ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Summary

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

Abstract

Fenotypy wzrostu mikroorganizmów są silnym wskaźnikiem ich podstawowej genetycznej sprawności i można je podzielić na 3 reżimy wzrostu: fazę opóźnioną, fazę logarytmiczną i fazę stacjonarną. Każda faza wzrostu może ujawnić różne aspekty sprawności, które są związane z różnymi warunkami środowiskowymi i genetycznymi. Pomiary ilościowe o wysokiej rozdzielczości dla wszystkich 3 faz wzrostu są na ogół trudne do uzyskania. Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę charakteryzowania wszystkich 3 faz wzrostu na pożywkach stałych za pomocą testu o nazwie One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY określa ilościowo fenotypy wzrostu pojedynczych komórek rosnących w kolonie na pożywkach stałych za pomocą mikroskopii poklatkowej. Metoda ta pozwala bezpośrednio obserwować niejednorodność populacji przy każdym parametrze wzrostu w genetycznie identycznych komórkach wyrastających na kolonie. Ta heterogeniczność populacji oferuje unikalną perspektywę dla zrozumienia regulacji genetycznej i epigenetycznej oraz reakcji na perturbacje genetyczne i środowiskowe. Chociaż metoda ODELAY została zademonstrowana przy użyciu drożdży, można ją zastosować na dowolnym mikroorganizmie tworzącym kolonię, który jest widoczny pod mikroskopią w jasnym polu.

Introduction

Fenotypy wzrostu mikroorganizmów są silnym wskaźnikiem ich genetycznego dopasowania do danego stanu środowiska. Wzrost jest klasycznie podzielony na 3 różne reżimy wzrostu: faza opóźnienia, faza logarytmiczna i faza stacjonarna wzrostu¹. Każda faza wzrostu może ujawnić różne aspekty sprawności, które są zależne od różnych warunków środowiskowych i genetycznych. Na przykład czas opóźnienia, czyli czas, jaki organizm spędza w fazie opóźnienia przed rozpoczęciem wykładniczego wzrostu, może wskazywać na zdolność organizmu do reagowania na zmienione warunki środowiskowe². Podwojenie czasu podczas wzrostu w fazie logarytmicznej, najczęstszy wskaźnik sprawności komórkowej, ujawnia ogólną wydajność zdolności organizmu do podziału poprzez metabolizowanie i wykorzystywanie materiałów środowiskowych do replikacji. Faza stacjonarna, w której wzrost po fazie logarytmicznej jest szybko zmniejszony, jest kolejnym wskaźnikiem dopasowania, który jest regularnie stosowany jako punkt końcowy wzrostu w punktowych testach wzrostu drożdży.

Obecnie dostępnych jest kilka testów wzrostu drożdży, które są uważane za standardowe metody oceny fenotypów wzrostu drożdży^3,4,5. Testy te opierają się przede wszystkim na metodach hodowli drożdży na podłożach stałych lub płynnych. Na pożywkach stałych, testy przypinania kolonii przenoszą niewielką liczbę komórek na stały agar za pomocą szpilki, a komórki drożdży mogą rosnąć przez określony czas. Kolonie są następnie obrazowane, a ich rozmiary są porównywane w końcowym punkcie końcowym⁶. Te testy przypinania kolonii okazały się solidne i skalowalne w celu generowania badań przesiewowych całego genomu. Ostatnio do tych testów włączono okresowe obrazowanie za pomocą skanerów płaskich i lustrzanek jednoobiektywowych (SLR) w celu rejestrowania wzrostu kolonii w czasie^7,8,9. Jednak rozdzielczość tych urządzeń uniemożliwia im wykrywanie pojedynczych komórek, a zatem te testy przypinania kolonii nie obserwują bezpośrednio czasu opóźnienia i nie mogą obserwować zmian między poszczególnymi komórkami, które rosną w kolonie.

Testy wzrostu na bazie płynów zostały również wykorzystane do przeprowadzenia badań przesiewowych całego genomu³. Sprzężenie płynnego testu wzrostu z mikroskopią poklatkową ujawniło niejednorodność populacji w czasie podwajania genetycznie identycznych pojedynczych komórek, co daje ważną perspektywę dla zrozumienia regulacji genetycznej i adaptacji środowiskowej. Jednak ten test nie mierzy innych aspektów wzrostu, takich jak czas opóźnienia i nośność¹⁰. Poniżej przedstawiamy metodę charakterystyki wszystkich trzech faz wzrostu mikroorganizmów tworzących kolonie na pożywkach stałych za pomocą testu, który nazywamy ODELAY¹¹. ODELAY polega na wykorzystaniu wysokoprzepustowej mikroskopii poklatkowej do rejestrowania obrazów pojedynczych komórek rosnących w kolonie na pożywkach stałych. Ta populacja pojedynczych komórek rosnących w kolonie ujawnia leżącą u podstaw heterogeniczność populacji, która nie jest wykrywana przez inne, mniej czułe pomiary, takie jak ocena końcowego punktu końcowego. Demonstrujemy metodę na drożdżach, ale ODELAY może być stosowany do każdego organizmu, który wykazuje kontrast w mikroskopii jasnego pola.

