Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie interakcji białko-białko w badaniach nad autofagią

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55881

⸱

9 września 2017

 ,  ,  , 
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Information Center, Sabanci University, 3EFSUN, Center of Excellence for Functional Surfaces and Interfaces for Nano Diagnostics, Sabanci University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione tutaj są dwie techniki badań interakcji białko-białko oparte na przeciwciałach: immunofluorescencja i immunoprecypitacja. Techniki te nadają się do badania fizycznych interakcji między białkami w celu odkrycia nowych składników komórkowych szlaków sygnałowych i zrozumienia dynamiki białek.

Streszczenie

Interakcje białko-białko są ważne dla zrozumienia kaskad sygnalizacji komórkowej i identyfikacji nowych składników szlaku i dynamiki białek. Większość aktywności komórkowych wymaga fizycznych interakcji między białkami. Aby przeanalizować i zmapować te interakcje, opracowano różne techniki eksperymentalne, a także narzędzia bioinformatyczne. Autofagia to mechanizm recyklingu komórkowego, który pozwala komórkom radzić sobie z różnymi stresorami, w tym brakiem składników odżywczych, chemikaliami i niedotlenieniem. Aby lepiej zrozumieć zdarzenia sygnalizacyjne związane z autofagią i odkryć nowe czynniki regulujące kompleksy białkowe w autofagii, przeprowadziliśmy badania przesiewowe interakcji białko-białko. Walidacja tych wyników badań przesiewowych wymaga zastosowania technik immunofluorescencji i immunoprecypitacji. W tym systemie specyficzne interakcje białko-białko związane z autofagią, które odkryliśmy, zostały przetestowane w liniach komórkowych Neuro2A (N2A) i HEK293T. Szczegóły zastosowanych procedur technicznych są wyjaśnione w tym wizualizowanym dokumencie eksperymentalnym.

Wprowadzenie

Makroautofagia (autofagia, tutaj) to mechanizm stresu komórkowego, który charakteryzuje się sekwestracją dużej ilości cytoplazmy, białek i organelli w pęcherzykach o podwójnej błonie zwanych pęcherzykami autofagicznymi. Poprzez fuzję zewnętrznej warstwy podwójnej membrany, pęcherzyki autofagiczne i ich ładunek są dostarczane do lizosomów i tam degradowane1. Autofagia zachodzi na niskich poziomach podstawowych we wszystkich typach komórek i we wszystkich organizmach, pełniąc funkcje homeostatyczne, takie jak degradacja białek i obrót organelli (np. mitochondriów). W warunkach prowadzących do stresu komórkowego, takich jak głód, autofagia jest szybko regulowana w górę i pozwala komórce utrzymać poziom energii i podstawowy metabolizm1,2,3.

Około 30 genów autofagii zostało sklonowanych z drożdży, a ich produkty białkowe okazały się odgrywać rolę w różnych etapach procesu autofagicznego, w tym w zarodkowaniu pęcherzyków, ekspansji, fuzji pęcherzyków do późnego endosomu/lizosomu i degradacji ładunku4,5. Ortologi większości tych genów zostały zidentyfikowane, a badania na różnych organizmach potwierdziły zachowanie ich funkcji komórkowych6. Badania przeprowadzone w ostatniej dekadzie wykazały, że istnieje kilka kompleksów białkowych związanych z autofagią i interakcji białko-białko, które zarządzają szlakami autofagii w skomplikowany i kontrolowany sposób. Istnieją mechanizmy przecięcia, kopie zapasowe, sprzężenie zwrotne i sprzężenie zwrotne, które pozwalają komórce koordynować autofagię z innymi powiązanymi zdarzeniami (takimi jak wydzielanie pęcherzykowe, biogeneza lizosomów, sortowanie i transport endosomów7, itd.) W bezstronnym hybrydowym ekranie drożdżowo-dwu wykorzystującym białko autofagii ATG5 jako przynętę, (ATG5 jest kluczowym białkiem autofagii zaangażowanym w podobny do E2 system koniugacyjny, który pośredniczy w lipidacji LC3 w autofagii wywołanej głodem), zidentyfikowaliśmy kinazę C aktywowaną receptorem 1 (RACK1; GNB2L1) jako silny interaktor i nowatorski składnik autofagii8. Co ważne, badanie przesiewowe wykazało, że interakcja ATG5-RACK1 była niezbędna do indukcji autofagii przez klasyczne induktory autofagii (tj. głód i hamowanie mTOR).

