Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55878

⸱

10 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1Section des Sciences Pharmaceutiques, Universités des Geneva–Lausanne (EPGL)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.

Streszczenie

Poszukiwanie nowych inhibitorów deacetylazy histonowej (HDAC) cieszy się coraz większym zainteresowaniem w odkrywaniu leków. Selektywność izoform znajduje się w centrum uwagi od czasu zatwierdzenia romidepsyny, inhibitora HDAC klasy I do terapii nowotworów, oraz badania klinicznego inhibitorów specyficznych dla HDAC6 w leczeniu szpiczaka mnogiego. Niniejsza metoda służy do oznaczania aktywności hamującej badanych związków na HDAC1 i HDAC6 w komórkach. Aktywność izoformy mierzy się za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej – analizy spektrometrii mas (UHPLC-MS) określonych substratów inkubowanych z leczonymi i nietraktowanymi komórkami HeLa. Zaletą tej metody jest to, że odzwierciedla endogenną aktywność HDAC w środowisku komórkowym, w przeciwieństwie do bezkomórkowych testów biochemicznych przeprowadzanych na izolowanych izoformach. Ponadto, ponieważ metoda opiera się na oznaczaniu ilościowym substratów syntetycznych, nie wymaga rozpoznawania przeciwciał endogennych białek acetylowanych. Można go łatwo dostosować do kilku linii komórkowych i zautomatyzowanego procesu. Metoda ta okazała się już przydatna w poszukiwaniu związków selektywnych dla HDAC6 w neuroblastach. Reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj dla standardowych inhibitorów HDAC trichostatyny A (nieswoistej), MS275 (specyficznej dla HDAC1) i tubastatyny A (specyficznej dla HDAC6) przy użyciu komórek HeLa.

Wprowadzenie

HDAC należą do rodziny enzymów zdolnych do deacetylacji histonów w obrębie struktury chromatyny. Posiadają one również inne substraty białkowe w cytozolu i występują w różnych przedziałach komórkowych. Do tej pory zidentyfikowano łącznie 18 izoform HDAC, które powiązano z wieloma mechanizmami komórkowymi, w tym z regulacją czynników transkrypcyjnych i ekspresji genów, a także z sygnalizacją i transportem komórkowym1,2,3,4,5,6,7. Inhibitory katalityczne HDAC pojawiły się jako potencjalne leki w terapii nowotworów. Większość inhibitorów HDAC zatwierdzonych obecnie przez FDA służy do leczenia chłoniaka z komórek T oraz szpiczaka mnogiego i są to niespecyficzne inhibitory HDAC, takie jak vorinostat (SAHA), belinostat i panobinostat8,9. Jednakże z inhibitorami pan-HDAC wiąże się szereg skutków ubocznych, a poszukiwanie małocząsteczkowych związków specyficznych dla danych izoform jest obecnie gorącym tematem w chemii medycznej i odkrywaniu leków. W związku z tym romidepsyna, selektywny inhibitor klasy I (HDAC1-3 i HDAC8), jest lekiem już zatwierdzonym10, podczas gdy inhibitory specyficzne dla HDAC6 znajdują się obecnie w fazie badań klinicznych, wykazując zwiększony potencjał terapeutyczny w leczeniu szpiczaka mnogiego11,12,13,14,15.

Testy przesiewowe służące do charakteryzacji inhibitorów HDAC opierają się na inkubacji substratu HDAC z źródłem enzymatycznym (pojedynczą izoformą, ekstraktem jądrowym lub lizatem komórkowym). Substrat stanowi zazwyczaj krótka sekwencja peptydowa zawierająca resztę acetyloizoleucyny sprzężoną z rozszczepialnym fluoroforem (np. kumaryną), taką jak N-(4-metylo-7-aminokumarynylo)-Nα-(t-butoxykarbonylo)-Nω-acetyloizoleucynamid (MAL)16. Aby rozróżnić aktywności specyficzne dla danej izoformy, konieczne jest przeprowadzenie oddzielnych testów bezkomórkowych z udziałem każdej izoformy, co może nie odzwierciedlać rzeczywistej aktywności izoform w żywych komórkach. Dostępne są komercyjnie substraty specyficzne dla izoform, takie jak benzylowy (S)-[1-(4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylokarbamoilo)-5-propionyloaminopentyl]karbaminian (MOCPAC, substrat specyficzny dla HDAC1) oraz (S)-[5-acetyloamino-1-(2-okso-4-trifluorometylo-2H-chromen-7-ylokarbamoilo)pentyl]kwas karbamowy tert-butyl ester (BATCP, substrat specyficzny dla HDAC6) (Ryc. 1B). Jednakże zastosowanie w żywych komórkach mieszaniny wielu substratów zawierającej MAL, MOCPAC i BATCP nie pozwoli na wykrycie poszczególnych produktów deacetylacji za pomocą pomiaru fluorometrycznego, ponieważ posiadają one ten sam rozszczepialny fluorofor.

