczurów trenowanych przez 2 dni; w przeciwieństwie do tego, szczury wyszkolone w ciągu 1 dnia zareagowały mniejszym potencjałem czynnościowym niż szczury niewyszkolone na 350 pA i wyższe prądy. Co więcej, Rysunek 4C pokazuje, że 1-dniowe wytrenowane szczury wykazywały niższy potencjał spoczynkowy, wyższy próg skoku i głębszą pohiperpolaryzację, podczas gdy 2-dniowe trenowane szczury wykazywały wyższy potencjał spoczynkowy (Rysunek 4C) i odporność błony (Rysunek 4D).

Jak opisaliśmy wcześniej¹¹, trening IA (Rysunek 1D) indukował plastyczność postsynaptyczną w synapsach pobudzających i hamujących neuronów CA1 hipokampa. Mierząc opóźnienie w kasetonie, mogliśmy oszacować kontekstową wydajność uczenia się szczura. Rysunek 1E pokazuje wyniki zadania IA. Po sparowanym porażeniu prądem szczury uczą się unikać ciemnej strony pudełka i pozostawać po oświetlonej stronie, której zwykle nie preferują. Tendencja do unikania ciemnej strony wskazuje zatem na nabywanie wspomnień kontekstowych.

Rysunek 5 pokazuje przykład analizy napięcia cęgowego, w której miniaturowe prądy postsynaptyczne uległy dramatycznym zmianom po kontekstowym uczeniu się. Aby zbadać plastyczność wywołaną uczeniem się, spontaniczne mEPSC za pośrednictwem AMPA i mIPSC za pośrednictwem GABA_A zostały sekwencyjnie zarejestrowane w obecności 0,5 μM tetrodotoksyny (Figura 5A i B). Jak pokazano na wykresach dwuwymiarowych (Rysunek 5C), każdy neuron CA1 miał różne średnie amplitudy dla mEPSC i mIPSC. Chociaż amplitudy były niskie i wykazywały wąski zakres dystrybucji u szczurów nietrenowanych, niesparowanych i chodzących, były one zróżnicowane u szczurów wyszkolonych przez IA (Tabela 5). ANOVA, po której przeprowadzono analizę post-hoc, wykazała znaczny wzrost średnich amplitud mEPSC i mIPSC u szczurów wyszkolonych przez IA (Figura 5E), co sugeruje indukowaną uczeniem się plastyczność postsynaptyczną w neuronach CA1.

Ponadto, każdy neuron CA1 wykazywał różne częstotliwości mEPSC i mIPSC (Rysunek 5D). Chociaż częstość występowania była niska i wykazywała wąski zakres dystrybucji u szczurów nietrenowanych, niesparowanych i chodzących, były one zróżnicowane u szczurów wyszkolonych w IA. ANOVA, po której nastąpiła analiza post-hoc, wykazała znaczny wzrost częstości występowania zdarzeń mEPSC i mIPSC u szczurów wyszkolonych przez IA (Figura 5F). Istnieją dwie możliwe interpretacje tych wyników. Po pierwsze, uczenie się kontekstowe zwiększyło liczbę funkcjonalnych synaps neuronów. Drugim jest to, że uczenie się kontekstowe zwiększa prawdopodobieństwo presynaptycznego uwalniania glutaminianu i GABA.

Aby dokładniej zbadać plastyczność presynaptyczną, przeprowadziliśmy również stymulacje impulsami parowanymi, jak informowaliśmy wcześniej^10,11.

