Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.
Artykuł metodologiczny
Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nowe technologie wykorzystujące kapilarne testy immunologiczne obiecują szybszą i bardziej ilościową ocenę białek w porównaniu do tradycyjnych testów immunologicznych. Jednak, podobnie jak w przypadku innych testów białkowych opartych na przeciwciałach, optymalizacja parametrów testu immunologicznego opartego na naczyniach włosowatych, takich jak stężenie białka, rozcieńczenie przeciwciał i czas ekspozycji, jest ważnym warunkiem wstępnym do uzyskania znaczących i wiarygodnych danych. Pomiary muszą mieścić się w liniowym zakresie testu, w którym zmiany sygnału są wprost proporcjonalne do zmian stężenia lizatu. Przedstawiono tutaj proces doboru odpowiednich stężeń lizatu, rozcieńczeń przeciwciał i czasów ekspozycji w ludzkiej linii komórkowej nabłonka oskrzeli, BEAS-2B. Liniowość testu wykazano w zakresie stężeń białek ekstraktu z całych komórek z przeciwciałami przeciwko p53 i α-tubulinie. Przykładem wypalenia sygnału jest obserwowanie przy najwyższych stężeniach przy długich czasach ekspozycji, a krzywa rozcieńczenia przeciwciał α-tubulina wykazuje nasycenie. Ponadto przedstawiono przykładowe wyniki eksperymentalne dla komórek poddanych działaniu doksorubicyny przy użyciu zoptymalizowanych parametrów.
Wprowadzenie
Kapilarne elektroforetyczne testy immunologiczne mierzą ekspresję białek w lizatach komórkowych za pomocą systemów separacji wielkości lub ładunków i zapewniają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi testami immunologicznymi. Na przykład, w porównaniu z western blot, zautomatyzowana procedura oparta na naczyniach włosowatych eliminuje potrzebę stosowania żeli, urządzeń transferowych i ręcznego mycia. Ponadto bezwzględna wymagana ilość białka jest około 10 razy mniejsza, co sprawia, że systemy oparte na naczyniach włosowatych są idealne do stosowania z rzadkimi typami komórek lub ograniczoną próbką1,2. Wyniki uzyskuje się w ciągu zaledwie 3 godzin przy użyciu zautomatyzowanych systemów i wcześniej wykazano, że są one bardziej ilościowe i powtarzalne niż konwencjonalne procedury western blot3,4,5. Proces oznaczania opartego na wielkości polega na ładowaniu próbek zawierających dodecylosiarczan sodu (SDS), ditiotreitol (DTT) i znakowane fluorescencyjnie markery masy cząsteczkowej do kolumn kapilarnych zawierających matryce do układania w stosy i separacji. Napięcie przyłożone do naczyń włosowatych oddziela białka w próbkach według wielkości, a światło UV unieruchamia oddzielone białka do ściany naczyń włosowatych. Kapilara jest następnie badana immunologicznie za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego specyficznego dla celu i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP). Luminol i nadtlenek katalizują wytwarzanie światła chemiluminescencyjnego, które jest mierzone przez kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) i analizowane w celu ilościowego określenia białka.
Pomimo względnej łatwości i szybkości zautomatyzowanej platformy do elektroforetycznego testu immunologicznego opartego na kapilarach, optymalizacja warunków testu, takich jak stężenie białka, rozcieńczenie przeciwciał i czas ekspozycji, jest ważna dla uzyskania dokładnych, powtarzalnych wyników. Ogólnie rzecz biorąc, należy wykonać następujące procedury w celu optymalizacji testu dla tych systemów:
1) Należy przeprowadzić badanie przesiewowe w celu oceny i wyboru przeciwciał pod kątem sygnału i swoistości dla docelowego białka. Jeśli to możliwe, do oceny swoistości można użyć oczyszczonego białka lub epitopu docelowego; Jednak nadal ważne jest, aby ocenić potencjalny sygnał niespecyficzny w całkowitym białku pochodzącym z systemu modelowego.
2) Następnie należy określić zakres dynamiczny testu. W idealnej sytuacji obserwuje się podwojenie sygnału (mierzone za pomocą powierzchni piku) wraz ze podwojeniem stężenia próbki; Jednak w praktyce proporcjonalna zmiana sygnału wejściowego w przewidywalny sposób (np. dopasowanie liniowe) jest wystarczająca do ilościowego określenia białka. Dodatkowo, ta optymalizacja zdefiniuje stężenie białka o wysokim sygnale, ale nadal w zakresie liniowym dla modelu eksperymentalnego.
