Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55913

⸱

12 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Streszczenie

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) było jedną z metod wyboru do izolowania wzbogaconych populacji komórek rozrodczych jąder ssaków. Obecnie pozwala na dyskryminację do 9 populacji mysich komórek rozrodczych o wysokiej wydajności i czystości. Ta wysoka rozdzielczość w rozróżnianiu i oczyszczaniu jest możliwa dzięki unikalnym zmianom w strukturze i ilości chromatyny podczas spermatogenezy. Wzorce te można uchwycić za pomocą cytometrii przepływowej męskich komórek rozrodczych barwionych fluorescencyjnymi barwnikami wiążącymi DNA, takimi jak Hoechst-33342 (Hoechst). Poniżej znajduje się szczegółowy opis niedawno opracowanego protokołu izolacji komórek rozrodczych jąder ssaków. Krótko mówiąc, zawiesiny pojedynczych komórek są generowane z tkanki jąder przez dysocjację mechaniczną, podwójnie barwione Hoechstem i jodkiem propidyny (PI) i przetwarzane za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania szeregowego, obejmująca selekcję żywych komórek (PI ujemnych) o różnej zawartości DNA (intensywność Hoechsta), jest stosowana podczas sortowania FACS w celu rozróżnienia do 5 typów komórek rozrodczych. Należą do nich, przy odpowiedniej średniej czystości (określonej na podstawie oceny mikroskopowej): spermatogonia (66%), pierwotne (71%) i wtórne (85%) spermatocyty oraz spermatydy (90%), dalej podzielone na subpopulacje okrągłe (93%) i wydłużające (87%). Realizacja całego przepływu pracy jest prosta, pozwala na jednoczesną izolację 4 typów komórek za pomocą odpowiedniej maszyny FACS i może być wykonana w czasie krótszym niż 2 godziny. Ponieważ skrócenie czasu przetwarzania ma kluczowe znaczenie dla zachowania fizjologii komórek ex vivo, metoda ta jest idealna do dalszych wysokoprzepustowych badań biologii męskich komórek rozrodczych. Co więcej, ustandaryzowany protokół wielogatunkowego oczyszczania komórek rozrodczych ssaków eliminuje metodologiczne źródła zmiennych i pozwala na stosowanie jednego zestawu odczynników do różnych modeli zwierzęcych.

Wprowadzenie

Biorąc pod uwagę brak systemu in vitro reprezentatywnego dla progresji spermatogenezy oraz obecność dużej różnorodności komórkowej w jądrach, badania biologii męskich komórek rozrodczych wymagają solidnych technik izolowania wzbogaconych populacji określonych typów komórek. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest szeroko stosowane w tym celu 1,2,3,4,5, ponieważ zapewnia wysoką wydajność i czystość oraz przewyższa inne metody izolacji pod względem liczby typów komórek rozrodczych, które może zidentyfikować i wybrać 6,7,8. Zasada analizy cytometrii przepływowej opiera się na wykrywaniu różnicowych wzorów światła po wzbudzeniu wiązką laserową pojedynczych komórek. Gdy komórka przechodzi przez laser, odbija/rozprasza światło pod wszystkimi kątami, proporcjonalnie do wielkości komórki (rozproszenie do przodu; FSC) oraz do złożoności wewnątrzkomórkowej (rozproszenie boczne; SSC). Zobacz Ormerod 9, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat cytometrii przepływowej.

