Method Article

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

DOI:

10.3791/55910

⸱

June 10th, 2017

 ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie obrazowania ramanowskiego do biomasy roślinnej rośnie, ponieważ może dostarczyć informacji przestrzennych i składowych na temat roztworów wodnych. Analiza zwykle nie wymaga intensywnego przygotowania próbki; Informacje strukturalne i chemiczne można uzyskać bez etykietowania. Jednak każdy obraz Ramana zawiera tysiące widm; Stwarza to trudności przy wydobywaniu ukrytych informacji, zwłaszcza w przypadku składników o podobnej budowie chemicznej. W niniejszej pracy przedstawiono analizę wielowymiarową w celu rozwiązania tego problemu. Protokół ustanawia ogólną metodę wizualizacji głównych składników, w tym ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny. W niniejszym protokole opisano procedury przygotowania próbki, akwizycji spektralnej i przetwarzania danych. Jest to w dużym stopniu zależne od umiejętności operatora w zakresie przygotowania próbek i analizy danych. Dzięki zastosowaniu tego podejścia badanie ramanowskie może być przeprowadzone przez użytkownika niebędącego specjalistą w celu uzyskania wysokiej jakości danych i znaczących wyników do analizy ściany komórkowej roślin.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomasa roślinna jest najobfitszym zasobem odnawialnym na Ziemi; składa się głównie z ligniny, celulozy i hemicelulozy; i jest uważana za atrakcyjne źródło bioenergii i biochemikaliów1. Niestety, może być odporny na degradację i nadawać stabilność hydrolityczną lub wytrzymałość strukturalną ścianie komórkowej rośliny. Taką odporność można przypisać dostępnej powierzchni, wielkości cząstek biomasy, stopniowi polimeryzacji, krystaliczności celulozy i ochronnej ligninie2. Kompleksowe zrozumienie strukturalnej i chemicznej natury ściany komórkowej roślin jest zatem istotne z punktu widzenia biologii i chemii roślin, a także z punktu widzenia komercyjnego wykorzystania. Powszechnie stosowane analizy chemii mokrej, takie jak chromatografia, spektrometria mas i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego, dostarczają jedynie uśrednionych danych dotyczących składu mierzonej próbki. Co więcej, metody te są inwazyjne i niszczą oryginalną strukturę tkanki roślinnej3.

Technika obrazowania Ramana to potężne narzędzie do nieniszczącej wizualizacji przestrzennie rozdzielonych informacji chemicznych4. Wykorzystuje światło laserowe do wywoływania nieelastycznego rozpraszania za pomocą fotonu i opiera się na zmianach polaryzowalności wynikających z wibracji molekularnych. W tym przypadku woda powoduje słabe rozpraszanie Ramana, co sprawia, że to podejście jest odpowiednie do badań in situ próbek biologicznych5. Zastosowanie techniki obrazowania ramanowskiego do ściany komórkowej rośliny może wyjaśnić strukturę i skład ścian komórkowych roślin w ich stanie naturalnym, z rozdzielczością w skali pojedynczej komórki, a nawet warstw ściany komórkowej6. Typowa analiza obrazowa ściany komórkowej rośliny składa się zazwyczaj z trzech etapów: 1) przygotowania próbki, 2) akwizycji spektralnej i 3) przetwarzania danych.