Metody oparte na immunofluorescencji są powszechnie stosowane do monitorowania interakcji białko-białko. Techniki te są głównie oparte na przeciwciałach i pomagają wizualizować interakcje i potwierdzać lokalizacje komórkowe. W tej technice przeciwciała sprzężone ze znacznikiem fluorescencyjnym, które są specyficzne dla białek będących przedmiotem zainteresowania, są zwykle używane do specyficznego barwienia. Każde białko może być znakowane przeciwciałami sprzężonymi z różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Stosując przeciwciała specyficzne dla białka, nakładanie się sygnału podczas łączenia obrazów wskazuje na kolokalizację białek pod mikroskopią konfokalną. Technika ta ma zastosowanie do komórek, a nawet tkanek. Techniki immunofluorescencji dostarczają wskazówek na temat dynamiki interakcji i pomagają zidentyfikować rozmiar i rozmieszczenie kompleksów białkowych, jednocześnie śledząc ogólne zmiany w morfologii komórek w różnych warunkach9. Immunoprecypitacja to kolejna powszechnie stosowana technika oparta na przeciwciałach, która pozwala na analizę interakcji między danymi białkami10. Korzystając z tej techniki, białka będące przedmiotem zainteresowania są izolowane z komórek lub ekstraktów tkankowych przy użyciu specyficznych przeciwciał, co powoduje wytrącanie białek, które znajdują się w kompleksie lub mają kontakt z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Koimmunoprecypitacja, w której wykrywa się białko i jego kointeraktora, ujawnia nie tylko interakcję między dwoma białkami, ale może mierzyć jej siłę oddziaływania w różnych okolicznościach11.

Ten protokół szczegółowo opisuje kluczowe techniki, które zostały użyte do potwierdzenia i scharakteryzowania interakcji ATG5-RACK1 i RACK1-LC3. Nacisk kładziony jest na techniki immunofluorescencji i immunoprecypitacji, z naciskiem na krytyczne kroki i pułapki w badaniach nad autofagią, a także sugestie dotyczące rozwiązywania problemów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Immunofluorescencja