Rysunek 1: Wydajność uczenia się po treningu.
Odp .: Projekt eksperymentalny pokazuje trening pręta wirnika i koronalny wycinek mózgu. B: Średnie opóźnienie spadające z cylindra pręta przyspieszającego wirnika. C: Średnie opóźnienie do odpadnięcia od pręta podczas pierwszej i ostatniej próby w dniach treningu 1 i 2⁷. **P<0,01 w porównaniu z pierwszą próbą. D: Schemat zadania unikania hamowania (IA) i koronalnego wycinka mózgu. E: Średnie opóźnienie do wejścia do ciemnego pola przed i po szkoleniu IA¹¹. **P<0,01 w porównaniu z przed treningiem IA. Liczby przy odcinkach koronalnych wskazują odległość przed bregmą w mm. Liczba zwierząt jest pokazana na dole pasków. Słupki błędów wskazują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Procedury krojenia.
O: Fotografie pokazują przygotowanie ostrych wycinków mózgu. Narzędzia preparacyjne przed użyciem schładzano w kruszonym lodzie. B: Sekcja i przycinanie mózgu. Należy pamiętać, że kąt przycinania po tylnej stronie musi być zorientowany równolegle do orientacji dendrytycznej. C: Cięcie mózgu w komorze wibratomowej. Mózg jest kąpany w buforze rozwarstwiającym i w sposób ciągły bąbelkowany mieszaniną gazów 5% CO₂ / 95% O₂ . D: Komora interfejsu wykonana z dwóch plastikowych pojemników na żywność i silikonowej rurki. Komora została wypełniona sztucznym płynem płynnym (CSF) i w sposób ciągły bąbelkowała mieszaniną gazów. E: Wycinki mózgu umieszczono na mokrej bibule filtracyjnej w komorze. Bar = 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Procedury zaciskania kropek.
A: System patch-clamp używany do rejestrowania sygnałów elektrycznych z neuronu. Lokalizacja elektrod stymulujących i rejestrujących w neuronach warstwy II/III jest pokazana w korze ruchowej szczura. B: Aby przeanalizować synapsy Schaffera neuronu piramidowego CA1, elektrodę stymulującą umieszczono w warstwie radiatum. W celu analizy synaps temporoammonicznych w warstwie molekularnej umieszczono elektrodę stymulującą. Pokazano reprezentatywne ślady wywołanych pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem receptorów AMPA i NMDA w tym samym neuronie CA1. C: Do ustabilizowania plastra w komorze nagraniowej użyto kotwy do krowy. D: Mapa reprezentacji w korze ruchowej, oparta na opublikowanych artykułach^15,16,17. ML = linia środkowa. E: Mikrofotografie IR-DIC neuronów warstwy II/III M1 przed (na górze) i podczas zapisu (na dole). Bar = 10 μm. F: Zmiany prądu pipety przed dotknięciem (u góry) i przy pęknięciu membrany (u dołu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki analizy cęgów prądowych⁷.
A: Reprezentatywne ślady potencjałów czynnościowych zarejestrowanych po indukcji za pomocą wstrzyknięć prądu. B: Zależności między średnim prądem wejściowym (pA) a potencjałem czynnościowym (liczba skoków) w wycinkach mózgu od szczurów nietrenowanych (otwarte paski), trenowanych przez 1 dzień (szare paski) i 2-dniowych treningów (wypełnione paski). C: Potencjał spoczynkowy, próg i pohiperpolaryzacja neuronów warstwy II/III. D: Opór błony i opór szeregowy neuronów. W każdej grupie użyliśmy 9 - 10 szczurów. Liczba komórek jest wyświetlana w każdym pasku. Słupki błędów wskazują SEM. *P<0,05, **P<0,01 w porównaniu z niewytrenowanym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki analizy cęgów napięcie¹¹.
Reprezentatywne ślady miniaturowych pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych (mEPSC i mIPSC) u szczurów wyszkolonych w procesie unikania hamowania (A) i hamowania (IA) (B). mEPSC przy -60 mV i mIPSC przy 0 mV mierzono sekwencyjnie w tym samym neuronie piramidowym CA1 w obecności tetrodotoksyny (0,5 μM). Pionowy pasek = 20 pA, poziomy pasek = 200 ms. C: Dwuwymiarowe wykresy średnich amplitud mE(I)PSC u szczurów nietrenowanych, wyszkolonych IA, niesparowanych i chodzących. D: Dwuwymiarowe wykresy częstości mE(I)PSC w 4 grupach. Należy zauważyć, że każdy neuron CA1 wykazywał różne średnie amplitudy i częstotliwości mE(I)PSC. Trening IA nie tylko wzmocnił średnie amplitudy (E), ale także zwiększył częstość zdarzeń mE(I)PSC (F). Użyliśmy 4 - 6 szczurów w każdej grupie. Liczba komórek jest pokazana u dołu pasków. Czerwone znaki plus (C, D) i paski z pionowymi liniami (E, F) wskazują średnią ± SEM. **P<0,01 w porównaniu z niewyszkolonymi szczurami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Bufor preparacyjny (Razem 1L)
NaH2PO4 • 2H2O	0,195 gr	1,25 mmol/l
Kcl	0,188 gr	2,5 mmol/L
CaCl2	0,074 gr	0,5 mmol/l
MgCl2 • 6H2O	1,423 grama	7,0 mmol/L
Chlorek choliny	12.579 gr	90 mmol/L
kwas askorbinowy	2.340 gr	11,6 mmol/L
Kwas pirogronowy	0,342 gr	3,1 mmol/l
NaHCO3	2.100 gr	25 mmol/L
glukoza	4.500 gr	25 mmol/L