Protocol

1. Przygotowanie wywaru z żelu agarozowego

1. Odważyć 2 g agarozy o wysokiej czystości.
2. Dodaj agarozę do butelki o pojemności 500 ml i zapisz ich łączną masę.
3. Obliczyć masę docelową butelki plus 2 g agarozy w 150 g ultraczystej wody, a następnie dodać 150 g ultraczystej wody z dokładnością do 0,1 g tej masy docelowej.
4. Zwróć uwagę na masę butelki oraz agarozę i wodę.
5. Umieść butelkę w kuchence mikrofalowej i upewnij się, że butelka jest dopasowana z luźną nakrętką na górze, aby zminimalizować parowanie wody podczas podgrzewania agarozy.
6. Podgrzej butelkę w kuchence mikrofalowej w seriach 15-20 s, a następnie krótko zakręć butelką, aby wymieszać agarozę i wodę. Powtarzaj tę procedurę, aż roztwór się zagotuje, a mieszanina będzie jednorodna.
   UWAGA: Uważaj, aby nie poparzyć skóry parą wydostającą się z butelki. Ponadto butelka stanie się gorąca w dotyku i wymagana jest odpowiednia ochrona, taka jak rękawica do autoklawu, aby uniknąć obrażeń.
7. Gdy stopiona agaroza stanie się jednorodna, ponownie zważyć butelkę i dodać ultraczystą wodę z dokładnością do 0,1 g pierwotnej masy. Zastąpi to wodę utraconą w wyniku parowania.
8. Zanim stopiona agaroza zestali się, zamieszaj, aby wymieszać z dodaną wodą, aby zapewnić jednorodność.
9. Podaniec 15,2 g agarozy do 9 - 50 ml plastikowych probówek.
10. Wstaw rurki do lodówki, aż będą potrzebne.

