Artykuł metodologiczny

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55886

⸱

25 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Streszczenie

Elektroporacja in utero to szybkie i skuteczne podejście do badania procesu migracji promieniowej w korze mózgowej rozwijających się embrionów myszy. Pomogło to w opisaniu różnych etapów migracji radialnej i scharakteryzowaniu mechanizmów molekularnych kontrolujących ten proces. Aby bezpośrednio i dynamicznie analizować migrujące neurony, należy je prześledzić w czasie. Protokół ten opisuje przebieg pracy, który łączy elektroporację in utero z organotypową hodowlą plastrów i poklatkowym obrazowaniem konfokalnym, co pozwala na bezpośrednie badanie i dynamiczną analizę radialnie migrujących neuronów korowych. Ponadto możliwa jest szczegółowa charakterystyka migrujących neuronów, taka jak prędkość migracji, profile prędkości, a także zmiany orientacji radialnej. Metodę tę można łatwo dostosować do przeprowadzania analiz funkcjonalnych genów będących przedmiotem zainteresowania w radialnie migrujących neuronach korowych poprzez utratę i zysk funkcji, a także eksperymentów ratunkowych. Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów jest najnowocześniejszą techniką, która po ustaleniu jest potężnym narzędziem do badania rozwoju kory mózgowej w mysich modelach zaburzeń migracji neuronów.

Wprowadzenie

Kora nowa jest głównym miejscem funkcji poznawczych, emocjonalnych i sensomotorycznych. Składa się z sześciu poziomych warstw zorientowanych równolegle do powierzchni mózgu. Podczas rozwoju komórki progenitorowe w bocznej ścianie kresomózgowia grzbietowego dają początek neuronom projekcyjnym, które migrują promieniście w kierunku powierzchni pial i uzyskują tożsamość neuronalną specyficzną dla typu warstwy. Po wytworzeniu w strefach komorowych/podkomorowych (VZ/SVZ) neurony te stają się przejściowo wielobiegunowe i spowalniają swoją migrację. Po krótkim pobycie w strefie pośredniej (IZ) przechodzą na morfologię dwubiegunową, przyczepiają się do promienistego rusztowania glejowego i kontynuują promieniście zorientowaną migrację do płytki korowej (CP). Po dotarciu do ostatecznego celu projekcji neurony odłączają się od radialnych procesów glejowych i uzyskują tożsamość specyficzną dla warstwy. Mutacje w genach wpływających na różne etapy migracji neuronów mogą powodować poważne wady rozwojowe kory mózgowej, takie jak lizencefalia lub heterotopia istoty białej1,2.

Elektroporacja in utero to szybka i skuteczna technika transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się mózgu embrionów gryzoni3,4. Dzięki tej technice możliwe jest wyłączenie i/lub nadekspresja genów będących przedmiotem zainteresowania w celu zbadania ich funkcji w rozwoju neuronów. Metoda ta w szczególności pomogła opisać szczegóły morfologiczne i scharakteryzować molekularne mechanizmy procesu migracji radialnej5,6,7,8,9. Neurony migrujące promieniście podlegają dynamicznym zmianom kształtu komórki, szybkości migracji, a także kierunku migracji, które wymagają bezpośredniej i ciągłej obserwacji w czasie. Organotypowa hodowla warstwowa i poklatkowe obrazowanie konfokalne mózgów poddanych elektroporacji pozwalają na bezpośrednią obserwację migrujących neuronów w czasie. Korzystając z tego połączonego podejścia, możliwe jest przeanalizowanie różnych cech migrujących neuronów, których nie można zbadać w nieruchomych odcinkach tkanek mózgów poddanych elektropoturowaniu.