Tabela 1: Przepis na bufor preparacyjny

Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (Razem 1L)
Kcl	0,186 gr	2,5 mmol/L
Zawartość NaCl	6.700 gr	114,6 mmol/L
NaH2PO4 •2H2O	0,156 gr	1 mmol/L
glukoza	1.800 gr	10 mmol/L
NaHCO3	2.184 gr	26 mmol/L
1M MgCl2	4 ml	4 mmol/l
1M CaCl2	4 ml	4 mmol/l

Tabela 2: Przepis na sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF)

Wewnątrzkomórkowe rozwiązanie dla cęgów prądowych (Łącznie 200 ml)
Kcl	0,0746 gr	5 mmol/L
K-glukonian	6.089 gr	130 mmol/L
HEPESY	0,476 gr	10 mmol/L
EGTA (EGTA)	0,0456 gr	0,6 mmol/l
1M MgCl2	500 μL	2,5 mmol/L
Na2 ATP	0,4408 gr	4 mmol/l
Na3 GTP	0,0418 gr	0,4 mmol/l
Na fosfokreatyna	0,510 gr	10 mmol/L

Tabela 3: Przepis na wewnątrzkomórkowe rozwiązanie do bieżącego zapisu cęgowego

powiedział:

Wewnątrzkomórkowe rozwiązanie do cęgów napięciowych (Łącznie 200 mL)
CsMeSO3	5.244 gr	(5,814)*	115 mmol/L	(127,5)*
CsCl	0,672 gr	(0,252)*	20 mmol/L	(7,5)*
HEPESY	0,476 gr		10 mmol/L
EGTA (EGTA)	0,0456 gr		0,6 mmol/l
1M MgCl2	500 μL		2,5 mmol/L
Na2 ATP	0,4408 gr		4 mmol/l
Na3 GTP	0,0418 gr		0,4 mmol/l
Na fosfokreatyna	0,510 gr		10 mmol/L
* niskie stężenie Cl- dla miniaturowych nagrań

Tabela 4: Przepis na wewnątrzkomórkowe rozwiązanie do zapisu cęgów napięcia

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Parametry		Niewprawnego	Przeszkolony w zakresie sztucznej inteligencji	Nieparzysty	Spacer po
Amplituda mEPSC	wariancja	5,8	Nr 32,1	Rozdział 4.7	Pozycja 5.9
	odchylenie standardowe	2.4	5,7	2.2	2.4
	Współczynnik zmienności	0,189	0,326	0,177	0,190
Amplituda mIPSC	wariancja	Rozdział 17.1	56,7	31,8	Pytanie 20,7
	odchylenie standardowe	4.1	7,5	5,6	Rozdział 4.5
	Współczynnik zmienności	0,279	0,387	0,367	0,286

Tabela 5: Różnorodność miniaturowych amplitud pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych (mEPSC i mIPSC) u szczurów wyszkolonych w unikaniu hamowania (IA)

szt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. Rozdział pkt. pkt.

Parametry		Niewprawnego	Przeszkolony w zakresie sztucznej inteligencji	Nieparzysty	Spacer po
Częstotliwość mEPSC	wariancja	Rozdział 278	2195	Rozdział 188	Rozdział 195
	odchylenie standardowe	17	Rozdział 47	14	14
	Współczynnik zmienności	0,902	1,198	0,893	0,874
Częstotliwość mIPSC	wariancja	Numer katalogowy: 3282	Numer katalogowy: 27212	1385	Numer katalogowy: 5135
	odchylenie standardowe	57	165	37	72 Rozdział 72
	Współczynnik zmienności	1,195	1,006	0,955	0,836

Tabela 6: Różnorodność częstotliwości miniaturowych pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych (mEPSC i mIPSC) u szczurów wyszkolonych w unikaniu hamowania (IA)

