Artykuł metodologiczny

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

DOI:

10.3791/55878

⸱

10 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1Section des Sciences Pharmaceutiques, Universités des Geneva–Lausanne (EPGL)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poszukiwanie nowych inhibitorów deacetylazy histonowej (HDAC) cieszy się coraz większym zainteresowaniem w odkrywaniu leków. Selektywność izoform znajduje się w centrum uwagi od czasu zatwierdzenia romidepsyny, inhibitora HDAC klasy I do terapii nowotworów, oraz badania klinicznego inhibitorów specyficznych dla HDAC6 w leczeniu szpiczaka mnogiego. Niniejsza metoda służy do oznaczania aktywności hamującej badanych związków na HDAC1 i HDAC6 w komórkach. Aktywność izoformy mierzy się za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej – analizy spektrometrii mas (UHPLC-MS) określonych substratów inkubowanych z leczonymi i nietraktowanymi komórkami HeLa. Zaletą tej metody jest to, że odzwierciedla endogenną aktywność HDAC w środowisku komórkowym, w przeciwieństwie do bezkomórkowych testów biochemicznych przeprowadzanych na izolowanych izoformach. Ponadto, ponieważ metoda opiera się na oznaczaniu ilościowym substratów syntetycznych, nie wymaga rozpoznawania przeciwciał endogennych białek acetylowanych. Można go łatwo dostosować do kilku linii komórkowych i zautomatyzowanego procesu. Metoda ta okazała się już przydatna w poszukiwaniu związków selektywnych dla HDAC6 w neuroblastach. Reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj dla standardowych inhibitorów HDAC trichostatyny A (nieswoistej), MS275 (specyficznej dla HDAC1) i tubastatyny A (specyficznej dla HDAC6) przy użyciu komórek HeLa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDACs należą do rodziny enzymów zdolnych do deacetylacji histonów w strukturze chromatyny. Mają również inne substraty białkowe w cytozolu i znajdują się w różnych przedziałach komórkowych. Do tej pory zidentyfikowano łącznie 18 izoform HDAC, które były związane z kilkoma mechanizmami komórkowymi, w tym regulacją czynników transkrypcyjnych i ekspresją genów, a także sygnalizacją komórkową i transportem1,2,3,4,5,6,7. Inhibitory katalityczne HDAC stały się potencjalnymi lekami terapeutycznymi w terapii nowotworów. Większość inhibitorów HDAC obecnie zatwierdzonych przez FDA jest przeznaczona do leczenia chłoniaka z komórek T i szpiczaka mnogiego i są nieswoistymi inhibitorami HDAC, takimi jak worinostat (SAHA), belinostat i panobinostat8,9. Jednak szereg skutków ubocznych wiąże się z pan-inhibitorami, a poszukiwanie małych cząsteczek specyficznych dla izoform jest gorącym tematem w chemii medycznej i odkrywaniu leków. W związku z tym selektywny inhibitor romidepsyny klasy I (HDAC1-3 i HDAC8) jest już zatwierdzonym lekiem10, podczas gdy inhibitory specyficzne dla HDAC6 są obecnie w fazie badań klinicznych, o zwiększonym potencjale terapeutycznym w szpiczaku mnogim11,12,13,14,15.

Testy przesiewowe mające na celu scharakteryzowanie inhibitorów HDAC opierają się na inkubacji substratu HDAC ze źródłem enzymatycznym (pojedyncza izoforma, ekstrakt jądrowy lub lizat komórkowy). Substratem jest zwykle mała sekwencja peptydowa zawierająca resztę acetylolizyny sprzężoną z rozszczepialnym fluoroforem (np. kumaryną), takim jak N-(4-metylo-7-aminokumarylo)-Nα-(t-butoksykarbonylo)-Nω-acetylolizynyamid (MAL)16. Aby rozróżnić działania specyficzne dla izoformy, konieczne są oddzielne testy bezkomórkowe obejmujące każdą izoformę, które mogą nie odzwierciedlać rzeczywistej aktywności izoformy w żywych komórkach. W handlu dostępne są substraty specyficzne dla izoformy, takie jak ester tert-butylowy (S)-[1-(4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylkarbamoilo)-5-propionyloaminoopentylo]karbaminianowy (MOCPAC, substrat specyficzny dla HDAC1) i (S)-[5-acetylamino-1-(2-okso-4-trifluorometylo-2H-chromen-7-ylkarbamoilo)pentylo]karbaminowy ester tert-butylowy kwasu (BATCP, substrat specyficzny dla HDAC6) (Rysunek 1B). Jednakże mieszanina wielosubstratowa zawierająca MAL, MOPAC i BATCP podana żywym komórkom nie pozwoli na wykrycie poszczególnych produktów deacetylowanych za pomocą pomiaru fluorometrycznego, biorąc pod uwagę, że zawierają one ten sam rozszczepialny fluorofor.