3) Określ optymalne stężenie przeciwciał za pomocą stałego stężenia białka wybranego w kroku optymalizacji 2. Wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał sygnał nasila się, aż do osiągnięcia stabilizacji przy nasyceniu. Stężenie przeciwciał bliskie temu poziomowi nasycenia jest wymagane do dokładnego pomiaru stężenia białka.
Proces używany do optymalizacji stężeń białek, rozcieńczeń przeciwciał i czasów ekspozycji dla automatycznego testu wielkości na podstawie kapilarnej6 jest demonstrowany przy użyciu ekstraktów z całych komórek wyizolowanych z BEAS-2B, transformowanej przez SV-40 ludzkiej linii komórkowej nabłonka oskrzeli. Izolację białek z ekstraktów komórkowych lub tkankowych można przeprowadzić przy użyciu wielu opublikowanych protokołów7,8,9 i nie będzie tutaj omawiane. Wyniki eksperymentu próbnego z wykorzystaniem zoptymalizowanych warunków są również przedstawiane dla całkowitej i ufosforylowanej (seryna 15, seryna 20) p53 w kulturach wystawionych na działanie doksorubicyny (powszechnego środka chemioterapeutycznego, który indukuje apoptozę komórek10) w stężeniu 1,2, 1,8 i 2,4 μg/ml przez 4 godziny przed zbiorem. Obszary pików p53 są znormalizowane do ɑ-tubuliny, która jest używana jako kontrola obciążenia.
Protokół
UWAGA: Należy upewnić się, że wszystkie odczynniki i próbki zostały przygotowane zgodnie z protokołem producenta opisanym poniżej. Podczas wykonywania tej procedury należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki nitrylowe, fartuch laboratoryjny, obuwie z zamkniętymi palcami oraz okulary ochronne. Tabela ze szczegółowym wykazem wymaganych materiałów, odczynników i sprzętu została podana osobno. Całkowite stężenie białka w próbkach powinno zostać wcześniej określone przy użyciu uznanych metod kompatybilnych z zastosowanym buforem do lizy, takich jak metoda Bradforda11.
1. Przygotowanie próbek i odczynników z zestawu standardowego dostarczonego przez producenta
- Aby przygotować 400 mM roztwór roboczy ditiotreitolu (DTT), dodaj 40 µL wody dejonizowanej do przezroczystej probówki zawierającej dostarczony przez producenta roztwór zapasowy. Ważne jest, aby unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do roztworu, mieszając go poprzez powolne i delikatne pipetowanie.
- Dodaj 20 µL 10X buforu do próbek oraz 20 µL przygotowanego 400 mM roztworu DTT do różowej probówki zawierającej fluorescencyjną 5X mieszaninę Master Mix (zob. Tabelę materiałów).
UWAGA: Master Mix (MM) jest zapieczętowany przez producenta folią, którą należy przebić końcówką pipety. Mieszaj delikatnie, powolnym pipetowaniem, aby uniknąć rozpryskiwania DTT w pipecie. - Następnie dodaj 16 µL wody dejonizowanej, 2 µL dostarczonego 10X buforu do próbek oraz 2 µL przygotowanego 400 mM roztworu DTT do białej probówki z biotynilowaną drabiną dostarczoną przez producenta. Wymieszaj delikatnie i przenieś do probówki 0,6 mL w celu denaturacji.
- Przygotuj 0,1x bufor do próbek, rozcieńczając dostarczony roztwór 10X z wodą w stosunku 1:100. Przygotuj wystarczającą ilość 0,1x buforu do próbek, aby rozcieńczyć wszystkie próbki.
- Oblicz ilość 0,1x buforu do próbek dodawanego do próbki, co będzie zależeć od pożądanej końcowej koncentracji całkowitego białka. Wymieszaj 1 część fluorescencyjnego 5x MM z 4 częściami rozcieńczonej próbki, aby uzyskać pożądane końcowe stężenie białka.
- Oblicz objętości w następujący sposób: (i) Objętość 5x fluorescencyjnego MM = (Pożądane końcowe stężenie białka)/5; (ii) Objętość roztworu zapasowego białka = (Pożądane końcowe stężenie białka x Całkowita wymagana objętość)/ Stężenie roztworu zapasowego białka; (iii) Objętość 0,1x buforu do próbek = Objętość całkowita - objętość 5x MM - objętość roztworu zapasowego białka.