Niedawno zastosowaliśmy konfokalne obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów w kulturach warstwowych mózgów poddanych elektroporacji, aby zbadać rolę czynnika transkrypcyjnego komórki B CLL/chłoniaka 11a (Bcl11a) podczas rozwoju kory mózgowej10. Bcl11a ulega ekspresji w młodych, migrujących neuronach korowych, a my użyliśmy warunkowo zmutowanego allelu Bcl11a (Bcl11aflox)11 do zbadania jego funkcji. Elektroporacja rekombinazy Cre wraz z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) do korowych komórek progenitorowych mózgów Bcl11aflox/flox pozwoliła nam stworzyć mozaikową sytuację mutanta, w której tylko kilka komórek jest zmutowanych na tle typu dzikiego. W ten sposób możliwe było zbadanie autonomicznych funkcji Bcl11a na poziomie pojedynczej komórki. Odkryliśmy, że zmutowane neurony Bcl11a wykazują zmniejszoną prędkość, zmiany w swoich profilach prędkości, a także losowe zmiany orientacji podczas migracji10. W przedstawionym protokole opisujemy przebieg udanej elektroporacji i przygotowania kultur warstwowych12 mózgów myszy, a także poklatkowe obrazowanie konfokalne kultur warstw korowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt (Regierungspräsidium Tübingen) i przeprowadzone zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt i dyrektywą UE 2010/63/UE.