Męskie komórki rozrodcze przechodzą specyficzne modyfikacje w zawartości DNA, strukturze chromatyny, rozmiarze i kształcie na różnych etapach spermatogenezy. W ten sposób można zidentyfikować i rozdzielić odrębne populacje komórek, łącząc rozpraszanie światła i barwienie DNA barwnikami fluorescencyjnymi 10,11. Do tego celu można użyć kilku barwników (recenzowanych w Geisinger i Rodriguez-Casuriaga 3), takich jak Hoechst-33342 (Hoechst), który był często używany w analizie cytometrii przepływowej komórek jąder w ciągu ostatniej dekady 1,2,4,10,12. Po wzbudzeniu światłem UV Hoechst emituje niebieską fluorescencję proporcjonalną do zawartości DNA komórkowego, podczas gdy fluorescencja dalekiej czerwieni odzwierciedla zmienność struktury chromatyny i zagęszczenia 1,13,14. W rezultacie, męskie komórki rozrodcze w różnych stadiach różnicowania wykazują specyficzne wzorce podczas FACS zawiesin pojedynczych komórek barwionych Hoechstem (Ho-FACS; 1,12). Co ciekawe, ze względu na mechanizm wypływu barwnika, który jest aktywny tylko w fazie spermatogonialnej, intensywność niebieskiej fluorescencji Hoechst nie jest proporcjonalna do zawartości chromatyny w tych komórkach i grupują się one jako populacja boczna podczas Ho-FACS 15. Dodatkowo, połączenie barwienia Hoechst z nieprzepuszczalnym barwnikiem jodkiem propidyny (PI) pozwala użytkownikom na odróżnienie żywych (PI ujemnych) od martwych (PI dodatnich) komórek podczas FACS 1,2,10,12. Strategia ta była wcześniej stosowana w analizach cytometrycznych przepływowych komórek rozrodczych jąder i szeroko zoptymalizowana u myszy w celu rozróżnienia do 9 typów komórek rozrodczych, w tym komórek w 4 różnych stadiach mejozy I 1,2,4,16. Na potrzeby tej pracy barwienie Hoechst ma trzy główne zalety. Po pierwsze, Ho-FACS został z powodzeniem zastosowany do izolacji męskich komórek rozrodczych w modelu myszy 1,2,12 i innych gryzoni, takich jak szczury i świnki morskie 17,18,19. Po drugie, Hoechst jest barwnikiem przepuszczalnym dla komórek i nie wymaga przepuszczalności błony, dzięki czemu zachowuje integralność komórki. Wreszcie, nie jest wymagane leczenie RNazą, ponieważ Hoechst wiąże się preferencyjnie z sekwencjami DNA poli(d[AT]) 1,20, co oznacza, że RNA jest zachowane i oprócz DNA i białek może być wykorzystane do dalszych badań molekularnych różnicowania komórek rozrodczych.

Pomimo podobieństwa w ploidalności DNA i/lub barwielności obserwowanej w analizach cytometrii przepływowej gatunków ssaków (recenzowane w Geisinger i Rodriguez-Casuriaga 3), istnieje duża zmienność w opisanych protokołach izolacji męskich komórek rozrodczych za pomocą cytometrii przepływowej. W różnych badaniach stosowano określone protokoły dysocjacji tkanek i stosowano różne barwniki wiążące DNA (pojedynczo lub w połączeniu) oraz strategie bramkowania FACS w różnych organizmach modelowych, głównie myszach, szczurach i świnkach morskich. W związku z tym na bezpośrednie porównanie danych zebranych w odniesieniu do różnych gatunków mogą mieć wpływ nieuwzględnione artefakty techniczne wynikające ze zmienności między metodologiami. Co ważne, uderzająca zasada zachowania dynamiki chromatyny w trakcie spermatogenezy ssaków (2N-4N-2N-1N) sugeruje, że znormalizowany protokół może być poprzecznie stosowany do różnych gatunków ssaków.

Celem tego badania było opracowanie pojedynczego przepływu pracy, który ma zastosowanie do różnych gatunków ssaków, poprzez połączenie i dostosowanie wcześniej opublikowanych technik 2,20. Standaryzacja metody przetwarzania tkanek została osiągnięta poprzez przeprowadzenie dysocjacji mechanicznej w celu przezwyciężenia potrzeby specyficznych dla gatunku dostosowań wymaganych do trawienia enzymatycznego 5. Warto zauważyć, że wykazano, że mechaniczna dysocjacja tkanki jąder gryzoni działa lepiej niż enzymatyczne trawienie tkanek 20 i Ho-FACS zawiesin pojedynczych komórek generowanych obiema metodami wykazują porównywalne wyniki 5. Jako dowód zasadności, protokół ten opisuje ustawienia używane do izolowania do 5 populacji komórek rozrodczych: spermatogonia (SPG); spermatocyty pierwotne (SPC I) i wtórne (SPC II) oraz spermatydy (SPD) – okrągłe (rSPD) i wydłużające się (eSPD). Co ważne, jest łatwy do wdrożenia w laboratorium, a głównymi wymaganiami są system dysocjacji tkanek oraz dostęp do sortera komórek wyposażonego w laser UV. Ten przepływ pracy (Rysunek 1) jest szybki i prosty i umożliwia jednoczesną izolację 4 populacji komórek rozrodczych ze świeżej tkanki jąder w czasie krótszym niż 2 godziny. Skrócony czas przetwarzania ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności komórkowej dla dalszych procedur. Co więcej, jego pomyślne wyniki u 5 różnych gatunków sugerują, że może być szeroko stosowany w kladzie ssaków, co czyni go idealną metodą izolowania komórek rozrodczych do badań porównawczych biologii rozrodu samców ssaków.