2. Denaturacja próbek i drabinki
- Umieść przygotowane próbki oraz biotynilowany marker wielkości w 95 °C podgrzewać w bloku grzejnym przez 5 min. Probiówki należy niezwłocznie wymieszać w wstrząsaczu vortex po inkubacji, odwirować przez ok. 5 s w wirówce stołowej, a następnie umieścić na lodzie.
UWAGA: Niektóre białka mogą wymagać łagodniejszych warunków denaturacji (np., 70 o(np. 4°C przez 10 min), aby zapobiec agregacji białek i poprawić ich migrację w matrycy kapilarnej. Należy rozważyć tę opcję w przypadku wystąpienia intensywnego rozmycia w obszarze wyższych mas cząsteczkowych (patrz przykład w materiale wideo).
3. Przygotowanie przeciwciał
- Zgodnie z wynikami optymalizacji (patrz: Reprezentatywne wyniki oraz film), przygotuj odpowiednie rozcieńczenie(ia) przeciwciała pierwszorzędowego (np. 1:50, 1:100) w dostarczonym rozcieńczalniku Antibody Diluent 2.
UWAGA: Przeciwciała w immunometrycznych testach kapilarnych są zazwyczaj stosowane w wyższych stężeniach niż w tradycyjnym western blottingu. Dostarczone przeciwciało drugorzędowe jest gotowe do użycia bez rozcieńczania.
4. Przygotowanie luminolu-S i nadtlenku
- Przygotować mieszaninę luminolu-S i nadtlenku w stosunku 1:1.
- Wymieszać za pomocą wibratora typu Vortex i przechowywać w lodzie.
UWAGA: Ważne jest, aby mieszaninę tę przygotowywać na świeżo do każdego badania eksperymentalnego. Do przeprowadzenia pełnej płytki wymagane jest łącznie 250ul mieszaniny.
5. Przygotowanie płytki do analizy
- Zgodnie z Rysunkiem 1, nanieś przygotowane wcześniej próbki i odczynniki na płytkę do testu. Szczegółowe instrukcje dla każdego rzędu znajdują się poniżej. Aby zminimalizować parowanie z dołków, upewnij się, że pokrywka płytki jest nakładana pomiędzy kolejnymi dodaniami odczynników.
- W rzędzie A pipetuj 5 µL Biotinylated Ladder do dołka A1. W pozostałych dołkach rzędu, od A2 do A25, pipetuj przygotowane próbki (po 5 µL każda).
UWAGA: Jest niezbędne, aby dołek A1 zawsze zawierał drabinę (ladder), ponieważ pierwsza kapilara w kartridżu jest zoptymalizowana pod kątem analizy tego standardu. - W rzędzie B pipetuj 10 µL Antibody Diluent 2 do każdego dołka (B1-B25).
- W rzędzie C pipetuj 10 µL Antibody Diluent 2 do dołka C1. W pozostałych dołkach rzędu C pipetuj 10 µL przeciwciała pierwszorzędowego (dołki C2-C25).
- W rzędzie D pipetuj 10 µL Streptavidin-HRP do dołka D1. W pozostałych dołkach rzędu D pipetuj 10 µL przeciwciała drugorzędowego (dołki D2-D25).
- W rzędzie E pipetuj 10 µL świeżo przygotowanej mieszaniny luminolu i nadtlenku do każdego dołka (E1-E25).
- Na koniec dodaj 500 µL buforu płuczącego na komorę do każdego z trzech górnych rzędów dołków z buforem.
UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza poprzez delikatne pipetowanie i nieodtłuszczanie całkowicie końcówki z ostatniej objętości, ponieważ pęcherzyki mogą zakłócić załadunek kapilarny i przebieg analizy. - Po załadowaniu wszystkich dołków wiruj płytkę przy ~1000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć pęcherzyki powietrza i upewnić się, że ciecz znajduje się na dnie dołków. Przebij widoczne pęcherzyki małym końcem pipety lub czystą igłą (np. sterylną igłą "rep top" o rozmiarze 25 G).