  1. Utrzymuj HEK293T ludzkich embrionalnych komórek nerkowych w pożywce DMEM o wysokim poziomie glukozy i mysich komórek neuroblastów N2A w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy, w inkubatorze nawilżanym 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Uzupełnij pożywkę hodowlaną 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), antybiotykami (50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny) i L-glutaminą (2 mM).
  2. Odłącz komórki, używając 0,25% trypsyny. Najpierw usunąć pożywkę z hodowli komórkowej, a następnie przemyć komórki 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować z 1 ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dezaktywuj trypsynę, dodając 2 ml pożywki DMEM.
  3. Dobrze umyć płytkę, pipetując. Usunąć 10 μl roztworu komórkowego i wymieszać go z 10 μl błękitu trypanowego. Policz liczbę żywych komórek za pomocą hemocytometru.
  4. Zarówno HEK293T, jak i N2A są przylegającymi liniami komórkowymi, jednak HEK293T komórki łatwo odrywają się od płytki. Dlatego, jeśli pracujesz z HEK293T linią komórkową, przed wysiewem komórek pokryj szkiełka nakrywkowe sterylnym, przefiltrowanym 0,01% poli-L-lizyną.
    1. Umieść sterylne szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 10 cm. Dodać odpowiednią ilość roztworu poli-L-lizyny na każde szkiełko nakrywkowe. Inkubować szkiełka nakrywkowe z roztworem poli-L-lizyny przez 10 minut.
    2. Usuń roztwór poli-L-lizyny.
      Uwaga: Poli-L-lizyna jest wielokrotnego użytku; Zbieranie i ponowne wykorzystanie do dalszych eksperymentów jest opcjonalne. Ponieważ poli-L-lizyna jest toksyczna, poczekaj, aż cały roztwór na szkiełkach nakrywkowych całkowicie wyparuje, a następnie odzyskaj poli-L-lizynę.
    3. Umyj szkiełka nakrywkowe sterylnym PBS.
  5. Dodaj 1 ml DMEM do każdego dołka 12-dołkowej płytki. Umieść szkiełko nakrywkowe w każdym dołku.
  6. Wysiewaj 20 000 komórek / dołek, kropla po kropli, jednocześnie potrząsając płytką, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek na szkiełkach przykrywkowych. Utrzymać komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i dodać lek tak, aby całkowity czas inkubacji nie przekraczał 48 godzin, tj. w przypadku 3 godzin leczenia Torinem, dodać lek po 45 godzinach od wysiewu.
    1. W badaniach interakcji RACK1-LC3 jako induktory autofagii zastosowano Torin 1, rapamycynę i głód. Komórki inkubowano z Torinem 1 przez 3 godziny (stężenie końcowe 250 nM); z rapamycyną przez 16 godzin (stężenie końcowe 200 nM); oraz ze zrównoważonym roztworem soli Earle'a (EBSS) przez 2 godziny w celu zagłodzienia komórek.
      Uwaga: Jako warunek kontrolny zastosowano inkubację w DMEM z 10% FBS.
  7. Po 48 godzinach całkowitego czasu inkubacji usunąć pożywkę z szkiełek nakrywkowych i przemyć je 1 ml PBS.
  8. Aby utrwalić komórki, inkubuj komórki z 1 ml lodowatego sterylnego filtrowanego 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (pH 7,4), przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania.
    Ponieważ PFA jest wrażliwy na światło, trzymaj (ważne) płytkę w ciemności w okresie inkubacji; Pomocne może być przykrycie talerza folią aluminiową. Co więcej, PFA jest toksyczny, dlatego należy pracować pod wyciągiem podczas mocowania komórek.
    Uwaga: Należy pamiętać, że etap fiksacji w eksperymentach immunofluorescencyjnych powinien być zoptymalizowany, ponieważ specyficzne przeciwciała mogą działać najlepiej przy użyciu różnych środków i warunków utrwalania.
  9. Po 20 minutach inkubacji PFA najpierw usuń roztwór PFA z szkiełek nakrywkowych, a następnie przemyj każdą próbkę 3 razy 1 ml sterylnego, przefiltrowanego PBS. Na tym etapie (ważne) umyj studzienki jeden po drugim, aby nie dopuścić do ich wyschnięcia. Unikaj wysuszenia, ponieważ będzie to zakłócać kolejne reakcje komórek, zmieniać morfologię komórek i zwiększać niespecyficzne sygnały.
  10. Po zakończeniu płukania należy przechowywać próbki w 1 ml PBS na lodzie.
