Wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie Drosophila

Podsumowanie

Test wyspowy jest stosunkowo nowym, opłacalnym testem, który może być użyty do oceny podstawowego zachowania lokomotorycznego Drosophila melanogaster. W tym manuskrypcie opisano algorytmy automatycznego przetwarzania danych i obiektywnej kwantyfikacji danych z testów wyspowych, dzięki czemu test ten jest czułym, wysokowydajnym odczytem dla dużych badań genetycznych lub farmakologicznych.

Streszczenie

Postępy w technologiach sekwencjonowania nowej generacji przyczyniają się do identyfikacji (kandydujących) genów chorobowych dla zaburzeń ruchowych i innych chorób neurologicznych w coraz szybszym tempie. Jednak niewiele wiadomo na temat mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tych zaburzeń. Genetyczny, molekularny i behawioralny zestaw narzędzi Drosophila melanogaster sprawia, że ten modelowy organizm jest szczególnie przydatny do charakteryzowania nowych genów i mechanizmów chorobowych w sposób wysokoprzepustowy. Niemniej jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe wymagają wydajnych i wiarygodnych testów, które w idealnym przypadku są opłacalne i pozwalają na zautomatyzowaną kwantyfikację cech istotnych dla tych zaburzeń. Test wyspowy jest opłacalną i łatwą do skonfigurowania metodą oceny zachowania lokomotorycznego Drosophila. W tym teście muchy są wyrzucane na platformę z ustalonej wysokości. Wywołuje to wrodzoną reakcję motoryczną, która umożliwia muchom ucieczkę z platformy w ciągu kilku sekund. Obecnie analizy ilościowe testów wysp filmowych są wykonywane ręcznie, co jest pracochłonnym przedsięwzięciem, szczególnie w przypadku wykonywania dużych ekranów.

Ten manuskrypt opisuje algorytmy "Drosophila Island Assay" i "Island Assay Analysis" do wysokowydajnego, zautomatyzowanego przetwarzania danych i kwantyfikacji danych z testów wyspowych. W konfiguracji prosta kamera internetowa podłączona do laptopa zbiera serię obrazów platformy podczas wykonywania testu. Algorytm "Drosophila Island Assay" opracowany dla oprogramowania open source Fidżi przetwarza te serie obrazów i określa ilościowo, dla każdego warunku eksperymentalnego, liczbę much na platformie w czasie. Skrypt "Island Assay Analysis", kompatybilny z darmowym oprogramowaniem R, został opracowany w celu automatycznego przetwarzania uzyskanych danych i obliczania, czy zabiegi/genotypy różnią się statystycznie. To znacznie poprawia wydajność testu wyspowego i sprawia, że jest to potężny odczyt dla podstawowych zachowań lokomocyjnych i lotnych. Dzięki temu można go zastosować na dużych ekranach badających zdolności lokomotoryczne much, modele zaburzeń ruchowych Drosophila i skuteczność leków.

Wprowadzenie

W ostatnich latach postęp w technologiach sekwencjonowania nowej generacji znacznie przyczynił się do identyfikacji genów leżących u podstaw degeneracyjnych zaburzeń ruchowych mózgu (np. ataksja móżdżkowa i choroba Parkinsona), pochodzenia obwodowego neuronalnego (np. stwardnienie zanikowe boczne i dziedziczna paraplegia spastyczna) oraz pochodzenia mięśniowego (np. dystrofia mięśniowa Duchenne'a i dystrofia miotoniczna)^1,2,3,4. Mimo to niewiele wiadomo na temat mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw większości tych zaburzeń. Lepsze zrozumienie tych mechanizmów ma zasadnicze znaczenie dla opracowania terapii.

Podobnie jak u ludzi, ruch w organizmach modelowych, taki jak lot i lokomocja u Drosophila, jest kontrolowany przez centralny mózg, obwodowy układ nerwowy i mięśnie. Ponadto szybki czas generacji i zestaw narzędzi genetycznych Drosophila sprawiają, że ten organizm modelowy jest szczególnie odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych genów związanych z zaburzeniami ruchowymi oraz do testowania leków^5,6. Ze względu na znaczną liczbę warunków, które muszą być testowane w takich ekranach, wysoce pożądane są wiarygodne, opłacalne i stosunkowo proste testy, a także narzędzia do ilościowego określania wyników wyjściowych w sposób zautomatyzowany.

Schmidt et al. (2012)⁷ opisali tani test zwany "testem wyspowym" do oceny zachowania lokomotorycznego Drosophila. Test wyspowy został z powodzeniem wykorzystany w badaniach przesiewowych na dużą skalę w celu identyfikacji genów o funkcjach specyficznych dla gleju⁷, w ocenie modeli niepełnosprawności intelektualnej Drosophila⁸, oraz do ogólnej oceny zachowania motorycznego muchy⁹. Podstawowa konstrukcja testu wyspowego składa się z podwyższonej platformy, na którą wrzuca się kilka much. Wywołuje to wrodzone zachowanie motoryczne, które umożliwia zdrowym muchom ucieczkę z platformy w ciągu kilku sekund. Test mierzy liczbę much pozostających na platformie w czasie^7,8,9. Wszystkie te cechy wskazują, że test wyspowy może być potężnym narzędziem przesiewowym dla genów zaangażowanych w zaburzenia ruchowe.

Obecnie analiza ilościowa danych testowych z wyspy filmowej jest wykonywana ręcznie^7,8,9. Aby poprawić wydajność testu, opracowano tanią metodę półautomatycznego ilościowego określania ucieczki much z platformy. Konfiguracja wykorzystuje prostą kamerę internetową podłączoną do laptopa do zbierania szeregów czasowych obrazu platformy, z klatkami rejestrowanymi co 0,1 s. Ramki są następnie przetwarzane za pomocą makra "Drosophila Island Assay", które określa ilościowo liczbę much na platformie w czasie. Makro "Test wyspy Drosophila" jest podzielone na trzy niezależne podmakra: (I) Makro podrzędne "Utwórz stos i projekcję" identyfikuje różne eksperymenty wyspowe przechowywane w różnych podfolderach i tworzy stos i projekcję każdego szeregu czasowego. (II) Podmakro "Define Platform" otworzy kolejno wszystkie pliki "Projection_image_name.tif" znajdujące się w poszczególnych podfolderach eksperymentalnych, w którym to momencie użytkownik jest proszony o ręczne zdefiniowanie platformy wyspy jako regionu zainteresowania (ROI). (III) "Analiza" automatycznie określa ilościowo liczbę much pozostających na platformie podczas szeregów czasowych. Makra podrzędne mogą być uruchamiane kolejno (w jednym przebiegu) lub niezależnie. Do analizy danych statystycznych opracowano skrypt, który automatycznie przetwarza uzyskane dane i stosuje test statystyczny w celu określenia, czy terapie/genotypy zachowują się znacząco różnie od siebie (Rysunek 1). Wreszcie wykazano, że ten układ można wykorzystać do oceny i ilościowego określenia nieprawidłowej zdolności lokomotorycznej modelu Drosophila dla ataksji-teleangiektazji (AT).