Rycina 1. Schemat pipetowania dla płytki testowej. Kodowanie kolorystyczne reprezentuje odpowiednie odczynniki i próbki (łącznie do 24) dodawane do płytki testowej. Do dołka A1 należy dodać biotynylioną drabinę (pomarańczowy), do dołków od A2 do A25 przygotowane próbki (jasnoniebieski), do dołków B1-B25 oraz C1 rozcieńczalnik przeciwciał Antibody Diluent 2 (jasnozielony), do dołków od C2 do C25 przeciwciało pierwotne (niebieski), do dołka D1 streptawidynę-HRP (ciemnoróżowy), do dołków od D2 do D25 przeciwciało wtórne (ciemnozielony) oraz do dołków od E1 do E25 mieszaninę luminolu z nadtlenkiem (fioletowy). Bufor do mycia jest dodawany do trzech pierwszych rzędów większych dołków w środkowej części płytki (ciemnoniebieski). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
6. Uruchamianie instrumentu do kapilarnego immunoanalizy
- Upewnij się, że instrument oraz dołączony komputer są włączone. Nie jest wymagany czas rozgrzewania.
- Otwórz oprogramowanie instrumentu na komputerze. Najpierw wybierz zakładkę „Assay” po prawej stronie okna, a następnie „New Assay” w menu „File Menu” po lewej stronie. Wybierz wielkość, zakres wielkości (np. 12-230 kDa) oraz typ kartridża ( np. 25 capillary), które zostały użyte w danym badaniu.
UWAGA: Jeśli jest to pożądane, można również wprowadzić parametry badania, w tym stężenie białka, typ przeciwciała i rozcieńczenie, ale nie są one wymagane do rozpoczęcia badania. - Otwórz drzwiczki instrumentu, naciskając przycisk na górze pomarańczowego panelu.
- Ostrożnie wyjmij kartridż kapilarny z opakowania. Nie dotykając szklanych kapilar, umieść kartridż w uchwycie na kartridże. Zweryfikuj poprawność osadzenia kartridża, obserwując zmianę koloru światła wewnętrznego z pomarańczowego na niebieski.
- Mocno przytrzymaj płytkę na blacie i ostrożnie odlej uszczelkę przeciwparującą z dolnej części płytki. Przebij wszystkie zauważone pęcherzyki w studzienkach z macierzą separacyjną za pomocą małego końcówki pipety lub czystej igły (np. sterylnej igły „rep top” 25 gauge).
- Umieść płytkę do badania w uchwycie na płytki, upewniając się, że jest ona całkowicie osadzona, a następnie zamknij drzwiczki instrumentu.
- Kliknij przycisk „Start” w oprogramowaniu.
UWAGA: Jeśli przycisk Start się nie pojawia, oznacza to utratę połączenia z instrumentem. Wybierz Instrument z menu w lewym górnym rogu, a następnie Connect. Powinno pojawić się okno pop-up z numerem seryjnym instrumentu; wybierz go, a następnie kliknij Connect. Przycisk Start powinien teraz być widoczny. - Po zakończeniu analizy zutylizuj płytkę. Wyjmij kartridż i umieść go w pojemniku na odpady ostre wraz z wszelkimi igłami, które mogły zostać użyte do przebijania pęcherzyków. Pozostaw urządzenie włączone, aby uniknąć problemów z połączeniem, jeśli instrument jest używany regularnie (np. przynajmniej raz w tygodniu).
7. Analiza eksperymentu
- Przed przystąpieniem do analizy należy upewnić się, że wykonano następujące kontrole jakości.
- Zweryfikuj standardy fluorescencyjne, wybierając ikonę „Show Standards”. Sprawdź, czy standardy są prawidłowo zidentyfikowane w zakładce „Graph View”. W przypadku błędnej identyfikacji przejdź do ikony „Single View”, kliknij prawym przyciskiem myszy na prawidłowy pik i wybierz opcję „Force Standard” lub kliknij prawym przyciskiem myszy na błędny pik i wybierz „Not a Standard”. Przeprowadź tę kontrolę dla każdej nowej kapilary.
- Zweryfikuj biotynilowaną drabinę molekularną, klikając ikony „Samples” oraz „Single View”. Wybierz drabinę w zakładce eksperymentu. Jeśli pik został błędnie zidentyfikowany, kliknij go prawym przyciskiem myszy w „Graph View” i wybierz „Remove Peak”.
UWAGA: Na przykład biotynilowana drabina używana do zestawu 12 - 230 kDa powinna wykazywać piki określające wielkość 12, 40, 66, 116, 180 oraz 230 kDa. Jeśli ten krok zostanie pominięty, wielkość pików próbek zostanie obliczona nieprawidłowo, co doprowadzi do uzyskania błędnych wyników. - Przejrzyj i przeanalizuj piki próbek. Pobierz z tabeli pików dane niezbędne do obliczeń eksperymentalnych, w tym masę cząsteczkową, pole powierzchni piku, wysokość piku oraz stosunek sygnału do szumu (S/N).
