Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Kapilarne elektroforetyczne testy immunologiczne mierzą ekspresję białek w lizatach komórkowych za pomocą systemów separacji wielkości lub ładunków i zapewniają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi testami immunologicznymi. Na przykład, w porównaniu z western blot, zautomatyzowana procedura oparta na naczyniach włosowatych eliminuje potrzebę stosowania żeli, urządzeń transferowych i ręcznego mycia. Ponadto bezwzględna wymagana ilość białka jest około 10 razy mniejsza, co sprawia, że systemy oparte na naczyniach włosowatych są idealne do stosowania z rzadkimi typami komórek lub ograniczoną próbką^1,2. Wyniki uzyskuje się w ciągu zaledwie 3 godzin przy użyciu zautomatyzowanych systemów i wcześniej wykazano, że są one bardziej ilościowe i powtarzalne niż konwencjonalne procedury western blot^3,4,5. Proces oznaczania opartego na wielkości polega na ładowaniu próbek zawierających dodecylosiarczan sodu (SDS), ditiotreitol (DTT) i znakowane fluorescencyjnie markery masy cząsteczkowej do kolumn kapilarnych zawierających matryce do układania w stosy i separacji. Napięcie przyłożone do naczyń włosowatych oddziela białka w próbkach według wielkości, a światło UV unieruchamia oddzielone białka do ściany naczyń włosowatych. Kapilara jest następnie badana immunologicznie za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego specyficznego dla celu i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP). Luminol i nadtlenek katalizują wytwarzanie światła chemiluminescencyjnego, które jest mierzone przez kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) i analizowane w celu ilościowego określenia białka.

Pomimo względnej łatwości i szybkości zautomatyzowanej platformy do elektroforetycznego testu immunologicznego opartego na kapilarach, optymalizacja warunków testu, takich jak stężenie białka, rozcieńczenie przeciwciał i czas ekspozycji, jest ważna dla uzyskania dokładnych, powtarzalnych wyników. Ogólnie rzecz biorąc, należy wykonać następujące procedury w celu optymalizacji testu dla tych systemów:

1) Należy przeprowadzić badanie przesiewowe w celu oceny i wyboru przeciwciał pod kątem sygnału i swoistości dla docelowego białka. Jeśli to możliwe, do oceny swoistości można użyć oczyszczonego białka lub epitopu docelowego; Jednak nadal ważne jest, aby ocenić potencjalny sygnał niespecyficzny w całkowitym białku pochodzącym z systemu modelowego.

2) Następnie należy określić zakres dynamiczny testu. W idealnej sytuacji obserwuje się podwojenie sygnału (mierzone za pomocą powierzchni piku) wraz ze podwojeniem stężenia próbki; Jednak w praktyce proporcjonalna zmiana sygnału wejściowego w przewidywalny sposób (np. dopasowanie liniowe) jest wystarczająca do ilościowego określenia białka. Dodatkowo, ta optymalizacja zdefiniuje stężenie białka o wysokim sygnale, ale nadal w zakresie liniowym dla modelu eksperymentalnego.

3) Określ optymalne stężenie przeciwciał za pomocą stałego stężenia białka wybranego w kroku optymalizacji 2. Wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał sygnał nasila się, aż do osiągnięcia stabilizacji przy nasyceniu. Stężenie przeciwciał bliskie temu poziomowi nasycenia jest wymagane do dokładnego pomiaru stężenia białka.