Protokół

1. Budowa Skrzynki Probierczej Wyspy

1. Przygotuj tacę wykonaną z wytrzymałego materiału, takiego jak polimetakrylan metylu (PMMA), aby pomieścić warstwę wody (np. kąpiel). Upewnij się, że materiał nie jest biały.
   UWAGA: Zalecane są wymiary 40 x 35 x 2,5^cm3 (Rysunek 1A).
2. Przygotuj pudełko (42 x 38 x 25 cm³) wykonane z wytrzymałego, przezroczystego materiału, takiego jak PMMA, które należy umieścić wokół wanny, aby zapobiec ucieczce much do przestrzeni laboratoryjnej. Umieść otwór (20 x 30 cm²) po bocznej stronie, który jest wystarczająco duży, aby eksperymentator mógł łatwo poradzić sobie z fiolkami z muchami i upuścić je na wyspę (Rysunek 1A).
3. Przygotuj podwyższoną platformę o wymiarach 10 x 15 x 2,5 cm³, wykonaną z nieprzepuszczalnego materiału (PMMA lub tworzywa sztucznego), który jest wodoszczelny.
   UWAGA: Ta platforma musi mieć jednolitą białą powierzchnię, aby zapewnić dobry kontrast do analizy obrazu. Rozmiar niekoniecznie jest stały, ale powinien być wystarczająco duży, aby upewnić się, że wszystkie muchy początkowo wylądują na platformie i będą miały szansę po niej chodzić (Rysunek 1A).
4. Zamocuj platformę, przyklejając ją do wanny lub umieszczając ciężarki lub inne ciężkie przedmioty w skrzynce platformy, aby zapobiec zmianom położenia platformy podczas sesji eksperymentalnej/filmowej.

2. Wymagania dotyczące oprogramowania i instalacja

1. Instalacja oprogramowania do rejestracji obrazu.
   1. Pobierz oprogramowanie do nagrywania obrazów, aby nagrać serię zdjęć wyspy (patrz tabela materiałów) i zainstaluj oprogramowanie na komputerze.
      UWAGA: Oprogramowanie do nagrywania obrazów opisane w tym protokole jest obsługiwane tylko przez system Windows. Do tabeli materiałów dodano alternatywę dla innych użytkowników.
2. Instalacja makr "Drosophila Island Assay".
   1. Pobierz makro "Drosophila Island Assay" i kompatybilną wersję Fiji¹⁰ (1.4 lub nowszą) z następującej strony internetowej: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
   2. Przesuń kursor do katalogu "Test wyspowy" i kliknij "widok".
   3. Kliknij "Pobierz wszystko". Zawartość folderu zostanie pobrana jako plik .zip; rozpakuj pobrany plik.
   4. Skopiuj plik "Drosophila Island Assay.ijm" do folderu "Fiji.app/plugins/directory."
      UWAGA: Podczas uruchamiania Fidżi makro "Test wyspy Drosophila" pojawi się na dole menu rozwijanego wtyczek.
3. Instalacja i pobieranie skryptu "Island Assay Analysis".
   1. Pobierz R¹¹ z następującej strony internetowej: https://cran.rstudio.com. Zainstaluj go na komputerze.
   2. Pobierz R studio z następującej strony internetowej: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Zainstaluj go na komputerze.
      UWAGA: Skrypt "Analiza testu wyspy" można uruchomić tylko za pomocą języka R. R studio, z łatwiejszym interfejsem użytkownika, jest prezentowany jako alternatywny krok dla użytkowników niedoświadczonych w R.
   3. Pobierz skrypt "Island Assay Analysis" z katalogu "Drosophila Island Assay" pod następującym adresem internetowym: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      UWAGA: Po wykonaniu kroku 2.2 skrypt "Analiza testu wyspowego" można również znaleźć w rozpakowanym folderze o nazwie "Test wyspowy".

3. Przygotowanie much do testowania na wyspie

Zbierz inscenizowane muchy dla każdego warunku eksperymentalnego w znieczuleniu zimnym lub dwutlenkiem węgla (CO₂), jak opisano wcześniej13 (przez okres 1 - 2 dni).
1. 1. Przygotować co najmniej 3 fiolki z próbkami na warunki doświadczalne, z których każda zawiera około 15 zaawansowanych much. Używaj tylko much z nienaruszonymi skrzydłami i w podobnym wieku i płci.
      UWAGA: Do opisanych tutaj eksperymentów, 5 fiolek z próbkami zawierających 15 samców much o genotypach w^-; Aktyna-Gal4/+ (kontrola) i w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) pobrano w dniu eklizacji, starzano przez 4 dni i wykorzystano do przeprowadzenia testu wyspowego. RNAi, szczepy kontrolne i sterownik Actin-gal4 uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz Tabela materiałów).
2. Pozwól muszkom zregenerować się, aby uniknąć skutków znieczulenia (co najmniej 1 dzień w przypadku stosowania CO₂ ) przed przetestowaniem zebranych much w teście wyspowym w wieku zainteresowania.

4. Konfiguracja eksperymentalna

UWAGA: Zobacz Rysunek 1B.

1. Do wanny wlej zimną wodę z niewielką ilością mydła i ustaw platformę na środku.
   UWAGA: Mydło zmniejsza napięcie powierzchniowe wody; muchy, które dotkną wody, utoną. Zapobiega to zwiększaniu się liczby much latających w pudełku podczas postępów sesji eksperymentalnej.
2. Umieść przezroczyste pudełko na wierzchu tacy i oświetl platformę od góry za pomocą lampy.
   UWAGA: Oświetlenie platformy jest wymagane głównie w celu zapewnienia odpowiedniego kontrastu wideo. Odpowiednia jest do tego zwykła lampa LED 12 V.
3. Umieść kamerę internetową bezpośrednio nad platformą (na zewnątrz pudełka) i podłącz ją do komputera.
4. Utwórz nowe foldery na komputerze, aby przechowywać różne dane eksperymentalne przed eksperymentami.
   1. Postępuj zgodnie ze strukturą przykładu zilustrowaną w Rysunek 2A, aby utworzyć foldery. Na przykład, jeśli projekt eksperymentu wymaga przetestowania dwóch genotypów z pięcioma powtórzeniami każdy, najpierw utwórz główny folder zawierający datę eksperymentu. Wewnątrz folderu głównego utwórz dwa podfoldery (po jednym na genotyp). Wewnątrz folderów genotypu utwórz pięć nowych podfolderów, po jednym na replicate.
      UWAGA: Do dalszej analizy ważne jest, aby serie obrazów odpowiadające poszczególnym eksperymentom były zapisywane w folderach o unikalnych nazwach.