Opisana tutaj metoda pozwala na wykrycie i względną kwantyfikację każdego substratu i jego zdeacetylowanego produktu w komórkach HeLa za pomocą testu wielosubstratowego, po którym następuje analiza UHPLC-ESI-MS/MS17. Test HDAC przeprowadza się na komórkach HeLa, aby umożliwić bezpośrednią identyfikację aktywności hamującej HDAC i specyficzności badanych związków na endogennych HDAC. Nacisk kładziony jest na HDAC1 i HDAC6, które są oceniane jednocześnie. Aby osiągnąć te pomiary enzymatyczne w pojedynczym teście inkubacyjnym, mieszaninę niespecyficznych i specyficznych substratów HDAC dodaje się do poddanych działaniu i niepoddanych działaniu substancji komórek HeLa podanych działaniu na 96-dołkowej płytce. Po etapie inkubacji komórki są poddawane lizie w celu uwolnienia substratów i odpowiednich produktów reakcji, które są rozdzielane i wykrywane przy użyciu metody UHPLC-MS (ryc. 1C). Deacetylowanymi produktami substratów MAL, MOCPAC i BATCP są odpowiednio deacetylowany MAL (dMAL), deacetylowany MOCPAC (dMOCPAC) i deacetylowany BATCP (dBATCP). Krzywe dawka-odpowiedź mogą być budowane ze związkami aktywnymi.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Ogólny schemat komórkowego testu HDAC w celu identyfikacji inhibitorów specyficznych dla HDAC1 i HDAC6 za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. (A) Schemat typowej płytki 96-dołkowej zawierającej komórki HeLa poddane działaniu substancji (związki testowe) i niepoddane działaniu substancji (kontrolne), a także ślepe próby bezkomórkowe. (B) Struktura chemiczna substratów dodawanych w postaci mieszaniny (po 21 μM każdy) przeznaczonych do deacetylacji przez endogenne HDAC. (C) Typowy chromatogram UHPLC-MS przedstawiający piki dodanych substratów (MAL, MOCPC i BATCP) oraz ich produktów deacetylacji (odpowiednio dMAL, dMOCPAC i dBACTP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w standardowym kapturze do hodowli tkankowej. Oczekuje się znajomości techniki sterylnej.

  1. Hodowla komórek HeLa do 80% zbiegu w kolbie do hodowli komórek T75 w MEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną G (100 U/ml) i streptomycyną (100 mg/ml).
    UWAGA: Etapy hodowli komórek, obróbki i lizy przeprowadza się przy przepływie laminarnym, przy czym etapy inkubacji komórek w temperaturze 37 °C przeprowadza się w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w sterylnych warunkach.
  2. Umyj komórki dwukrotnie 5 ml DPBS, odessać DPBS i dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek.
  3. Dodać 9 ml pożywki hodowlanej MEM, dokładnie zawiesić zawiesinę komórek i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  4. Dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 6 x 104 komórek/ml w MEM.
  5. Dodaj 100 μl zawiesiny komórkowej, aby kontrolować i testować dołki sterylnej, płaskodennej, poddanej kulturze tkankowej 96-dołkowej płytki (Rysunek 1A).
  6. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej MEM do ślepych studzienek 96-dołkowej płytki (Rysunek 1A).
  7. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 h.
    UWAGA: 24-godzinna inkubacja to odpowiedni czas na przetestowanie endogennej aktywności HDAC w komórkach HeLa. Różne typy komórek o nieznanej aktywności HDAC mogą wymagać oceny przebiegu czasowego komórek kontrolnych.