Proces używany do optymalizacji stężeń białek, rozcieńczeń przeciwciał i czasów ekspozycji dla automatycznego testu wielkości na podstawie kapilarnej⁶ jest demonstrowany przy użyciu ekstraktów z całych komórek wyizolowanych z BEAS-2B, transformowanej przez SV-40 ludzkiej linii komórkowej nabłonka oskrzeli. Izolację białek z ekstraktów komórkowych lub tkankowych można przeprowadzić przy użyciu wielu opublikowanych protokołów^7,8,9 i nie będzie tutaj omawiane. Wyniki eksperymentu próbnego z wykorzystaniem zoptymalizowanych warunków są również przedstawiane dla całkowitej i ufosforylowanej (seryna 15, seryna 20) p53 w kulturach wystawionych na działanie doksorubicyny (powszechnego środka chemioterapeutycznego, który indukuje apoptozę komórek¹⁰) w stężeniu 1,2, 1,8 i 2,4 μg/ml przez 4 godziny przed zbiorem. Obszary pików p53 są znormalizowane do ɑ-tubuliny, która jest używana jako kontrola obciążenia.

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i próbki są przygotowane zgodnie z protokołem producenta, opisanym poniżej. Podczas tej procedury należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, buty z zakrytymi palcami i okulary ochronne. Tabela konkretnych wymaganych materiałów, odczynników i sprzętu jest dostępna osobno. Całkowite stężenie białka w próbkach należy wcześniej określić przy użyciu ustalonych metodologii, które są zgodne z zastosowanym buforem lizatu, takich jak test Bradforda¹¹.

1. Przygotowanie próbek i odczynników ze standardowego opakowania dostarczonego przez producenta

1. Aby przygotować 400 mM roztwór roboczy ditiotreitolu (DTT), dodaj 40 μl wody dejonizowanej do przezroczystej probówki zawierającej dostarczony materiał od producenta. Ważne jest, aby unikać wprowadzania pęcherzyków do roztworu poprzez mieszanie roztworu z powolnym i delikatnym pipetowaniem.
2. Dodać 20 μl buforu do próbki 10X i 20 μL przygotowanego 400 mM roztworu DTT do różowej probówki zawierającej fluorescencyjną mieszankę wzorcową 5X (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Mieszanka Master Mix (MM) jest zapieczętowana przez producenta foliową osłoną i musi być przekłuta końcówką pipety. Mieszaj delikatnie, powoli pipetując, aby uniknąć rozpryskiwania się DTT w pipecie.
3. Następnie dodaj 16 μl wody dejonizowanej, 2 μl dostarczonego buforu do próbki 10X i 2 μl przygotowanego 400 mM roztworu DTT do białej biotynylowanej rurki drabinkowej dostarczonej przez producenta. Delikatnie wymieszaj i przenieś do probówki o pojemności 0,6 ml w celu denaturacji.
4. Przygotować 0,1x bufor próbki, rozcieńczając dostarczony roztwór 10X 1:100 wodą. Przygotować wystarczającą ilość 0,1 x buforu do próbek, aby rozcieńczyć wszystkie próbki.
5. Obliczyć ilość 0,1x buforu próbki, która jest dodawana do próbki, która będzie zależeć od końcowego pożądanego stężenia białka całkowitego. Wymieszaj 1 część 5x fluorescencyjny MM z 4 częściami rozcieńczonej próbki, aby uzyskać pożądane końcowe stężenie białka.
   1. Obliczyć objętości w następujący sposób: (i) Objętość 5x fluorescencyjny MM = (Pożądane końcowe stężenie białka)/5; (ii) Objętość zapasu białka = (Pożądane końcowe stężenie białka x Całkowita wymagana objętość)/ Stężenie białka; (iii) Objętość 0,1x bufor próbki = Całkowita objętość - 5x objętość MM - Objętość białka.

2. Denaturacja próbek i drabiny

1. Przygotowane próbki i drabinkę biotynylową umieścić w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C na 5 minut. Natychmiast po inkubacji zawirować probówki, wirować przez ~5 s w wirówce stołowej i umieścić na lodzie.
   UWAGA: Niektóre białka mogą wymagać łagodniejszych warunków denaturacji (np. 70 ^oC przez 10 min), aby zapobiec agregacji białek i poprawić migrację w macierzy kapilarnej. Rozważ tę opcję, jeśli występuje silne rozmazywanie przy wyższych masach cząsteczkowych (patrz na przykład wideo).