2. Przygotowanie ODELAY Agarozy

1. Podgrzej 400 ml wody dejonizowanej do wrzenia w przykrytej zlewce na płycie grzejnej, delikatnie mieszając mieszadłem magnetycznym.
2. Dodaj 2 ml pożywki 10X (np. peptonu z ekstraktu drożdżowego (YEP) lub kompletnej mieszaniny suplementów (CSM)) do 15,2 g podwielokrotności agarozy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z kroku 1.10.
   UWAGA: Podłoże CSM ma tendencję do przyklejania się do szkiełek. W przypadku stosowania preparatów z podłożami CSM, do preparatu należy dodać 5 μl glikolu polietylenowego (PEG) o stężeniu 50% wag. PEG zapobiega przywieraniu agaru do szkiełek podstawowych podczas uwalniania pleśni i nie hamuje wzrostu drożdży.
3. W razie potrzeby dodaj dodatkowe suplementy odżywcze 100X i użyj wody, aby zwiększyć całkowitą objętość dodaną z tego kroku do 1 ml.
4. Zważyć porcję agarozy z dodanymi pożywkami i dodatkami przed umieszczeniem stożkowej probówki o pojemności 50 ml we wrzącej wodzie z kroku 2.1.
5. Po 16 minutach wyjąć probówkę o pojemności 50 ml i homogenizować mieszaninę za pomocą wiru. Trzymaj nakrętkę mocno zaciśniętą na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
   UWAGA: Pokrywka zlewki pomaga równomiernie podgrzać całą probówkę, w przeciwnym razie utworzy się warstwa stałej agarozy, która prawdopodobnie się nie stopi. Również w tym czasie wygodnie jest zmontować formę agarozową (Rysunek 1).
6. Homogenizować mieszaninę za pomocą wiru.
7. Gotuj przez dodatkowe 2 minuty, aby upewnić się, że cały agar jest wymieszany i stopiony.
8. Zważ probówkę i zastąp utraconą masę ultra czystą, sterylną wodą.
9. Dodaj 2 ml odczynnika 10X pochodzenia węglowego (np. 20% w/v glukozy) i odwiruj, aby uzyskać roztwór pożywki agarozowej.
   UWAGA: Separacja szkiełek szklanych: Podczas montażu formy należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że długie przekładki są umieszczone w formie we właściwej orientacji. Dzieje się tak dlatego, że gdy laser tnie akryl, ma tendencję do cięcia jako stożek, pozostawiając część z lekko pochylonymi bokami zamiast dokładnie 90°. Następnie, gdy forma zostanie umieszczona na blacie, aby uwolnić szkło z agaru, krawędź przekładki powinna znajdować się pod ostrym kątem z agarem. Kąt ostry pomaga ścisnąć krawędź agaru z dala od górnego kawałka szkła, ponieważ zewnętrzna krawędź przekładki formy jest obrócona wokół dolnej krawędzi (patrz rysunek 1). Rezultatem jest bardziej równomierne oddzielenie agaru od górnego kawałka szkła.
   UWAGA: Nie należy stosować środków antyadhezyjnych stosowanych na szkło, takich jak oleje, spraye silikonowe, a nawet komercyjne środki do pielęgnacji okien, ponieważ zanieczyszczą one powierzchnię agaru i prawdopodobnie zahamują wzrost. Te metody wymagają pewnej praktyki, aby były spójne.
10. Wyczyść cztery szkiełka o grubości 2 cale x 3 cale x 1 mm 70% etanolem i wysusz wymuszonym obiegiem powietrza.
11. Wyczyść formy akrylowe 70% etanolem, wysusz i zmontuj, jak pokazano na Rysunek 1. Weź trzy dolne części, jak pokazano, i złóż je tak, aby dwie identyczne części nakładały się na trzeci kawałek (Rysunek 1B). Zaciśnij elementy podstawy z każdej strony za pomocą dwóch małych spinaczy do segregatorów (Rysunek 1C). Umieść słupki w formie, upewniając się, że rzaz lasera jest prawidłowo ustawiony ( Rysunek 1E).
12. Umieść oczyszczone i wysuszone szkiełko na formie i przytrzymaj je na miejscu, umieszczając drugie szkiełko po drugiej stronie. Zamocuj zespół za pomocą większego spinacza do segregatora ( Rysunek 1D). Zaciśnij oba slajdy za pomocą większych klipsów do segregatorów (Rysunek 1D). Upewnij się, że górny klips do segregatora styka się ze szklanym szkiełkiem zachodzącym na akryl.
13. Dodaj pozostałe spinki do segregatorów. Ponownie upewnij się, że zaciski stykają się ze szkiełkiem w miejscu, w którym zachodzi on na akryl (Rysunek 1D).
    UWAGA: Przed napełnieniem zmontowanej formy stopionym agarem upewnij się, że krawędzie są uszczelnione, pipetując około 70 μl stopionego podłoża agarowego wzdłuż wewnętrznej strony formy. Ten agar szybko zestala się i zapobiegnie wyciekom.
14. Napełnij formę stopionym agarem, uważając, aby nie utknąć pęcherzyków powietrza w formie.
    UWAGA: Można to osiągnąć, powoli pipetując stopiony agar wzdłuż krawędzi formy. Po napełnieniu pozostaw formę do ostygnięcia przez 40 minut do 1 godziny w temperaturze otoczenia około 23 °C. Jeśli pozostawi się go do zbyt długiego ostygnięcia, agar może pęknąć w formie.
    UWAGA: Separacja pleśni: Prawidłowe usunięcie pleśni z odlewanego agaru jest niezbędne do zapewnienia jednolitej, stałej podkładki agarowej do wzrostu drożdży. Niezapewnienie skutecznego oddzielenia pleśni na tym etapie spowoduje różnice wzrostu, które można przypisać niedoskonałościom stałej podkładki agarowej. Zaleca się przećwiczenie tego kroku kilka razy.
15. Zacznij od wyjęcia dolnego klipsa do segregatora. Usuń dolną część formy, która składa się z trzech ułożonych kawałków. Przytrzymaj szkiełka, ściskając je, a następnie wyjmij spinki do segregatora. Pamiętaj, aby nie uderzać o boki formy podczas wyjmowania klipsów do segregatora. To zdeformuje media.
16. Umieść formę na krawędzi blatu stołu tak, aby strona formy z niebieską kropką była skierowana do góry i w lewym dolnym rogu (Rysunek 1E). Umieść kciuki pod akrylem, a pierwszy palec na górze w kierunku wewnętrznej krawędzi formy.
17. Powoli i ostrożnie dociśnij kciukiem do formy, tak jakby obracał przekładkę formy wokół jej dolnej krawędzi (Rysunek 1F). Stosuj stały, ale powoli zwiększający się nacisk. Użytkownicy zobaczą pęknięcie i pęcherzyk powietrza pojawiający się wzdłuż linii, w której górna szyba zakrywa przekładkę formy.
18. Po zobaczeniu początkowej linii przerwania kontynuuj pchanie kciukami w górę i wywieraj stały nacisk. W tym momencie agar powinien zacząć odrywać się od szkła (Rysunek 1F). Kontynuuj obracanie formy do góry. Spowoduje to podniesienie szkła bez jego przesuwania. Linia, w której agar odkleja się od szklanki, powinna nadal oddalać się od początkowej linii pękania.
    UWAGA: W tym momencie agar przykleja się zarówno do dna, jak i do góry szklanki. Czasami zdarza się to w przypadku skrajnej lewej krawędzi. Dopóki zdeformowany obszar nie znajduje się w obszarze, w którym zauważono drożdże, powinno to być w porządku.
19. Ponieważ szklanka jest całkowicie wolna, chwyć ją i całkowicie wyjmij z formy. Następnie usuń drugi kawałek formy, wykonując podobny ruch, aby podnieść kawałek bez przesuwania agaru. Umieść szkiełka w sterylnym pudełku z końcówkami z odrobiną sterylnej wody o wysokiej czystości na dnie. Zamknąć pudełko i przechowywać w temperaturze 4 °C O/N do użycia następnego dnia. W przypadku dłuższego przechowywania tempo wzrostu stanie się niespójne.