Wyniki
Czas ekspozycji- Określanie nasycenia sygnału
Wypalenie sygnału może wystąpić, gdy podłoże z luminolem i nadtlenkiem zostanie zbyt szybko wyczerpane. Można to ustalić, analizując dane dla różnych czasów ekspozycji chemiluminescencyjnej. W oprogramowaniu analitycznym należy przejść do sekcji „Edit -> Analysis -> Images”. Czasy ekspozycji obejmują zakres od 5 do 480 s. Oś y na elektroferogramie wskazuje stosunek sygnału do czasu, zatem dane z każdej ekspozycji powinny wykazywać podobny współczynnik sygnału/czasu. Współczynnik ten maleje wraz z kolejnymi, dłuższymi ekspozycjami, jeśli luminol ulega wyczerpaniu, co zaobserwowano w przypadku przeciwciała p53 DO-1 (Rysunek 2). Ze względu na wyczerpywanie się podłoża, w tym badaniu stężenie do 0,2 µg/µL można uznać za mierzalne jedynie przy ekspozycjach od 5 do 30 s. W związku z tym, w tym przykładzie, czas ekspozycji wynoszący 15 s został określony jako optymalny dla analizy danych p53.
Miareczkowanie lizatu - Określanie liniowego zakresu dynamicznego
Ważne jest, aby pomiary były wykonywane w zakresie liniowości każdego testu, w którym zmiany sygnału mierzone jako pole powierzchni piku są proporcjonalne do zmian ilości białka w próbce. Przy zastosowaniu optymalnego czasu ekspozycji wynoszącego 15 s, wybranego w poprzedniej sekcji, wykazano liniowość testu zarówno dla p53, jak i ɑ-tubuliny w zakresie stężeń przekraczającym 15-krotność (Rycina 3). Z naszego doświadczenia wynika, że wartość R2 >0,9 dla dopasowania regresji liniowej jest uważana za akceptowalną dla zakresu rozcieńczeń oczyszczonego białka o znanej ilości (jeśli test jest pomiarem ilościowym bezwzględnym) lub lizatu próbki o nieznanej ilości białka docelowego (jeśli test jest pomiarem ilościowym względnym).
Optymalizacja rozcieńczenia przeciwciał
Stosowanie przeciwciał w stężeniach nasycających pozwala upewnić się, że zmierzone zmiany sygnału wynikają wyłącznie ze zmian w ilości białka. W ramach demonstracji dwa ekstraкты z całych komórek linii komórkowej BEAS-2B (do analizy wprowadzono 0,2 µg/µL całkowitego białka) poddano analizie z użyciem seryjnie rozcieńczonych stężeń przeciwciał ɑ-tubulin w zakresie od 1:25 do 1:800 (Rysunek 4). Sygnał chemiluminescencyjny (tutaj mierzony jako pole powierzchni piku) wykreślono w funkcji rozcieńczenia przeciwciał. Nasycenie zaobserwowano w pobliżu rozcieńczenia 1:50, gdzie krzywa zaczyna wyraźnie osiągać plateau.
Próba eksperymentalna - leczenie doksorubicyną komórek BEAS-2B
Przy zastosowaniu zoptymalizowanych warunków testowych, hodowlę komórek BEAS-2B traktowano trzema różnymi stężeniami doksorubicyny (1,2, 1,8 i 2,4 µg/mL) przez 4 h (Rycina 5, Tabela 1). Aktywacja białka p53 poprzez modyfikacje potranslacyjne pośredniczy w kilku odpowiedziach komórkowych, w tym w zatrzymaniu cyklu komórkowego, starzeniu się komórek oraz apoptozie12. W szczególności fosforylacji seryny 15 przypisuje się aktywację transkrypcyjną p53, prowadzącą do apoptozy po traktowaniu doksorubicyną13. W niniejszym pokazie znormalizowane do ɑ-tubuliny pola pod pikami przedstawiono jako krotność wartości kontrolnej. Co ciekawe, po 4 h ekspozycji na doksorubicynę zaobserwowano 3,5- do 4-krotny wzrost fosforylacji p53 w serynie 15 oraz 2-krotny wzrost poziomu p53 ufosforylowanego w serynie 20. Wyniki te wskazują na aktywację p53; jednak w przypadku wybranych stężeń nie zaobserwowano zależności dawka-odpowiedź (wręcz przeciwnie, najniższa przetestowana dawka wywołała najsilniejszą odpowiedź). Całkowite p53 nie wykazało wyraźnej odpowiedzi na traktowanie w tym modelu systemowym. Wcześniej zaobserwowaliśmy aktywację fosforylacji p53 przy braku zwiększenia poziomu całkowitego p53 w podobnych warunkach w komórkach BEAS-2B traktowanych cynkiem14.