1. Elektroporacja in utero

  1. Igły do mikroiniekcji
    1. Wciągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna: 1,0 mm, średnica wewnętrzna: 0,58 mm, długość: 100 mm) do igieł do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do mikropipet z filamentem w pudełku (2,5 mm x 2,5 mm) i następującym programem: CIEPŁO: 540, CIĄGNIĘCIE: 125, PRĘDKOŚĆ: 20 i OPÓŹNIENIE: 140. Określ wartość HEAT dla każdego żarnika z osobna, wykonując test RAMP (wartość HEAT: RAMP+25).
    2. Igły skośne pod kątem 38° i ze średnią lub dużą prędkością obrotową za pomocą mikromłynka, aby uzyskać rozmiar końcówki od 20 do 30 μm do wstrzykiwania w dniu embrionalnym (E) 13,5 lub młodszym oraz od 30 do 40 μm do wstrzykiwania w starszych stadiach embrionalnych. Do przechowywania przymocuj igły w pudełku lub na szalce Petriego z plasteliną, aby zapobiec uszkodzeniu końcówek.
  2. Roztwór plazmidowego DNA
    1. Przygotować konstrukt plazmidowego DNA zawierający fluorescencyjne białko reporterowe (np. GFP) przy użyciu zestawu do przygotowania maxi bez endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Rozcieńczyć roztwór plazmidowego DNA do końcowego stężenia 1 - 2 μg/μL w wolnym od endotoksyn buforze Tris-EDTA zawierającym Fast Green w końcowym stężeniu 0,01%. Podwielokrotny roztwór i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Bakteriostatyczny roztwór chlorku sodu
    1. Przygotować bakteriostatyczny roztwór chlorku sodu, dodając alkohol benzylowy do końcowego stężenia 0,9% do izotonicznego 0,9% roztworu chlorku sodu. Sterylny roztwór filtrujący bezpośrednio przed użyciem.
  4. Roztwór do wstrzykiwań karprofenu
    1. Przygotować roztwór karprofenu do wstrzykiwań, dodając karprofen do końcowego stężenia 0,5 mg/ml do sterylnego izotonicznego 0,9% roztworu chlorku sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 28 dni.
  5. Znieczulenie, iniekcja DNA i elektroporacja
    1. Zważ mysz w ciąży w ciąży E14,5 i umieść ją w przezroczystej komorze anestezjologicznej podłączonej do parownika i nasyconej 5% izofluranem. Gdy zwierzę jest nieprzytomne, przenieś je do maski znieczulającej przymocowanej do płytki grzewczej o temperaturze 37 °C i utrzymuj je w znieczuleniu za pomocą 1,8 - 2,2% izofluranu.
      nuta: Oceń rozwój znieczulenia chirurgicznego na podstawie utraty szczypania ogona i odruchów pedałowania (szczypanie palców).
    2. W przypadku analgezji należy wstrzyknąć podskórnie 100 μl roztworu karprofenu do wstrzykiwań na 10 mg masy ciała myszy (5 mg/kg masy ciała). Obróć mysz tyłem do dołu i ostrożnie przykryj oczy wazeliną, aby nie wyschły.
    3. Delikatnie rozłóż kończyny i przymocuj je do płytki rozgrzewającej za pomocą taśmy chirurgicznej. Wysterylizuj jamę brzuszną 70% etanolem, a następnie roztworem jodu (7,5 mg/ml) za pomocą wacików celulozowych. Powtórz tę procedurę trzy razy, aby zapewnić prawidłową dezynfekcję.
    4. Przykryj brzuch jałową gazą, w której wycięto nacięcie, aby oszczędzić pole (średnica: 2 - 2,5 cm) na nacięcie brzucha. Zwilżyć gazę bakteriostatycznym roztworem chlorku sodu.
      Uwaga: Ponownie oceń rozwój znieczulenia chirurgicznego przez utratę odruchu pedałowania.