  11. Przygotować roztwór blokujący: PBS z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% saponiną.
  12. Przykryj płytkę 6-dołkową folią parafinową. Upewnij się, że spód płyty jest gładki po pokryciu folią parafinową. Oznacz płytkę 6-dołkową.
  13. Za pomocą pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe z płytek 12-dołkowych na płytki 6-dołkowe pokryte folią parafinową.
  14. Wyrzucić PBS na szkiełka nakrywkowe i dodać 100 μl roztworu blokującego do każdego szkiełka nakrywkowego w celu przepuszczalności. Próbki należy inkubować na lodzie przez 30 minut.
  15. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym. Przed eksperymentami zoptymalizuj rozcieńczenia przeciwciał, aby określić najlepsze stężenia robocze do barwienia.
    UWAGA: Na przykład przeciwciało LC3 stosuje się w rozcieńczeniu 1:100 w roztworze blokującym.
  16. Po 30 minutach inkubacji wyrzucić roztwór blokujący i delikatnie przemyć próbki 1 ml PBS.
  17. Dodać 100 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdego szkiełka osłonowego. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce.
    UWAGA: Czas inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym powinien być zoptymalizowany. W zależności od przeciwciała preferowana może być inkubacja przez noc w temperaturze 4 °C. Najlepiej jest delikatnie inkubować na wytrząsarce (100 obrotów/min), aby równomiernie rozprowadzić przeciwciało na szkiełkach nakrywkowych.
  18. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przemyć próbki pojedynczo, 3 razy 1 ml PBS.
  19. Przygotować przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:500 w roztworze blokującym (może być konieczna optymalizacja rozcieńczeń przeciwciała drugorzędowego). W tym przypadku zastosowano przeciwciało anty-królicze IgG Alexa Fluor 568 jako drugorzędowe przeciwciało anty-królicze.
    1. Próbki inkubować w 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Ponieważ przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem są wrażliwe na światło, (ważne) utrzymuj roztwór w ciemności. Umieścić próbki w ciemności w trakcie i po drugorzędowej inkubacji przeciwciał.
  20. Po wtórnej inkubacji przeciwciał należy przemyć płytkę 3 razy PBS.
    UWAGA: Na podstawie doświadczenia można stwierdzić, że niektóre przeciwciała mają silne sygnały tła, których nie można wyeliminować za pomocą płukania PBS. W przypadku wystąpienia takiego przeciwciała, po kroku 1.21 pomocne może być trzymanie próbek w PBS w temperaturze 4 °C przez 6 godzin.
    1. W razie potrzeby wybarwić komórki barwnikiem wiążącym DNA, takim jak Hoechst, aby oznaczyć jądra.
  21. Aby wybarwić więcej niż jedno białko, należy zastosować tę samą procedurę, zaczynając od kroku 1.16 dla drugiego białka.
    1. Upewnij się, że nie ma reaktywności gatunkowej między przeciwciałami podczas barwienia więcej niż jednym przeciwciałem (np. użyj przeciwciał myszy i królika).
      Uwaga: W tym przypadku RACK1 jest barwiony jako drugie białko przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych anty-RACK1 i przeciwciał drugorzędowych anty-mysich IgG Alexa Fluor 488 przy użyciu tych samych stężeń, o których mowa powyżej.
  22. Przygotuj roztwór montażowy: 50% glicerolu w 1x PBS. Przefiltruj przez filtr 22 μm.
  23. Przetrzyj szkiełka etanolem za pomocą niestrzępiącej się ściereczki i dodaj 10 μl roztworu montażowego do każdego szkiełka. Za pomocą pęsety umieść szkiełka nakrywkowe na każdej kroplitak, aby strona z komórkami miała bezpośredni kontakt z medium montażowym. Delikatnie wylej nadmiar roztworu montażowego za pomocą niestrzępiących się chusteczek.
  24. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci. Najpierw ustabilizuj szkiełka nakrywkowe, dodając krople lakieru do paznokci na 4 krawędziach, a następnie całkowicie je uszczelnij.
  25. Próbki należy jak najszybciej przeanalizować pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym, ponieważ sygnał fluorescencyjny może wyblaknąć po kilku godzinach.