Rysunek 2. Porównanie obrazów ekspozycji w celu wykrycia wypalenia sygnału. Widoki ścieżek przedstawiają malejące stężenia białek w lizatach BEAS-2B analizowanych z użyciem przeciwciała p53 DO-1 w rozcieńczeniu 1:500. Na obrazy naniesiono współczynniki sygnału chemiluminescencyjnego, raportowane jako wysokości pików w oprogramowaniu urządzenia. W przeciwieństwie do wysokości pików, wizualna intensywność prążków jest generowana i korygowana automatycznie przez urządzenie w celu ułatwienia obserwacji prążków i nie jest porównywalna między poszczególnymi panelami. Należy zwrócić uwagę na spadek sygnału chemiluminescencyjnego wraz ze wzrostem czasu ekspozycji, przy czym sygnał zaczyna znikać (podzielony pik) przy dwóch najdłuższych ekspozycjach, co wskazuje na wyczerpanie substratu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3. Miareczkowanie lizatu przedstawiające widok ścieżek. Miareczkowanie lizatu przedstawiające widok ścieżek (A) lizatu BEAS-2B po inkubacji z przeciwciałami p53 DO-1 w rozcieńczeniu 1:500 lub ɑ-tubuliną w rozcieńczeniu 1:50. W przeciwieństwie do wartości pól pod pikami, wizualna intensywność prążków jest generowana i dostosowywana automatycznie przez instrument w celu ułatwienia obserwacji prążków i nie jest porównywalna pomiędzy poszczególnymi panelami. Analiza regresji liniowej (B) potwierdza, że testy są liniowe w całym badanym zakresie, od 0,01 do 0,20 µg/µL oraz od 0,025 do 0,40 µg/µL, przy wartościach R2 wynoszących odpowiednio 0,999 i 0,985. Wybrano całkowite stężenia białek w środku zakresu liniowego, aby uwzględnić potencjalną zmienność białka docelowego w obu kierunkach (np. 0,2 µg/µL dla α-tubuliny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 4. Krzywe rozcieńczeń przeciwciał α-tubuliny dla dwóch oddzielnych lizatów białkowych BEAS-2B z normalizacją i bez normalizacji linii bazowej. Wyraźne odejście od liniowości widoczne jest przy rozcieńczeniu 1:50 (0,02), co wskazuje na nasycenie. Dlatego rozcieńczenie 1:50 wybrano jako optymalne dla tego przeciwciała. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5.Wpływ 4-godzinnej inkubacji z doksorubicyną (DXN) na ekspresję całkowitego i fosforylowanego w serynie białka p53 w komórkach BEAS-2B. Pola powierzchni piku zostały znormalizowane względem α-tubuliny i przedstawione jako krotność w stosunku do kontroli (CTL). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1. Wpływ 4-godzinnej inkubacji z doksorubicyną (DXN) na ekspresję całkowitego i fosforylowanego po serynie białka p53 w komórkach BEAS-2B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.
Dyskusja
Od dziesięcioleci utrzymuje się zainteresowanie rozwojem kapilarnych metod immunologicznych opartych na elektroforetycznych metodach ze względu na niskie wydatki na próbki i odczynniki, skrócony czas przetwarzania w porównaniu z tradycyjnymi metodami oraz wysoką kompatybilność w celu automatyzacji procedury 4,15. Istnieje wiele różnych protokołów separacji białek, które wykorzystują kapilary, w tym metody elektroforetyczne, elektrokinetyczne, przesiewania polimerów i izoelektryczne, które izolują białka według różnych właściwości (odpowiednio ładunku elektrostatycznego, równowagi podziału, właściwości przesiewania matrycy rozdzielającej i pH)16. W tym miejscu opisujemy metodę elektroforezy kapilarnej opartej na przeciwciałach (lub teście immunologicznym), wykorzystującej separację polimerów przez przesiewanie, która została zautomatyzowana i komercyjnie przyjęta3. Zalety tego systemu obejmują łatwość użycia i obsługi, standaryzowane i dostępne na rynku odczynniki oraz niezawodne, czułe pomiary, które wymagają mniej odczynników i próbek w porównaniu z tradycyjnymi testami białkowymi, takimi jak western blot, test immunologiczny sprzężony z enzymami i inne formaty 3,4,5. W poprzednich ocenach tej technologii zauważono, że zakres wielkości białka, który można ocenić, był ograniczony przez dostępną matrycę separacji4, jednak ostatnie oferty rozszerzyły mierzalny zakres z 2 do 440 kDa17. Ponadto wiadomo, że niektóre lizatu są niezgodne z testem18, dlatego należy wcześniej rozważyć wybór zastosowanych odczynników doświadczalnych.