Discussion

Głównym ograniczeniem techniki zacisku krosowego jest zapis w przygotowaniu plastrów, który może nie odzwierciedlać tego, co dzieje się in vivo. Chociaż analiza cęgów prądowych in vivo jest bardziej wiarygodna, uzyskanie wystarczających danych od przytomnych zwierząt jest technicznie trudne. Ponieważ każdy neuron piramidowy ma inne właściwości komórkowe, potrzebna jest odpowiednia liczba komórek, aby prawidłowo analizować różnice w neuronach po treningu. Co więcej, analiza napięcia cęgowego wymaga ciągłego leczenia farmakologicznego CNQX, APV lub bicukuliny w celu określenia charakteru odpowiedzi postsynaptycznych. Aby przeanalizować miniaturowe reakcje wywołane przez pojedynczy pęcherzyk glutaminianu lub GABA, konieczne jest ciągłe leczenie tetrodotoksyną w celu zablokowania spontanicznych potencjałów czynnościowych. Chociaż niedawno opracowana technika obrazowania wielofotonowego jest skuteczna w analizie zmian morfologicznych w synapsach pobudzających¹⁹, do analizy funkcji synaps in vivo potrzebna jest technika połączonego patch clamp. Obecnie dość trudno jest analizować zmiany morfologiczne w synapsach hamujących, ponieważ większość synaps hamujących nie tworzy kolców. W tej chwili zacisk plasterkowy byłby najbardziej odpowiednią techniką do analizy właściwości komórek lub funkcji synaps pobudzających/hamujących u wyszkolonych zwierząt.

Korzystając z analizy cęgów prądowych (ryc. 4), niedawno opisaliśmy wewnętrzną plastyczność wywołaną uczeniem motorycznym w neuronach warstwy II/III. W szczególności szczury trenowane przez 1 dzień wykazały znaczny spadek spoczynkowego potencjału błonowego i wzrost progu skoku. Szczury trenowane przez 2 dni wykazały znaczny wzrost spoczynkowego potencjału błonowego, co doprowadziło do zwiększonej pobudliwości. Wyniki te sugerowały, że u wyszkolonych szczurów zaszły dynamiczne zmiany w wewnętrznej plastyczności neuronów warstwy II/III M1. Dodatkowa analiza napięcia cęgowego ujawniła wzrost współczynnika sparowanych impulsów u szczurów trenowanych w ciągu 1 dnia, co sugeruje, że nastąpił przejściowy spadek presynaptycznego prawdopodobieństwa uwolnienia GABA⁷. W związku z tym możliwe jest, że odhamowanie GABA w synapsach warstwy II/III może wywołać wynikającą z tego plastyczność indukowaną uczeniem się w M1. W tym celu przygotowanie M1 w plastrach wymaga kąpieli z blokerem receptora GABA_A w celu indukcji LTP²⁰.

Analiza miniaturowych potencjałów postsynaptycznych jest skutecznym sposobem wykrywania plastyczności synaptycznej u zwierząt wyszkolonych w IA. Sekwencyjny zapis mEPSC i mIPSC w pojedynczym neuronie CA1 pozwala na analizę synaptycznej siły pobudzającej/hamującej każdego pojedynczego neuronu. Ponieważ pojedyncza odpowiedź mE(I)PSC jest przypisywana pojedynczemu pęcherzykowi glutaminianu lub GABA, wzrost amplitudy mE(I)PSC sugeruje wzmocnienie postsynaptyczne. Korzystając z analizy mE(I)PSC, znaleźliśmy indywidualne różnice w sile wejścia pobudzającego / hamującego do każdego neuronu CA1 (Figura 5C). Trening IA wyraźnie promował różnorodność w sile synaptycznej, ale nie zaobserwowano tego w innych grupach (Tabela 5).

Różnorodność synaptyczna wywołana uczeniem się może być analizowana matematycznie. Obliczając prawdopodobieństwo pojawienia się każdego punktu, dane z każdego neuronu można przekształcić w samoentropię (bit) przy użyciu teorii informacji Claude'a E. Shannona²¹. Punkt o wysokim prawdopodobieństwie pojawienia się (wokół średniego poziomu) wskazuje na niską autoentropię, podczas gdy punkt o bardzo rzadkim prawdopodobieństwie (punkt odchylony) wskazuje na wysoką autoentropię. W porównaniu z niewyszkolonymi szczurami, samoentropia na neuron była wyraźnie zwiększona u szczurów wyszkolonych przez IA, ale nie u^szczurów niesparowanych lub chodzących przez niego. Analiza ta sugeruje, że po uczeniu kontekstowym nastąpił wzrost ilości informacji wewnątrz CA1.

