Artykuł metodologiczny

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

DOI:

10.3791/55918

⸱

26 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki satelitarne (SC) to komórki macierzyste mięśni znajdujące się pomiędzy błoną plazmatyczną włókien mięśniowych a otaczającą blaszką podstawną. Są one niezbędne do regeneracji mięśni. W przypadku urazu, który często występuje w mięśniach szkieletowych, aktywowane są SC. Namnażają się jako mioblasty i różnicują się, aby naprawić zmiany w mięśniach. Wśród wielu zdarzeń, które zachodzą podczas różnicowania mięśni, duże znaczenie mają cytozolowe sygnały Ca2+. Te sygnały Ca2 + powstają w wyniku uwalniania Ca2 + z wewnętrznych magazynów Ca2 +, a także w wyniku wejścia Ca2 + z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, w szczególności z wejścia Ca2+ w sklepie (SOCE). W pracy opisano metodologię zastosowaną do uzyskania czystej populacji ludzkich mioblastów z próbek mięśni pobranych po operacjach ortopedycznych. Tkanka jest trawiona mechanicznie i enzymatycznie, a komórki są amplifikowane, a następnie sortowane za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z obecnością określonych markerów błonowych. Po uzyskaniu ludzkie mioblasty są namnażane i angażują się w różnicowanie poprzez usuwanie czynników wzrostu z pożywki hodowlanej. Poziomy ekspresji specyficznych czynników transkrypcyjnych i immunofluorescencji in vitro wykorzystuje się do oceny procesu różnicowania miogennego w warunkach kontrolnych i po wyciszeniu białek biorących udział w sygnalizacji Ca2+. Na koniec szczegółowo opisujemy zastosowanie Fura-2 jako ratiometrycznej sondy Ca2+, która zapewnia wiarygodne i powtarzalne pomiary SOCE.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie mięśnie szkieletowe składają się z grup kurczliwych, wielojądrowych włókien mięśniowych powstałych w wyniku fuzji miogennych komórek prekursorowych. Mięśnie szkieletowe mają zdolność regeneracji po urazie dzięki obecności SCs, komórek macierzystych mięśni szkieletowych znajdujących się między błoną plazmatyczną włókien mięśniowych (sarkolemma) a blaszką podstawną. W nieuszkodzonych mięśniach SC są najczęściej obecne w stanie spoczynku. W odpowiedzi na naprężenia mechaniczne lub urazy, SC aktywują się (mioblasty), proliferują i ulegają różnicowaniu w celu utworzenia nowych włókien mięśniowych lub samoodnowie w celu uzupełnienia puli SC1,2. Z biegiem lat opracowano kilka technik izolowania SC i ich potomstwa, mioblastów, z biopsji mięśni szkieletowych. Dzięki lepszemu zrozumieniu markerów powierzchniowych komórek wyrażanych na tych komórkach i metodologii sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)3,4,5, możliwe jest teraz wyizolowanie czystych populacji ludzkich mioblastów z próbek mięśni.

Sygnalizacja wapniowa reguluje rozwój mięśni szkieletowych, homeostazę i regenerację. W szczególności duże znaczenie dla tych procesów ma wpis Ca2+, który jest aktywowany po wyczerpaniu zapasów wewnątrzkomórkowych, zwany SOCE6. Po stymulacji komórki poziom Ca2 + w retikulum endo/sarkoplazmatycznym (ER / SR) zmniejsza się, co z kolei aktywuje kanały Ca2 + błony plazmatycznej, które umożliwiają wejście Ca2 + w celu uzupełnienia klasy ER/SR7. Dwa główne białka zaangażowane w SOCE to białko cząsteczki interakcji zrębowej 1 (STIM1) wykrywające ER / SR Ca2 + i kanał Orai1 błony komórkowejCa2 +. Mięśnie szkieletowe obficie wyrażają te dwa białka, a także inne białka z tej samej rodziny (STIM2 i Orai2-Orai3)8,9 i kilka kanałów przepuszczalnych dla Ca2+ z rodziny TRPC (TRPC)10,11,12,13. Przenikanie Ca2+ przez szlak SOCE ma ogromne znaczenie dla tworzenia/regeneracji mięśni14. Mutacje białek STIM1 lub Orai1 mają szkodliwy wpływ na funkcjonowanie mięśni, prowadząc głównie do hipotonii mięśni15. Modele zwierzęce z upośledzeniem SOCE wykazują również zmniejszoną masę mięśniową i siłę, wraz ze zwiększoną męczliwością6,16,17. Jak wspomniano, inne białka STIM i Orai, a także wiele kanałów TRPC, ulegają ekspresji w mięśniach szkieletowych, a ich odpowiednie role nie zostały do tej pory określone. Obniżając ich poziom ekspresji, możliwe jest zatem zbadanie ich implikacji w SOCE i ich roli podczas różnicowania mięśni szkieletowych człowieka.