3. Przygotowanie kultury ODELAY

1. Rozłóż szczepy na 96-dołkowej płytce w celu wzrostu O/N.
2. Następnego dnia rozcieńczyć 20 μl hodowli przez noc na pożywce o objętości 200 μl, aby uzyskać całkowitą objętość 220 μl na nowej płytce.
3. Zmierzyć gęstość optyczną każdej kultury przy długości fali 600 nm (OD600) w czytniku płytek. Korzystając z czytnika płytek i robota do obsługi cieczy, postępuj zgodnie z protokołem automatycznego rozcieńczania opisanym w krokach 3.3.1 - 3.3.6. Ręcznie rozcieńczyć kultury na płytce do około 0,1 OD600 (opcjonalnie).
   1. Na czytniku płytek naciśnij "Eksperymentuj" w sekcji "utwórz nowy". Wybierz ODELAYDilution.exp i uruchom eksperyment. Wprowadź nazwę eksperymentu jako iterację ODELAY "Data", "Godzina", "Nazwa eksperymentu".
   2. Kliknij kartę statystyk, a następnie kliknij ikonę Excela. Zapisz dane na pendrive'ie i przenieś je do komputera robota do obsługi cieczy.
   3. Otwórz edytor układu i metody robota. Otwórz plik metody "ODELAYDilution_v1.med". Uruchom plik wykonywalny "Convert_SynergyFiles.exe". Wprowadź wartość 0,09 dla wartości docelowej OD600.
   4. Kliknij "Korekta kleju" i "Korekcja gal" na 0,05. Zmierz ślepe nośniki na identycznej płytce. Kliknij "Generuj plik". Wybierz plik w edytorze metod. Kliknij ikonę światła stopu, aby uruchomić metodę otwierania programu rozcieńczania w czasie wykonywania.
   5. Upewnij się, że rurki są otwarte, talerze mają zdjęte pokrywki i osłony przeciwpyłowe są zdjęte z końcówek. Załaduj płyty, rurki i końcówki na pokład robota do obsługi cieczy, zgodnie z układem pokładu.
   6. Kliknij przycisk "Odtwórz", aby uruchomić program rozcieńczania. Wybierz odpowiednią liczbę końcówek o pojemności 50 μl. Wybierz odpowiednią liczbę końcówek o pojemności 300 μl. Poczekaj około 12 minut, aż proces zostanie uruchomiony.
4. Wyjmij płytkę rozcieńczającą z robota, zakryj końcówki i ponownie zakryj probówki z pożywką o pojemności 15 ml. Hodować płytkę przez 5 - 6 godzin w temperaturze 30 °C.
5. Na około 1 - 2 godziny przed rozpoczęciem drugiego rozcieńczania należy włączyć komory inkubacyjne mikroskopu. Pozwolić im osiągnąć równowagę w °C lub temperaturze wymaganej do przeprowadzenia eksperymentu.
6. Powtórzyć kroki rozcieńczania 3,3 - 3,4, ale rozcieńczyć kultury do OD600 0,01 - 0,02 w celu wykrycia kultur na szkiełkach agarozowych.
7. Przykryj płytkę rozcieńczającą metalową uszczelką zamrażarki.
8. Sonikować płytkę rozcieńczającą w łaźni lodowej przez 30 sekund, gdy płytka unosi się w lodowatej wodzie, używając metalowego wiadra wirówki do przytrzymania płytki (Rysunek 2A). Przenieść sonikowane kultury z płytki rozcieńczającej na płaską płytkę dolną. Oznacz 4 x 96-dołkowe płytki z płaskim dnem 1, 2, 3 i 4 (Rysunek 2B).
   1. Przenieść 150 μl płytki rozcieńczającej z baseników A01 - D06 do studzienek C04 - F09 płytki oznaczonej 1. Następnie przenieść 150 μl płytki rozcieńczającej z dołków A07 - D12 do studzienek C04 - F09 płytki oznaczonej 2. Następnie przenieść 150 μl płytki rozcieńczającej z baseników E01 - H06 do studzienek C04 - F09 płytki oznaczonej 3. Na koniec przenieść 150 μl płytki rozcieńczającej z dołków E07 - H12 do studzienek C04 - F09 płytki oznaczonej 4.
9. Przejdź do kroku 4, Plamienie na agarze