2. Immunoprecypitacja

  1. Odłącz i policz komórki zgodnie z opisem w krokach 1.2 i 1.3.
  2. Jeśli pracujesz z komórkami HEK293T, zasiej 4 miliony komórek dla każdego stanu na 15-centymetrowych szalkach Petriego. Jeśli pracujesz z komórkami N2A, wysiewaj 5 milionów komórek na 15-centymetrowych szalkach Petriego. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C do końca doświadczenia.
  3. Poddać komórki działaniu odpowiednich leków lub warunków przez określony czas, tak aby całkowity czas inkubacji komórek nie przekraczał 48 godzin
    Uwaga: W testach immunoprecypitacyjnych w tym badaniu komórki traktowano przez 3 godziny Torin 1 (250 nM), 16 godzin rapamycyną (200 nM) i 2 godziny EBSS. DMEM z 10% FBS został dodany do komórek jako kontrola.
  4. Po 48 godzinach całkowitego czasu inkubacji należy usunąć pożywkę i zebrać komórki. Ponieważ HEK293T komórki łatwo odrywają się od płytki, mycie płytki lodowatym PBS może być odpowiednie do zbioru. Jednak komórki N2A są bardziej odporne na oderwanie; Użyj skrobaków do komórek, aby pomóc w zbieraniu komórek.
    1. Zbierz wszystkie komórki w probówkach do mikrowirówek.
  5. Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć osad 1 ml PBS poprzez ponowne zawieszenie przez pipetowanie.
  6. Powtórzyć etap wirowania, ale z najwyższą prędkością wirówki w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant.
  7. Przygotuj bufor do testu radio-immunoprecypitacyjnego (RIPA) przed rozpoczęciem eksperymentu.
    UWAGA: Istnieją 3 rodzaje bufora RIPA; Wybierz zgodnie z intensywnością interakcji badanych białek (patrz wzory poniżej).
    1. Jeśli występuje silna interakcja białko-białko, wybierz zwykły bufor RIPA.
    2. Jeśli interakcja jest słaba, wybierz łagodny RIPA lub łagodniejszy RIPA.
      Uwaga: Przepisy tych znajdują się w następujących krokach. Wszystkie, które są stosowane w testach immunoprecypitacyjnych, powinny być uzupełnione inhibitorami proteazy.
      1. Przygotuj zwykły bufor RIPA, używając 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,5% deoksycholanu sodu i 0,1% dodecylosiarczanu sodu w 50 mM Tris pH 8.
      2. Przygotuj łagodny bufor RIPA, używając 1% NP-40, 150 mM NaCl i 0,25% deoksycholanu sodu w 50 mM Tris pH 7,5.
      3. Przygotuj łagodniejszy bufor RIPA, używając 1% Triton-X 100, 137 mM NaCl, 1% glicerolu i 1 mM ortowanadanu sodu w 50 mM Tris pH 7,4.
  8. Po dobraniu odpowiedniego buforu RIPA należy uzupełnić bufor o inhibitory proteazy (RIPA+). Następnie poddaj komórki lizie z 3-krotnością objętości osadu komórkowego w RIPA+.
  9. Wirować zawiesinę przez 15 s. Trzymać ją na lodzie przez 5 minut. Powtórzyć wirowanie i oblodzenie 5 razy, a następnie odwirować próbki w temperaturze 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki i odwirować w celu usunięcia resztek komórek. Przenieść supernatant do czystej probówki.
  11. Rozcieńczyć lizaty białkowe w stosunku 1:50 i przygotować 96-dołkową płytkę z ślepą próbą i wzorcami. Rozcieńczyć próbki.
    1. Wymieszać próbki z roztworem Bradforda w stosunku 1:20. Inkubować przez 15 minut w ciemności.
    2. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 595 nm. Obliczyć stężenie białka, stosując wartości absorbancji dla każdej próbki.
  12. Dzień przed pobraniem komórek połącz kulki białka A Plus z przeciwciałami, które są specyficzne dla interesującego białka.
    1. Odetnij krawędź końcówki o pojemności 200 μl za pomocą nożyczek i użyj 25 μl z zawiesiny kulki dla każdego stanu.
    2. Umyj kulki raz 1 ml PBS, raz 1 ml buforu RIPA i raz 1 ml RIPA+. Etapy prania przeprowadzać w temperaturze 3 300 x g, 4 °C przez 1 min.
    3. Po ostatnim praniu dodaj 300 μl RIPA+ na kulki i dodaj 1,5 μg przeciwciała, które jest specyficzne dla białka, które ma być ściągnięte.
    4. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze (20 obrotów/min).
      Uwaga: W tym przypadku ATG5 został immunoprecypitowany przy użyciu specyficznych przeciwciał anty-ATG5.
  13. Po całonocnej inkubacji kulek z przeciwciałem, przemyj kulki raz PBS, raz RIPA i raz RIPA+, jak opisano w kroku 2.12.2.
  14. Dodać 2 mg lizatu białkowego na kulki dla każdego warunku i uzupełnić całkowitą objętość do 300 μl za pomocą buforu/probówki RIPA+. Inkubować probówki przez noc na rotatorze w temperaturze 4 °C.