Pomiar SOCE może być wykonany przy użyciu dwóch różnych podejść: elektrofizjologicznych zapisów prądu i pomiarów Ca2+. Elektrofizjologia jest z pewnością bardziej bezpośrednią metodą, ponieważ mierzy prąd będący przedmiotem zainteresowania i związaną z nim sygnaturę elektrofizjologiczną. Jednak technika ta jest bardzo trudna do zastosowania w komórkach mięśniowych, głównie ze względu na duży rozmiar komórek mięśniowych i mały rozmiar endogennego prądu SOCE. Obrazowanie cytozolowego Ca2 + jest technicznie bardzo dostępne, ale pomiar jest bardziej pośredni, ponieważ poziom Ca2 + mierzony w cytozolu odzwierciedla zarówno wejście Ca2 +, jak i ponowne wypompowanie z komórki lub do magazynów wewnętrznych.

Metodologia, która obejmuje izolowanie mioblastów z małych kawałków ludzkich mięśni szkieletowych po trawieniu enzymatycznym, amplifikacji i FACS, jest wyjaśniona w tym artykule. Proces różnicowania mięśni i protokół immunofluorescencji w celu śledzenia ekspresji markerów różnicowania w czasie są opisane w 18. Na koniec wyjaśniono pomiar SOCE i rolę różnych kanałów jonowych w sygnalizacji Ca2 + i różnicowaniu mięśni szkieletowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki mięśni ludzkich (tkanki uzyskane z mięśni półścięgnistych) zostały pobrane podczas operacji ortopedycznej u zdrowych pacjentów jako odpady chirurgiczne. Wszystkie metody związane z badaniem na ludziach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Szwajcarskich Organów Regulacyjnych ds. Zdrowia i zatwierdzone przez Komisję Cantonale d'Ethique de la Recherche z Władz Kantonalnych Genewy w Szwajcarii (protokół CER nr 12-259). Uzyskano świadome i pisemne zgody od wszystkich dorosłych uczestników biorących udział w badaniu.

1. Izolacja mioblastów od ludzkich mięśni szkieletowych

  1. Podczas wszystkich zabiegów należy utrzymywać sterylne warunki, pracując pod kapturem do hodowli tkankowych poziomu II oraz używając sterylnego podłoża i sterylnych.
    Uwaga: Ta procedura może być stosowana do wielu ludzkich mięśni szkieletowych.