4. Plamienie na agarze za pomocą automatycznego robota do wykrywania cieczy

1. Wyjąć szkiełka agarozowe przechowywane w temperaturze 4 °C O/N (od kroku 2.19) z nawilżonych, sterylnych pudełek na pipety.
2. W razie potrzeby przytnij rogi podłoża agarozowego czystą żyletką, aby upewnić się, że zmieszczą się w komorze szkiełka.
3. Zdejmij suwak clamp z uchwytu. Ostrożnie umieść płytkę agarową we wgłębieniu stage mocowanie komory.
   UWAGA: Upewnij się, że orientacja slajdu jest spójna w każdym eksperymencie.
4. Sprawdź, czy zacisk jest równo z dnem komory. Jeśli jest krzywy, prowadnica może nie być całkowicie osadzona we wgłębieniu. Umieść przekładkę poziomującą w pozycji płyty środkowej robota wykrywającego. Ta podkładka dystansowa zapewnia kontakt ze poziomującymi, dzięki czemu komorę suwaka można wypoziomować za pomocą końcówek.
5. Ułóż talerze na stole w kolejności ich kwadrantu. Tablice 1, 2, 3 i 4 uporządkowane od lewej do prawej (Rysunek 2B).
6. Ułóż końcówki tak, aby wewnętrzne 24 dołki C04 - F09 były zajęte końcówkami w 4 pustych pudełkach na końcówki. Piąte pudełko będzie musiało mieć jedną końcówkę w pozycji C10, a także 4 końcówki z odciętymi końcami w pozycjach A01, A12, H01 i H12. Te 4 odcięte końcówki zapewniają stabilność zacisku płytki końcówki (Rysunek 2C i 2D).
7. Zdejmij górną pokrywę z mocowania komory przesuwnej.
8. Umieść pierwszy stempel końcówki w miejscu startowym programu wykrywania sterowania robotem. Powinno to wybić dziurę w agarozie, która później zostanie wykorzystana do wyrównania współrzędnych początku. Umieść płytkę 1 na robocie do obsługi cieczy, aby dostrzec pierwszą ćwiartkę. Upewnij się, że pokrywka została zdjęta i kontynuuj program spottingu.
9. Sprawdź, czy wszystkie plamy są obecne. Poczekaj też ~30 s, aż wyschną. Gdy plamki mają średnicę około 1 mm, program może być kontynuowany. Opróżnij zużyte końcówki do pojemnika na zagrożenie biologiczne i umieść świeże końcówki na robocie. Zamień płytkę 1 na 2. płytę kwadrantową.
10. Powtórz te czynności dla trzeciej ćwiartki. I powtórz ponownie dla 4. ćwiartki.
11. Gdy plamy wyschną, załóż pokrywę komory przesuwnej i odwróć urządzenie.
12. Zamontuj połączenia przewodów z filtrem powietrza.
13. Umieść szkiełko podstawowe w górnej części komory.
    UWAGA: Ten szkiełko ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia strumienia ciepła do agaru i minimalizuje tworzenie się kondensatu po stronie szkiełka nakrywkowego obiektywu komory. Nie zapomnij o tym szkiełku nakrywkowym. W zależności od konfiguracji mikroskopu, to szkiełko nakrywkowe zapobiega kondensacji pary wodnej po stronie obiektywu przez nagrzewanie się od strony oświetlenia.
14. Ustaw wentylator tak, aby wdmuchiwał gorące powietrze na stronę obiektywu komory. Wentylator ten zapobiega tworzeniu się kondensatu na szkiełku nakrywkowym. Ustaw natężenie przepływu powietrza przez bełkotkę na 10 ml/min.

5. Uruchamianie ODELAY na mikroskopie

1. Uruchom skrypt "ODELAY_Microscope_Control.m".
2. Kliknij "Migawka", aby otworzyć migawkę światła przechodzącego, a następnie przycisk "Ostrość", aby zainicjować wysoką szybkość kamery (Rysunek 3A, Czerwone strzałki).
3. Kliknij "Go Origin" i przesuń scenę, aby znaleźć znak początku, który został wybity w agarze.
4. Następnie przesuń się lekko w prawo, aby skupić się na komórkach drożdży zauważonych w obszarze E07.
5. Wróć do punktu początkowego otworu przebijanego i wyśrodkuj go w polu widzenia.
6. Ustaw początek układu współrzędnych na tę wartość, naciskając przycisk "set" (Rysunek 3A, Niebieskie strzałki). Teraz przejdź do pozycji H18 i ustaw ostrość za pomocą sześciokątnej znajdującej się najbliżej tego miejsca. Następnie przejdź do pozycji L07 i ustaw ostrość za pomocą sześciokątnej znajdującej się najbliżej tego miejsca. Następnie przejdź do pozycji E07 i ustaw ostrość za pomocą sześciokątnej znajdującej się najbliżej tego miejsca.
7. W razie potrzeby powtarzaj kroki 5.5 - 5.7, aż te pozycje pozostaną ostre.
8. Sprawdź ostrość na środku i na krawędziach w miejscach E12, H12, L12. Dostosuj zakres autofokusa, jeśli wartości Z ostrości, wskazywane przez wartość Z, są większe niż ± zakres autofokusa (np. ustaw zakres autofokusa na 60 μm, wartość Z dla punktu środkowego większą niż ±40 μm).
9. Naciśnij przycisk resetowania, ponieważ spowoduje to aktywację właściwości przycisku, a następnie naciśnij ODELAY (Rysunek 3A, Zielone strzałki). Wybierz katalog, w którym chcesz zapisać dane. Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca ilość miejsca na dysku.
   UWAGA: Mikroskop zbiera dane przez 48 godzin lub do momentu zamknięcia programu.