Główną zaletą zautomatyzowanej procedury z dostępnymi na rynku komponentami jest spójność wyników dzięki ustandaryzowanym metodom i odczynnikom. Minimalizuje to ryzyko niepowodzenia testu poprzez automatyzację krytycznych etapów procedury. Należy jednak pamiętać, że podczas protokołu należy przestrzegać pewnych praktyk, aby zminimalizować problemy z kapilarnym testem immunologicznym opartym na elektroforezie. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby mieszanina luminolu-S i nadtlenku była przygotowana na świeżo i bezpośrednio przed załadowaniem płyty. Konsekwentny czas spowoduje stałą luminescencję po dodaniu środka utleniającego, co spowoduje spójne pomiary dla konkretnego testu przeciwciała po teście. Ponadto ważne jest, aby używać odczynników nieprzeterminowanych, co przede wszystkim wpływa na siłę działania środka utleniającego. Ponadto ważne jest, aby ściśle przestrzegać kolejności ładowania próbek, przeciwciał i innych odczynników (patrz rysunek 1). Każdy odczynnik odpipetowany na miejscu spowoduje niepowodzenie testu i zmarnowany przebieg.
Oprócz tych krytycznych kroków, podstawowe problemy związane z tą techniką można generalnie przezwyciężyć poprzez optymalizację. Rzeczywiście, warunki te są specyficzne dla każdej kombinacji układ/przeciwciało i dlatego powinny być określane empirycznie dla każdego nowego testu. W tym artykule skupimy się na trzech typowych procedurach optymalizacyjnych: czasie ekspozycji, miareczkowaniu lizatu i rozcieńczaniu przeciwciał pierwotnych. Zdolność do generowania mierzalnych wyników zależy od analizy czasu ekspozycji, w którym podłoże luminolowe nie ulega szybkiemu wyczerpaniu, ponieważ zubożenie substratu powoduje utratę sygnału. Miareczkowanie lizatu określa liniowy zakres dynamiczny każdego testu, który może się różnić w zależności od różnych systemów modelowych, a także różnych przeciwciał, nawet dla tego samego docelowego białka. Rozcieńczenia przeciwciał wybrane w stężeniach nasyconych lub zbliżonych do nich zapewniają, że na zmiany sygnału nie będzie miał wpływu niedobór wolnego przeciwciała, a jedynie różna ilość dostępnego epitopu docelowego białka. Inne czynniki brane pod uwagę podczas procesu optymalizacji mogą obejmować czas inkubacji przeciwciał oraz czas układania w stosy/ładowania próbki. W większości przypadków domyślne ustawienia instrumentu zapewniają najlepszą równowagę między rozdzielczością a czułością. Jednak w niektórych przypadkach słabą rozdzielczość lub czułość można poprawić, dostosowując te parametry.