2. Leczenie komórek związkami testowymi i substratami HDAC

  1. Odessać pożywkę z dołków płytki 96-dołkowej.
  2. Dodaj 25 μl 2x badanych związków (np. trichostatyny A, MS275 i tubastatyny A) w MEM do studzienek testowych. Dodać 25 μl MEM do studzienek kontrolnych i ślepych.
    UWAGA: Stężenie badanych związków należy dostosować tak, aby zapewnić zakres co najmniej 5 końcowych stężeń badanych (jedno stężenie na studzienkę). Końcowe stężenie DMSO w badanym związku nie powinno przekraczać 0,5% i powinno być takie samo w każdym studzince, łącznie ze ślepymi próbami i kontrolami. Ostateczna objętość inkubacji wynosi 50 μl na studzienkę. Trichostatyna A jest testowana w 5 stężeniach w zakresie od 500 do 1,95 nM (rozcieńczenie 1:4). MS275 i tubastatyna A są testowane w 5 stężeniach w zakresie od 8 000 do 6,17 nM (rozcieńczenie 1:6). Pożądane stężenie końcowe badane dla każdego badanego związku powinno być określone przez każdego indywidualnego użytkownika poprzez utworzenie krzywej dawka-odpowiedź.
  3. Dodać 25 μL mieszaniny substratów (42 μM MAL, 42 μM MOCPAC i 42 μM BATCP w MEM) do studzienek kontrolnych i testowych. Dodać 25 μl MEM do ślepych studzienek.
    UWAGA: Końcowe stężenie każdego substratu wynosi 21 μM. MOCPAC i BATCP rozróżniają odpowiednio aktywność HDAC1 i HDAC6 (Rysunek 1B). W przypadku braku aktywności tych substratów, zastosowanie MAL może potencjalnie prowadzić do identyfikacji aktywności wobec innej izoformy HDAC.
  4. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 8 godzin w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 .
    UWAGA: Ten czas inkubacji jest odpowiedni dla komórek HeLa i pozwala endogennemu HDAC na interakcję z syntetycznymi substratami. Różne linie komórkowe mogą wymagać dostosowania czasu inkubacji i/lub stężenia substratu.

3. Liza komórek i przygotowanie próbki do UHPLC-ESI-MS/MS

Uwaga: Etapy przygotowania próbki wykorzystują organiczne chemikalia, które są wysoce łatwopalne i toksyczne po spożyciu lub wdycheniu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i okulary ochronne.

  1. Dodać 10 μl 6x buforu RIPA (rozcieńczonego z 10x buforu RIPA) uzupełnionego inhibitorem proteazy do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
  2. Zatrzymaj reakcję, dodając 160 μl zimnego acetonitrylu do każdej studzienki i mieszając, pipetując w górę iw dół.
    UWAGA: Przed tym krokiem utrzymuj acetonitryl w temperaturze -20 °C.
  3. Umieść talerz w zamrażarce w temperaturze -80 °C na 10 minut.
  4. Wyjmij płytkę z zamrażarki i przenieś 220 μl zawartości każdej studzienki na niesterylną płytkę 96-dołkową ze stożkowym dnem (V-bottom). Odwirować płytkę w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 min.
    UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie białek i soli. W razie potrzeby roztwory można przenieść do indywidualnych stożkowych probówek wirówkowych przed odwirowaniem lub przefiltrować przez zestaw 96-dołkowych płytek filtracyjnych PVDF o średnicy 0,65 μm. Pomyślne usunięcie osadu jest wymagane przed analizą UHPLC.
  5. Przenieść 200 μl supernatantu (lub filtratu) do 96-dołkowej płytki zgodnej z systemem UHPLC i uszczelnić ją zdzieraną folią termozgrzewalną za pomocą zgrzewarki do płyt.
    UWAGA: Należy unikać pipetowania granulek podczas usuwania supernatantów. Jeżeli analiza UHPLC nie może być przeprowadzona natychmiast, płytkę można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 24 godziny do czasu analizy.

4. Analiza UHPLC/MS-MS

  1. Przygotuj system UHPLC, wypełniając go systemem fazy ruchomej (95% A:5% B):
    A:H2O, klasy HPLC, zawierający 0,1% kwasu mrówkowego (przygotować 1 l)
    B: Acetonitryl, klasy HPLC, zawierający 0,1% kwasu mrówkowego (przygotować 1 l).
    Uwaga: Faza ruchoma zawiera organiczne substancje chemiczne, które są wysoce łatwopalne i toksyczne po spożyciu lub wdychaniu . Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i okulary ochronne.
  2. Umieścić 96-dołkową płytkę w menedżerze próbek zawierającym uchwyt na płytki. Próbki należy uruchomić zgodnie z warunkami UHPLC-ESI-MS/MS podanymi w tabeli 1.
    UWAGA: Każda kolumna analitycznej płytki 96-dołkowej powinna mieć jedną studzienkę kontrolną i jedną studzienkę ślepą (jak pokazano na schemacie płytki Rysunek 1A). Kontrole są reprezentatywne dla 100% aktywności enzymatycznej w badanej linii komórkowej, podczas gdy ślepe próby służą do sprawdzenia, czy źródło MS zapewnia spójne tło. Nietypowe piki stwardnienia rozsianego wykryte w danej ślepej próbie należy zbadać, aby zapobiec zmianom czułości stwardnienia rozsianego.