6. Przetwarzanie danych ODELAY

1. Otwórz ODELAY_IPT.exe lub użyj skryptu ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m skryptu (Rysunek 3C).
2. Przygotuj arkusz kalkulacyjny *ODELAYExpDisc.xlsx Excel.
3. Nazwij eksperyment w komórce B1.
4. Wybierz katalog obrazów, w którym przechowywane są pliki obrazów E07 - H18.
5. Wybierz katalog danych, w którym będą zapisywane dane.
6. Zapisz datę rozpoczęcia eksperymentu w komórce B04. Użyj formatu MM/DD/RRRR.
7. Zapisz czas rozcieńczania w komórce C04. Ten czas to około pięciu minut przed zebraniem pierwszego obrazu. Użyj formatu GG:MMpm, gdzie HH oznacza h, a MM oznacza min.
8. Dodaj nazwy szczepów zgodnie z tabliczką źródłową (krok 3.1). Ze względu na sposób, w jaki szczepy są wykrywane, są one przegrupowywane na szkiełku agarozowym ODELAY. Komórki w arkuszu kalkulacyjnym B31-B126 to płytka źródłowa, natomiast komórki C31 - C126 to lokalizacje punktowe na płytce agarowej ODELAY.
9. Następnie naciśnij przycisk "Przetwarzaj dane" i wybierz *ODELAYExpDisc.xlsx, który właśnie został przygotowany.
10. Odczekaj 16-24 h w zależności od systemu komputerowego użytego do przetwarzania danych.
11. Po przetworzeniu obrazów pojawi się katalog o nazwie "ODELAY Well Data" i plik "*_Index_ODELAYData.mat". Naciśnij przycisk "Załaduj dane" i wybierz plik "*_Index_ODELAYData.mat", który właśnie został wygenerowany. Spowoduje to załadowanie zestawu danych, który został właśnie przetworzony. Znak "*" w nazwie pliku zostanie wyświetlony zgodnie z nazwą eksperymentu wprowadzoną w arkuszu kalkulacyjnym programu Excel.
12. Po załadowaniu danych sprawdź je za pomocą paska czasu znajdującego się na dole, kliknij kwadrat obrazu, aby zobaczyć krzywe wzrostu dla tego miejsca, lub znajdź interesującą Cię studnię na liście po lewej stronie, a następnie załaduj obrazy dla tej listy.
13. Wygeneruj histogramy parametrów wzrostu populacji, naciskając przycisk "Wykres skrzypiec". Spowoduje to wygenerowanie wykresu pokazanego w Rysunek 4 lub Rysunek 6.

Results

Przykładowe obrazy drożdży rosnących w mikroskopii poklatkowej są pokazane w Rysunek 3B. Po przetworzeniu obrazów poklatkowych, reprezentatywny zestaw danych porównujących szczepy drożdży BY4741 i BY4742 jest pokazany na Rysunek 4. W tym przykładowym zestawie danych różnice w czasie podwajania między różnymi pozycjami na płycie są bardzo niewielkie. Jeśli podłoże agarozowe jest źle przygotowane, wówczas oczywiste odchylenie zarówno w czasie podwajania, jak i opóźnienia byłoby widoczne w pozycjach punktowych, które pokrywają się ze zdeformowanym obszarem żelu agarozowego. Chociaż czasy podwajania wydają się być stosunkowo jednolite, ten przykład pokazuje różnice w pomiarach czasu opóźnienia. Bardziej spójny zestaw danych jest pokazany w Rysunek 6. W tym zestawie danych zarówno czas opóźnienia, jak i czas podwojenia są jednolite.