5. Ustawienia wideo w sekcji "Urządzenie przechwytujące" interfejsu

1. Otwórz oprogramowanie do nagrywania obrazu i w zakładce "Przechwytywanie" kliknij "Zdjęcia poklatkowe..." i wybierz odpowiednią kamerę internetową jako "Urządzenie przechwytujące".
2. Umieść martwą muchę na wyspie; dostosuj ustawienia wideo, klikając pole "Ustawienia wideo". Przewiń paski narzędzi, dostosowując jasność, kontrast i kolor w taki sposób, aby martwa mucha wydawała się na białym tle (Rysunek 2B). Po zakończeniu regulacji kliknij "OK".

6. Ustawienia nagrywania i zapisywania wideo w sekcji "Time-lapse" interfejsu

1. Dostosuj ustawienia w "Ustawieniach filmu poklatkowego", aby zapisać eksperyment jako plik .avi. Kliknij "Przeglądaj...", wybierz katalog, w którym film będzie przechowywany, zdefiniuj nazwę filmu i naciśnij "zapisz."
   UWAGA: Plik wideo nie jest używany do ilościowego określania danych; Jednak może być przydatne, aby uzyskać ogólne pojęcie o eksperymencie.
2. Dostosuj ustawienia w sekcji "Ustawienia filmu poklatkowego".
   1. W polu kompresji wybierz "Intel IYUV code" do kompresji wideo i wybierz "Rób jedną klatkę co 0.1 sekundy", z "Szybkością odtwarzania (obrazy na sekundę):" na 10.
   2. Zapisz szereg czasowy eksperymentu jako .bmp klatki, klikając "Zaawansowane..." Wybierz "Utwórz obraz .bmp dla każdej przechwyconej klatki". Kliknij "Przeglądaj". Wybierz ten sam katalog w oknie "Podczas przechwytywania filmu AVI" (jak wybrano w kroku 6.1), kliknij "Otwórz" i naciśnij "OK".
      UWAGA: Zwróć uwagę, że podczas eksperymentu klatki są przechowywane jako pliki .bmp (wymagane do analizy danych). Program nazywa klatki jako "A", po którym następuje liczba odpowiadająca sekwencji przechwytywania klatek (np. "A_number.bmp") (Rysunek 2C). Zawsze zapisuj obrazy należące do różnych eksperymentów w nowym folderze, aby mieć pewność, że poprzednio nagrane serie obrazów nie zostaną nadpisane. Należy pamiętać, że obrazy nie są automatycznie zapisywane w tym samym folderze co plik wideo, chyba że ten folder zostanie wybrany w sekcji "Przeglądaj..." po kliknięciu pola "Zaawansowane".

7. Test wyspy i zbieranie danych

1. Naciśnij przycisk start w interfejsie obrazu poklatkowego w oprogramowaniu do nagrywania obrazu, aby rozpocząć nagrywanie.
2. Postukać w eksperymentalną fiolkę zawierającą muchy (krok 3) 2-3 razy, aby upewnić się, że muchy znajdują się na dnie fiolki. Szybko wyjmij korek z fiolki i energicznym ruchem postukaj w fiolkę o platformę, tak aby wszystkie muchy spadły na platformę w tym samym czasie (Rysunek 1C).
3. Po około 30 s naciśnij przycisk "Stop", aby zatrzymać nagrywanie.
   UWAGA: Jeśli wszystkie muchy znikną z platformy, nagrywanie można zatrzymać wcześniej.
4. Usuń muchy, które pozostały na platformie przez 30 sekund ręcznie po zatrzymaniu nagrywania obrazu.
5. Zanim przejdziesz do nagrywania następnego eksperymentu, zmień katalog docelowy dla .bmp plików i filmów (patrz sekcja 6).

8. Przetwarzanie danych: Uruchamianie makro "Drosophila Island Assay"

UWAGA: Zobacz Rysunek 1D.