3. Przygotowanie przeciwciał

1. Zgodnie z ustaleniami optymalizacji (patrz reprezentatywne wyniki i film), przygotuj pożądane rozcieńczenie (rozcieńczenia) pierwszorzędowego przeciwciała (np. 1:50, 1:100) w dostarczonym rozcieńczalniku przeciwciał 2,
   UWAGA: Przeciwciała są zwykle stosowane w wyższych stężeniach w kapilarnym teście immunologicznym niż w tradycyjnym western blot. Dostarczone przeciwciało drugorzędowe jest gotowe do użycia bez rozcieńczania.

4. Przygotowanie Luminolu-S i Nadtlenku

1. Przygotuj mieszaninę luminolu-S i nadtlenku w stosunku 1:1.
2. Wirować do mieszania i przechowywania na lodzie.
   UWAGA: Ważne jest, aby mieszanina ta była przygotowywana na świeżo dla każdego testu doświadczalnego. Do uruchomienia pełnej płyty potrzebna jest całkowita mieszanka 250ul.

5. Przygotowanie płytki testowej

1. Jak pokazano na Rysunek 1, załaduj próbki i odczynniki przygotowane powyżej na płytkę testową. Zapoznaj się ze szczegółowymi instrukcjami poniżej dla każdego wiersza. Aby zminimalizować parowanie z dołków, należy upewnić się, że pokrywka płytki jest wymieniana między dodawaniem odczynników.
2. W rzędzie A odpipetować 5 μl biotynylowanej drabinki do studzienki A1. Do pozostałego rzędu pipetować przygotowane próbki (po 5 μl każda) do studzienek A2-A25.
   UWAGA: Konieczne jest, aby studzienka A1 zawsze zawierała drabinkę, ponieważ pierwsza kapilara we wkładzie jest zoptymalizowana do pracy z tym standardem.
3. W rzędzie B odpipetować 10 μl rozcieńczalnika przeciwciał 2 do każdej studzienki (B1-B25).
4. W rzędzie C odpipetować 10 μl rozcieńczalnika przeciwciał 2 do studzienki C1. Do pozostałych studzienek w rzędzie C odmierzyć pipetą 10 μl przeciwciała pierwszorzędowego (studzienki C2-C25).
5. W rzędzie D odpipetować 10 μl Streptawidyny-HRP do studzienki D1. Do pozostałych studzienek w rzędzie D odpipetować 10 μl przeciwciała wtórnego (studzienki D2-D25).
6. W rzędzie E odpipetować 10 μl świeżo przygotowanej mieszanki nadtlenku luminolu do każdej studzienki (E1-E25).
7. Na koniec dodaj 500 μl buforu płuczącego na komorę do każdego z 3 górnych rzędów studzienek buforowych.
   UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków poprzez delikatne pipetowanie i nie wyrzucanie końcowej objętości z końcówki, ponieważ pęcherzyki mogą zakłócać ładowanie kapilarne i bieg
.
8. Po załadowaniu wszystkich studzienek odwiruj płytkę o sile ~1000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć pęcherzyki i upewnić się, że ciecz znajduje się na dnie studzienek. Usuń wszelkie widoczne bąbelki małą końcówką pipety lub czystą igłą (np. sterylną igłą "rep top" o rozmiarze 25).

Rysunek 1. Szablon do pipetowania na płytkę testową. Kodowanie kolorami reprezentuje odpowiednie odczynniki i próbki (łącznie do 24) dodane do płytki testowej. Dodać biotynylowaną drabinkę do studzienki A1 (pomarańczowa), przygotowane próbki z dołków A2 do A25 (jasnoniebieska), rozcieńczalnik przeciwciał 2 do dołków B1-B25 i C1 (jasnozielona), pierwszorzędowe przeciwciało do studzienek C2 do C25 (niebieska), streptawidyna-HRP do studzienki D1 (ciemnoróżowa), przeciwciało drugorzędowe do studzienek D2 do D25 (ciemnozielona) i mieszanina luminolu i nadtlenku do studzienek E1 do E25 (fioletowa). Bufor płuczący dodaje się do pierwszych trzech rzędów większych studzienek na środkowej płycie (ciemnoniebieskiej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Uruchamianie testu immunologicznego na naczynia włosowate