Opisana tutaj metoda umożliwia detekcję i względną kwantyfikację każdego substratu oraz jego deacetylowanego produktu w komórkach HeLa przy użyciu testu wielosubstratowego, a następnie analizy UHPLC-ESI-MS/MS17. Test HDAC przeprowadza się na komórkach HeLa, aby umożliwić bezpośrednią identyfikację aktywności hamującej HDAC oraz specyficzności badanych związków w odniesieniu do endogennych HDAC. Szczególna uwaga skupiona jest na HDAC1 i HDAC6, które są oceniane jednocześnie. Aby przeprowadzić te pomiary enzymatyczne w ramach jednego testu z inkubacją, do traktowanych i nietraktowanych komórek HeLa wysianych na płytce 96-dołkowej dodaje się mieszaninę nieswoistych i swoistych substratów HDAC. Po etapie inkubacji komórki są lizowane w celu uwolnienia substratów i odpowiadających im produktów reakcji, które są rozdzielane i wykrywane metodą UHPLC-MS (Rysunek 1C). Produktami deacetylacji substratów MAL, MOCPAC i BATCP są odpowiednio deacetylowany MAL (dMAL), deacetylowany MOCPAC (dMOCPAC) i deacetylowany BATCP (dBATCP). Dla związków aktywnych można wykreślić krzywe zależności efektu od dawki.

Test inhibicji komórek w płycie z chromatogramem UHPLC-MS do analizy związków i reakcji substratów.
Rysunek 1: Ogólny schemat testu HDAC w oparciu o komórki w celu identyfikacji inhibitorów specyficznych dla HDAC1 i HDAC6 poprzez analizę wielu substratów za pomocą UHPLC-MS. (A) Schemat typowej płytki 96-dołkowej zawierającej komórki HeLa poddane działaniu związków testowych oraz niepoddane działaniu związków (kontrola), a także próbki ślepe bez komórek. (B) Struktura chemiczna substratów dodanych w formie mieszaniny (każdy w stężeniu 21 µM) w celu deacetylacji przez endogenne HDAC. (C) Typowy chromatogram UHPLC-MS przedstawiający piki dodanych substratów (MAL, MOCPAC i BATCP) oraz ich produktów deacetylacji (odpowiednio dMAL, dMOCPAC i dBACTP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane w standardowej komorze do hodowli tkanek. Wymagana jest znajomość technik sterylnych.

  1. Hodować komórki HeLa do 80% konfluencji w kolbie T75 do hodowli komórkowej w pożywce MEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę G (100 U/mL) oraz streptomycynę (100 mg/mL).
    UWAGA: Etapy hodowli komórkowej, traktowania i lizy przeprowadza się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, natomiast inkubację komórek w 37 °C wykonuje się w warunkach sterylnych, w atmosferze uwilgotnionej 5% CO2.
  2. Przemyć komórki dwukrotnie 5 mL DPBS, odessać DPBS i dodać 1 mL odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubować w 37 °C przez 5 min w celu odklejenia komórek.
  3. Dodać 9 mL pożywki hodowlanej MEM, dokładnie resuspendować zawiesinę komórkową i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  4. Dostosować gęstość zawiesiny komórkowej do 6 x 104 komórek/mL w MEM.
  5. Dodać 100 µL zawiesiny komórkowej do studzienek kontrolnych i testowych sterylnej, płaskodنnej płytki 96-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek (Rysunek 1A).
  6. Dodać 100 µL pożywki hodowlanej MEM do studzienek pustych (blank) płytki 96-dołkowej (Rysunek 1A).
  7. Inkubować płytkę 96-dołkową w 37 °C przez 24 h.
    UWAGA: Inkubacja przez 24 h jest odpowiednim czasem do badania endogennej aktywności HDAC w komórkach HeLa. W przypadku różnych typów komórek o nieznanej aktywności HDAC może być konieczna ocena przebiegu czasowego dla komórek kontrolnych.