1. Uruchom makro podrzędne "Utwórz stos i projekcję" I, aby utworzyć stosy i projekcje zebranej serii obrazów.
   1. Uruchom Fidżi, kliknij "Wtyczki" na pasku narzędzi i wybierz "Test wyspy Drosophila" z menu rozwijanego; pojawi się nowe okno.
   2. Wprowadź ustawienie "Identyfikator szeregów czasowych pierwszego obrazu" w interfejsie graficznym makra.
      UWAGA: Zarejestrowane klatki obrazu są zapisywane jako "A-number.bmp" zgodnie z kolejnością, w jakiej obrazy są uzyskiwane. W interfejsie makra "Identyfikator pierwszej ramki" uzupełnij ustawienie numerem nadanym pierwszej ramce przez program oraz rozszerzeniem pliku. Wypełnij pole "Identyfikator pierwszej ramki" ciągiem "-0001.bmp", ponieważ pierwsza ramka nazywa się "A-0001.bmp" (Rysunek 2C). W przypadku, gdy inne formaty obrazu (takie jak .tiff lub .jpeg) są generowane przez oprogramowanie kamery internetowej, określ poprawne rozszerzenie pliku pierwszego obrazu w polu "Identyfikator szeregów czasowych pierwszego obrazu".
   3. Wybierz tylko makro podrzędne "Utwórz stos i projekcję", kliknij "OK" i wybierz główny katalog zawierający wszystkie podfoldery z indywidualnymi eksperymentami testowymi wyspy.
      UWAGA: Następnie przetworzone zostaną pliki .bmp w każdym folderze eksperymentu, które zawierają "Identyfikator pierwszej klatki". W każdym podfolderze eksperymentu pojawią się dwa nowe pliki, domyślnie nazwane "Stack_image_name.tif" i "Projection_image_name.tif" (Rysunek 1D). Po wykonaniu tego kroku .bmp pliki można usunąć. Pliki .tif stosowych i odwzorowanych zawierają wszystkie dane i są wystarczające do dalszej analizy.
2. Uruchom makro podrzędne "Zdefiniuj platformę" II, aby wybrać dokładną lokalizację platformy.
   1. Otwórz interfejs graficzny "Testu wyspy Drosophila", zaznacz tylko pole wyboru "Zdefiniuj platformę" i naciśnij "OK".
   2. W oknie "Wybierz katalog" wybierz główny katalog, w którym przechowywane są eksperymentalne podfoldery i naciśnij "Wybierz".
      UWAGA: Makro podrzędne "Define Platform" automatycznie wyszukuje pliki "Projection_image_name.tif" we wszystkich podfolderach przechowywanych w katalogu głównym. Otworzy się obraz "Projection_image_name.tif" przechowywany w pierwszym folderze wraz z dwoma oknami — "Zdefiniuj platformę" i "Menedżer ROI".
   3. Wybierz narzędzie "Zaznaczenia wielokątów" na pasku narzędzi, aby narysować zaznaczenie pasujące do platformy wyspy.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wykluczyć z wyboru granicę platformy. Zobacz Rysunek 2D.
   4. Po wybraniu platformy na pierwszym obrazku, kliknij "Dodaj" w oknie "Menedżer ROI"; wybrany obszar pojawi się w oknie menedżera ROI jako zestaw wartości (Rysunek 2D). Naciśnij "Ok" w oknie "Zdefiniuj platformę". Makro przejdzie do następnej projekcji.
   5. Kliknij na liczby (Rysunek 2D) zapisane w oknie "Menedżer ROI"; poprzedni wybór pojawi się automatycznie w bieżącej projekcji obrazu.
      UWAGA: Ponieważ platforma wyspowa prawdopodobnie będzie miała ten sam rozmiar i pozycję, gdy eksperymenty są wykonywane z rzędu (o ile pozycja kamery internetowej i wyspy pozostaje niezmieniona), przydatne jest przechowywanie zwrotu z inwestycji definiującego platformę w "menedżerze ROI". W ten sposób użytkownik zaoszczędzi czas; w nadchodzących projekcjach wystarczy kliknąć tymczasowo zapisany wybór w menedżerze ROI.
   6. Jeśli pozycja wyspy nieznacznie się zmieniła w porównaniu z poprzednim eksperymentem, dostosuj położenie zaznaczenia, klikając lewym przyciskiem myszy środek zaznaczenia i przeciągając wybrany obszar do wymaganej pozycji.
   7. Jeśli zaznaczenie nie pasuje do platformy, kliknij lewym przyciskiem myszy poza zaznaczeniem i narysuj nowe zaznaczenie dla platformy za pomocą narzędzia "Wybór wielokąta". Zapisz nowy wybór w menedżerze ROI, klikając "Dodaj; ", w oknie "Menedżer ROI" pojawi się nowy wybór, z którego można korzystać w sposób ciągły.
   8. Po dostosowaniu wyboru kliknij "OK" w oknie "Zdefiniuj platformę" i powtarzaj procedurę, aż wszystkie platformy zostaną zdefiniowane.
      UWAGA: Zauważ, że binarny obraz platformy odpowiadający wyznaczonemu obszarowi ROI w kolorze białym na czarnym tle, o nazwie "Platform_image_name.tif", pojawił się dla każdego przetworzonego obrazu w tym samym podfolderze eksperymentalnym, co obrazy stosu i projekcji wygenerowane w kroku 8.1.3 (Rysunek 1D).
3. Określ minimalny rozmiar muchy.
   UWAGA: To ustawienie określa minimalny rozmiar muchy w pikselach. Cząstki, które są mniejsze niż określony minimalny rozmiar, zostaną wykluczone z analizy, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich spowodowanych szumem.
   1. Otwórz stos obrazów utworzony za pomocą makra podrzędnego "Utwórz stos i projekcję" I.
   2. Przekonwertuj stos obrazów na 8-bitowy, klikając Image>>Type>>8-bit.
   3. Przejdź do menu, naciśnij Image>>Adjust>>Threshold, upewnij się, że pole "Ciemne tło" jest zaznaczone i naciśnij "Zastosuj; ", pojawi się drugie okno o nazwie "Próg". Kliknij "Ciemne tło" i naciśnij "OK."
      UWAGA: Zostanie utworzony binarny stos obrazów, w którym muchy są zdefiniowane w kolorze czarnym, a platforma w kolorze białym. Jeśli tak nie jest, zastosuj funkcję "Odwróć", klikając Edytuj>>Odwróć>>uruchom.
   4. Ustaw skalę, aby wykrywać liczbę pikseli, klikając przycisk Analizuj>>Ustaw skalę. Zastosuj następujące ustawienia: odległość w pikselach = 1, znana odległość = 1, współczynnik proporcji pikseli = 1 i jednostka długości = piksel. Naciśnij "OK".
   5. Wybierz narzędzie "Różdżka" (śledzenie) na pasku narzędzi i kliknij muchę (czarną kropkę) znajdującą się na platformie. Naciśnij ctrl+m (użytkownicy systemu Windows) lub cmd+m (użytkownicy komputerów Mac); nowe okno "Wyniki" wskaże obszar wybranego miejsca w pikselach. Zrób to kolejno dla kilku much i określ minimalny rozmiar muchy.
      UWAGA: Podczas uruchamiania makra ustaw ustawienie "Minimalny rozmiar muchy" na najmniejszy obserwowany rozmiar muchy minus margines 10%. (Rysunek 2E).
4. Uruchom podmakro "Analiza" III, aby określić ilościowo muchy uciekające z platformy.
   1. Przejdź do paska narzędzi, wybierz "Wtyczki" i wybierz "Test wyspy Drosophila".
   2. Dostosuj ustawienie "Minimalny rozmiar muchy" zgodnie z wartością zdefiniowaną w kroku 8.3.
      UWAGA: Wartości zdefiniowanej w kroku 8.3 należy używać tylko wtedy, gdy standardowe ustawienie "Minimalny rozmiar muchy" powoduje wykluczenie much, które były obecne na platformie lub jeśli makro wykrywa sygnał tła jako muchy.
   3. W ustawieniu "Liczba much na fiolkę" napełnij maksymalną liczbę much obecnych w fiolkach podczas całego eksperymentu. Na przykład, jeśli w jednym eksperymencie fiolki zawierają 15 much, w innych 20 much, a jeszcze inne 23 muchy, "Liczba much w fiolce" musi być wskazana jako 23.
   4. Zaznacz pole wyboru "Analizuj" i naciśnij "OK; " pojawi się nowe okno "Wybierz katalog". Wybierz główny katalog (ze wszystkimi podfolderami i plikami w środku) i naciśnij "wybierz"."
      UWAGA: Makro przeanalizuje wszystkie obrazy przechowywane w podfolderach, o ile zawierają one pliki "stack_image_name", "Projection_image_name" i "Platform_image_name". Makro będzie przetwarzać obraz po obrazie. Dane wyjściowe makra składają się z binarnego stosu obrazów wynikowych o nazwie "result_stack_subfolder_name.tif" i wynikowego pliku tekstowego o nazwie "result_subfolder_name.txt", które pojawiają się w każdym folderze danych. Wynikowy plik tekstowy (.txt) zawiera pomiary ilościowe odpowiadające stosowi obrazów i składa się z 9 kolumn. Zawartość tych kolumn podsumowano w tabeli 1. "Result_stack_subfolder_name.tif" odpowiada szeregowi czasowemu obrazu z jednego eksperymentu, gdzie muchy wykryte podczas eksperymentu są reprezentowane jako czarne kropki na białym tle (Rysunek 1E).
   5. Dokładnie sprawdź stos wyników, aby upewnić się, że nie wystąpiły żadne artefakty i że makro działało poprawnie (Rysunek 2F).
      UWAGA: Przykładami artefaktów mogą być elementy obrazu, które nie są muchami, ale są wykrywane jako takie przez algorytm segmentacji obrazu (wyniki fałszywie dodatnie). Może to być na przykład spowodowane wykryciem sygnału tła z powodu niedokładnego wyboru ROI.