2. Protokół dysocjacji

  1. Próbki mięśni (2 - 3 g) przenieść na sterylną płytkę o średnicy 6 cm.
  2. Przemyć próbki mięśni 5 - 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powtórz pranie.
  3. Usuń tkankę łączną i tłuszczową za pomocą zakrzywionych nożyczek i zacisku.
  4. Zważyć próbkę mięśni (patrz krok 2.13) i przenieść ją na nową, sterylną płytkę o średnicy 6 cm.
  5. Dodaj 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA.
  6. Za pomocą nożyczek pokrój i zmiel tkankę mięśniową na małe kawałki (mniej niż 2 mm).
  7. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przenieś mięsień mielony do butelki dysocjacyjnej o pojemności 200 ml zawierającej pręt magnetyczny. Powtarzaj ten krok, aż 90 ml 0,05% trypsyny-EDTA zostanie przeniesione ze wszystkimi zmielonymi mięśniami do pudełka dysocjacyjnego. Zamknąć butelkę dysocjacyjną i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut przy łagodnym wzburzeniu.
  8. Wyjąć butelkę dysocjacyjną z łaźni grzewczej i zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 10 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS; 10% objętości końcowej) do butelki dysocjującej. Homogenizować mieszaninę za pomocą pipety.
  9. Przygotuj dwie probówki o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 70 μm na każdej. Przepuścić połowę zawiesiny komórek przez sitko na każdej probówce, pipetując filtr w górę i w dół, aż zawiesina przejdzie przez filtr.
  10. Odwirować probówki o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; zassać i odrzucić supernatant.
  11. Zawiesić komórki za pomocą 10 ml pożywki wzrostowej (GM; Tabela 1) i przepuścić komórki przez sitko o wielkości 40 μm umieszczone na jednej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować probówkę o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; Odessać i odrzucić supernatant.
  12. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml GM i odwirować probówkę o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; zassać i odrzucić supernatant.
  13. Zawiesić komórki z 1 ml GM i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.
    Uwaga: Zwykle należy zebrać plon 3 x 105 komórek na g mięśni. Wydajność oblicza się, dzieląc liczbę komórek przez masę biopsji mięśnia (krok 2.4).
  14. Umieścić 2 x 105 komórek na sterylnej 6-centymetrowej płytce zawierającej 4 ml GMO i inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 . Przygotuj tyle talerzy, ile potrzeba.
  15. Zmień GM po 3 dniach.
    Uwaga: Świeżo zdysocjowane komórki potrzebują czasu, aby przylgnąć do płytki hodowlanej. Co więcej, czas pierwszego podwojenia komórek miogennych wynosi około 50 - 60 godzin. Po pierwszym podziale czas podwojenia wynosi około 20 godzin.
  16. Po 5 - 7 dniach, gdy komórki osiągną 70 - 80% zbieżności (około 1,5 x 106 komórek/na 6 cm płytki), rozpocznij barwienie przeciwciał i sortowanie komórek (krok 3).

3. Barwienie przeciwciał i sortowanie komórek

  1. Po jednokrotnym przepłukaniu PBS inkubować przylegające komórki (na 6-centymetrowej płytce) z 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 3 minuty (lub inkubować w 5% CO2 ). Zatrzymaj reakcję, dodając 2 ml GM i zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Po odwirowaniu (200 x g przez 5 min) ponownie zawieś komórki w 1 ml GM.
  2. Policz komórki za pomocą komory Neubauera.
  3. Wykonaj następujące procedury na ice.
    Uwaga: Procedura ustawiania prawidłowej kompensacji fluorescencji na cytometrze jest niezbędna i powinna być podobna na każdym cytometrze. Probówki 1 i 2 są używane jako kontrole ujemne. Probówki 3 - 7 służą do ustawiania kompensacji na cytometrze podczas pierwszego eksperymentu (Tabela 2). Końcowe stężenie stosowane dla każdego przeciwciała i odpowiadającego mu izotypu powinno być takie samo (około 1 μg/106 komórek).
  4. Wysyłka 1 x 105 komórek w probówce (probówka 5 ml) dla probówek 1 - 7 (Tabela 2). Umieścić pozostałą zawiesinę komórek w probówce 8 w celu sortowania komórek.
  5. Umyj komórki 1 ml zimnego buforu FACS (PBS-5% FCS). Zamknąć i odwirować probówki o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut; Odessać i odrzucić supernatant.
  6. Dodać 200 μl buforu FACS na probówkę. Dodać przeciwciała do probówki zgodnie z tabelą 2. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
  7. Umyj komórki: dodaj 1 ml buforu FACS do każdej probówki. Zamknąć probówki i odwirować je w temperaturze 200 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS. Zamknij probówki i trzymaj je na lodzie do momentu sortowania komórek. Przygotuj 4 probówki po 1,5 ml, każda zawierająca 500 μl GM, która jest niezbędna do zebrania komórek podczas sortowania komórek. Trzymaj je na lodzie.
  9. Sortuj ludzkie mioblasty według cytometrii przepływowej (Rysunek 1). Po wykluczeniu komórek krwiotwórczych CD45-dodatnich, oddziel komórki CD45-ujemne na podstawie ekspresji CD56. Następnie bramkuje populację CD56-dodatnią dla CD34, CD144 i CD146 (ludzkie mioblasty definiuje się jako komórki CD56 + / CD146 + / CD45 / CD34 / CD144-). Ponownie przeanalizuj niewielką część posortowanej populacji komórek, aby sprawdzić czystość.
  10. Zebrać probówki zawierające ludzkie mioblasty w jednej probówce o pojemności 15 ml i przemyć jednorazowo, dodając 5 ml GM. Odwirować probówkę o sile 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; odessać i wyrzucić supernatant.
  11. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml GM i umieścić komórki na niepowlekanej 6-centymetrowej płytce zawierającej 4 ml GM (2 x 10 5 komórek na płytkę). Inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 .