1. Upewnij się, że instrument i towarzyszący mu komputer są włączone. Nie jest potrzebny czas na rozgrzewkę.
2. Otwórz oprogramowanie oprzyrządowania na komputerze. Najpierw wybierz zakładkę "Test" po prawej stronie okna i "Nowy test" w "Menu plików" po lewej stronie. Wybierz rozmiar, zakres rozmiarów (np. 12-230 kDa) i typ wkładu (np. 25 kapilarny), który został użyty do danego testu.
   UWAGA: W razie potrzeby można również wprowadzić parametry testu, w tym stężenie białka, typ przeciwciała i rozcieńczenie, ale nie są one wymagane do rozpoczęcia testu.
3. Otwórz drzwiczki instrumentu, naciskając przycisk na górze pomarańczowego panelu.
4. Ostrożnie wyjmij wkład kapilarny z opakowania. Nie dotykając samych szklanych kapilarn, umieść wkład w uchwycie wkładu. Sprawdź osadzenie wkładu, obserwując, jak światło wewnętrzne zmienia się z pomarańczowego na niebieskie.
5. Przytrzymaj mocno płytkę na stole i ostrożnie zdejmij uszczelkę parowania z dolnej części płytki. Wszelkie pęcherzyki widoczne w tych studzienkach z matrycą separacyjną należy przebić małą końcówką pipety lub czystą igłą (np. sterylną igłą "rep top" o rozmiarze 25).
6. Umieść płytkę testową na uchwycie płytki, upewniając się, że jest całkowicie osadzona, i zamknij drzwiczki instrumentu.
7. Kliknij przycisk "Start" w oprogramowaniu.
   UWAGA: Jeśli nie pojawi się przycisk Start, oznacza to, że połączenie z instrumentem zostało utracone. Wybierz Instrument z menu w lewym górnym rogu, a następnie Połącz. Powinno pojawić się wyskakujące okienko z numerem seryjnym instrumentu; wybierz tę opcję, a następnie kliknij przycisk Połącz. Powinien teraz pojawić się przycisk Start.
8. Po zakończeniu biegu wyrzuć płytkę. Wyjmij wkład i umieść go w pojemniku na ostre przedmioty w celu usunięcia, wraz z igłami, które mogły zostać użyte do przebijania bąbelków. Pozostaw zasilanie włączone, aby uniknąć problemów z połączeniem, jeśli instrument jest używany regularnie (np. co najmniej raz w tygodniu).

7. Analiza eksperymentu

1. Przed analizą upewnij się, że przeprowadzono następujące kontrole jakości.
   1. Sprawdź wzorce fluorescencyjne, wybierając ikonę "Pokaż standardy". Sprawdź, czy standardy są poprawnie zidentyfikowane w zakładce "Widok wykresu". Jeśli są nieprawidłowe, przejdź do ikony "Pojedynczy widok", kliknij prawym przyciskiem myszy na właściwy szczyt i wybierz "Wymuś standard" lub kliknij prawym przyciskiem myszy na niewłaściwy szczyt i wybierz "Nie jest standardem". Wykonaj tę kontrolę dla każdej nowej kapilary.
   2. Sprawdź drabinę biotynylową, klikając ikony "Próbki" i "Pojedynczy widok". Wybierz drabinę w zakładce eksperymentu. Jeśli szczyt zostanie nieprawidłowo zidentyfikowany, kliknij go prawym przyciskiem myszy w "Widoku wykresu" i wybierz "Usuń szczyt".
      UWAGA: Na przykład drabina biotynylowa używana w zestawie 12 - 230 kDa powinna pokazywać szczyty rozmiaru 12, 40, 66, 116, 180 i 230 kDa. Jeśli ten krok nie zostanie wykonany, wielkość pików próbki zostanie nieprawidłowo obliczona, co spowoduje fałszywe wyniki.
   3. Wyświetlanie i analizowanie pików próbek. Uzyskaj dane z tabeli pików, w tym masę cząsteczkową, obszar piku, wysokość piku i sygnał do szumu (S/N), zgodnie z potrzebami do obliczeń eksperymentalnych.