9. Analiza danych za pomocą "Analizy Test Wyspy"

1. Uporządkuj dane zgodnie z opisem w Rysunek 2A, aby umożliwić analizę za pomocą skryptu "Island Assay Analysis". Wygeneruj katalog główny z podfolderami, gdzie każdy podfolder odpowiada jednemu warunkowi eksperymentalnemu, który ma zostać przeanalizowany.
2. W podfolderach wygeneruj foldery zawierające niezależne repliki eksperymentalne (Rysunek 2A) oraz pliki results.txt utworzone przez makro "Test Drosophila Island".
   UWAGA: Makro "Analiza testu wyspowego" przetworzy jednocześnie wszystkie warunki eksperymentalne znajdujące się w katalogu głównym.
3. Uruchom program R lub R studio. Kliknij na Plik>>Otwórz plik... na pasku narzędzi i wybierz skrypt "Analiza testu wyspowego".
   1. Zainstaluj pakiety ggplot2 i matrixStats podczas uruchamiania skryptu "Island Assay Analysis" po raz pierwszy. Wpisz następujące polecenie w oknie konsoli:
      > install.packages("ggplot2"), wpisz
      > install.packages("matrixStats"), wprowadź.
4. Określ lokalizację plików wyjściowych danych i analizy w skrypcie. Wstaw w następujących wierszach skryptu:
   1. Wiersz 16: Wstaw ścieżkę do głównego katalogu, który zawiera eksperymenty, które mają być analizowane i porównywane (w Rysunek 2A, jest to ścieżka kierująca do folderu "Test wyspy").
   2. Wiersz 19: Wstaw ścieżkę do folderu, w którym są przechowywane pliki wyjściowe analizy.
      UWAGA: Katalog wskazany w wierszu 16 może zawierać tylko foldery, które mają być analizowane. Skrypt nie będzie również działał poprawnie, jeśli ścieżki wstawione w wierszu 16 i wierszu 19 są takie same.
5. Uruchom skrypt, klikając Kod>>Uruchom region>>Uruchom wszystko na pasku narzędzi.
   UWAGA: Zauważ, że trzy wynikowe pliki .csv i jeden wynikowy plik .txt (Rysunek 1E) pojawiają się w katalogu zdefiniowanym w wierszu 19. Są to: (I) Plik "data_all_conditions.csv" zawiera przetworzone dane odpowiadające każdemu warunkowi doświadczalnemu i powtórzeniom eksperymentalnym, zorganizowane zgodnie z opisem w Tabeli 2. (II) Plik "Statistics summary.csv" podsumowuje średnią, odchylenie standardowe (SD), oraz błąd standardowy średniej (SEM) procentu much na platformie dla każdego warunku eksperymentalnego. (III) Plik "AUC.csv" zawiera obszar pod krzywą dla każdej kontrpróby doświadczalnej. (IV) W zależności od liczby warunków obecnych w głównym folderze, skrypt wyeksportuje plik "Welch_t-test_results.txt" (2 warunki) lub plik "AUC_anova_results.txt" (więcej niż 2 warunki), w którym wskazane są wyniki testu t lub ANOVA porównującego obszar pod krzywą między warunkami eksperymentalnymi. Zauważ, że cztery różne typy plików graficznych .tiff (Rysunek 1E) pojawiają się w ścieżce zdefiniowanej w wierszu 19. Nazywają się one: "Name_Of_Data_Folder.tiff" (gdzie Name_Of_Data_Folder oznacza nazwę folderu podaną przez użytkownika), "AUC.tiff", "Escape_response_all_conditions.tiff" i "AUC_anova.tiff". Szczegółowe informacje na temat zawartości tych wykresów można znaleźć w Reprezentatywnych wynikach tego manuskryptu oraz w Rysunek 3.

Wyniki

W opisanym protokole dane z testu wyspowego Drosophila są pozyskiwane i przetwarzane w trzech etapach. Po pierwsze, reakcja ucieczki lotnej Drosophila wyrzuconych na platformę wyspową jest rejestrowana za pomocą kamery internetowej i zapisywana jako pojedyncze obrazy .bmp (sekcje protokołu 1 - 7). Po drugie, makro „Drosophila Island Assay” (krok 8) przetwarza klatki, generując plik tekstowy „result.txt” (Tabela 1), w którym podsumowano liczbę obiektów wykrytych w każdej klatce, oraz stos obrazów „Result_stack.tiff”, który pokazuje obiekty wykryte w obszarze platformy w każdej klatce. Po trzecie, skrypt „Island Assay Analysis” (sekcja protokołu 9) przetwarza dane z makra zapisane w plikach „results.txt” poszczególnych eksperymentów. W skrypcie zawarto kilka kroków w celu filtrowania i łączenia danych do analizy statystycznej. Wykrywana jest pierwsza klatka, w której muchy zostają wyrzucone na platformę, i przyjmuje się ją jako punkt czasowy 1. Wcześniejsze klatki są usuwane ze zbioru danych. Do analizy wybieranych jest 100 klatek następujących po punkcie czasowym 1 (odpowiadających 10 s). Eksperymenty, w których początkowa liczba much wykrytych na platformie jest mniejsza niż 5, są automatycznie wykluczane z analizy, co eliminuje niewiarygodne wyniki z eksperymentów o zbyt małej liczbie próbek. Wykluczane są również eksperymenty, w których początkowa liczba much wykrytych na platformie przekracza ustawienie „Number of flies per vial” powiększone o tolerancję wynoszącą 3. Eliminuje to zbiory danych, w których cząsteczki szumu zostały błędnie zidentyfikowane jako muchy. Następnie skrypt oblicza procent wykrytych much dla każdego punktu czasowego w stosunku do najwyższej liczby much wykrytych w serii. Błędy w zbiorach danych spowodowane wchodzeniem i wychodzeniem much z ROI (wykrywane jako spadek, a następnie wzrost procentu much na platformie w czasie) są automatycznie korygowane poprzez uznanie ich za stale obecne na platformie w wcześniejszych etapach. Wszystkie zbiory danych z powtórzeń dla określonego warunku eksperymentalnego, które znajdowały się w głównym katalogu, są łączone i eksportowane do pliku „data_all_conditions.csv”. Jego kolumny reprezentują zmienne opisane w Tabeli 2. Skrypt wyeksportuje również wykres liniowy dla każdego warunku eksperymentalnego, nazwany zgodnie z folderem zawierającym dane. Wykres ten przedstawia procent much pozostających na platformie w czasie (reakcja ucieczki lotnej) dla powtórzeń eksperymentalnych znajdujących się w odpowiednim folderze (Rycina 3A-B). Średnia, SD i SEM dla każdego warunku eksperymentalnego są obliczane i podsumowane w pliku „Statistics summary.csv”. Wykres liniowy o nazwie „Escape_response_all_conditions.tiff” pokazuje średnią reakcję ucieczki lotnej dla maksymalnie 12 warunków eksperymentalnych znajdujących się w głównym folderze (Rycina 3C). Na koniec obliczana jest powierzchnia pod krzywą dla wszystkich warunków eksperymentalnych znajdujących się w głównym folderze i podsumowywana w pliku „AUC.csv”. W zależności od liczby warunków w głównym folderze, skrypt przeprowadzi dwustronny nieparowany test t Welcha (2 warunki) lub analizę ANOVA z korekcją Tukeya dla wielokrotnych porównań (więcej niż 2 warunki), aby określić, czy warunki eksperymentalne różnią się od siebie znacząco. Wyniki te są podsumowane w plikach „Welch_t-test_results.txt” lub „AUC_anova_results.txt”. Podczas wykonywania analizy ANOVA skrypt wyeksportuje również plik „AUC_anova.tiff”, który wyświetla różnicę w średnim AUC oraz 95% przedziały ufności dla porównywanych warunków eksperymentalnych. Wartości bezwzględnej powierzchni pod krzywą dla powtórzeń eksperymentalnych wszystkich warunków eksperymentalnych są wyświetlane jako pojedyncze punkty danych z medianami w pliku „AUC.tiff” (Rycina 3D).