4. Konserwacja komórek

  1. Zmieniaj połowę pożywki co 2 dni. Usuń 2 ml starego GM z naczynia hodowlanego i dodaj 2 ml GM.
    Uwaga: Mioblasty wytwarzają czynniki wzrostu, które są korzystne dla warunków hodowli.
  2. Trypsynizuj komórki, gdy osiągną 70-80% konfluencji, aby uniknąć różnicowania wstępnego. Po jednokrotnym spłukaniu PBS inkubować przylegające komórki (na 6-centymetrowej płytce) z 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 3 minuty. Zatrzymaj reakcję, dodając 2 ml GM i zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Po odwirowaniu (200 x g przez 5 min) ponownie zawieś komórki w 1 ml GM.
  3. Policz komórki i przygotuj 6 cm płytki po 2 x 10 po5 komórek na płytkę w 4 ml GM.
  4. Utrzymuj ludzkie mioblasty do 6 pasaży lub zamrażaj je w GM zawierającym 10% DMSO, 1 x 106 komórek na ml. Zamrozić komórki w pojemniku do stopniowego zamrażania (1 °C/min); W celu długotrwałego przechowywania umieść komórki w ciekłym azocie.

5. Transfekcja ludzkich mioblastów za pomocą siRNA

Uwaga: Mioblasty są transfekowane za pomocą komercyjnego odczynnika do transfekcji dwa dni przed indukcją różnicowania. Wpływ specyficznego siRNA na gen jest zawsze porównywany z efektem kontrolnego siRNA. siRNA to dwuniciowe RNA, które muszą być trzymane na lodzie i manipulowane w rękawiczkach.

  1. Uzyskaj 70 - 80% zlewającą się monowarstwę ludzkich mioblastów na 6-centymetrowej płytce (około 1,5 x 106 komórek).
    Uwaga: 5 x 105 komórek na transfekcję jest potrzebnych do uzyskania zlewającej się monowarstwy transfekowanych mioblastów po 2 dniach w GM.
  2. Przygotować szklane szkiełka nakrywkowe (opisane dla obrazowania wapnia w kroku 7).
  3. Ciepły GM, 0,05% trypsyny-EDTA i PBS do 37 °C.
  4. Wykonaj wszystkie poniższe czynności w okapie do hodowli tkankowych poziomu II, aby zachować sterylność.
  5. W probówce o pojemności 1,5 ml należy przesłać 500 μl zredukowanej pożywki surowicy, 3 μl odczynnika do transfekcji i 1 μl siRNA w temperaturze 20 μM. Delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 - 20 minut.
  6. W tym czasie inkubacji przygotuj mioblasty do transfekcji. Po jednokrotnym spłukaniu PBS inkubować przylegające komórki (na 6-centymetrowej płytce) z 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 3 minuty. Zatrzymaj reakcję, dodając 2 ml GM i zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Po odwirowaniu (200 x g przez 5 min) ponownie zawieś komórki w 1 ml GM.
  7. Policz komórki za pomocą komory Neubauera.
  8. Zawiesić 5 x 105 komórek w 200 μl GM dla każdej transfekcji (tj. dla 2 transfekcji ponownie zawiesić w 400 μl).
  9. Dodać 200 μl zawiesiny komórkowej do każdych 500 μl mieszaniny siRNA-transfektant. Pipetować w górę i w dół dwa razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Dodać 700 μl (komórki + transfektant siRNA) do 3,5 cm naczynia hodowlanego zawierającego szklane szkiełko nakrywkowe. Dodaj GM, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.
  11. Po 24 godzinach w temperaturze 37 °C i 7% CO2 całkowicie zastąpić pożywkę 2 ml świeżego GM. Po kolejnych 24 godzinach zwykle obecna jest zlewająca się monowarstwa transfekowanych komórek; jeśli tak, wywołać różnicowanie mioblastów poprzez zastąpienie GM 2 ml pożywki różnicującej (DM; Tabela 1).
  12. Eksperymenty obrazowania wapnia należy wykonywać 24 - 48 godzin po indukcji różnicowania lub na proliferujących mioblastach.
    Uwaga: Immunofluorescencję wykonuje się zwykle 48 godzin po indukcji różnicowania.