Ten protokół składa się z trzech głównych sekcji, oprócz etapów przygotowawczych: (1) mechaniczna dysocjacja tkanki jądra i (2) barwienie komórek jąder za pomocą Hoechst i PI, a następnie (3) sortowanie odpowiednich komórek spermatogennych za pomocą FACS. Po zebraniu te wzbogacone populacje różnych komórek rozrodczych jąder ssaków mogą być wykorzystywane do szerokiego zakresu zastosowań. Protokół ten opisuje "uniwersalną" metodę dysocjacji w celu oczyszczenia męskich komórek rozrodczych z wielu różnych gatunków ssaków. W zależności od rodzaju badania, które użytkownicy chcą przeprowadzić z wyizolowanymi komórkami rozrodczymi, można użyć innych pożywek lub. Poniższe kroki protokołu służą do generowania zawiesin jednokomórkowych z jednego całego jądra myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane poniżej były zgodne z regulaminem Komitetu Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.

1. Przygotowania do protokołu dysocjacji mechanicznej

  1. Wstępnie zwilż jednorazowy wkład dezagregacyjny tkanek o grubości 50 μm w celu dysocjacji całego jądra myszy.
    UWAGA: Ten jednorazowy wkład do dezagregacji tkanek zawiera mikroostrza przeznaczone do cięcia tkanek oraz nieruchomą stalową siatkę z około 100 sześciokątnymi otworami. Dostępne są różne rozmiary siatki do wkładu dezagregacji tkanek, aby dostosować ten protokół w oparciu o gatunki i pożądane typy komórek. Wkłady 50 μm zastosowano dla wszystkich gatunków ssaków wymienionych w tej pracy.
    1. Załaduj 1 ml lodowatej czerwieni fenolowej 1x Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy Dulbecco na jednorazowy wkład dezagregacyjny 50 μm.
      UWAGA: Czerwień fenolowa może zakłócać wykrywanie czerwonej fluorescencji podczas FACS.
    2. Odessać 1x DMEM z wkładu dezagregacji tkanek za pomocą jednorazowej strzykawki bezigłowej o pojemności 3 ml z portu strzykawki.
  2. Włącz system dezagregacji tkanek, naciskając przycisk "ON". Ten system nie wymaga czasu na "rozgrzewkę".
  3. Wstępnie zwilż trzy jednorazowe filtry 40 μm lodowato zimnym 1x DMEM. Umieść każdy jednorazowy filtr 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Odpipetować 1 ml 1x DMEM i przepuścić płyn.
  4. Przygotować szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm do pobierania tkanek jąder. Odpipetować 500 μL 1x DMEM na szalkę Petriego.

2. Przygotowanie tkanki jąder do protokołu dysocjacji mechanicznej

  1. Przeprowadź sekcję samca myszy, aby ostrożnie usunąć świeże całe jądra lub fragmenty jąder (jeśli masz do czynienia z innymi gatunkami ssaków) za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
    UWAGA: Upewnij się, że tkanki są wolne od tłuszczu i martwicy. Świeże tkanki jąder generują lepszą jakość zawiesiny jednokomórkowej niż tkanki zamrożone.
    1. Przenieść zebrane jądra/fragmenty na przygotowaną szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierającą 500 μL 1x DMEM.
    2. Delikatnie spłucz tkankę w 1x DMEM, aby usunąć czerwone krwinki (jeśli są obecne).
  2. Ostrożnie usuń osłonkę białawą. Grubość osłonki białawej będzie się różnić u różnych gatunków.
    1. Chwyć jeden koniec jądra kleszczami.
    2. Nakłuj drugi koniec jądra skalpelem, nadal trzymając jeden koniec jądra kleszczami z poprzedniego kroku.
    3. Zeskrob kanaliki jądrowe za pomocą skalpela, nadal trzymając jeden koniec jądra kleszczami z kroku 2.2.1.
  3. Pokrój kanaliki jądrowe na kawałki o wielkości ~2-3 mm3 za pomocą skalpela.