Technika zaciskania łaty slice może być również stosowana do badań nad warunkowaniem strachu w bocznym ciele migdałowatym⁹ oraz do badań doświadczeń sensorycznych w korze beczkowej⁸. Co więcej, technika ta może być stosowana z różnymi innymi technikami do dalszych badań. Na przykład technikę dostarczania genów znakowanych białkiem zielonej fluorescencji (GFP) za pośrednictwem wirusa można połączyć z techniką zacisku plastrowego w celu analizy funkcji określonych cząsteczek. Ponadto ogniskowe mikrowstrzyknięcie znacznika wstecznego może być wykorzystane do wizualizacji określonych neuronów, które rzutują na określony obszar. Następnie, korzystając z techniki cęgów prądowych, można przeanalizować właściwości specyficzne dla komórki w wizualizowanych neuronach²³. Co więcej, połączenie dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej z dwufotonowym laserowym odsadzaniem glutaminianu wykorzystano do wykazania wzrostu specyficznego dla kręgosłupa i odpowiedzi EPSC w neuronach piramidowych warstwy II/III kory mózgowej myszy¹⁹. W związku z tym technika zaciskania plastrów plastrów jest ulepszana poprzez łączenie jej z nowymi substancjami chemicznymi, dostarczaniem genów i technikami manipulacji zdjęciami.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bieżnie Rota-Rod	Med Associates Inc.	ENV577
Pudełko do unikania hamowania	Shinano Seisakusho
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku
Blade	Nisshin EM Co., Ltd	LC05Z
Strzykawka perfuzyjna serca	JMS Co., Ltd	JS-S00S
Wibratome	Leica Microsystems	VT-1200
Ściągacz poziomy	Instrument Sutter	Model P97
Microfilm 34 gauge	World Precision Instruments, Inc	MF34G-5
0,22 i mikro; m filtr	Millipore	SLGVR04NL
Axopatch– Wzmacniacz 1D	Tablica Axon Instruments
Digidata 1440 AD	Oprogramowanie Axon Instruments
pCLAMP 10	Axon Instruments
	Kamera CCD Olympus	BX51WI
	Kontroler kamery Olympus	U-CMAD3
Hamamatsu Photonics K.K.		C2741
Stymulator	Nihon Kohden	SEN-3301
Izolator	Nihon Kohden	SS-104J
Manipulator z napędem	silnikowym Sutter Instrument	MP-285
Mikromanipulator	Narishige	NMN-21
Pompa perystaltyczna	Gilson, Inc	MINIPULS® 3
Szklana kapilarna	Narishige	GD-1,5
Ag/AgCl	World Precision Instruments, Inc	EP4
Slice Anchor	Warner instruments	64-0252
Elektroda stymulująca	Unique Medical Co., Ltd	KU201-025B
Materiały<	silny>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor separacyjny/ sztuczny CSF
NaH2PO4 • 2H2O	Sigma-Aldrich Co.	C1426
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries	039-00475
MgCl2 • 6H2O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
Chlorek choliny	Sigma-Aldrich Co.	C7527
Kwas askorbinowy	Wako Pure Chemical Industries	190-01255
Kwas pirogronowy Na	Wako Pure Chemical Industries	199-03062
NaHCO3	Sigma-Aldrich Co.	28-1850-5
Glukoza	Sigma-Aldrich Co.	07-0680-5
Materiały<	silny>Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Roztwór wewnątrzkomórkowy
K-Gluconate	Sigma-Aldrich Co.	G4500
HEPES	Wako Pure Chemical Industries	346-01373
EGTA	Wako Pure Chemical Industries	348-01311
Na2 ATP	Nacalai Tesque	01072-24
Na3 GTP	Sigma-Aldrich Co.	G-8877
Na fosfokreatyna	Sigma-Aldrich Co.	P-7936
CsMeSO3	Sigma-Aldrich Co.	C1426
CsCl	Wako Pure Chemical Industries	033-01953
Materials	Company	Numer katalogowy	Uwagi
Drugs w aCSF
2-Chloroadenozyna	Sigma-Aldrich Co.	C5134
Pikrotoksyna	Sigma-Aldrich Co.	P-1675
Tetrodotoksyna	Wako Pure Chemical Industries	207-15901
CNQX	Sigma-Aldrich Co.	C239
APV	Sigma-Aldrich Co.	Ciągnik siodłowy A5282