6. Barwienie immunofluorescencyjne markerów różnicowania

Uwaga: Barwienie immunofluorescencyjne wykonuje się po 48 godzinach w DM, ale można je również przeprowadzić w innych okresach różnicowania. Miogenina i MEF2 są białkami jądrowymi ulegającymi ekspresji tylko w zróżnicowanych komórkach (przed fuzją w miotubach), a ich barwienie pozwala na ocenę procesu różnicowania. Łańcuch ciężki miozyny (MyHC) ulega ekspresji tylko w miotubach i służy do oszacowania wielkości miotubki i wskaźnika fuzji (liczba jąder w miotubach/całkowita liczba jąder).

  1. Po 48 godzinach w stężeniu s.m. przemyć zlewającą się monowarstwę zróżnicowanych komórek dwukrotnie 1 ml PBS w temperaturze pokojowej. Zrób to ostrożnie, aby uniknąć odłączenia miotubes.
  2. Utrwalić komórki 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki PBS dwukrotnie, po 5 minut każda.
  3. Udrażnić komórki 1 ml PBS zawierającego 0,25% Triton X-100 przez 45 minut i przemyć 3 razy 1 ml PBS.
  4. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania poprzez inkubację komórek w PBS uzupełnionym 0,2% Tween-10 i 2% kozią surowicą (roztwór blokowy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokowym (600 μl na płytkę 3,5 cm).
    Uwaga: Stosowane są następujące przeciwciała pierwszorzędowe: mysia anty-miogenina (1:600), królicze przeciwciało anty-MEF2 (1:300) i mysie przeciwciało anty-MyHC (MF20, 1:1,000). Możliwe jest zmieszanie tego samego roztworu blokującego, ciężkiego łańcucha anty-miozyny myszy lub mysiej anty-miogeniny, z króliczym anty-MEF2.
  6. Usunąć roztwór blokowy i dodać 600 μl roztworów przeciwciał pierwszorzędowych na 3,5-centymetrową płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
  7. Umyj komórki 3 razy 1 ml PBS. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze z 600 μl przeciwciał drugorzędowych przygotowanych w roztworze blokowym, w następujący sposób: kozioł anty-mysz Alexa 488 (1:1,000), kozioł anty-królik Alexa 546 (1:1,000) i DAPI (1:50, roztwór podstawowy o stężeniu 15 μM).
    UWAGA: DAPI jest toksycznym związkiem, z którym należy obchodzić się w rękawiczkach.
  8. Odessać i przemyć komórki 3 razy 1 ml PBS.
  9. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium mocującego z alkoholu poliwinylowego z roztworem zapobiegającym blaknięciu. Przechowywać je w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu obrazowania komórek.