3. Uzyskiwanie zawiesin jednokomórkowych przez mechaniczną dysocjację tkanki jąder

UWAGA: Opisane poniżej etapy dysocjacji dotyczą jądra jednej dorosłej myszy. Objętość tkanek jąder od młodych myszy lub gatunków innych niż mysie powinna być odpowiednio dostosowana. Młode zwierzęta mogą nie zawierać wszystkich stadiów komórek rozrodczych. Niektóre gatunki ssaków mają zmiany w składzie tkanki jąder w sezonach lęgowych w porównaniu z sezonem bez godów.

  1. Przenieś małe kawałki kanalików jądrowych do wstępnie zwilżonego wkładu dezagregacji tkanek 50 μm za pomocą kleszczy i dodaj 1 ml 1x DMEM.
  2. Załaduj wkład dezagregacji tkanek do systemu dezagregacji tkanek i przetwarzaj przez 5 minut, przekręcając pokrętło z trybu "czuwania" do trybu "pracy".
  3. Wyjąć wkład dezagregacji tkanek z systemu dezagregacji tkanek i odessać zawiesinę komórek za pomocą jednorazowej strzykawki bezigłowej o pojemności 3 ml z portu strzykawki.
    1. Zassać kilka razy, aby usunąć cały płyn z wkładu dezagregacji tkanek. Nie wszystkie z 1 ml mogą zostać odzyskane z wkładu dezagregacji tkanek.
  4. Przepuść zasysaną zawiesinę komórek przez dwa jednorazowe, wstępnie zwilżone filtry 40 μm. Przefiltruj dwukrotnie, aby usunąć wszelkie agregaty komórek.
    1. Umieść jeden wstępnie zwilżony filtr 40 μm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Bezpośrednio dodać zassane komórki ze strzykawki do filtra 40 μm. Zawiesina jednokomórkowa z przepustką pipety za pomocą pipety jednorazowej.
    2. Wyjmij zużyty, wstępnie zwilżony filtr 40 μm i umieść kolejny wstępnie zwilżony filtr 40 μm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Pobraną zawiesinę jednokomórkową należy pipetować na czysty filtr 40 μm.
    3. Zebrać przefiltrowaną zawiesinę jednokomórkową za pomocą czystej jednorazowej pipety.
  5. Pipetą przefiltrowaną zawiesinę komórek należy odpipetować z powrotem do wkładu dezagregacji tkanek o średnicy 50 μm i przetwarzać przez kolejne 5 minut w systemie dezagregacji tkanek.
  6. Odzyskaj cały płyn z wkładu dezagregacji tkanek.

4. Barwienie za pomocą Hoechst i jodku propidyny (PI)

  1. Przenieść zawiesinę odzyskanych komórek z wkładu dezagregacji tkanek 50 μm do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Odzyskane zostanie około 1-1,5 ml zawiesiny jednokomórkowej.
  2. Odzyskaną zawiesinę jednokomórkową podzielić na cztery probówki o pojemności 1,5 ml lub 5 ml.
    1. W przypadku pierwszych trzech probówek odpipetować 150 μl zawiesiny jednokomórkowej i odpipetować resztę zawiesiny jednokomórkowej do ostatniej z czterech probówek (około 550 μl zawiesiny jednokomórkowej).
      UWAGA: Ilość zawiesiny pojedynczej komórki w ostatniej probówce może się różnić w zależności od wydajności odzyskiwania zawiesiny komórkowej w kroku 3.6.
  3. Ustaw pierwszą probówkę z czterech probówek jako niezabarwioną kontrolę dla sesji FACS.
  4. Przygotować zawiesiny komórek barwione pojedynczym barwnikiem (PI lub Hoechst) jako kontrole. Dodać 2,5 μl Hoechst lub 1 μl PI do każdej probówki (drugiej i trzeciej).
  5. Przygotuj podwójnie zabarwioną tubę. Zostanie to wykorzystane do zbierania subpopulacji komórek rozrodczych. Dodać 2,5 μl Hoechst i 1 μl PI do ostatniej probówki.
    UWAGA: Hoechst ma okres przydatności do spożycia 2-3 miesiące. Użycie starszych zapasów barwnika spowoduje znaczne zmiany podczas sesji FACS.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Umieść próbki w rotatorze probówek lub odwracaj probówki o pojemności 1,5 ml co 5-10 minut.
  7. Zawiesinę komórek filtrować za pomocą wstępnie zwilżonego sitka o średnicy 40 μm i utrzymywać przefiltrowany roztwór na lodzie i w ciemności do sesji FACS.
    UWAGA: Etap filtracji jest niezbędny, aby zapobiec zbrylaniu się komórek dla FACS. Dodatkowo, leczenie DNazą (patrz Rysunek 1) lub solą dipotasową kwasu 2-naftolo-6,8-disulfonowego (NDA20) może być stosowane w celu ograniczenia zlepiania się komórek. Przedłużone okresy oczekiwania wpłyną na sygnał fluorescencyjny wykryty podczas FACS i mogą skutkować zwiększoną śmiercią komórek.

5. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) Konfiguracja i oczyszczanie komórek jąder

  1. Przygotuj probówki zbiorcze FACS.
    1. Pokryj 5 ml polipropylenowych probówek okrągłodennych lub probówek 1,5 ml 400 μl FBS do pobrania komórek. Zdekantować nadmiar FBS po nałożeniu powłoki.
    2. Dodaj pożywkę zbierającą FACS (1x DMEM + 10% Płodowa Surowica Bydlęca, FBS) do probówek: 1 ml dla probówek 5 ml lub 100 μL dla probówek 1,5 ml.
  2. Ustaw odpowiednie warunki sortowania w sortowniku komórek i oprogramowaniu.
    UWAGA: Inne maszyny do sortowania komórek i oprogramowanie analityczne mogą być używane z podobnymi strategiami konfiguracji i bramkowania opisanymi poniżej. Opisane tutaj warunki zostały zaadaptowane z Gaysinskaya i Bortvin 2, Geisinger i Rodriguez-Casuriaga 3 oraz Getun i inni.4
    1. Załaduj laser ultrafioletowy z filtrem pasmowo-przepustowym 463/25 nm, aby wykryć niebieski Hoechst i filtr pasmowy LP 680 nm do wykrywania czerwieni Hoechst i wykrywania PI.
    2. Użyj lustra dichroicznego 555DLP, aby odróżnić fluorescencję niebieską od czerwonej.
    3. Użyj dyszy 70 μm i sortuj komórki z szybkością 1000-2000 komórek/sekundę.
      UWAGA: Na wydajność sortowania bezpośredni wpływ ma natężenie przepływu. Wysokie natężenia przepływu (>3500 zdarzeń/s) zwiększają szybkość sortowania, ale powodują zanieczyszczenie populacji. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w odnośniku 12.
  3. Ustaw bramki przy użyciu próbek kontrolnych.
    1. Załadować i uruchomić niebarwioną próbkę.
    2. Wyklucz resztki komórek na podstawie wzoru wykresu FSC i SSC. Szczątki komórek pojawią się w lewym dolnym kwadrancie wykresu. Dowolnie ustaw próg dla resztek komórek przez użytkownika lub technika sortowania komórek.
    3. Bramka na pojedynczych komórkach poprzez dostosowanie progu dla FSC i szerokości impulsu. Różne sortery komórek mają różne sposoby rozróżniania singletów. Ponieważ szerokość impulsu odzwierciedla czas potrzebny komórkom na przejście przez laser, pojedyncze komórki mają niższe wartości w porównaniu z agregatami wielokomórkowymi. Dostosowanie progu na wykresie dla FSC w stosunku do szerokości impulsu może być użyte do wyboru dla singletów.
    4. Ustaw optymalne napięcia lampy fotopowielacza (PMT).
    5. Użyj zarówno komórek niebarwionych, jak i barwionych jednobarwnie, aby ustalić próg sygnału fluorescencji PI lub Hoechsta.
      UWAGA: Ważne jest, aby zoptymalizować podstawowe napięcia PTM dla interesujących ogniw w celu ustalenia odpowiedniego zakresu fluorescencji dla każdego barwnika. Ma to kluczowe znaczenie dla optymalnego wykrywania sygnału i czułości. Niebarwione i pojedynczo barwione komórki kontrolne są używane do ustalenia szeregu ujemnie i dodatnio barwionych komórek barwnikami PI i/lub Hoechst oraz minimalizacji szumu w sygnałach. Więcej informacji na temat optymalizacji napięcia PMT za pomocą ogniw kontrolnych można znaleźć w Gaysinskaya i Bortvin 2
    6. Bramka na żywych komórkach na podstawie barwienia PI (PI ujemne) i wykresu FSC. Martwe komórki będą dodatnie pod względem fluorescencji PI.
    7. Ustaw bramkę zawartości DNA, wykreślając histogram liczby komórek na podstawie niebieskiej fluorescencji Hoechsta. Powinny pojawić się 3 piki o rosnącym stężeniu niebieskiej fluorescencji Hoechsta, reprezentujące komórki haploidalne (1C), diploidalne (2C) i tetraploidalne (4C). Ustaw 3 bramki, po jednej na każdy szczyt.
    8. Obserwuj co najmniej 500 000 zdarzeń na wykresie FSC vs SSC przed przystąpieniem do bramkowania na populacjach komórek rozrodczych.
  4. Bramka różnych populacji komórek rozrodczych.
    1. Załadować barwioną próbkę Hoechst/PI.
    2. Ustaw pierwsze 3 bramki nadrzędne, które są wspólne dla wszystkich populacji.
      1. Wyklucz resztki komórek na podstawie wykresu FSC i SSC. Wybierz podkoszulki na podstawie wykresu FSC w porównaniu z szerokością impulsu. Wybierz żywe komórki, bramkując komórki ujemne PI.
    3. Zdefiniuj bramę spermatogonii.
    4. Wykreśl komórki ujemne PI na podstawie intensywności fluorescencji niebieskiej i czerwonej Hoechsta. Spermatogonia pojawia się jako populacja poboczna (patrz Ryc. 1).
    5. Zdefiniuj bramki dla pozostałych populacji komórek rozrodczych. UWAGA: Patrz rysunek 1 i rysunek uzupełniający 2, aby uzyskać szczegółowe informacje wizualne.
    6. Wykreśl komórki ujemne PI w bramce zawartości DNA.
      1. Dla plemników bramka pik ma najniższą fluorescencję Hoechsta (1C).
      2. W przypadku spermatocytów II bramka piku za pomocą pośredniej fluorescencji Hoechsta (2C).
      3. W przypadku spermatocytów I bramka piku o najwyższej fluorescencji Hoechsta (4C).
    7. Wykres intensywności niebieskiej i czerwonej fluorescencji Hoechsta w celu udoskonalenia populacji spermatocytów i spermatyd z bramek zawartości DNA.
  5. Zbierz wybrane bramki subpopulacji do przygotowanych wcześniej probówek zbiorczych. Każde jądro potrzebuje średnio od 45 minut do 1,5 godziny, aby zebrać około 0,5-6,0 x 106 komórek dla każdej subpopulacji.
    UWAGA: Długotrwała ekspozycja komórek na Hoechst może z czasem nieznacznie zmienić lokalizację populacji. Odśwież ustawienia po 20-30 minutach FACS. Maksymalny plon dla każdej subpopulacji będzie zależał od skuteczności etapu dysocjacji.