Czas ekspozycji - Określanie wypalenia sygnału

Wypalenie sygnału może wystąpić, gdy podłoże luminolu i nadtlenku wyczerpuje się zbyt szybko. Można to ustalić, analizując dane przy różnych czasach ekspozycji na chemiluminescencję. W oprogramowaniu do analizy przejdź do "Edytuj -> Analiza -> Obrazy". Czas naświetlania wynosi od 5 do 480 s. Oś y w elektroferogramie informuje o sygnale/czasie, więc dane z każdej ekspozycji powinny mieć podobny współczynnik sygnał/czas. Współczynnik ten zmniejsza się wraz z sekwencyjnymi dłuższymi ekspozycjami, jeśli luminol zostanie wyczerpany, jak widać w przypadku przeciwciała p53 DO-1 (Rysunek 2). Ze względu na zubożenie substratu, test ten można uznać za mierzalny do stężenia 0,2 μg/μl tylko przy ekspozycji 5 - 30 s. Dlatego w tym przykładzie 15 s określono jako optymalny czas ekspozycji na analizę danych dla p53.

Miareczkowanie lizatu - Wyznaczanie liniowego zakresu dynamiki

Ważne jest, aby pomiary były wykonywane w liniowym zakresie dynamiki każdego testu, gdzie zmiany sygnału mierzone przez obszar piku są proporcjonalne do zmian ilości białka w próbce. Stosując optymalny czas ekspozycji wynoszący 15 s wybrany w poprzednim rozdziale, wykazano liniowość testu zarówno dla p53, jak i ɑ-tubuliny w ponad 15-krotnym zakresie stężeń (Rysunek 3). Z naszego doświadczenia wynika, że wartość R2 wynosząca >0,9 dopasowania regresji liniowej jest uważana za akceptowalną dla zakresu rozcieńczeń oczyszczonego białka o znanej ilości (jeśli test jest bezwzględnym pomiarem ilościowym) lub lizatu próbki nieznanego białka docelowego (jeśli test jest względnym pomiarem ilościowym).

Optymalizacja rozcieńczania przeciwciał

Używanie przeciwciał przy nasyconych stężeniach pomaga zapewnić, że wszelkie mierzone zmiany sygnału są spowodowane tylko zmianami w ilości białka. Jako demonstrację, dwa ekstrakty z całych komórek linii komórkowej BEAS-2B (0,2 μg / μL całkowitego białka załadowanego do testu) zostały zbadane z seryjnie rozcieńczonymi stężeniami przeciwciał ɑ-tubuliny w zakresie od 1:25 do 1:800 (Rysunek 4). Sygnał chemiluminescencyjny (w tym przypadku mierzony jako powierzchnia piku) został wykreślony w stosunku do rozcieńczenia przeciwciała. Nasycenie zaobserwowano w pobliżu rozcieńczenia 1:50, gdzie krzywa zaczyna się zauważalnym plateau.