  15. Po inkubacji umyj kulki zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 2.12.2).
    1. Po ostatnim praniu użyj mniejszej końcówki pipety, aby usunąć cały supernatant bez dotykania kulek.
    2. Dodaj 10 μl 3x barwnika ładującego: 6% SDS, 30% glicerolu, 16% β-merkaptoetanolu i 0,1% błękitu bromofenolowego w 1M Tris-HCl pH 6,8.
  16. Przygotuj kontrole wejściowe, używając co najmniej 100 μg lizatu białkowego dla każdego warunku. Wyrównaj objętość próbki za pomocą wody i dodaj odpowiednią objętość 3-krotnie obciążającego barwnika.
  17. Gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut
    Uwaga: Zwykle podczas gotowania próbek nakrętki probówek mogą się spontanicznie otworzyć i próbki są tracone. Unikaj tego, przytrzymując nakrętki zamknięte za pomocą specjalnego blokera nasadek.
  18. Odwiruj próbki i załaduj je do żeli SDS-PAGE, aby oddzielić białka zgodnie z ich rozmiarami przy użyciu standardowych protokołów.
    Uwaga: W tym badaniu na RACK1 i ATG5 próbki przepuszczono przez 12% żele poliakrylamidowe pod napięciem 80 V przez 30 minut, a następnie pod napięciem 120 V przez około 90 minut. Jednak w przypadku mniejszych białek, takich jak LC3, bardziej odpowiednie jest stosowanie 15% żeli poliakrylamidowych.
  19. Po zakończeniu pracy żelu przenieś białka do membran nitrocelulozowych lub PVDF za pomocą metod transferu mokrego lub półsuchego. Następnie zablokuj błony przez inkubację w 5% beztłuszczowym mleku w PBS z 0,05% Tween 20 (PBST) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Płukać membrany 3 razy PBST przez 5 min.
  20. Inkubować błony z pierwszorzędowymi przeciwciałami w stężeniach roboczych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Do rozcieńczania przeciwciał pierwszorzędowych należy stosować roztwory czerwone zawierające BSA (5% frakcja BSA Cohn V, 0,02% azydek sodu w PBST, pH 7,5; dodać czerwień fenolową dodaną jako marker pH), aby umożliwić ponowne użycie przeciwciał.
    UWAGA: Na przykład rozcieńczyć przeciwciało ATG5 2,000x w czerwonym roztworze.
    1. Pod koniec czasu inkubacji przemyć membrany 3 razy PBST.
  21. Inkubować błony z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z HRP, które przygotowano w 5% roztworze mleka beztłuszczowego (tutaj zastosowano anty-króliczą IgG w stosunku 1:10 000). Następnie przemyć membrany 3x PBST przez 5 min.
  22. Przygotować roztwór ECL: 25 mM luminolu, 9 mM kwasu kumarowego, 3 x 10-4 % H2O2 w 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Używaj świeżego H2O2 do każdego eksperymentu.
    UWAGA: Reakcja rozpoczyna się po dodaniuH2O2 i trwa przez około 20 minut.
    1. Inkubować błony i filmy rentgenowskie przez 20 minut w ECL. Rozwiń je i napraw w ciemnym pokoju.
  23. W celu sprawdzenia koimmunoprecypitacji białek o zbliżonej lub nakładającej się masie cząsteczkowej może być konieczne usunięcie przeciwciał z błon poprzez inkubację błon w temperaturze 60 °C przez 30 minut w buforze do oddzielania: (25 mM Tris-HCl pH 2 i 1% SDS).
  24. Powtórz kroki od 2.20 do 2.23, aby sprawdzić, czy nie ma koimmunoprecypitacji przy użyciu różnych przeciwciał. Na przykład, po wykryciu ATG5 i usunięciu błon, białko RACK1 przetestowano na tych samych błonach przy użyciu przeciwciała pierwszorzędowego anty-RACK1 (1:1 000) i przeciwciał drugorzędowych (1:10 000). β-aktyna była używana jako kontrola załadunku; a sygnał IgG wykorzystano jako kontrolę obciążenia dla próbek immunoprecypitowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na Rysunku 1 przedstawiono przykład wyniku kolokalizacji uzyskanego przy użyciu niniejszego protokołu. Zaprezentowano rysunek z naszej niedawnej publikacji8. W tym przypadku endogenne białko RACK1 zabarwiono na zielono, natomiast endogenne białko LC3 na czerwono. Żółte kropki widoczne na zdjęciach po nałożeniu obrazów (merged) wskazują miejsca nakładania się sygnałów zielonego i czerwonego. Zatem żółte kropki reprezentują częściową kolokalizację tych dwóch białek.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Techniki immunoprecypitacji i immunofluorescencji mają kluczowe znaczenie dla badania interakcji białko-białko. Chociaż te dwie techniki są powszechnie stosowane i dobrze ugruntowane, należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów w celu określenia jakości eksperymentów podczas korzystania z tych technik.