7. Obrazowanie wapnia

  1. Wcześniejsza kultura przygotuj szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm. Umieść szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu na 48 godzin, aby usunąć tłuszcz i brud z powierzchni, co zmniejsza przyleganie komórek do szkiełka nakrywkowego.
  2. Po kilkukrotnym spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą, włóż je z powrotem do wody i wysterylizuj (autoklawow).
  3. Umieść jedno szkiełko nakrywkowe na 3,5-centymetrowej płytce hodowlanej i pozostaw do wyschnięcia. Przechowuj szalki Petriego do dalszych eksperymentów lub użyj ich natychmiast.
  4. Dodaj transfekowane mioblasty (5 - 6 x 105 komórek) do szklanego szkiełka nakrywkowego.
    Uwaga: Eksperymenty wykonuje się 24 - 48 godzin po indukcji różnicowania lub na proliferujących mioblastach.
  5. Aby wykonać obrazowanieCa2+, przemyj komórki 2 razy PBS lub bezpośrednio pożywką użytą do eksperymentów (pożywka zawierająca wapń; Tabela 3). Załaduj ogniwa 2 μM Fura-2/AM plus 1 μM kwas pluronowy przez około 30 minut w ciemności w RT.
    Uwaga: Kwas pluronowy pomaga w rozpuszczaniu Fura-2. Fura-2/AM i kwas pluronowy rozpuszczają się w pożywce zawierającej wapń.
  6. Umyj komórki dwukrotnie w tym samym podłożu, ale bez Fura-2/AM i kwasu pluronowego i pozostaw je w ciemności na dodatkowe 10 - 15 minut, aby umożliwić deestryfikację Fura-2/AM.
  7. Jeśli wydajność ładowania Fura-2 jest zbyt niska, dodaj więcej Fura-2 (np. 4 μM) i/lub inkubuj komórki przez dłuższy czas (np. 40 min).
  8. Usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki hodowlanej i umieścić je w komorze doświadczalnej. Dodać ~1 ml pożywki zawierającej wapń (w zależności od objętości komory doświadczalnej). Zainstaluj go na stoliku mikroskopu i rozpocznij nagrywanie.
    Uwaga: Fluorescencyjna sonda Fura-2 czuła naCa 2+ jest wzbudzana na przemian przy 340 nm i 380 nm, a światło emisyjne jest zbierane przy 510 nm. Ponieważ wahania stężenia Ca2+ są stosunkowo powolne, należy uzyskać 1 stosunek co 2 s.
  9. Aby aktywować SOCE, stosuje się następujący klasyczny protokół ponownego dodawania thapsigarginy/Ca2+: pozostaw komórki na 2-3 minuty w pożywce zawierającej wapń. Zastąp pożywkę podłożem bezwapniowym na 1-2 minuty.
    1. Dodać 1 μM thapsigarginy, aby wyczerpać wewnętrzne zapasy wapnia.
      Uwaga: Thapsigargin jest nieodwracalnym blokerem aktywności pompy Ca2 + ATPazy (SERCA) siateczki sarko-endoplazmatycznej. Po 8 - 10 minutach szybko zastąp pożywkę pożywką zawierającą wapń. Ca2+ wejdzie do komórek przez kanały SOCE. Odczekaj około 5 minut przed zakończeniem eksperymentów.
      UWAGA: Thapsigargin jest toksycznym związkiem, z którym należy obchodzić się w rękawiczkach.

8. Analiza pomiarowa Ca2+

Uwaga: Przeprowadź analizę za pomocą oprogramowania do akwizycji.