Próba eksperymentalna - leczenie doksorubicyną w komórkach BEAS-2B

Korzystając z optymalnych warunków testowych, hodowla komórkowa BEAS-2B była traktowana trzema różnymi stężeniami doksorubicyny (1,2, 1,8 i 2,4 μg/ml) przez 4 godziny (Rysunek 5, Tabela 1). Aktywacja p53 poprzez modyfikacje potranslacyjne pośredniczy w kilku reakcjach komórkowych, w tym w zatrzymaniu cyklu komórkowego, starzeniu się i apoptozie12. W szczególności fosforylacja seryny 15 została przypisana transkrypcyjnej aktywacji p53, co spowodowało apoptozę po leczeniu doksorubicyną13. W tej demonstracji znormalizowane obszary pików ɑ-tubuliny są przedstawione jako fałd kontroli. Co ciekawe, po 4 godzinach ekspozycji na doksorubicynę zaobserwowano 3,5 do 4-krotny wzrost fosforylacji p53 przy serynie 15 i 2-krotny wzrost poziomu fosforylacji p53 przy serynie 20. Wyniki te wskazują na aktywację p53; Nie obserwuje się jednak zależności między dawką a wybraną reakcją dla wybranych stężeń (i odwrotnie, najniższa badana dawka wywołała najwyższą odpowiedź). Całkowita wartość p53 nie wykazała wyraźnej odpowiedzi na leczenie w tym systemie modelowym. Wcześniej zaobserwowaliśmy aktywację fosforylacji p53 przy braku zwiększonych poziomów całkowitego p53 w podobnych warunkach w komórkach BEAS-2B traktowanych14.

Rysunek 2. Porównanie obrazu ekspozycji w celu wykrycia przepalenia sygnału. Widoki pasa ruchu pokazują malejące stężenia białka dla lizatów BEAS-2B badanych przeciwciałem p53 DO-1 w rozcieńczeniu 1:500. Współczynniki sygnału chemiluminescencji, podawane jako wysokości pików w oprogramowaniu przyrządu, są nakładane na siebie. W przeciwieństwie do wysokości szczytów, intensywność pasma wizualnego jest automatycznie generowana i dostosowywana przez instrument, aby ułatwić oglądanie pasm i nie jest porównywalna z jednego panelu do drugiego. Zwróć uwagę na spadek sygnału chemiluminescencji wraz ze wzrostem czasu ekspozycji, przy czym sygnał zaczyna zanikać (split peak) przy dwóch najdłuższych ekspozycjach, co wskazuje na wyczerpanie substratu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Miareczkowanie lizatu pokazujące widoki pasa ruchu. Miareczkowanie lizatu pokazujące widoki pasa ruchu (A) lizatu BEAS-2B podczas sondowania za pomocą 1:500 p53 DO-1 lub 1:50 ɑ-tubuliny. W przeciwieństwie do wartości powierzchni pików, natężenia pasma wizualnego są automatycznie generowane i dostosowywane przez instrument, aby ułatwić oglądanie pasm i nie są porównywalne między panelami. Analiza regresji liniowej (B) potwierdza, że testy są liniowe w całym badanym zakresie, od 0,01 do 0,20 μg/μL i od 0,025 do 0,40 μg/μL, z wartościami R2 wynoszącymi odpowiednio 0,999 i 0,985. Całkowite stężenia białka w środku zakresu liniowego zostały wybrane tak, aby uwzględnić potencjalną zmienność białka docelowego w dowolnym kierunku (np. 0,2 μg/μL dla α-tubuliny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Krzywe rozcieńczenia przeciwciał α-tubuliny dla dwóch oddzielnych lizatów białka BEAS-2B z normalizacją wyjściową i bez niej. Wyraźne odejście od liniowości obserwuje się przy rozcieńczeniu 1:50 (0,02), co wskazuje na nasycenie. W związku z tym wybrano 1:50 jako optymalne rozcieńczenie dla tego przeciwciała. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Wpływ 4-godzinnego leczenia doksorubicyną (DXN) na całkowitą i fosforylowaną serynę ekspresję białka p53 w komórkach BEAS-2B. Obszary pików są normalizowane do α-tubuliny i wykreślane jako fałd kontrolny (CTL). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Wpływ 4-godzinnego leczenia doksorubicyną (DXN) na całkowitą i fosforylowaną serynę ekspresję białka p53 w komórkach BEAS-2B. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Niniejszy manuskrypt został zrecenzowany przez Narodowe Laboratorium Badań nad Skutkami Zdrowia i Środowiska i zatwierdzony do publikacji. Treść niekoniecznie odzwierciedla poglądy Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (EPA), a wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.