Ataksja telangiektazy (AT) jest autosomalnym recesywnym zaburzeniem ruchowym charakteryzującym się wczesnym wystąpieniem ataksji móżdżkowej w wyniku mutacji w genie Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM)¹⁴. Mutanty ortologa ATM u Drosophila, tefu, wykazują defekty w zakresie mobilności oraz długości życia¹⁵. Aby ocenić makro „Drosophila Island Assay”, w teście wyspy przebadano model AT u muszek Drosophila, a uzyskane przez makro dane zestawiono z wynikami ręcznego liczenia. Wyniki pokazują, że powszechny knockdown tefu (w^-; Actin-Gal4/GD11950) znacząco zmniejsza zdolność tych muszek do opuszczenia platformy w porównaniu z kontrolami w tym samym tle genetycznym (w^-; Actin-Gal4/+) (Rycina 4). Po 1 s platformę opuściło 50% muszek kontrolnych, w przeciwieństwie do <1% muszek z tefu-RNAi. Co istotne, dane uzyskane za pomocą makra wiernie odwzorowały dane otrzymane poprzez ręczne liczenie, co wskazuje, że makro jest niezawodnym narzędziem, które może być wykorzystane do kwantyfikacji danych z testu wyspy oraz oceny defektów ruchu (Rycina 4 A-B).

Rycina 1: Schemat przedstawiający wymagania, procedurę eksperymentalną i analizę testu wyspy (island assay). (A) Wyposażenie do testu wyspy. (B) Układ eksperymentalny dla testu wyspy. (C) Test wyspy. (D) Przetwarzanie danych z testu wyspy za pomocą makra „Drosophila Island Assay”. Makro „Drosophila Island Assay” składa się z 3 podmakr: 1) tworzenie stosu i projekcji, 2) definiowanie platformy oraz 3) analiza. (E) Przetwarzanie i ocena statystyczna danych przy użyciu skryptu „Island Assay Analysis”. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Przykłady różnych regulacji wymaganych podczas realizacji protokołu. (A) Wymagana struktura katalogów, w której eksperymenty z testu wyspowego muszą być zapisywane w celu przetwarzania i analizy danych. (B) Podczas regulacji ustawień wideo muchy muszą być widoczne jako czarne obiekty na białym tle. (C) Pliki wyjściowe klatek obrazu zapisane przez oprogramowanie do rejestracji obrazu opisane w niniejszej pracy. (D) Żółta obramowanie wskazuje wybór platformy. Zapisany wybór platformy w „ROI Manager” jest wyróżniony na niebiesko. (E) Muchy są reprezentowane jako białe kropki podczas regulacji ustawienia „Minimum fly size”. Okno wyników pokazuje powierzchnię much w pikselach. (F) Przykład pojedynczej zarejestrowanej klatki obrazu (po lewej) i odpowiadającej jej klatki w wynikowym stosie obrazów, uzyskanym za pomocą makra „Drosophila Island Assay” (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: Obrazy wynikowe otrzymane po przetworzeniu danych za pomocą skryptu „Island Assay Analysis”. (A) Wykres liniowy przedstawiający reakcję ucieczki lotnej dla każdego powtórzenia eksperymentalnego grupy kontrolnej. (B) Wykres liniowy przedstawiający reakcję ucieczki lotnej dla każdego powtórzenia eksperymentalnego tefu RNAi. (C) Średnia reakcja ucieczki lotnej dla wskazanych warunków eksperymentalnych; słupki błędów reprezentują SEM. (D) Wykresy kropkowe przedstawiające rozkład pola pod krzywą dla warunków kontrolnych i mutantów. Powtórzenia eksperymentalne dla warunków tefu RNAi oraz kontrolnych są wyświetlane jako poszczególne punkty danych (na czarno) z medianami (czerwona linia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Muchy z powszechnym wyciszeniem genu tefu wykazują znacznie zmniejszoną zdolność do opuszczenia platformy. Dane przedstawiają procent much na platformie w czasie (s) dla much kontrolnych (w^-; Actin-Gal4/+) oraz much z RNAi tefu (w^-; Actin-Gal4/GD11950). (liczba powtórzeń = 5; słupki błędu reprezentują SEM). (A) Surowe dane uzyskane za pomocą makra „Drosophila Island Assay”. (B) Wykresy kropkowe przedstawiające rozkład pola pod krzywą dla warunków kontrolnych i RNAi tefu uzyskane za pomocą makra „Drosophila Island Assay” (nieparzysty test t Welcha, **p <0,01). (C) Surowe dane uzyskane poprzez ręczne zliczanie liczby much obecnych na wyspie na sekundę. (D) Wykresy kropkowe przedstawiające rozkład pola pod krzywą dla warunków kontrolnych i RNAi Tefu uzyskane poprzez ręczne zliczanie (nieparzysty test t Welcha, **p <0,01). Słupki błędu reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Nazwa kolumny	Opis
Przekrój	Nazwa ramki.
Liczba	Liczba obiektów wykrytych w klatce w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) platformy.
Powierzchnia całkowita	Całkowita powierzchnia obiektów wykrytych w klatce w granicach platformy (ROI) wyrażona w pikselach.
Średnia wielkość	Całkowita powierzchnia obiektów wykrytych w klatce podzielona przez liczbę obiektów w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) platformy.
% powierzchni	Procent powierzchni zajmowanej przez obiekty w stosunku do całkowitej powierzchni platformy (ROI).
Okres ważności.	Całkowity obwód obiektów wykrytych w klatce w granicach obszaru zainteresowania (ROI) platformy, wyrażony w pikselach.
Min. rozmiar muchy	minimalny rozmiar muchy zdefiniowany przez użytkownika w interfejsie graficznym "Muszka owocówka Test wyspowy" makro (w pikselach).
Obszar ROI	Obszar platformy (ROI) zdefiniowany przez użytkownika podczas uruchamiania podmakra define platform (w pikselach).
Liczba much	Liczba much wykorzystywanych w każdym eksperymencie, określona przez użytkownika w interfejsie graficznym "Muszka owocówka Test wyspowy" makro.