Po pierwsze, pierwszorzędowe przeciwciała, które są używane w tych testach, powinny być specyficzne dla białek będących przedmiotem zainteresowania. Aby to zapewnić, użyj knockdownów shRNA lub komóre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Naukową i Technologiczną Radę Badań Naukowych Turcji (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, Uniwersytet Sabanci. SEB i NMK są wspierane przez stypendium TUBITAK BIDEB 2211 na studia doktoranckie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór trypsyny EDTA APrzemysł biologiczny BI03-050-1A
PBSGE HealthcareSH-30256.01
DMEM (wysoka glukoza)Sigma 5671
DMEM (niski poziom glukozy)Sigma5546
Trypan BlueSigmaT8154
HemocytometrSigmaZ359629-1EA
Szkiełka nakrywkoweJena BioscienceCSL-103
IsolabI.075.02.005
Poly-L-LizynaSigma P8920
TorinTocris4247
DMSOSigmaVWRSAD2650
EBSSBiological Industries BI02-010-1A
(PFA)Sigma15812-7
BSASigma  A4503
SaponinSigma84510
LC3 PrzeciwciałoSigmaL7543
Przeciwciało anty-królicze IgG Alexa Fluor 568  Przeciwciało InvitrogenA11011
RACK1Santa Cruz Biotechnology  sc-17754
Przeciw myszom IgG Alexa Fluor 488  InvitrogenA11001
NP-40ApplichemA16694.0250
Chlorek soduApplichemA9242.5000
Deoksycholan soduSigma30970
Dodecylosiarczan sodu (SDS)BiochemikaA2572
Trizma BaseSigmaT1503
Triton-X Applichem4975
Ortowanadan soduSigma450243
Przeciwciało ATG5SigmaA0856
GlicerolApplichemA4453
β-Merkaptoetanol ApplichemA1108.0250
Błękit bromofenolowy ApplichemA3640.0005
Mleko beztłuszczoweApplichemA0830
Tween 20SigmaP5927
Azydek soduRiedel de Haen13412
Czerwony fenol Sigma114537-5G
anty-królicza IgG, HRP sprzężonaz Jackson Immuno. 
LuminolFluka9253
Kwas komeryjnySigmaC9008
Nadtlenek wodoruMerckK35522500604
anty mysie IgG, HRP sprzężoneJackson Immuno.115035003
β-Przeciwciało aktynoweSigma A5441
Normalna surowica króliczaSanta Cruz Biotechnologysc-2027
RapamycinSigma  R0395
Białko A-Agaroza KoralikiSanta Cruz BiotechnologySC-2001
Płodowa surowica bydlęca BiowestS1810-500
roztwór penicyliny/streptomycynyPrzemysł biologiczny 03-031-1B
L-glutamina Przemysł biologiczny BI03-020-1B
Rozwiązanie Bradford Sigma6916
Membrana nitocelulozowaGE HealthcareA10083108
Filmy rentgenowskieFujifilm47410 19289
Inhibitor proteazySigmaP8340
Paraformaldehyd 1110305144

Bibliografia

  1. Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
  2. Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556(2013).
  3. Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
  4. Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
  5. Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
  6. Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
  7. Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
  8. Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
  9. Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
  10. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
  11. Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika immunoprecypitacjitechnika immunofluorescencjimikroskopia konfokalnaanaliza Western blotlinia komórkowa HEK293Tlinia komórkowa N2Ametoda Bradfordaelektroforeza w żelu SDS
Badanie interakcji białko-białko w badaniach nad autofagią
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.