  1. Otwórz eksperyment. Narysuj region 1 w obszarze, w którym nie ma komórek (obszar tła) i narysuj inne regiony w cytoplazmie komórek, które mają być analizowane (regiony można narysować na dowolnym obrazie: obraz 340 nm, 380 nm lub obraz proporcji). Przejdź do sekcji "Uruchom eksperymenty" > "Obrazy referencyjne". Pod kanałami 340 i 380 wybierz "region 1", a następnie kliknij "Odejmij tło".
  2. Uruchom cały eksperyment (F4: do przodu), aby upewnić się, że nic nie zakłóca obszaru tła, takiego jak fluorescencyjna plamka pyłu, która przemieszcza się przez obszar tła, i że komórki nie poruszają się w czasie eksperymentów.
    Uwaga: Wybrane obszary zainteresowania nie powinny zawierać ciemnych obszarów; W przeciwnym razie wartość współczynnika będzie wydawać się zaszumiona, ponieważ część tła zostanie uwzględniona w pomiarze.
  3. Kliknij "Dane dziennika" i ponownie odtwórz cały eksperyment.
    Uwaga: Spowoduje to otwarcie arkusza kalkulacyjnego, w którym rejestrowany jest czas i stosunek. Możliwe jest również zapisanie poszczególnych długości fal 340 nm i 380 nm.
  4. Aby uzyskać informacje na temat SOCE, wyodrębnij dwa ważne parametry z eksperymentu: amplitudę ponownego dodawania Ca2+ i nachylenie fazy wejścia Ca2+ (Rysunek 3).
  5. Amplitudę należy uzyskać, odejmując wartość współczynnika tuż przed ponownym dodaniem Ca2+ od maksymalnej amplitudy wysokości Ca2+. Maksymalne nachylenie należy uzyskać, dopasowując regresję liniową pierwszych sekund po ponownym dodaniu Ca2+.
    Uwaga: Obszar pod krzywą odpowiedzi thapsigarginy jest również parametrem informacyjnym do wyodrębnienia, ponieważ odzwierciedla ilość wolnego wapnia przechowywanego w SR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po enzymatycznej dysocjacji próbki ludzkiego mięśnia, komórki zostały amplifikowane w GM. Ludzkie mioblasty, zdefiniowane jako komórki CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144-, uzyskano po FACS. Mioblasty stanowiły ponad 60% analizowanej populacji (Ryc. 1). Pierwotne ludzkie mioblasty poddano ponownej powłoce, wyhodowano do zbiegu i hodowano w DM przez 48 godzin. Po barwieniu immunologicznym w celu ekspresji czynnika transkrypcyjnego MEF2 i specyficznego dla mięśni łańcucha ciężkiego miozyny białkowej (MyHC), ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i hodowla ludzkich mioblastów z dorosłych mięśni szkieletowych oferuje model in vitro do badania różnicowania i regeneracji mięśni. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół, który pozwala na oczyszczanie dużych plonów ludzkich mioblastów w prosty i niedrogi sposób. Ponadto technika ta zapewnia wiarygodne i powtarzalne wyniki pod względem procentu wyizolowanych mioblastów i ich skuteczności różnicowania miogennego. Rzeczywiście, uzyskaliśmy około 60% ludzkich mioblast...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (numer grantu 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Fundację Marcela Levaillanta" oraz "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szynka" s F10ThermoFisher Scientific31550-023
FCSThermoFisher Scientific10270-106Lot 41G5532K
BSASigmaO5482
fetuinSigmaF3385
EGFCorning354001
DexamethansoneSigmaD1756
InsulinaSigmaI9278
KreatynaSigma27900
PirogronianSigmaP4562
UrydynaSigmaU3003
GentamycynaThermoFisher Scientific15710-049
Trypsyna-EDTA 0,05%ThermoFisher Scientific25300-062
70 μ m sitko do komórekFalcon352350
40 μ m Filtr siatkowyFalcon352340
Falcon 50  Probówkaml Falcon352070
Sokół 15  Probówka Falcon352096
Falcon 5  Probówka mL (FACS)Falcon352058
Pożywka hodowlana: OPTI-MEMThermoFisher Scientific31985-047
Reakcja transfektantowa: RNAiMaxThermoFisher Scientific1756064
PBS ThermoFisherScientific14190-094
Podłoże montażoweFluka10981
Mysz anty-MyHC *DSHBMF20 Koncentrat
Mysi anty-miogeninBD Pharmigen556358
Rabbit anty-MEF2Santa Cruz BiotechC-21
Goat anty-myszy Alexa488ThermoFisher ScientificA11029
Koza anty-królik Alexa 546ThermoFisher ScientificA11035
Mysz anty ludzka CD56-Alexa488BD Pharmingen557699
Mysz anty ludzka CD146-PECy7BD Pharmingen562135
Mysz anty ludzka CD45-PE-CF594BD Pharmingen562279
Mysz anty ludzka CD34-APCBD Pharmingen345804
Mysz anty ludzka CD144-PEBD Pharmingen560410
Alexa Fluor 488 mysz IgG1kBD Pharmingen557702
PECy7 mysz IgG1kBD Pharmingen557872
PE-CF594 mysz IgG1kBD Pharmingen562292
Mysz APC IgG1kBD Pharmingen550854
Mysz PE IgG1kBD Pharmingen556650
DAPISigmaD9542UWAGA:  toksyczny związek
ParaformaldehydFluka762400
Fura-2 AMThermoFisher ScientificF1201
Pluronic F-127ThermoFisher ScientificP3000MP
ThapsigarginSigmaT9033UWAGA : toksyczny związek 
Oprogramowanie do akwizycji obrazowania ratiofowego: Metafluor 6.3Molecular Device
* : MF 20 został zdeponowany w DSHB przez Fischmana, D.A. 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  2. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  3. Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195(2014).
  4. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
  5. Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
  7. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  8. Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
  9. Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
  10. Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
  11. Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
  12. Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
  13. Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
  14. Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
  15. Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
  16. Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
  17. Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805(2013).
  18. Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
  21. Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855(2016).
  22. Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
  23. Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
  24. Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowaobrazowanie wapnia z u yciem Fura 2trawienie tkaneksortowanie kom reksygnalizacja wapniowaregeneracja mi niczynniki transkrypcyjne

Powiązane artykuły