Tabela 1: Parametry mierzone przez makro „Drosophila Island Assay”.Parametry opisane w tej tabeli pojawią się w pliku „results.txt” po uruchomieniu makra „Drosophila Island Assay”.

Nazwa kolumny	Opis
Przekrój	Numer klatki.
Liczba	Liczba much wykrytych w klatce w obrębie granic platformy (ROI).
X.Powierzchnia	Całkowita powierzchnia much wykrytych w klatce w granicach platformy (ROI) wyrażona w pikselach.
Min. wielkość muchy	minimalna wartość rozmiaru obszaru skanowania (fly size) zdefiniowana przez użytkownika w interfejsie graficznym "Muszka owocówka Test wyspowy" makro (w pikselach).
Obszar ROI	Obszar platformy (ROI, w pikselach) zdefiniowany przez użytkownika podczas uruchamiania submakra "zdefiniuj platformę".
Liczba much	Liczba much użytych w eksperymencie, zdefiniowana przez użytkownika w interfejsie graficznym "Muszka owocówka Analiza wyspowa" makro.
X.Count	% much obecnych na platformie w odpowiednim przekroju/klatce w stosunku do najwyższej liczby much wykrytych na platformie podczas eksperymentu.
Punkt czasowy	Punkt czasowy 1 reprezentuje pierwszą analizowaną klatkę i odpowiada klatce, w której muchy po raz pierwszy pojawiają się na platformie. W każdym powtórzeniu analizowanych jest łącznie 100 klatek (co przy zastosowaniu opisanych ustawień odpowiada 10 s).
Eksperyment	Liczba powtórzeń dla każdego stanu.
Warunki	Wskazuje nazwę warunku eksperymentalnego (zgodnie z nazwą folderu zawierającego dane, zdefiniowaną przez użytkownika).

Tabela 2: Opis zmiennych uzyskanych po przetworzeniu danych za pomocą skryptu „Island Assay Analysis”.Parametry opisane w tej tabeli pojawiają się w pliku „data_all_conditions.csv” po przetworzeniu danych za pomocą skryptu „Island Assay Analysis”.

Dyskusja

Protokół ten opisuje makro "Test Wyspy Drosophila ", który ilościowo ocenia zachowanie motoryczne Drosophila podczas testu na wyspie. Makro dokładnie zlicza muchy na platformie w czasie, dzięki czemu test wyspowy jest bardzo czuły i nadaje się do ilościowej, wysokoprzepustowej oceny wad ruchowych. Metodologia ta pozwala na porównanie każdego schorzenia, z muchami hodowanymi w różnych warunkach genetycznych i/lub środowiskowych, w tym w ekspozycji na leki. Odczyt ten jest zatem szczególnie przydatny jako narzędzie odkrywcze podczas wykonywania dużych badań genetycznych lub farmaceutycznych, podczas badania modeli zaburzeń ruchowych i innych chorób neurologicznych Drosophila lub podczas badania zachowań związanych z lokomocją.

Protokół testu wyspowego przedstawiony w tym manuskrypcie zapewnia przewagę nad istniejącymi/alternatywnymi metodami. Na przykład lokomocja ze śledzeniem wideo jest znacznie bardziej czasochłonna i mniej odpowiednia do testowania dużych rozmiarów prób. Test wyspowy jest wysokoprzepustowym narzędziem przesiewowym i w tym sensie jest porównywalny z szybkim interaktywnym testem geotaksji ujemnej (RING)¹⁶. Różnica między nimi polega na tym, że testy wyspowe pozwalają na wykrycie szerszego zakresu problemów lokomotorycznych; Niezdolność much do opuszczenia platformy może być spowodowana wadami w locie, skakaniu lub chodzeniu spowodowanymi wadami skrzydeł (mięśni/neuronów) i/lub nóg (mięśni/neuronów). Z drugiej strony, test RING ocenia wady w zachowaniu podczas wspinaczki/chodzenia spowodowane wadami nóg (mięśni/neuronów). W przypadku, gdy użytkownicy są zainteresowani wieloma odczytami behawioralnymi, test wyspowy można również łatwo połączyć z innymi testami, takimi jak test RING. Ponadto lasery wymagane do optogenetyki można łatwo zainstalować w pojemniku testowym wyspy, a konfiguracja jest tak prosta, że można ją łatwo przenieść do pomieszczenia, w którym można kontrolować temperaturę i światło.

Aby zapewnić powodzenie i odtwarzalność opisanego tutaj testu wyspowego, należy postępować zgodnie z kilkoma zaleceniami. Porcję i przenieść muchy do eksperymentalnych fiolek testowych co najmniej jeden dzień przed eksperymentem, aby uniknąć skutków CO₂ lub zimnego znieczulenia. Nie należy przepełniać eksperymentalnych fiolek (należy użyć 10 - 15 much na fiolkę; najlepiej jest zawsze umieszczać taką samą liczbę much w jednej fiolce). Trzymaj muchy na świeżym jedzeniu przez cały czas. Jeśli nie jesteś jeszcze zaznajomiony z przeprowadzaniem testu, poćwicz rzucanie much na platformę, aby zmaksymalizować wydajność. Ćwicz również szybkie cofanie ręki zaraz po tym, ponieważ przeszkadza to w analizie danych (analiza obrazu i liczenie much zaczynają się dopiero po tym, jak ręka znajdzie się poza obrazem). Utrzymuj identyczne warunki środowiskowe i eksperymentalne w eksperymentach, które muszą być porównane (np. grupa kontrolna kontra mutanty lub genotyp badany w różnym wieku). Eksperymenty należy zawsze wykonywać o tej samej porze dnia i utrzymywać fiolki w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności. Aby uzyskać moc statystyczną, należy zbadać co najmniej trzy kontrpróby techniczne na kontrpróbę biologiczną.

Aby zapewnić pomyślne działanie opisanego tutaj makra, ustawienia kamery internetowej i obrazu muszą zostać dostosowane w celu uzyskania maksymalnego kontrastu: muchy pojawiające się jako czarne obiekty na białej platformie. Gdy liczba much nie jest prawidłowo zliczana przez makro, dostosuj ustawienia kontrastu, sprawdź, czy ROI jest prawidłowo wybrany i upewnij się, że rozmiar much na platformie jest wyższy od określonego ustawienia minimalnego rozmiaru muchy (patrz krok 8.3 tego protokołu). Ustawienia należy zdefiniować tylko raz. Mają one zastosowanie do wszystkich eksperymentów, o ile odległość między kamerą internetową a platformą nie ulega zmianie. Ustawienia Circularity_min i max definiują okrągłość cząstek (cząstki = zliczone muchy), które zostaną uwzględnione w analizie (muchy = zliczone obiekty). 1 oznacza idealne koło, a 0 oznacza linię¹⁷. Ponieważ muchy zawsze wykazują pewien stopień kolistości (mucha nie może pojawić się jako linia prosta), ustawienie "Circularity_max" jest ustawione na 1, a ustawienie "Circularity_min" jest ustawione na 0,4. Jest mało prawdopodobne, że użytkownik będzie musiał dostosować te ustawienia.