6. Mikroskopowa ocena oczyszczonych komórek

  1. Wirować zebrane komórki w temperaturze 500-600 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  2. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml lodowatego roztworu buforowego 1x buforu fosforanowego (PBS) lub 1x DMEM.
    UWAGA: Objętość re-zawiesiny można regulować w zależności od liczby sortowanych komórek i pożądanego stężenia końcowego.
  3. Pobrać pipetą 40 μl umytych komórek na czyste szkiełko podstawowe i umieścić szkiełko nakrywkowe.
  4. Utrwalić pozostałe komórki 4% paraformaldehydem (PFA) i przechowywać utrwalone komórki w temperaturze 4 °C w ciemności do wykorzystania w przyszłości.
    1. Odpipetować 100 μl 4% PFA bezpośrednio do probówek zbiorczych.
    2. Krótko przemieszać probówki lub pipetę kilka razy, aby zapewnić dobre wymieszanie zawiesiny komórek.
  5. Wizualizuj przygotowane preparaty w mikroskopie wyposażonym w lampę UV, aby wykryć fluorescencję Hoechsta pod obiektywem 63X. Więcej informacji na temat identyfikacji określonych typów komórek rozrodczych można znaleźć w sekcji Wyniki – Ocena morfologiczna posortowanych populacji komórek rozrodczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zawiesiny pojedynczych komórek otrzymane z mechanicznej dysocjacji tkanki jąder