Chociaż jedną z głównych zalet obrazowania Ramana jest możliwość uzyskania bezznacznikowych i nieniszczących widm przy minimalnym przygotowaniu próbki, fizyczne cięcie próbki jest nadal konieczne, aby odsłonić powierzchnię będącą przedmiotem zainteresowania. Proces ten powinien być wykonywany ostrożnie, aby uzyskać płaską powierzchnię, ponieważ technika ta polega na utrzymaniu ostrości optycznej7. Akwizycja spektralna wymaga równowagi między jakością obrazu a długim czasem akwizycji8. Przetwarzanie danych ma na celu skuteczne wyodrębnienie informacji chemicznej z danych obrazu, zwłaszcza w przypadku składników o podobnej budowie chemicznej, takich jak celuloza i hemiceluloza. Ze względu na silne nakładanie się widm, dokładne widma są trudne do rozpoznania. W tym przypadku analiza wielowymiarowa jest prostym podejściem do skutecznego odkrycia ukrywających się informacji strukturalnych i chemicznych9. W niniejszej pracy przedstawiono ogólny protokół opisujący zastosowanie obrazowania ramanowskiego do wizualizacji głównych składników ścian komórkowych roślin, w tym ligniny, celulozy i hemicelulozy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Wytnij mały blok tkanki (około 3 mm x 3 mm x 5 mm) z próbki rośliny (np. łodygi topoli).
  2. Zanurz chusteczkę we wrzącej wodzie dejonizowanej na 30 minut. Natychmiast przenieś ją do wody dejonizowanej o temperaturze pokojowej (RT) na 30 minut. Powtarzaj ten krok, aż tkanka opadnie na dno pojemnika, wskazując, że powietrze z tkanki zostało usunięte i że tkanka zmiękła.
    Uwaga: W przypadku próbek, które opadają na dno przed tym krokiem, zazwyczaj powtórz ten cykl 3-5 razy.
  3. Przygotować 20, 50, 70, 90% (v/v) podwielokrotności glikolu polietylenowego (PEG) w wodzie dejonizowanej, jak również czysty PEG, i utrzymywać roztwory w temperaturze 65 °C.
  4. Inkubuj tkankę w serii stopniowanych kąpieli PEG, aby wyprzeć wodę i umożliwić infiltrację PEG.
    Uwaga: Zazwyczaj do osadzania używa się PEG o masie cząsteczkowej 2,000 (PEG2000).
    1. Przetwarzaj tkankę z klasyfikowanym PEG w piecu do suszenia w następujący sposób: (a) 20% PEG przez 1 godzinę, (b) 50% PEG przez 1,5 godziny, (c) 70% PEG przez 2 godziny, (d) 90% PEG przez 2 godziny i (e) 100% PEG przez 10 godzin.
  5. Podgrzej kasetę w temperaturze 65 °C w piekarniku. Wlej PEG zawierający blok do kasety, a następnie umieść blok tkanki w żądanej pozycji za pomocą wstępnie podgrzanej pęsety lub igieł.
  6. Powoli schładzaj kasetę i przechowuj chusteczkę w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
  7. Rozetnij blok PEG zawierający tkankę docelową na mały blok (około 1 cm x 1 cm x 2 cm) za pomocą ostrej żyletki i zamontuj go na mikrotomie.
  8. Wytnij cienkie odcinki z bloku PEG (zwykle 3-10 μm).
  9. Opłucz sekcję wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy, aby usunąć PEG z tkanki.
  10. Zanurz sekcje w toluenie/etanolu (2:1, v/v) na 6 godzin, aby usunąć ekstrakty. Przygotować ciecz reakcyjną, mieszając 65 ml wody dejonizowanej, 0,5 ml kwasu octowego i 0,6 g chlorynu sodu w zlewce. Dodać jedną sekcję i 3 ml płynu reakcyjnego do fiolki o pojemności 5 ml. Przykręcić górną część fiolki.
  11. Ogrzewać fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 75 °C przez 2 godziny w celu usunięcia ligniny z tkanki. Przepłucz sekcję wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy.
  12. Przenieś nieleczony/delignifikowany wycinek na szklane szkiełko mikroskopowe. Ostrożnie rozłóż sekcję za pomocą szczotek lub igieł. Usuń nadmiar wody dejonizowanej za pomocą bibuły.
  13. Zanurzyć wycinek w D2O. Przykryć próbkę szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu D2O.