    5. Za pomocą kleszczyków Micro Adson (ząbkowane, długość: 12 cm) i cienkich nożyczek (ustawionych pod kątem na bok, długość: 9 cm) przeciąć skórę około 1,5 cm wzdłuż linii środkowej brzucha. Przetnij leżący pod spodem mięsień wzdłuż linea alba.
    6. Usuń jeden róg macicy za pomocą kleszczyków pierścieniowych (długość: 9 cm, średnica zewnętrzna: 3 mm, średnica wewnętrzna: 2,2 mm) i delikatnie umieść go na zwilżonej gazie.
      Uwaga: Trzymaj róg macicy kleszczami pierścieniowymi tylko między zarodkami i nie naruszaj łożyska ani żadnych naczyń zasilających. Utrzymuj macicę wilgotną przez cały czas za pomocą bakteriostatycznego roztworu chlorku sodu.
    7. Ostrożnie ustaw zarodek za pomocą kleszczy pierścieniowych i zlokalizuj boczną komorę, która przedstawia się jako cień w kształcie półksiężyca równoległy do zatoki strzałkowej. Miejsce wstrzyknięcia leży mniej więcej w środku linii między pigmentowanym okiem a zbiegiem zatok, gdzie zatoka strzałkowa rozgałęzia się do dwóch zatok poprzecznych. Wbić igłę do mikroiniekcji przez ścianę macicy do komory bocznej.
      Uwaga: W razie potrzeby głębokość wstrzyknięcia można skorygować poprzez wycofanie igły.
    8. Wstrzyknąć od 1 do 2 μl roztworu DNA do komory bocznej za pomocą mikrowstrzykiwacza, który jest obsługiwany za pomocą pedału nożnego, stosując następujące ustawienia: 25 psi, 10 do 20 ms na impuls i 5 do 10 impulsów. Udane wstrzyknięcie może być monitorowane przez kolorowy roztwór DNA, który powinien wypełnić układ komorowy.
    9. Umieścić elektrody typu pęseta (o średnicy 3 mm dla E13,5 lub młodszych i o średnicy 5 mm dla E14,5 lub starszych) w taki sposób, aby "dodatni" koniec znajdował się po tej samej stronie co wstrzyknięta komora, a "ujemny" koniec znajdował się po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory poniżej ucha głowy zarodka.
    10. Zwilżyć miejsce elektroporacji kilkoma kroplami bakteriostatycznego roztworu chlorku sodu i zastosować 5 impulsów prądu elektrycznego (35 V dla E13.5 lub młodszych i 40 V dla E14.5 lub starszych) o czasie trwania 50 ms w odstępach 950 ms.
      Uwaga: Prądy od 60 do 90 mA są zwykle wystarczające do udanej elektroporacji. Niższe prądy nie będą skutecznie transfekować neuronów, podczas gdy wyższe prądy mogą prowadzić do śmierci embrionalnej.
    11. Powtórzyć procedurę (por. kroki 1.5.7 do 1.5.10.) dla każdego zarodka rogu macicy i delikatnie umieścić go z powrotem w jamie brzusznej.
    12. Usuń róg macicy z drugiej strony i powtórz procedurę opisaną w Kroku 1.5.7 do 1.5.11.
    13. Zamknij jamę brzuszną, zszywając warstwę mięśniową przed zszyciem skóry za pomocą kleszczy Micro Adson, uchwytu igły Mathieu (węglik wolframu, długość: 14 cm) i niewchłanialnego szwu chirurgicznego (koło 3/8, 13 mm, punkt stożkowy).
      Uwaga: Uważaj, aby nie uchwycić macicy ani żadnych innych narządów podczas szycia.
    14. Ostrożnie zdezynfekuj szew skórny roztworem jodu (7,5 mg/ml) i delikatnie usuń nadmiar wazeliny okołogałkowej za pomocą wacików celulozowych. Umieść mysz pod lampą podczerwieni, aż się obudzi. Uważnie monitoruj mysz przez następne dwa dni. Powtórzyć zabieg przeciwbólowy zgodnie z opisem w kroku 1.5.2 po 12 do 24 godzinach.