Rysunek 2 porównuje zawiesiny pojedynczych komórek uzyskane poprzez mechaniczną dysocjację tkanki jądra myszy w różnych warunkach. Próbki otrzymane z przetworzonej świeżej tkanki, niebarwione (Rysunek 2A) lub barwione Hoechstem (Rysunek 2B), wykazują obecność pojed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę wysoce konserwatywną dynamikę chromatyny podczas spermatogenezy u ssaków, celem tej pracy było opracowanie protokołu izolowania męskich komórek rozrodczych w różnych stadiach różnicowania z różnych tkanek jąder ssaków (ryc. 1). Jedną z głównych przeszkód w zastosowaniu jednego przepływu pracy do różnych modeli zwierzęcych jest potrzeba dostosowań specyficznych dla gatunku, zwłaszcza w odniesieniu do protokołów dysocjacji tkanek. Obecne metody opierają się głównie na enzymaty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) za psie jądra; laboratorium Jasona Aranda i dr Teda Cicero na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis (WashU) za dostarczenie jąder szczurów oraz Brianne Tabers za pomoc w zbieraniu; Jared Hartsock i Dr. Salt's Lab w WashU dla jąder świnki morskiej; i dr Michael Talcott z Wydziału Medycyny Porównawczej w WashU za miniaturowe jądra świni. Autorzy dziękują również Alvin J. Siteman Cancer Center w Washington University School of Medicine i Barnes-Jewish Hospital w St. Louis, MO, za korzystanie z rdzenia cytometrii przepływowej Sitemana, który zapewniał usługę sortowania komórek obsługiwaną przez personel. Siteman Cancer Center jest częściowo wspierane przez NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842.

To badanie zostało sfinansowane przez stypendium doktoranckie FCT [SFRH/BD/51695/2011 dla ACL], granty z Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych [R01HD078641 i R01MH101810 do DFC] oraz kontrakt badawczy FCT [IF/01262/2014 do AML].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paraformaldehydVWR#157104% PFA, Do utrwalania posortowanych komórek
MedimachineBD Biosciences#340588;System dysocjacji jąder
1X zmodyfikowany Dulbecco Eagle mediumLife Technologies#31053DMEM, do dysocjacji jąder
MediconBD Biosciences#340591Wkład dezagregacyjny do dysocjacji jąder
Surowica bydlęca płoduThermo Scientific#10082139FBS, do kolekcji FACS
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoecsht, Do barwienia
FACS40 i mikro; m sitko do komórekGREINER BIO-ONE#89508-342Do dysocjacji jąder
100x 15 mm szalka PetriegoFalcon#351029Do rozwarstwienia jądra
5 ml polipropylenowe probówki okrągłodenneFalcon#352063Do pobierania FACS
1,5 ml probówki EppendorfVWR#20170-650Do pobierania FACS
3 ml niepotrzebna strzykawkaBD Biosciences#309657Do dysocjacji jąder
50 ml rurka stożkowaMIDSCIDo dysocjacji jąder 
Propidium JodekInvitrogen#L7011PI, Do barwienia FACS
Sortownik komórek MoFlo LegacyBeckman Coulter#ML99030Do
oprogramowania do sortowania komórekBeckman Coulter#ML99030Do soli fizjologicznej buforowanej fosforanem FACS
Thermo Scientific#AM9625PBS, Do mikroskopii
Szkiełko mikroskopoweFisher Scientific#12-544-4Do mikroskopii
Szkiełko nakrywkoweszklane Fisher Scientific#12-548-87Do mikroskopii
Jednorazowa pipeta transferowa (3 ml)Samco Scientific#225Do dysocjacji jąder
DNase IRoche#10104159001Do dysocjacji jąder
Ostrze chirurgiczne ze stali węglowejMiltex#4-111Do rozwarstwienia jądra
Automatyczny licznik komórek CountessInvitrogen#C10227Do automatycznego liczenia komórek
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)Sigma#T8154Do barwienia żywotności
#C50R FACS Summit

Bibliografia

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39(2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie Hoechstemjodeczek propidynyfluorescencyjne sortowanie kom rek FACSizolacja spermatogoniianaliza spermatocyt wseparacja spermatyd
Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.