Makro od czasu do czasu popełnia błędy w liczeniu, gdy mucha znajduje się blisko granicy platformy. Może się to zdarzyć, jeśli muchy nie mogą latać, ale wchodzą i wychodzą ze zdefiniowanego przez użytkownika zwrotu z inwestycji. W większości przypadków ponowny wybór ROI (dopasowanie go w jak największym stopniu do platformy) może łatwo rozwiązać ten problem. Jednak skrypt "Island Assay Analysis" jest w stanie stosunkowo dobrze wykryć i skorygować nieprawidłowe zliczanie danych spowodowane przez muchy wchodzące i wychodzące z ROI. Chociaż rozdzielczość prezentowanej tutaj kamery internetowej jest wystarczająco wysoka, aby dość dobrze rozróżniać muchy w bliskiej odległości, zaimplementowaliśmy dodatkowe algorytmy w procedurze przetwarzania obrazu makra "Drosophila Island Assay", takie jak funkcja watershed i erode¹⁷. Ułatwiają one prawidłowe rozgraniczenie much, które znajdują się w bliskiej odległości na platformie. Ponadto makro nie jest w stanie odróżnić much, które zeskoczyły z platformy lub odleciały od niej. Niemniej jednak ogólnie obserwuje się, że zdrowe młode szczepy much odlatują natychmiast po upuszczeniu na platformę, podczas gdy starsze muchy i muchy z deficytami lokomotorycznymi pozostają dłużej na platformie i ostatecznie skaczą lub spadają z platformy. Pomimo tych ograniczeń, test i analiza zapewniają bardzo dokładny pomiar zachowania lokomotorycznego.

Aby zapewnić pomyślne wykonanie skryptu "Analiza testu wyspowego", użytkownik musi upewnić się, że wprowadził poprawne ścieżki dla plików wejściowych i wyjściowych w wierszach skryptu wskazanych w protokole oraz podał dane w odpowiednim formacie folderu (jak pokazano na rysunku 2). Jeśli użytkownik uzna, że kryteria stosowane do odfiltrowywania niewiarygodnych danych eksperymentalnych są zbyt rygorystyczne (wiersz 68: pierwsza wartość w kolumnie "Liczba" jest mniejsza lub równa 5; wiersz 71: pierwsza wartość w kolumnie "Liczba" jest wyższa niż całkowita liczba much wyrzuconych na platformę +3), Wyłącz te ustawienia filtrowania, dodając znak # przed tekstem w wierszach 68 i 71 w skrypcie "Analiza testu wyspowego". W takim przypadku wszystkie zestawy danych zostaną uwzględnione w analizie. Alternatywnie ustawienia filtra można zmienić, dostosowując wartości w wierszach 68 i 71 zgodnie z potrzebami użytkownika. Możliwe artefakty w wartościach zliczania w "results.txt" wygenerowanym przez makro "Drosophila Island Assay" można również dostosować ręcznie, a skrypt można ponownie uruchomić na skorygowanych danych. W przypadku, gdy użytkownik jest zainteresowany przetwarzaniem więcej niż 10 kl./s lub więcej niż 10 s danych, należy dostosować liczbę klatek przetwarzanych przez skrypt "Island Assay Analysis". Analizę statystyczną można również zastąpić alternatywami zdefiniowanymi przez użytkownika.

Folder o nazwie "Przykłady testu wyspowego", zawierający przykłady z szeregami czasowymi obrazów uzyskanymi za pomocą testu wyspowego, można znaleźć na następującej stronie internetowej: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Pobierz folder "Examples Island Assay" i postępuj zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, aby szybko zapoznać się ze strukturą przechowywania plików, przetwarzaniem obrazów za pomocą makra "Drosophila Island assay" oraz skryptem "Island Assay Analysis".

Test wyspowy, w połączeniu z opracowanym skryptem makro i analitycznym, może być wykorzystany do oceny i ilościowego określenia nieprawidłowego zachowania ruchowego modelu Drosophila Ataxia-Teangiectasia. Ponieważ test może być skutecznie stosowany w różnym wieku, dobrze nadaje się do analizy potencjalnie postępującej natury fenotypów.

Podsumowując, test wyspowy, w połączeniu z makro "Drosophila Island Assay" i skryptem "Island Assay Analysis", jest opłacalnym, wiarygodnym i wysoce wydajnym testem do obiektywnej analizy i ilościowego określania wad lokomotorycznych modeli zaburzeń ruchowych Drosophila w sposób wysokoprzepustowy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
25 x 95 mm Drosophila fiolki	Flystuff	32-116SB-Kamera
internetowa Logitech C525 HD	Logitech-Każda		kamera internetowa ze złączem USB jest odpowiednia.
Stojak do trzymania kamery internetowej	-	--
Lampa	-	--	Diody LED 12 V są odpowiednie
Podkładka do	-		Każda podkładka pod mysz działa
Pudełko testowe wyspy	-		Wymiary 40x35x2,5 cm. Otwór 20x30 cm. Przezroczysty.
Wanna do testów wyspowych	-		Wymiary 42x38x25 cm. Inna niż biała.
Wyspa/platforma	-	-	Wymiary 42x38x25 cm. Jednolita biała.
Mydło	-		odpowiedni jest standardowy detergent do mycia naczyń.
		Skrypty komputerowe działają zarówno w systemie Windows, jak i Mac
Oprogramowanie do nagrywania obrazów: HandiAvi®	AZcendant® -		HandyAvi jest kompatybilny tylko z systemem Windows i został opisany w całym manuskrypcie. Można go pobrać z: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (wersja 5.0)
Oprogramowanie do nagrywania obrazu: WebcamCapture	-		wtyczka Fiji/ImageJ, która może być używana na komputerze Mac jako alternatywa dla HandyAvi do nagrywania obrazów i można ją pobrać z: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ Korzystając z tej metody, użytkownik musi użyć tych samych ustawień folderu i ustawień nagrywania obrazu, które są wskazane w tym manuskrypcie, z wyjątkiem tego, że dla każdego replikacji eksperymentalnej, przechwycony stos obrazów powinien zostać wyeksportowany jako Stack.tiff do odpowiedniego folderu replikacji eksperymentalnej. Po uruchomieniu makra "Drosophila Island Assay" na tych danych, w ustawieniu "Identyfikator pierwszej ramki" nie powinien znajdować się żaden tekst.
Fiji	-	-	Wersja 1.4 lub nowsza, można pobrać z: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio	-	-	Można pobrać z: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R	-		-Wersja 3.3.2, można pobrać z: https://cran.rstudio.com