2. Organotypowa kultura plastrów

  1. Roztwór podstawowy laminy
    1. Rozpuścić 1 mg liofilizowanej lamininy w sterylnej wodzie, aby otrzymać 1 mg/ml roztworu podstawowego lamininy. Przygotować 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Roztwór podstawowy poli-L-lizyny
    1. Rozpuścić 50 mg poli-L-lizyny w sterylnej wodzie, aby otrzymać 1 mg/ml roztworu podstawowego poli-L-lizyny. Przygotować 0,5 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Kompletny Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (Kompletny HBSS)
    1. Przygotuj kompletny HBSS, łącząc 50 ml 10 x roztworu HBSS, 1,25 ml 1 M buforu HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M roztworu D-glukozy, 5 ml 100 ml roztworu chlorku wapnia, 5 ml 100 ml roztworu siarczanu magnezu 100 ml i 2 ml 1 M roztworu wodorowęglanu sodu. Dodać sterylną wodę do 0,5 l, sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Pożywka do kultur plastrowych
    1. Połącz 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml kompletnego HBSS (por. sekcja 2.3.1), 1,35 ml 1 M D-glukozy, 0,25 ml 200 mM L-glutaminy i 0,5 ml penicyliny-streptomycyny, aby uzyskać 50 ml pożywki do hodowli warstwowej. Sterylnie przefiltruj i dodaj surowicę końską do końcowego stężenia 5%. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.
  5. Roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP)
    1. Przygotować 3% roztwór agarozy LMP, rozpuszczając 1,5 g agarozy LMP w 50 ml kompletnego HBSS, ogrzewając w kuchence mikrofalowej przez 1 do 2 minut przy pośredniej mocy.
      nuta: Uważnie monitoruj ciepło, aby zapobiec przelaniu się podczas gotowania.
    2. Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 38 °C do momentu, gdy będzie on gotowy do użycia. Przechowywać w temperaturze 4 °C i raz użyć ponownie.
  6. Powlekanie wkładów membranowych
    1. Dodać jedną porcję roztworu podstawowego lamininy (por. krok 2.1.1) i jedną podwielokrotność roztworu podstawowego poli-L-lizyny (por. krok 2.2.1.) do 6 ml sterylnej wody, aby uzyskać roztwór powlekający (wystarcza na 6 wkładek).
    2. Umieść wkładki membranowe w 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml sterylnej wody na dnie każdej studzienki. Dodać 1 ml roztworu powlekającego (por. krok 2.6.1.) na wierzch każdej membrany i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze dwutlenku węgla.
      Uwaga: Stosować wyłącznie wkładki z optycznie przezroczystymi membranami, takimi jak membrana z politetrafluoroetylenu (PTFE).
    3. Umyj membrany trzykrotnie 1 ml sterylnej wody i wysusz. Tego samego dnia należy stosować powlekane membrany lub przechowywać w czystej 6-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C przez okres do czterech tygodni.
  7. Sekcja mózgu i osadzanie
    1. Dwa dni po elektroporacji umieść mysz w przezroczystej komorze podłączonej do waporyzatora i nasyconej 5% izofluranem. Gdy zwierzę jest nieprzytomne, wyjmij je z komory i złóż w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Usuń macicę zawierającą zarodki i umieść ją na 10-centymetrowej szalce Petriego z lodowatym kompletnym HBSS.
      Uwaga: Od tego momentu wszystkie roztwory, zarodki i mózgi należy przechowywać na lodzie.
    3. Użyj mikroskopu stereoskopowego, kleszczyków z cienką końcówką (prostych, 11 cm) i pary nożyczek sprężynowych Vannas Tübingen (ustawionych pod kątem, długość: 9,5 cm), aby oddzielić każdy zarodek od macicy i przenieść go na inną szalkę Petriego zawierającą lodowato zimny, kompletny HBSS.