Rysunek 1: Zespół formy agarowej.
Składniki formy agarowej są pokazane w (A). Zamontuj podstawę, jak pokazano w (B), a następnie clamp podstawa za pomocą małych spinaczy do segregatorów. Umieść dłuższe pionowe elementy we wnęce podstawy (C), a następnie umieść szkiełka w formie, jak pokazano na (D). Widok z boku pokazujący kąt nachylenia formy i orientację szczeliny formy potrzebnej do spójnego oddzielenia agaru od szkiełka podstawowego (E). Zwróć uwagę na położenie kciuka i palców wskazujących, a także prostą linię agaru oddzielającą się od szkiełka (F) i zwróć uwagę na strzałkę poziomą. Linia separacji powinna przesuwać się równomiernie w kierunku pionowych strzałek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Metoda sonikacji i plamienia.
Sonikuj płytkę w lodowatej wodzie i używając uchwytu wiadra wirówki, aby pomóc podeprzeć płytkę (A). Ułożyć płytki z etapu 3.8.1 w celu plamienia na płytce agarozowej (B). Ułóż również końcówki tak, aby skrajne lewe pudełko końcówek miało jedną końcówkę w pozycji C10, a następnie cztery inne końcówki z odciętymi końcami, aby nie rozbijały uchwytu płytki (C). Umieść pozostałe końcówki w czterech pudełkach tak, aby wewnętrzne 24 pozycje końcówek były zajęte (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Graficzny interfejs użytkownika ODELAY.
Zrzut ekranu graficznego interfejsu użytkownika dla "ODELAY_Microscopecontrol.m" (A). Interfejs ten umożliwia monitorowanie kamery i regulację ustawień oświetlenia mikroskopu dla trybów epifluorescencji i jasnego pola. Czerwone strzałki wskazują przyciski Ostrość i Przesłane, które aktywują aparat w celu szybkiego robienia zdjęć i otwierania migawki światła przechodzącego. Niebieskie strzałki służą do przesuwania sceny dla punktu początkowego, a następnie ustawiania punktu początkowego za pomocą przycisku "Go Origin" i przycisku "Set". Zielone strzałki wskazują na "Resetuj" i "ODELAY!! ", które resetują tryby obrazu ODELAY do bieżących warunków i inicjują zbieranie obrazów ODELAY. Zdjęcia poklatkowe drożdży rosnących na stałym podłożu po 0, 3, 6 i 9 godzinach po plamieniu (B). Zrzut ekranu graficznego interfejsu użytkownika dla "ODELAY_IPT.m" lub narzędzia do przetwarzania obrazu ODELAY (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykładowe wyjście ODELAY.
Ten zestaw danych porównuje szczepy BY4741 i BY4742 na pożywkach YPD. Ten rysunek jest przykładem dobrze przygotowanego szkiełka agarozowego; Jednak ustawienia autofokusa nie są optymalne. Dane przedstawione w każdej kolumnie, od lewej do prawej, to: nośność w logarytmie₂ obszaru kolonii; czas podwojenia, podany w min; i czas opóźnienia, podawany w min. W tym przykładzie czasy podwojenia wszystkich punktów na szkiełku agarowym pokrywają się z niewielką ilością wydłużonego czasu podwojenia w kierunku kolumny. Jednak czasy opóźnień różnią się znacznie w tym zestawie danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykłady krzywych wzrostu.
Ten przykład pokazuje, jak słaba początkowa ostrość może spowodować wzrost szacowanego czasu opóźnienia (t_lag) (A), podczas gdy sąsiednia pozycja pokazuje krótszy czas opóźnienia (B). t_d to czas podwojenia w min, a t_lag to czas opóźnienia w min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykład dobrze przeprowadzonego eksperymentu testowego.
Przykład szczepu BY4742 testowanego po wymianie żarówki halogenowej wolframowej na oświetlacz diodowy i upewnieniu się, że autofokus jest ustawiony prawidłowo. Wydaje się, że wszystkie czasy podwojeń dobrze się pokrywają, a czasy opóźnień wydają się być spójne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Test ODELAY ma kilka krytycznych punktów zapewniających powtarzalne i wiarygodne pomiary fenotypowe. Pierwszym krytycznym punktem jest konsekwentne przygotowywanie kultur drożdży. Należy zachować ostrożność, aby zebrać komórki drożdży ze wzrostu logarytmicznego. Jeśli kultury uległy nasyceniu, to ich niejednorodność populacji wzrośnie, co może zaciemnić heterogeniczność spowodowaną czynnikami genetycznymi lub środowiskowymi (np . źródło węgla)¹¹. Drugim krytycznym punktem jest konsekwentne przygotowywanie pożywki. Ogólnie rzecz biorąc, należy wygenerować dużą ilość roztworu podłoża podstawowego 10X, a następnie używać go z czasem, aby zminimalizować efekty wsadowe. Formułowanie pożywek wagowo, o ile to możliwe, pomaga z czasem poprawić konsystencję pożywki, zapewniając ścisłe monitorowanie gęstości agaru i ogólnej zawartości wody w agarozie. Trzecim krytycznym punktem jest zminimalizowanie lub wyeliminowanie wszelkich odkształceń mechanicznych podłoża agarozowego. Do mechanicznego odkształcenia podłoża najczęściej dochodzi podczas oddzielania agarozy od szkiełek szkiełkowych. Podobnie jak w przypadku wielu technik laboratoryjnych, opanowanie tego kroku wymaga praktyki.

Zmienność czasu opóźnienia, jak pokazano na rysunku 4, jest często związana z jednym z trzech czynników: mechanicznym odkształceniem podłoża agarozowego, zmianą grubości formowanego agaru lub niestabilnym źródłem światła. Jeśli podłoże agarozowe zmienia się pod względem wysokości Z w poprzek matrycy plamek, zmiana wysokości może przytłoczyć zakres procedury autofokusa, powodując, że początkowe obrazy będą nieco nieostre. Z tego powodu sprawdź wysokość ostrości w wielu miejscach pośrodku i wzdłuż krawędzi matrycy plamek, aby upewnić się, że procedura autofokusa ma wystarczający zakres Z, aby znaleźć ostrość. W razie potrzeby użyj panelu Autofokus, aby zwiększyć zakres ostrości i liczbę kroków ustawiania ostrości.