Kapilarne metody elektroforetyczne oparte na testach immunologicznych zapewniają szybkie, wydajne i powtarzalne pomiary białek. Chociaż metody te były wykorzystywane głównie w warunkach badawczo-rozwojowych, spójność tych technologii ma potencjalne zastosowanie w zastosowaniach regulacyjnych i klinicznych. Na przykład identyfikacja subpopulacji podatnych na toksyny środowiskowe lub pacjentów z progresją choroby może opierać się na biomarkerach białkowych mierzonych w dostępnych matrycach, takich jak krew, mocz i ślina. Wraz ze spadkiem kosztów odczynników i operacji oraz wzrostem liczby próbek i celów, które można jednocześnie ocenić, prawdopodobnie zobaczymy metody testów immunologicznych opartych na elektroforetycznych kapilarach w tego typu zastosowaniach.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Niniejszy manuskrypt został zrecenzowany przez Narodowe Laboratorium Badań nad Skutkami Zdrowia i Środowiska i zatwierdzony do publikacji. Treść niekoniecznie odzwierciedla poglądy Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (EPA), a wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Keithowi Tarpleyowi z zespołu graficznego i medialnego US EPA Office of Research and Development-Research Triangle Park (ORD-RTP) za rozwój, nagranie i edycję filmu instruktażowego. Chcielibyśmy również podziękować Deborah Pritchett z ProteinSimple za pomocne rozmowy dotyczące optymalizacji naszych danych. JM Guynn był wspierany przez Oak Ridge Institute for Science and Education Research/Participation Program przy Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
| P53 DO-1 przeciwciało pierwszorzędowe | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-126 | |
| Fosforylowane P53 (SER 15) Przeciwciało pierwotne | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9286 | |
| Fosforylowane p53 (SER 20) Przeciwciało pierwotne | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9287 | |
| Przeciwciało pierwotne alfa-tubuliny | Technologia sygnalizacji komórkowej | 3873 | używana jako kontrola obciążenia |
| Oprogramowanie Compass | ProteinSimple (Santa Clara, Kalifornia) | dostarczany z zestawem Wes | |
| 12-230 kDa Master | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (od tego czasu zastąpiony nowym zestawem #) | |
| www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | ZAWIERA CZĘŚĆ NR: Bufor do płukania (60 mL) 042-202 10X Bufor do próbek (440 μ L) 042-195 Wstępnie napełnione mikropłytki (8) PS-PP01 Wkłady kapilarne (8) PS-CC01 Rozcieńczalnik przeciwciał II (20 ml) 042-203 Luminol-S (1,5 mL) 042-233 Nadtlenek (1,5 ml) 042-234 Streptawidyna-HRP (132 μ L) 042-414 Pakiet standardowy (8): Biotynylowana drabinka, fluorescencyjna mieszanka główna 5X, naziemna telewizja cyfrowa i pusta probówka 0,6 ml PS-ST01 Przeciwciało wtórne przeciw królikowi 042-206 lub Wtórne przeciwciało przeciw myszach 042-205 | ||
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| Hodowla komórkowa, leczenie i zbiory (przy użyciu protokołów zalecanych przez dostawcę; protokoły nie są zawarte w rękopisie) | |||
| Komórki BEAS-2B | Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
| pożywka do wzrostu keratynocytów, KGM Gold | Lonza Ltd (Bazylea, Szwajcaria) | 192152 | do hodowli komórkowych |
| pożywka podstawowa keratynocytów, KBM Gold | Lonza Ltd (Bazylea, Szwajcaria) | 192151 | pożywka wolna od surowicy do dozowania chemicznego |
| doksorubicyna | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
| Testy Coomassie Blue Bradford | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | do oznaczania ilościowego białek |
| Zestaw ekstraktu jądrowego | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | służy do przygotowania lizatów |
| ZAWIERA: | |||
| Bufor do lizy AM1 | |||
| 1M ditiotreitol (DTT) | |||
| Koktajl | |||
| 10X PBS& nbsp; | |||
| fosfatazy |
Bibliografia
- Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. Hematopoietic stem cell protocols. 1185, Springer. (2014).
- Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways. Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).
- Chen, J. Q., et al. Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system. Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).
- Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. J Transl Med. 13, 182(2015).
- Liu, S., et al. The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized & Translational Medicine Research. J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).
- ProteinSimple Western. Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. J Vis Exp. (84), e51149(2014).
- Thorn, C. F., et al. Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects. Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. J Vis Exp. (38), (2010).
- Taira, N., Yoshida, K. Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets. Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).
- Thompson, T., et al. Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis. J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).
- Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells. PLoS One. 11 (5), e0155875(2016).
- Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
- Shintani, H. Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , 1, Springer. Netherlands. (1997).
- Wes reagents and consumables :: ProteinSimple. , https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html (2017).
- Simple Western Size Assay Buffer Compatibility. , http://www.proteinsimple.com/documents/SW_Buffer_Compatibility_Table_rev_D.pdf (2017).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Immunoanaliza z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnejsystem ProteinSimple Weszautomatyzowana elektroforeza kapilarnaoptymalizacja stężenia białkaoptymalizacja rozcieńczenia przeciwciałoptymalizacja czasu ekspozycjiliniowy zakres dynamicznyzapobieganie nasyceniu sygnałuekstrakt z całych komóreklinia komórkowa BEAS-2B