5. Analiza danych

  1. Zintegruj obszar piku każdego substratu i jego zdeacetylowanego produktu za pomocą odpowiedniego oprogramowania integracyjnego UHPLC.
    UWAGA: Użyj parametrów automatycznej integracji z metodą wygładzania (na przykład Średnia, rozmiar okna 3 i liczba gładkich 2). Korzystając z warunków chromatograficznych podanych w tabeli 1, kolejność elucji jest następująca: dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) i BATCP (9,8 min), jak pokazano na Rysunek 1C.
  2. Dla każdego substratu obliczyć stosunek powierzchni piku (deacetylowany/acetylowany) w każdym chromatogramie (próbki testowe i kontrolne).
  3. Obliczyć procentową inhibicję HDAC w każdej badanej próbce:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Hamowanie HDAC1 oblicza się przy użyciu stosunku powierzchni piku dMOCPAC/MOCPAC; Hamowanie HDAC6 oblicza się za pomocą dBATCP/BATCP. Stosunek dMAL/MAL może być użyty do wyrażenia ogólnego hamowania HDAC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować zastosowanie metody do identyfikacji nieselektywnych i selektywnych inhibitorów HDAC1 (klasa I) i HDAC6 (klasa IIb), komórki HeLa zostały potraktowane znanymi standardowymi związkami: trichostatyną A (nieselektywną między HDAC1 i HDAC6)18, MS275 (selektywny inhibitor HDAC1)19, oraz tubastatyną A (selektywny inhibitor HDAC6)20. Korzystając z obecnej metody (Rysunek 1), można bezpo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hamowanie HDAC jest gorącym tematem w odkrywaniu leków, z obecnym naciskiem na selektywne inhibitory HDAC6 w terapii nowotworów21. Selektywność HDAC jest zwykle oceniana za pomocą serii wysokoprzepustowych, bezkomórkowych testów, które mają na celu określenie siły hamującej w stosunku do poszczególnych izoform HDAC21. Jednak selektywność inhibitora musi być dodatkowo potwierdzona w żywych komórkach poprzez ocenę statusu acetylacji endogennych substratów białkowych, takich j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy uznają COST Action CM1406 (Epigenetic Chemical Biology). Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez fundację Pierre'a Merciera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BATCPSigma-AldrichB4061
MALSigma-AldrichSCP0168Synonim: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPACSigma-AldrichM2195
MS275Sigma-AldrichEPS002
Trichostatyna ASigma-AldrichT8552
Tubastatyna ASigma-AldrichSML0044
Acetonitryl, klasa HPLCFisher Scientific10660131
Kwas mrówkowy, klasa LC/MSFisher Scientific10596814
H2O,destylowany H2O klasy HPLC
Komórki HeLaATCCATCC CRM-CCL-2
Dysocjacja komórek odczynnik TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013
DMSO, klasa hodowli komórkowejApplichem146463
DPBSThermoFisher Scientific14190144
Surowica bydlęca płoduBiowestS1810
MEMThermoFisher Scientific22561021
Penicylina-StreptomycynaBioconcept4-01F00-H
10x bufor RIPAAbcamab156034
Tabletki inhibitora proteazy SigmaFastSigma-AldrichS8820
96-dołkowe, sterylne, płaskodenne, poddane hodowli tkankowej CorningVWR29442-058
Płytki 96-dołkowe, niesterylne, V-bottom CorningVWR29442-404stosowane na etapie wirowania
Płytka 96-dołkowa, stożkowe dno, NuncThermoFisher Scientific249944kompatybilna z systemem Acquity UHPLC
Kolby do hodowli komórkowych T75 CorningSigma-AldrichCLS430641
Zrywalna folia termozgrzewalnaSystemWaters 186002789
Acquity
Eppendorf 5810 RFisher Scientific05-413-323
Oprogramowanie integracyjne: MassLynx V4.1WatersNumer katalogowy niedostępny
Zgrzewarka termiczna Combi SP-0669/240WatersNumer katalogowy niedostępny
Quattro micro API Tandem Quadrupole SystemWatersNumer katalogowy niedostępny
przefiltrowany przez system oczyszczania Milli-Q UPLC Wirówka Waters

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
  2. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
  3. Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
  4. Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
  5. Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
  6. Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
  7. Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
  8. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
  9. Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
  10. Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
  11. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
  12. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
  13. U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
  14. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
  15. Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
  16. Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935(2003).
  17. Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
  18. Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
  19. Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
  20. Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
  21. Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
  22. Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
  23. Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
  24. Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
  25. Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
  26. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno HDAC1 i HDAC6analiza UHPLC MSselektywno inhibitor w HDACtest deacetylacji substratuprotok lizy kom rekTrichostatin A MS275swoisto Tubastatin Adetekcja MOCPAC BATCPprzesiewy w procesie odkrywania lek w

Powiązane artykuły