Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) było jedną z metod wyboru do izolowania wzbogaconych populacji komórek rozrodczych jąder ssaków. Obecnie pozwala na dyskryminację do 9 populacji mysich komórek rozrodczych o wysokiej wydajności i czystości. Ta wysoka rozdzielczość w rozróżnianiu i oczyszczaniu jest możliwa dzięki unikalnym zmianom w strukturze i ilości chromatyny podczas spermatogenezy. Wzorce te można uchwycić za pomocą cytometrii przepływowej męskich komórek rozrodczych barwionych fluorescencyjnymi barwnikami wiążącymi DNA, takimi jak Hoechst-33342 (Hoechst). Poniżej znajduje się szczegółowy opis niedawno opracowanego protokołu izolacji komórek rozrodczych jąder ssaków. Krótko mówiąc, zawiesiny pojedynczych komórek są generowane z tkanki jąder przez dysocjację mechaniczną, podwójnie barwione Hoechstem i jodkiem propidyny (PI) i przetwarzane za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania szeregowego, obejmująca selekcję żywych komórek (PI ujemnych) o różnej zawartości DNA (intensywność Hoechsta), jest stosowana podczas sortowania FACS w celu rozróżnienia do 5 typów komórek rozrodczych. Należą do nich, przy odpowiedniej średniej czystości (określonej na podstawie oceny mikroskopowej): spermatogonia (66%), pierwotne (71%) i wtórne (85%) spermatocyty oraz spermatydy (90%), dalej podzielone na subpopulacje okrągłe (93%) i wydłużające (87%). Realizacja całego przepływu pracy jest prosta, pozwala na jednoczesną izolację 4 typów komórek za pomocą odpowiedniej maszyny FACS i może być wykonana w czasie krótszym niż 2 godziny. Ponieważ skrócenie czasu przetwarzania ma kluczowe znaczenie dla zachowania fizjologii komórek ex vivo, metoda ta jest idealna do dalszych wysokoprzepustowych badań biologii męskich komórek rozrodczych. Co więcej, ustandaryzowany protokół wielogatunkowego oczyszczania komórek rozrodczych ssaków eliminuje metodologiczne źródła zmiennych i pozwala na stosowanie jednego zestawu odczynników do różnych modeli zwierzęcych.
Wprowadzenie
Biorąc pod uwagę brak systemu in vitro reprezentatywnego dla progresji spermatogenezy oraz obecność dużej różnorodności komórkowej w jądrach, badania biologii męskich komórek rozrodczych wymagają solidnych technik izolowania wzbogaconych populacji określonych typów komórek. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest szeroko stosowane w tym celu 1,2,3,4,5, ponieważ zapewnia wysoką wydajność i czystość oraz przewyższa inne metody izolacji pod względem liczby typów komórek rozrodczych, kt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury opisane poniżej były zgodne z regulaminem Komitetu Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.
1. Przygotowania do protokołu dysocjacji mechanicznej
- Wstępnie zwilż jednorazowy wkład dezagregacyjny tkanek o grubości 50 μm w celu dysocjacji całego jądra myszy.
UWAGA: Ten jednorazowy wkład do dezagregacji tkanek zawiera mikroostrza przeznaczone do cięcia tkanek oraz nieruchomą stalową siatkę z około 100 sześciokątnymi otworami. Dostępne są różne rozmiary siatki do wkładu dezagregacji tkanek, aby dostosować ten protokół w oparciu o gatunki i pożądane typy komórek. Wk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zawiesiny pojedynczych komórek uzyskane z mechanicznej dysocjacji tkanki jądra
Rysunek 2 porównuje zawiesiny pojedynczych komórek uzyskane poprzez mechaniczną dysocjację tkanki jąder myszy w różnych warunkach. Próbki uzyskane z przetworzenia świeżej tkanki, niebarwione (Rysunek 2A) lub barwione Hoechstem (Rysunek 2B), wykazują obecność pojedyn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Biorąc pod uwagę wysoce konserwatywną dynamikę chromatyny podczas spermatogenezy u ssaków, celem tej pracy było opracowanie protokołu izolowania męskich komórek rozrodczych w różnych stadiach różnicowania z różnych tkanek jąder ssaków (ryc. 1). Jedną z głównych przeszkód w zastosowaniu jednego przepływu pracy do różnych modeli zwierzęcych jest potrzeba dostosowań specyficznych dla gatunku, zwłaszcza w odniesieniu do protokołów dysocjacji tkanek. Obecne metody opierają się głównie na enzymaty.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) za psie jądra; laboratorium Jasona Aranda i dr Teda Cicero na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis (WashU) za dostarczenie jąder szczurów oraz Brianne Tabers za pomoc w zbieraniu; Jared Hartsock i Dr. Salt's Lab w WashU dla jąder świnki morskiej; i dr Michael Talcott z Wydziału Medycyny Porównawczej w WashU za miniaturowe jądra świni. Autorzy dziękują również Alvin J. Siteman Cancer Center w Washington University School of Medicine i Barnes-Jewish Hospital w St. Louis, MO, za korzystanie z rdzenia cytometrii przepływowej Sitemana, który zapewniał usługę sortowania komórek obsługiwaną przez personel. Siteman....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldehyd | VWR | #15710 | 4% PFA, Do utrwalania posortowanych komórek |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System dysocjacji jąder |
| 1X zmodyfikowany Dulbecco Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, do dysocjacji jąder |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Wkład dezagregacyjny do dysocjacji jąder |
| Surowica bydlęca płodu | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, do kolekcji FACS |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, Do barwienia |
| FACS40 i mikro; m sitko do komórek | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | Do dysocjacji jąder |
| 100x 15 mm szalka Petriego | Falcon | #351029 | Do rozwarstwienia jądra |
| 5 ml polipropylenowe probówki okrągłodenne | Falcon | #352063 | Do pobierania FACS |
| 1,5 ml probówki Eppendorf | VWR | #20170-650 | Do pobierania FACS |
| 3 ml niepotrzebna strzykawka | BD Biosciences | #309657 | Do dysocjacji jąder |
| 50 ml rurka stożkowa | MIDSCI | Do dysocjacji jąder | |
| Propidium Jodek | Invitrogen | #L7011 | PI, Do barwienia FACS |
| Sortownik komórek MoFlo Legacy | Beckman Coulter | #ML99030 | Do |
| oprogramowania do sortowania komórek | Beckman Coulter | #ML99030 | Do soli fizjologicznej buforowanej fosforanem FACS |
| Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, Do mikroskopii | |
| Szkiełko mikroskopowe | Fisher Scientific | #12-544-4 | Do mikroskopii |
| Szkiełko nakrywkowe | szklane Fisher Scientific | #12-548-87 | Do mikroskopii |
| Jednorazowa pipeta transferowa (3 ml) | Samco Scientific | #225 | Do dysocjacji jąder |
| DNase I | Roche | #10104159001 | Do dysocjacji jąder |
| Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej | Miltex | #4-111 | Do rozwarstwienia jądra |
| Automatyczny licznik komórek Countess | Invitrogen | #C10227 | Do automatycznego liczenia komórek |
| Roztwór błękitu trypanowego (0,4%) | Sigma | #T8154 | Do barwienia żywotności |
Bibliografia
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