Trzecim możliwym warunkiem, który może prowadzić do słabej ostrości, jest niestabilne lub migoczące źródło światła, które może zakłócić obliczony wynik ostrości dla określonej wysokości Z. Wolframowe żarówki halogenowe mają tendencję do migotania na długo przed przepaleniem się żarówek. Efekt słabej ostrości zaobserwowano w jednym z przykładów, w którym krzywe wzrostu zanurzają się między pierwszym a drugim punktem czasowym (rysunek 5A), podczas gdy sąsiedni punkt nie ma takiego samego spadku (rysunek 5B). W tym przypadku zły stan ostrości został złagodzony poprzez wymianę wolframowo-halogenowego źródła światła.

W praktyce autorzy odkryli, że aby zmniejszyć migotanie żarówek halogenowych wolframowych o mocy 100 W, żarówki należy wymieniać co 500 godzin lub mniej więcej co 2 miesiące, gdy mikroskopy są intensywnie eksploatowane. Aby uniknąć problemów ze słabą ostrością spowodowanych migoczącą żarówką, często wymieniaj wolframowe halogenowe źródło światła lub wymień żarówkę halogenową na diodowe źródło światła. Przykład zestawu danych, który pokazuje małą zmienność czasów podwajania, a także bardziej jednolite czasy opóźnienia, przedstawiono na rysunku 6. Ten zestaw danych został wykonany za pomocą iluminatora diodowego, który zapewnia bardziej stabilne oświetlenie w czasie podczas wykonywania autofokusa.

Chociaż wiele z wymienionych tutaj punktów dotyczących optymalizacji przygotowania mediów może wydawać się oczywistych, w literaturze większość ekranów na dużą skalę nie replikuje się dobrze ze sobą ^8,11. Dlatego dokładnie opisaliśmy przygotowanie kultur i pożywek agarozowych, aby można było wygenerować bardziej powtarzalne badania fenotypowe.

Test ODELAY ma obecnie ograniczoną przepustowość w porównaniu z testami opartymi na pinpingu, takimi jak syntetyczne macierze genetyczne lub test Scan-O-Matic. Chociaż metody te zwiększają liczbę mierzonych szczepów, brakuje im zdolności do rozpoznawania pojedynczych komórek, a zatem nie mogą mierzyć heterogeniczności populacji, którą obserwujemy w klonalnych szczepach drożdży. Pochodzenie tej heterogeniczności populacji nie jest obecnie zrozumiałe, ale połączenie technologii i obliczeń, jak pokazano tutaj, daje możliwość obiektywnego zajęcia się podstawowymi mechanizmami komórkowymi¹².

Autorzy pragną zauważyć, że ODELAY jest obecnie zoptymalizowany tylko dla określonej marki mikroskopu i typu korpusu. Modyfikacja ODELAY dla innych systemów mikroskopowych jest prosta, ale będzie wymagała znajomości interfejsu API¹³ o otwartym kodzie źródłowym. Jednak zarówno API, jak i skrypty ODELAY są napisane tak, aby można je było łatwo dostosować do różnych systemów i testów eksperymentalnych.

Chociaż ODELAY został pierwotnie opracowany dla drożdży, byliśmy w stanie wykorzystać go bez modyfikacji do obserwacji wzrostu Mycobacterium smegmatis. Obserwacja innych mikroorganizmów tworzących kolonie jest możliwa po wprowadzeniu zmian w dostarczonym kodzie źródłowym¹¹. Ogólnie rzecz biorąc, ODELAY jest potężnym i elastycznym narzędziem do porównywania mikroorganizmów hodowanych w różnych warunkach środowiskowych i perturbacjach genetycznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose UltraPure	ThermoFisher	16500500	Gel Temp 36C, Moc żelu (1%) 1,2 g/cm²
Pepton (YEP)	Fisher Scientific	BP1422-2
Kompletna mieszanka suplementów (CSM)	Fisher Scientific	MP114560222
Glikol polietylenowy 3350 (śr. mol. 3000-3700)	SigmaAldrich	P2906
BY4741	ThermoFisher	95400.BY4741
Szczep drożdży BY4742	ThermoFisher	95400.BY4742
50 ml Probówki Falcon	Corning	430291	1
skrzynka 15 ml Probówki Falcon	Corning	352096
2 x 3 cale o grubości 1,0 mm 1/2 brutto	VWR	48382-179
96-dołkowa płytka płaska z płaskim dnem	Corning
Robot do obsługi płynów	Hydra Thermo	1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Robot do obsługi płynów Końcówki	Hamilton
hydra 100 mL Wydłużona długość DARTS	Thermo	5527
Synergy H4 Czytnik płytek	Biotek	H4MLFAD
Leica DMI6000 B	Mikroskop Leica
Obiektyw Leica 10X/0.3NA	Aparat Leica	11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0	Hamamatsu	C11440-22CU
MATLAB z zestawem narzędzi do przetwarzania obrazu	Mathworks
MicroManager	Open Imaging		https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (skrypty MATLAB i GUI)			www.aitchisonlab.com\ODELAY dla skryptów i oprogramowania Matlab
Komora			www.aitchisonlab.com\ODELAY dla rysunków mechanicznych
ODELAY Formy			www.aitchisonlab.com\ODELAY do rysunków form