2. Traktowanie komórek związkami testowymi i substratami HDAC

  1. Odssać pożywkę z dołków płytki 96-dołkowej.
  2. Do dołków testowych dodać 25 µL 2x związków testowych (np. trichostatyny A, MS275 i tubastatyny A) w MEM. Do dołków kontrolnych i ślepych dodać 25 µL MEM.
    UWAGA: Stężenie związków testowych należy dostosować tak, aby uzyskać zakres co najmniej 5 końcowych stężeń testowych (jedno stężenie na dołek). Końcowe stężenie DMSO w związku testowym nie powinno przekraczać 0,5% i powinno być takie samo w każdym dołku, w tym w ślepych i kontrolnych. Końcowa objętość inkubacji wynosi 50 µL na dołek. Trichostatynę A testuje się w 5 stężeniach w zakresie od 500 do 1,95 nM (rozcieńczenie 1:4). MS275 i tubastatynę A testuje się w 5 stężeniach w zakresie od 8 000 do 6,17 nM (rozcieńczenie 1:6). Pożądane końcowe stężenie testowe dla każdego związku testowego powinien określić poszczególni użytkownicy poprzez stworzenie krzywej zależności efektu od dawki.
  3. Do dołków kontrolnych i testowych dodać 25 µL mieszaniny substratów (42 µM MAL, 42 µM MOCPAC i 42 µM BATCP w MEM). Do dołków ślepych dodać 25 µL MEM.
    UWAGA: Końcowe stężenie każdego substratu wynosi 21 µM. MOCPAC i BATCP rozróżniają odpowiednio aktywność HDAC1 i HDAC6 (Ryc. 1B). W przypadku braku zaobserwowania aktywności z tymi substratami, zastosowanie MAL może potencjalnie prowadzić do zidentyfikowania aktywności przeciwko innej izoformie HDAC.
  4. Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C przez 8 h w inkubatorze z wilgotnym powietrzem i 5% CO2.
    UWAGA: Ten czas inkubacji jest odpowiedni dla komórek HeLa i pozwala endogennej HDAC na oddziaływanie z substratami syntetycznymi. Różne linie komórkowe mogą wymagać korekty czasu inkubacji i/lub stężenia substratu.

3. Lizą komórek i przygotowanie próbek do analizy UHPLC-ESI-MS/MS

Ostrzeżenie: Etapy przygotowania próbek wymagają użycia chemikaliów organicznych, które są łatwopalne i toksyczne w przypadku połknięcia lub wdychania. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki i okulary ochronne.

  1. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodać 10 µL buforu RIPA 6x (rozcieńczonego z buforu RIPA 10x) z dodatkiem inhibitora proteaz.
  2. Zatrzymać reakcję, dodając do każdego dołka 160 µL zimnego acetonitrylu, a następnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    UWAGA: Przed tym krokiem acetonitryl należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Umieścić płytkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 10 min.
  4. Wyjąć płytkę z zamrażarki i przenieść 220 µL zawartości każdego dołka do niesterylnej płytki 96-dołkowej z dnem stożkowym (V-bottom). Odwiruzować płytkę przy 5,000 x g i 4 °C przez 10 min.
    UWAGA: Celem tego kroku jest usunięcie białek i soli. W razie potrzeby roztwory można przenieść do pojedynczych stożkowych probówek do wirowania przed centryfugacją lub przefiltrować przez zestaw 96-dołkowych płyt filtracyjnych PVDF 0,65 µm. Skuteczne usunięcie osadu jest wymagane przed analizą UHPLC.
  5. Przenieść 200 µL supernatantu (lub filtratu) do płytki 96-dołkowej kompatybilnej z systemem UHPLC i szczelnie zamknąć ją za pomocą folii termotopliwej z możliwością odrywania, używając uszczelniacza płytek.
    UWAGA: Podczas pobierania supernatantów należy unikać aspirowania osadu. Jeśli analiza UHPLC nie może być wykonana natychmiast, płytkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h do czasu analizy.

4. Analiza UHPLC/MS-MS

  1. Przygotować system UHPLC, napełniając go układem fazy ruchomej (95% A:5% B):
    A: H2O, klasy HPLC, zawierający 0,1% kwasu mrówkowego (przygotować 1 L)
    B: Acetonitryl, stopnia HPLC, zawierający 0,1% kwasu mrówkowego (przygotować 1 l).
    Uwaga: Faza ruchoma zawiera związki organiczne, które są łatwopalne i toksyczne w przypadku połknięcia lub wdychania. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki i okulary ochronne.
  2. Umieść płytkę 96-dołkową w managerze próbek wyposażonym w uchwyt do płytek. Przeanalizuj próbki zgodnie z podanymi warunkami UHPLC-ESI-MS/MS w Tabela 1.
    UWAGA: Każda kolumna analitycznej płytki 96-dołkowej powinna zawierać jeden dołek kontrolny i jeden dołek ślepy (zgodnie z przedstawionym schematem płytki) Rycina 1A). Próby kontrolne reprezentują 100% aktywności enzymatycznej w badanej linii komórkowej, natomiast próby ślepe służą do sprawdzenia, czy źródło MS zapewnia spójne tło. Niezwykłe piki MS wykryte w danej próbie ślepej powinny zostać zbadane, aby zapobiec zmianom czułości MS.