    4. Wykonaj nacięcie na poziomie pnia mózgu i przetnij wzdłuż strzałkowej linii środkowej. Złudź skórę i chrząstki pokrywające mózg. Następnie odetnij pień mózgu tuż za półkulami i usuń mózg z czaszki. Przenieś mózg za pomocą szpatułki z mikrołyżeczką (185 mm x 5 mm) na 12-dołkową płytkę zawierającą lodowaty kompletny HBSS. Zbierz wszystkie mózgi ze ściółki na 12-dołkowej płytce.
    5. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przebadać mózgi w 12-dołkowej płytce pod kątem jasności fluorescencji, a także wielkości elektroporowanego obszaru. Wybierz od 2 do 4 mózgów z jasnymi sygnałami fluorescencyjnymi w przypuszczalnej korze somatosensorycznej do dalszego przetwarzania.
    6. Wlać 3% roztwór agarozy LMP utrzymywany w temperaturze 38 °C do odklejanej jednorazowej formy do zatapiania. Usuń mózg z 12-dołkowej płytki za pomocą szpatułki z mikrołyżką i ostrożnie odsącz nadmiar kompletnego HBSS wokół mózgu za pomocą cienkiej bibuły.
    7. Delikatnie umieść mózg w roztworze agarozy, popchnij go na dno formy i ostrożnie wyreguluj jego położenie za pomocą igły o rozmiarze 20. W przypadku odcinków koronalnych zorientuj mózg tak, aby opuszki węchowe były skierowane do góry. Trzymaj pleśń na lodzie, aż roztwór agarozy zestali się i kontynuuj cięcie mózgu.
  8. Sekcja wibratomu i kultura plastrów
    1. Wyjmij blok agarozy z formy i umieść go na pokrywce sterylnej szalki Petriego. Odetnij nadmiar agarozy czystą żyletką, pozostawiając około 2 do 3 mm poniżej opuszki węchowej i 1 mm agarozy po pozostałych stronach. Przymocuj przycięty blok agarozy z opuszkami węchowymi skierowanymi w dół do etapu próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
      Uwaga: Przed cięciem wysterylizuj narzędzia i sprzęt 70% etanolem.
    2. Przenieś etap próbki do komory krojenia wibrującego mikrotomu z łopatkami zawierającego lodowaty kompletny HBSS i ustaw mózg grzbietową stroną w kierunku ostrza. Wytnij plastry mózgu o grubości 250 μm zawierające obszar elektroporowany o niskiej lub umiarkowanej amplitudzie 0,9 mm i bardzo niskiej prędkości cięcia 0,09-0,12 mm/s. Zwykle z każdego pomyślnie naelektryzowanego mózgu uzyskuje się od 4 do 6 wycinków z jasnym sygnałem fluorescencyjnym.
    3. Za pomocą wygiętej szpatułki z mikrołyżeczką i kleszczykami z cienką końcówką ostrożnie przenieś wycinki mózgu wraz z otaczającą je agarozą na 6-dołkową płytkę zawierającą lodowato kompletny HBSS.
      Uwaga: Uważaj, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej, dotykając tylko obrzeża agarozy wokół sekcji kleszczykami podczas przenoszenia.
    4. Przetwarzaj wszystkie wybrane mózgi zgodnie z opisem w krokach od 2.8.1 do 2.8.3.
    5. Zwilż wkładki membranowe 100 μl kompletnego HBSS przed umieszczeniem plastrów mózgu na błonach, aby ułatwić ich umieszczenie. Na 1 wkładce membranowej można umieścić do 5 plastrów.
    6. Ostrożnie przenieś plastry na błony za pomocą wygiętej szpatułki z mikrołyżeczką i kleszczyków z cienką końcówką. Delikatnie naciągnij plasterek na szpatułkę, dotykając tylko krawędzi agarozy kleszczami i delikatnie wepchnij plasterek ze szpatułki na błonę. Ułóż plasterek za pomocą kleszczy i kontynuuj przenoszenie pozostałych plasterków. Usunąć nadmiar kompletnego HBSS za pomocą pipety.
      Uwaga: Nie nakładaj plasterków na siebie.
    7. Za pomocą kleszczyków ostrożnie umieścić wkładki membranowe z plastrami na 6-dołkowej płytce zawierającej 1,8 ml pożywki do hodowli plastrów (por. krok 2.4.1.) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze dwutlenku węgla aż do obrazowania poklatkowego.