2. Akwizycja spektralna

  1. Otwórz oprogramowanie operacyjne konfokalnego mikroskopu Ramanowskiego. Włącz laser (długość fali = 532 nm), skup się na powierzchni krzemu krystalicznego za pomocą obiektywu mikroskopu 100X i kliknij przycisk kalibracji, aby skalibrować instrument.
  2. Przełącz przyrząd w tryb mikroskopu optycznego i włącz lampę mikroskopu. Zamontuj szkiełko mikroskopowe na stoliku, szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu.
  3. Obejrzyj próbkę za pomocą obiektywu mikroskopowego 20X i zlokalizuj obszar zainteresowania. Nałóż olejek immersyjny na szkiełko nakrywkowe i przełącz na obiektyw mikroskopu zanurzeniowego (60X, apertura numeryczna NA = 1,35). Skoncentruj się na powierzchni próbki.
  4. Przełącz przyrząd w tryb testowania Ramana i wyłącz lampę mikroskopu.
  5. Wybierz obszar odwzorowania za pomocą narzędzia prostokątnego. Zmień rozmiar kroku, aby określić liczbę uzyskanych widm.
    Uwaga: Należy zwrócić uwagę na rozmiar kroku (zwykle większy niż średnica plamki obliczona na podstawie apertury numerycznej obiektywu; teoretycznie 1,22λ/NA). Rozmiary poniżej tej wartości spowodują nadpróbkowanie.
  6. Ustaw optymalne parametry spektralne, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu (SNR) i jakość widmową w odpowiednim czasie akwizycji (zwykle < 8 godzin), w zależności od przydatności próbki. Ogólnie rzecz biorąc, wprowadź parametry obrazowania w oprogramowaniu przyrządu w następujący sposób: laser (532 nm), filtr (100%), otwór (300), szczelina (100), spektrometr (1,840 cm-1), rowki (1200t), obiektyw (olej 60X) i czas akwizycji (2 s).
  7. Zapisz dane spektralne przed przetworzeniem danych i przekonwertuj je do uniwersalnego formatu (np. plików TXT).

3. Analiza danych

  1. Załaduj dane spektralne (pliki TXT) do oprogramowania do analizy danych (np. Matlab). Zastosuj technikę redukcji szumów w zbiorze danych w celu poprawy SNR (np. algorytm Savitzsky'ego-Golaya lub algorytm falkowy)
  2. Użyj próbek niepoddanych obróbce, aby uzyskać obrazy ligniny i polisacharydów. W przypadku obrazowania ligniny należy wziąć pod uwagę pik widmowy około 1,600 cm-1 spowodowany symetrycznymi wibracjami rozciągającymi pierścienia aromatycznego. Do obrazowania polisacharydowego (w tym celulozy i hemicelulozy) należy użyć piku widmowego około 2,889 cm-1 ze względu na rozciąganie CH iCH2.
  3. Użyj próbek delignifikowanych, aby wygenerować obrazy celulozy i hemicelulozy. Wykonaj rozdzielczość krzywej samodzielnego modelowania (SMCR) na uzyskanych widmach, aby rozróżnić widma celulozy i hemicelulozy oraz zobrazować ich rozkład.
  4. Wykonaj analizę głównych składowych (PCA) i analizę skupień na uzyskanych danych, aby odróżnić widma Ramana od różnych warstw ściany komórkowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia przegląd typowego systemu mikro-ramanowskiego do obrazowania ramanowskiego ściany komórkowej roślin. Na przykład, pierwotne widma Ramana topoli (Populus nigra L.) mają znaczne dryfy i skoki linii bazowej (Rysunek 2a). Po wykonaniu metody automatycznego wstępnego przetwarzania zestawu danych obrazowania Ramana (APRI), te dwa zanieczyszczenia spektralne są pomyślnie usuwane (Rysunek 2b). Typ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściana komórkowa rośliny jest kompozytem, który jest zorganizowany w kilka warstw, w tym narożnik komórki (CC), ściana wtórna (SW, z warstwami S1, S2 i S3) oraz złożona blaszka środkowa (CML, blaszka środkowa plus sąsiednia ściana pierwotna), co utrudnia uzyskanie płaskiej powierzchni podczas przygotowywania próbki. W związku z tym próbki roślin, zwłaszcza trawa, która ma bardziej skomplikowaną strukturę niż drewno, często muszą zostać zestalone, aby umożliwić dokładne pokrojenie. PEG jest idealną twardą matrycą do cięci...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy chińskiemu Ministerstwu Nauki i Technologii (2016YDF0600803) za wsparcie finansowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MicrotomeThermo ScientificMicrom HM430
Konfokalny mikroskop RamanowskiHoriba Jobin YvonXplora
PiekarnikSzanghaj ZHICHENGZXFD-A5040

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonzalo, G. D., et al. Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation. J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).
  2. Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
  3. Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
  4. Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
  5. Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
  6. Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
  7. Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
  8. Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
  9. Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
  10. Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
  11. Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891(2016).
  12. Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
  13. Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
  14. Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
  15. Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Raman ImagingMultivariate AnalysisPlant Cell WallLignin VisualizationCellulose ImagingHemicellulose AnalysisSpectral AcquisitionData ProcessingSample PreparationConfocal Microscopy

Related Articles