5. Analiza danych

  1. Zintegruj pole powierzchni piku dla każdego substratu oraz jego zdeacetylowanego produktu przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do integracji UHPLC.
    UWAGA: Należy zastosować parametry integracji automatycznej z metodą wygładzania (na przykład: średnia, rozmiar okna 3 i liczba wygładzeń 2). Przy zastosowaniu warunków chromatograficznych podanych w Tabeli 1, kolejność elucji to: dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) oraz BATCP (9,8 min), co przedstawiono na Ryc. 1C.
  2. Dla każdego substratu oblicz stosunek pól powierzchni pików (zdeacetylowany/acetylowany) w każdym chromatogramie (próbki badawcze i kontrolne).
  3. Oblicz procent hamowania HDAC dla każdej próbki badawczej:
    Wzór na procent hamowania, % Inhibition=100-(Test ratio x 100/Control ratio).
    UWAGA: Hamowanie HDAC1 oblicza się na podstawie stosunku pól powierzchni pików dMOCPAC/MOCPAC; hamowanie HDAC6 oblicza się na podstawie stosunku dBATCP/BATCP. Stosunek dMAL/MAL można wykorzystać do określenia ogólnego hamowania HDAC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować zastosowanie tej metody do identyfikacji inhibitorów nieselektywnych i selektywnych dla HDAC1 (klasa I) oraz HDAC6 (klasa IIb), komórki HeLa potraktowano znanymi związkami standardowymi: trichostatiną A (nieselektywną w odniesieniu do HDAC1 i HDAC6)18, MS275 (inhibitorem selektywnym dla HDAC1)19 oraz tubastatiną A (inhibitorem selektywnym dla HDAC6)20. Wykorzystując niniejszą metodę (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hamowanie HDAC jest gorącym tematem w odkrywaniu leków, z obecnym naciskiem na selektywne inhibitory HDAC6 w terapii nowotworów21. Selektywność HDAC jest zwykle oceniana za pomocą serii wysokoprzepustowych, bezkomórkowych testów, które mają na celu określenie siły hamującej w stosunku do poszczególnych izoform HDAC21. Jednak selektywność inhibitora musi być dodatkowo potwierdzona w żywych komórkach poprzez ocenę statusu acetylacji endogennych substratów białkowych, takich j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy uznają COST Action CM1406 (Epigenetic Chemical Biology). Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez fundację Pierre'a Merciera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BATCPSigma-AldrichB4061
MALSigma-AldrichSCP0168Synonim: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPACSigma-AldrichM2195
MS275Sigma-AldrichEPS002
Trichostatyna ASigma-AldrichT8552
Tubastatyna ASigma-AldrichSML0044
Acetonitryl, klasa HPLCFisher Scientific10660131
Kwas mrówkowy, klasa LC/MSFisher Scientific10596814
H2O,destylowany H2O klasy HPLC
Komórki HeLaATCCATCC CRM-CCL-2
Dysocjacja komórek odczynnik TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013
DMSO, klasa hodowli komórkowejApplichem146463
DPBSThermoFisher Scientific14190144
Surowica bydlęca płoduBiowestS1810
MEMThermoFisher Scientific22561021
Penicylina-StreptomycynaBioconcept4-01F00-H
10x bufor RIPAAbcamab156034
Tabletki inhibitora proteazy SigmaFastSigma-AldrichS8820
96-dołkowe, sterylne, płaskodenne, poddane hodowli tkankowej CorningVWR29442-058
Płytki 96-dołkowe, niesterylne, V-bottom CorningVWR29442-404stosowane na etapie wirowania
Płytka 96-dołkowa, stożkowe dno, NuncThermoFisher Scientific249944kompatybilna z systemem Acquity UHPLC
Kolby do hodowli komórkowych T75 CorningSigma-AldrichCLS430641
Zrywalna folia termozgrzewalnaSystemWaters 186002789
Acquity
Eppendorf 5810 RFisher Scientific05-413-323
Oprogramowanie integracyjne: MassLynx V4.1WatersNumer katalogowy niedostępny
Zgrzewarka termiczna Combi SP-0669/240WatersNumer katalogowy niedostępny
Quattro micro API Tandem Quadrupole SystemWatersNumer katalogowy niedostępny
przefiltrowany przez system oczyszczania Milli-Q UPLC Wirówka Waters

Bibliografia

  1. Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
  2. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
  3. Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
  4. Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
  5. Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
  6. Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
  7. Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
  8. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
  9. Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
  10. Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
  11. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
  12. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
  13. U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
  14. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
  15. Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
  16. Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935(2003).
  17. Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
  18. Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
  19. Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
  20. Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
  21. Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
  22. Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
  23. Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
  24. Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
  25. Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
  26. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywno HDAC1 i HDAC6analiza UHPLC MSselektywno inhibitor w HDACtest deacetylacji substratuprotok lizy kom rekTrichostatin A MS275swoisto Tubastatin Adetekcja MOCPAC BATCPprzesiewy w procesie odkrywania lek w
Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.