3. Obrazowanie poklatkowe

  1. Konfiguracja mikroskopu
    1. Ustawić komorę klimatyczną umieszczoną na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego na temperaturę 37 °C i 5% atmosfery dwutlenku węgla. Użyj detektora hybrydowego, aby zmniejszyć intensywność lasera i poprawić żywotność komórek. Do szczegółowej analizy należy użyć suchego obiektywu o bardzo dużej odległości roboczej 40X i aperturze numerycznej 0,6 lub większej.
      Uwaga: Wszystkie elementy mikroskopu muszą być wstępnie podgrzane do 37 °C przez 2 - 3 godziny przed obrazowaniem, aby zapewnić stabilną ostrość podczas procesu obrazowania.
  2. Obrazowanie warstw
    1. Wybierz wycinek mózgu do obrazowania z 6-dołkowej płytki zawierającej wkładki membranowe za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
      Ostrzeżenie: Unikaj długotrwałej ekspozycji na światło ultrafioletowe, ponieważ może to spowodować fotouszkodzenie komórek.
      Uwaga: Wybierz wycinek z jasnymi pojedynczymi neuronami w górnej części SVZ migrującymi promieniście w kierunku powierzchni wycinka. Drobne procesy fluorescencyjne promienistych komórek glejowych, które obejmują cały CP, wskazują na nienaruszone promieniste rusztowanie glejowe, które jest wykorzystywane przez promieniście migrujące neurony korowe.
    2. Za pomocą kleszczy przenieś wkładkę membranową z plastrem, który został wybrany do obrazowania poklatkowego, do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm zawierającego 2 ml pożywki do hodowli plastrów. Umieść naczynie w komorze klimatycznej mikroskopu konfokalnego.
    3. Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli i zwiększ prędkość skanowania z 400 Hz do 700 Hz, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę odpowiednio z około 1,4 do około 2,5 klatki na sekundę. Uśredniaj nie więcej niż dwa razy. Zdefiniuj stos z przechodzący przez obszar elektroporowany (zwykle 400-100 μm) z rozmiarem kroku 1,5 μm. Łącznie ustawienia te pozwalają na uzyskanie wystarczającej rozdzielczości i jasności obrazu przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego poziomu fotouszkodzeń podczas akwizycji. Rozpocznij serię poklatkową, wykonując stos z co 30 min.
      Uwaga: Długotrwała ekspozycja plastra na światło laserowe wywoła fotouszkodzenia, zmniejszając żywotność komórek. Dostosuj odpowiednio czas ekspozycji na światło lasera.
    4. Analizuj serie poklatkowe za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) lub jego odpowiednika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wcześniej wykazaliśmy, że genetyczna delecja Bcl11a poprzez elektroporację in utero upośledza migrację radialną późno powstających neuronów projekcyjnych warstw górnych10. Elektroporacja plazmidowego wektora DNA zawierającego Cre-IRES-GFP skutecznie usunęła Bcl11a w mózgach warunkowych Bcl11aflox/flox 11. Analiza mózgów electroporowanych w dniu E14.5, przeprowadzona trzy dni po zabiegu,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Migracja promieniowa jest kluczowym procesem w rozwoju kory nowej. Mutacje w genach wpływających na różne etapy tego procesu mogą powodować poważne wady rozwojowe kory mózgowej, w tym lizencefalię i heterotopię istoty białej 1,2. Niedawno wykazaliśmy, że Bcl11a, który ulega ekspresji w młodych migrujących neuronach projekcyjnych kory mózgowej, odgrywa rolę w migracji radialnej. Użyliśmy poklatkowego obrazowania konfokalnego migrujących neuronów w ostrych wycinkac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Jacqueline Andratschke, Elenie Werle, Sachi Takenace i Matthiasowi Tobererowi za doskonałą pomoc techniczną, a także Victorowi Tarabykinowi za pomocne dyskusje. Prace te zostały wsparte dotacją Deutsche Forschungsgemeinschaft dla S.B. (BR-2215).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
izofluranAbbott Laboratories 506949Płytka
6-dołkowaForene Corning351146
płytka 12-dołkowaCorning351143
niewchłanialny szew chirurgicznyEthiconK890HKoło 3/8, 13 mm, punkt stożkowy
Micro Adson KleszczeFine Science Tools11018-12ząbkowane, długość: 12 cm
cienkie nożyczkiNarzędziado nauki14063-09kąt na bok, długość: 9 cm
Uchwyt igły MathieuFine Science Tools12510-14węglik wolframu, długość: 14 cm
kleszcze z cienką końcówkąFine Science Tools11370-40proste, 11 cm
Vannas Tü Bingen Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15005-08kątowe do góry,
kleszcze pierścienioweFine Science Tools11103-09OD: 3mm, ID, 2.2 mm, długość: 9 cm
HBSS (10X)Gibco14180046
L-GlutaminaGibco25030081
Penicylina/StreptomycynaGibco15140122
surowica koniaGibco
włosowate ze szkła borokrzemianowego
system anestezjologicznyHarvard Apparaus72-6471
komora anestezjologicznaHarvard Apparaus34-0460
34-0415
agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520100
mikrotom z wibrującymi ostrzamiLeicaVT1200 S
fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaM205 FA
stereoskopowyLeicaM125
odwróconą fluorescencjąLeicaDM IL LED
konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaTCS SP5II
LeicaHyD
, 40x/0.60 NA
Usługi obrazowania życiaCube, Brick & Pudełkowa
wkładka do hodowli komórkowychMilliporePICM0RG50
mikromłynekNarishigeEG-45zastosowanie kąta 38° do ukosowania
mikrowtryskiwaczaParker Hannifin 052-0500-900Picospritzer III
karprofenPfizer Animal HealthNDC 61106-8507
Forma do emdeddinguPolysciences18986-1
maxi plazmidu bez endotoksynQiagen12362
szybki zielonySigmaF7252
lamininaSigmaL2020
poli-L-lizynaSigmaP5899
HEPESSigmaH4034
D-glukozaSigmaG6152
chlorek wapniaSigmaC7902
siarczan magensiumSigmaM2643
wodorowęglan soduSigmaS6297
elektroporator o fali kwadratowejSonidelCUY21EDIT
pęseta z platynowymi elektrodami dyskowymi 5 mmŚciągacz do mikropipet SonidelCUY650P5
Sutter InstrumentP-97
pudełko filamentuSutter InstrumentFB255B2,5 mm x 2,5 mm
VWR231-0191185 mm x 5 mm
, 50 mmWorld Precision InstrumentsFD5040-100
9,5 cm 26050088 Naczynia BME Gib 41010026 co Aparat Harvard 30-0016 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm kanister filtra fluosorberowego Harvard Apparaus mikroskop z Detektor hybrydowy Obiektyw System kontroli temperatury mikroskopu Leica 11506201 Rimadyl zestaw Szpatułka do mikrołyżek Naczynie szklane

Bibliografia

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9(2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Radialna migracja neuron wpolaryzacja neuron w korowychrozw j neocortexuanaliza pr dko ci migracjipomiar k ta odchyleniastereomikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły