Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55924

⸱

13 lipca 2017

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół hybrydyzacji RNA in situ, szczególnie dla niskopoziomowych genów receptora zapachowego (OR), jak również innych genów, w czułkach owadów za pomocą sond znakowanych digoksygeniną (DIG) lub biotyną.

Streszczenie

Owady rozwinęły wyrafinowane systemy odbioru węchu, aby wykrywać egzogenne sygnały chemiczne. Te sygnały chemiczne są przekazywane przez neurony receptorów węchowych (ORN) umieszczone w strukturach przypominających włosy, zwanych chemosensillami, anten. Uważa się, że receptory zapachowe (OR) są zaangażowane w kodowanie zapachów na błonach ORN. W związku z tym zdolność do identyfikacji genów zlokalizowanych w ORN jest niezbędna do rozpoznania genów OR i stanowi fundamentalną podstawę do dalszych funkcjonalnych badań in situ. Poziomy ekspresji RNA specyficznych ORw czułkach owadów są bardzo niskie, a zachowanie tkanki owada do badań histologicznych jest wyzwaniem. W związku z tym trudno jest zlokalizować OR do określonego typu sensilli za pomocą hybrydyzacji RNA in situ. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy i wysoce skuteczny protokół hybrydyzacji RNA in situ, szczególnie w przypadku genów OR owadów o niskiej ekspresji. Ponadto zidentyfikowano specyficzny gen OR poprzez przeprowadzenie eksperymentów hybrydyzacji in situ z dwukolorową fluorescencyjną metodą przy użyciu genu receptora o koekspresji, Orco, jako markera.

Wprowadzenie

Czułki owadów, które są najważniejszymi narządami chemosensorycznymi, pokryte są wieloma strukturami przypominającymi włosy - zwanymi sensilla - które są unerwione przez neurony receptorów węchowych (ORN). Na błonie ORN owadów, receptory zapachowe (OR), rodzaj białka zawierającego siedem domen transbłonowych, są wyrażane przez koreceptor (ORco), tworząc heteromer, który działa jako kanał jonowy bramkowany nawaniaczem1,2,3. Różne sale operacyjne reagują na różne kombinacje związków chemicznych4,5,6.

Szarańcza (Locusta migratoria) głównie polega na sygnałach węchowych, aby wywołać ważne zachowania7. Sale operacyjne szarańczy są kluczowymi czynnikami dla zrozumienia molekularnych mechanizmów węchowych. Lokalizacja specyficznego genu OR szarańczy w neuronie morfologicznie specyficznego typu sensillum przez hybrydyzację RNA In Situ (RNA ISH) jest pierwszym krokiem w badaniu funkcji OR.

RNA ISH używa znakowanej komplementarnej sondy RNA do pomiaru i lokalizacji określonej sekwencji RNA w przekroju tkanki, komórek lub całych wierzchowców in situ, dostarczając wglądu w procesy fizjologiczne i patogenezę chorób. Sondy RNA znakowane digoksygeniną (znakowane DIG) i biotyną są szeroko stosowane w hybrydyzacji RNA. Znakowanie RNA digoksygeniną-11-UTP lub biotyną-16-UTP można przygotować przez transkrypcję in vitro z polimerazami SP6 i T7 RNA. Sondy RNA znakowane DIG i biotyną mają następujące zalety: są nieradioaktywne; bezpieczny; stajnia; bardzo wrażliwy; bardzo specyficzny; i łatwe do wyprodukowania przy użyciu PCR i transkrypcji in vitro. Sondy RNA znakowane DIG i biotyną mogą być wykrywane chromatogennie i fluorescencyjnie. Sondy RNA znakowane DIG można wykryć za pomocą przeciwciał sprzężonych z fosfatazą alkaliczną anty-digoksygeniną (AP), które można uwidocznić za pomocą bardzo czułych substratów chemiluminescencyjnych: soli toluidynowej chlorku tetrazolu nitroniebieskiego tetrazolu chlorku / 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu toluidyny (NBT / BCIP) za pomocą mikroskopu optycznego lub fosforanu 2-hydroksy-3-naftoinowego-2'-fenylanilidu (HNPP) sprzężonego z solą chlorku hemi-4-chloro-2-metylobenzenodiazonium (Fast Red) za pomocą mikroskopu konfokalnego. Sondy RNA znakowane biotyną można wykryć za pomocą przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanu (HRP) przeciwko streptatynie, które można uwidocznić za pomocą fluoresceiny-tyramidu za pomocą mikroskopu konfokalnego. W ten sposób dwukolorową fluorescencyjną hybrydyzację in situ można przeprowadzić w celu wykrycia dwóch docelowych genów w jednym wycinku za pomocą sond RNA znakowanych DIG i biotyną.

RNA ISH z sondami znakowanymi DIG i/lub biotyną został z powodzeniem wykorzystany do lokalizacji genów związanych z węchem, takich jak OR, receptor jonotropowy, białko wiążące zapachy i białko błony neuronu czuciowego, w czułkach owadów, ale nie wyłącznie, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, L. migratoria i szarańczy pustynnej Schistocera gregaria8,9,10,11,12,13,14,15,16. Istnieją jednak dwa zasadnicze wyzwania związane z wykonywaniem RNA ISH dla OR owadów: (1) geny OR (z wyjątkiem ORco) ulegają ekspresji na niskich poziomach i tylko w kilku komórkach, co bardzo utrudnia wykrycie sygnału, oraz (2) zachowanie tkanki owada do histologii, tak aby morfologia była zachowana, a szum tła niski, może być wyzwaniem. W artykule przedstawiono szczegółowy i skuteczny protokół opisujący RNA ISH do lokalizacji genów OR w czułkach owadów, obejmujący detekcję zarówno chromogenną, jak i tyramidową amplifikację sygnału (TSA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Aby ograniczyć degradację RNA, przygotuj roztwory używając wody destylowanej w mokro autoklawizowanej (o temperaturze 121 °C przez 60 min), a także materiałów z mokrego autoklawu.

1. Przygotowanie antysensownych i sond RNA ISH

  1. Amplifikacja i oczyszczanie genów docelowych
    1. Najpierw wyprodukuj dwuniciowy fragment L. migratoria OR1 o długości 387 pz (LmigOR1, GenBank: JQ766965) z plazmidu zawierającego cDNA LmigOR1 o pełnej długości z polimerazą DNA Taq, która dodaje adeniny do obu końców fragmentów.
      1. Użyć 100 μl końcowej objętości reakcyjnej, zawierającej 50 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, po 4 μl starterów sensownych i antysensownych (Tabela 1), 1 μl matrycy plazmidowej i 41 μlH2Owolnego od RNaz. Stosować następujący protokół PCR: 94 °C przez 5 minut, a następnie 30 cykli po 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min, a następnie 72 °C przez 10 min.
      2. Powtórz te kroki, aby uzyskać dwuniciowy fragment LmigOR2 o masie 1 303 pz (GenBank: JQ766966) i dwuniciowy fragment LmigORco o długości 1 251 pz (GenBank: JN989549). Startery użyte w tych doświadczeniach przedstawiono w tabeli 1.
      3. Uruchom produkty PCR na 1,2% żelach agarozowych w 1x buforze Tris-acetate-EDTA i wizualizuj za pomocą barwienia bromkiem etydyny.
    2. Ekstrahuj te produkty PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
      1. Po elektroforezie należy wyciąć prążki DNA z żelu i umieścić plastry żelu w probówce o pojemności 1,5 ml. Następnie dodać 100 μl buforu wiążącego (Buffer PN) na 0,1 g plastra żelu. Wirować i inkubować w temperaturze 50 °C, aż plasterek żelu całkowicie się rozpuści.
      2. Wprowadzić kolumnę adsorpcyjną CA2 do probówki zbiorczej i dodać 500 μl buforu równoważącego (bufor BL). Poprawia to zdolność absorpcji i stabilność membrany krzemionkowej. Wirować przy 12 400 x g przez 1 min.
      3. Przenieść rozpuszczoną mieszaninę żelu do zespołu kolumny adsorpcyjnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Następnie odwirować probówki o stężeniu 12 400 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ i ponownie włóż kolumnę adsorpcyjną do probówki zbiorczej.
      4. Dodać dwukrotnie 600 μl roztworu do przemywania (z dodatkiem etanolu, buforu PW). Wirować przy 12 400 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ i ponownie włożyć kolumnę adsorpcyjną do probówki zbiorczej.
      5. Opróżnij probówkę zbiorczą i ponownie odwiruj zespół kolumny przy 12 400 x g przez 2 minuty, aby umożliwić odparowanie resztek etanolu.
      6. Ostrożnie przenieść kolumnę adsorpcyjną do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć granulkę na powietrzu przez 5-10 minut i ponownie rozpuścić DNA w odpowiedniej objętości (np. 30 μl) wody wolnej od nukleaz.
      7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wirować przy 12 400 x g przez 2 minuty. Odrzucić kolumnę adsorpcyjną i przechowywać DNA w temperaturze 4 °C lub -20 °C.
  2. Konstruowanie rekombinowanych plazmidów
    1. Indywidualnie podlicytować fragment LmigOR1 o długości 387 pz, fragment LmigOR2 o długości 1 303 pz i fragment LmigORco o długości 1 251 pz do wektora T, który zawiera promotory polimeraz RNA T7 (upstream) i SP6 (downstream) sąsiadujących z wstawionym DNA za pomocą ligazy DNA T4. Przygotować następujące 10 μl reakcji: 5 μl 2x buforu ligacyjnego, 1 μl wektora T, 3 μl (∼100 ng) DNA wstawionego genu i 1 μl ligazy DNA T4 i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać 5 μl każdego rekombinowanego plazmidu zawierającego 387 pz fragment LmigOR1, 1,303 pz fragment LmigOR2 i 1,251 pz fragment LmigORco oddzielnie do 50 μl kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α w sterylnych probówkach 1,5 mL.
      1. Delikatnie wymieszać i umieścić probówki w lodzie na 30 minut, a następnie inkubować je przez 90 s w temperaturze 42 °C. Przenieść je z powrotem do lodu na 3 minuty.
      2. Do każdej probówki dodać 450 μl płynnej pożywki Luria-Bertani (LB) bez ampicyliny i inkubować je w wytrząsarce z prędkością 150 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu przywrócenia E. coli DH5α.
      3. Pobrać 100 μl podwielokrotności każdego transformantu i użyć ich do zaszczepienia płytek stałego substratu LB zawierających 50 μg/ml ampicyliny, 24 μg/ml izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 40 μg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozydu (X-gal).
      4. Inkubować te płytki w inkubatorze ciągłym w temperaturze 37 °C przez 18 godzin. Przebadać docelowe rekombinowane plazmidy metodą przesiewową niebiesko-białą. Zsekwencjonuj docelowe rekombinowane plazmidy za pomocą sekwencjonowania Sangera i zidentyfikuj kierunki wstawiania trzech genów OR.
  3. Wybierz endonukleazy restrykcyjne do linearyzacji rekombinowanych plazmidów
    1. Używaj endonukleaz restrykcyjnych, które nie tylko trawią się w miejscu wielokrotnego klonowania wektora, ale także nie przecinają wstawionego DNA. W tym eksperymencie wszystkie 3 geny są wprowadzane do wektora T w kierunku odpowiadającym wektorowi.
    2. Użyj endonukleazy restrykcyjnej Nco I, aby zlinearyzować rekombinowane plazmidy zawierające fragment LmigOR1 o długości 387 pz, fragment LmigOR2 o długości 1,303 pz i fragment LmigORco o długości 1,251 pz w celu wytworzenia sond antysensownych. Użyj endonukleazy restrykcyjnej Spe I, aby wyprodukować sondy wykrywające.
      UWAGA: Jeśli kierunek wstawiania odpowiada kierunkowi wektora, wówczas wybiera się unikalne miejsce restrykcyjne od końca T7 do linearyzacji rekombinowanego plazmidu, a polimeraza SP6 RNA jest używana do przygotowania sondy antysensownej. Do linearyzacji rekombinowanego plazmidu wybiera się unikalne miejsce restrykcyjne od końca SP6, a polimerazę RNA T7 wykorzystuje się do przygotowania sondy czujnikowej. W przeciwnym razie, jeśli kierunek wstawiania nie odpowiada kierunkowi wektora, wówczas wybiera się unikalne miejsce restrykcyjne od końca SP6 do linearyzacji rekombinowanego plazmidu, a polimeraza RNA T7 jest używana do przygotowania sondy antysensownej. Unikalne miejsce restrykcyjne od końca T7 jest wybierane do linearyzacji rekombinowanego plazmidu, a polimeraza RNA SP6 jest używana do przygotowania sondy wykrywającej.
  4. Oczyszczanie linearyzowanych rekombinowanych plazmidów
    1. Trawić 20 μg każdego z trzech rekombinowanych plazmidów zawierających 387 pz fragment LmigLUB1, 1,303 pz fragment LmigOR2 i 1,251 pz fragment LmigORco przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej Nco I w 100 μl reakcji, która zawiera 10 μl 10x buforu, 40 μl 0,5 μg/μL plazmidu, 3 μl Nco I i 47 μl H2O wolnego od RNaz, a następnie 3 godziny inkubacji w temperaturze 37 °C.
    2. Podobnie, trawić 20 μg każdego z tych trzech rekombinowanych plazmidów za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Spe I.
    3. Oczyścić te strawione plazmidy za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, jak opisano w ppkt 1.1.2. Określić stężenia tych ekstrahowanych, zlinearyzowanych rekombinowanych plazmidów za pomocą spektrofotometrii i dostosować do 0,5 μg/μl.
  5. Przygotuj sondy antysensowne i czujnikowe
    1. Użyj systemu transkrypcji RNA T7/SP6 do generowania sond antysensownych i zmysłowych. Polimeraza RNA SP6 służy do transkrypcji dwuniciowego RNA dla znakowanych DIG i biotyną sond antysensownych dla tych trzech genów OR przy użyciu linearyzowanych rekombinowanych plazmidów jako matryc in vitro. Polimeraza RNA T7 jest używana do produkcji sond pomiarowych. Przeprowadzić reakcję w 20 μL końcowej objętości, zawierającej 2 μL 10x mieszaniny NTP, 2 μL 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, 1 μL inhibitora RNazy, 2 μL polimerazy RNA T7 lub SP6, 4 μL 0,5 μg/μL zlinearyzowanego plazmidu i 9 μLH2Owolnego od RNaz, następnie 3 godziny inkubacji w temperaturze 37 °C.
    2. Inkubować sondy antysensowne i wykrywające znakowane DIG i biotyną przez 30 minut z 1 μl DNazy w temperaturze 37 °C. Dodać 2,5 μl 5 M LiCl i 75 μl absolutnego etanolu, a następnie inkubować reakcje przez 30 minut w temperaturze -70 °C.
    3. Wirować przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant. Dodaj 150 μl 70% etanolu, aby przepłukać środek strącający. Przygotuj 70% etanol (1 l), dodając 95% etanolu (736,8 ml) do sterylnej wody destylowanej (263,2 ml).
    4. Ponownie odwirować przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i wysuszyć osad na powietrzu przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 25 μl H2O wolnego od RNaz, aby rozpuścić antysensowne sondy RNA i czujnikowe.
    5. Jeśli długość wstawionego genu jest dłuższa niż 1 kb, następnie fragmentuj antysens RNA i sonduj wyczuwanie do średniej długości ~ 300 pz przez inkubację w roztworach buforowych wodorowęglanowo-węglanowych. Przeprowadzić reakcję w końcowej objętości 50 μl, zawierającej 25 μl sondy RNA i 25 μl roztworu buforowego wodorowęglanowo-węglanowego (80 mM NaHCO3, 120 mM Na2CO3, pH 10,2) w temperaturze 60 °C. Wymagany czas hydrolizy jest określony przez wcześniej opublikowany wzór17.
    6. Dodać 5 μl 10% kwasu octowego, aby zatrzymać reakcję. W tym eksperymencie należy rozdrobnić sondy antysensowne i sensowne LmigOR2 i LmigORco odpowiednio przez 24 i 23 minut.
      t = (Lo-L f)/kXLoXLf
      Lo = początkowe długości fragmentów w kb
      Lf = końcowa długość fragmentu w kb
      k = stała szybkości hydrolizy, około 0,11 KB-1 min-1
      t = czas hydrolizy w min
    7. Na koniec dodać 250 μl buforu hybrydyzacyjnego i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie sekcji kriostatu

  1. Schłodzić mikrotom do zamrażania do temperatury -24 °C.
  2. Wybierz nowe dorosłe szarańcze, które linieją i mają nienaruszone czułki. Pokrój anteny na kawałki 2-3 mm za pomocą sterylnych maszynek do golenia.
  3. Umieść związek O.C.T. na uchwycie mikrotomu do zamrażania i umieść jedną lub dwie próbki na związku poziomo. Następnie przenieść posiadacza do mikrotomu zamrażającego w temperaturze -24 °C, aby zrównoważyć stan mieszanki aż do zamarznięcia. Wyjmij uchwyt i przykryj próbki niewielką ilością związku. Ponownie przenieść uchwyt do mikrotomu zamrażającego w temperaturze -24 °C na co najmniej 10 minut (Rysunek 1).
    UWAGA: Unikaj dostania się pęcherzyków do związku.
  4. Zamocować uchwyt z próbkami w mikrotomie do zamrażania, a następnie podzielić zamrożone próbki na plastry o grubości 12 μm w temperaturze -24 °C.
  5. Rozmrozić, ułożyć plastry jeden po drugim na szkiełkach podstawowych (25 x 75 mm; bez nukleaz) i wysuszyć na powietrzu przez 10 minut.

3. Mocowanie sekcji

  1. Po przygotowaniu skrawków kriostatu umieścić szkiełka w plastikowym pojemniku (~100 x 40 x 80 mm) i utrwalić tkanki, inkubując szkiełka w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Myć szkiełka w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 1 minutę.
  3. Aby wyeliminować białka alkaliczne, przenieś szkiełka do 0,2 M HCl na 10 minut.
  4. Aby wyeliminować białko powierzchniowe kwasu nukleinowego, przenieś szkiełka do 1XPBS z 1% Triton X-100 na 2 minuty.
  5. Umyj szkiełka dwukrotnie przez 30 s w 1x PBS.
  6. Na koniec płukać szkiełka w roztworze formamidu przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

4. Hybrydyzacja

  1. Przygotuj sondy antysensowne i czujnikowe
    1. Użyj buforu hybrydyzacyjnego do rozcieńczenia antysensu RNA lub sond wykrywających w 1,5 ml probówkach bez nukleazy. W tym eksperymencie, dla wszystkich sond antysensownych i sensownych (LmigOR1, LmigOR2 i LmigOrco), dodaj 1 μl sondy do 99 μl buforu hybrydyzacyjnego na szkiełko. Ogólnie rzecz biorąc, użycie rozcieńczeń sond antysensownych w stosunku 1:100 powoduje uzyskanie znaczących sygnałów dodatnich i niskiego tła przy użyciu tego protokołu.
    2. W celu detekcji chromogennej należy rozcieńczać sondy z oznaczeniem DIG pojedynczo.
    3. W celu wykrycia TSA rozcieńczyć LmigOR1 znakowany DIG za pomocą sond LmigOrco znakowanych biotyną lub LmigOR2 znakowany DIG sondami LmigOR1 znakowanymi biotyną razem w buforze hybrydyzacyjnym
      4. .
    4. Podgrzewać rozcieńczenia przez 10 minut w temperaturze 65 °C i umieszczać je na lodzie na co najmniej 5 minut.
  2. krzyżowanie
    1. Opróżnić szkiełka i dodać 100 μl rozcieńczonych sond antysensownych i czujnikowych (krok 4.1) do skrawków tkanki. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe (24 mm x 50 mm; bez nukleazy) na skrawkach tkanki.
    2. Umieść zakryte szkiełka poziomo w wilgotnym pudełku (∼300 x 180 x 50 mm3; Rysunek 2) i inkubować w temperaturze 55 °C przez 22 godziny. Dodaj roztwór formamidu lub 1X PBS na dno pudełka, aby utrzymać wilgotne środowisko, ale nie zanurzaj szkiełek w płynie.
  3. Mycie i blokowanie.
    1. Po hybrydyzacji ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe. Umyć szkiełka dwukrotnie przez 30 minut w 0,1x sól fizjologiczna z cytrynianu sodu (SSC) w temperaturze 60 °C.
      UWAGA: Mycie polega na umieszczeniu szkiełek w uchwycie na szkiełka, który następnie umieszcza się w plastikowym pojemniku i delikatnie miesza na bujaku (~50 obr./min; Rysunek 2).
    2. Płucz szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) przez 30 s.
    3. Dodać 1 ml 1% odczynnika blokującego do TBS uzupełnionego 0,03% Triton X-100 na każde szkiełko i inkubować przez 30 minut. Następnie wyrzuć roztwór blokujący.
  4. Immunohistochemia.
    1. Do wykrywania chromogennego należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 jednostek (U)/ml przeciwciała sprzężonego z anty-digoksygeniną AP do 1,5 U/ml roztworu AP. Dodać 100 μl roztworu AP na zakryte szkiełko (24 mm x 50 mm).
    2. Do wykrywania TSA należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 U/ml przeciwciała sprzężonego z anty-digoksygeniną AP- i przeciwciała sprzężonego z anty-biotyną streptawidyną HRP do roztworu AP/HRP. Dodać 100 μl roztworu AP/HRP na zakryte szkiełko (24 mm x 50 mm).
    3. Inkubować szkiełka w wilgotnym pudełku (Rysunek 2) przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Użyj roztworu formamidu lub 1X PBS, aby pudełko było wilgotne, ale nie rozmoczone.

5. Barwienie

  1. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe. Umyj szkiełka trzy razy przez 5 minut w 1x TBS uzupełnionym 0,05% Tween-20. Przepłukać szkiełka w buforze DAP (wykrywanie chromogenne: pH 9,5; Wykrywanie TSA: pH 8,0) przez 5 min.
  2. Barwienie (detekcja chromogenna)
    1. Dodać 100 μl roztworu substratu NBT (375 μg/ml)/BCIP (188 μg/ml) (rozcieńczonego w DAP; pH 9,5) do każdego szkiełka. Ostrożnie umieść szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm) na szkiełkach.
    2. Inkubować szkiełka w wilgotnym pojemniku z roztworem substratu przez 10 minut - O/N w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Sprawdź rozwój, patrząc od czasu do czasu na szkiełka pod mikroskopem.
    3. Gdy rozwój jest gotowy, zatrzymaj reakcję, przenosząc szkiełka do wody.
  3. Barwienie (wykrywanie TSA)
    1. Za pomocą strzykawki przesunąć substrat HNPP (100 μg/ml)/Fast Red (250 μg/ml) z filtra strzykawkowego (0,22 μm; Rysunek 2).
    2. Dodać 100 μl podłoża HNPP/Fast Red na szkiełko pokryte szkiełkiem nakrywkowym (24 x 50 mm). Inkubować szkiełka przez 30 minut z podłożem HNPP/Fast Red w temperaturze pokojowej.
    3. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez 5 minut w 1X TBS uzupełnionym 0,05% Tween-20.
    4. Użyj 100 μl podłoża TSA/szkiełka przykrytego (24 x 50 mm2). Inkubować szkiełka z substratem TSA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez 5 minut w 1x TBS uzupełnionym 0,05% Tween-20.
  4. Osadź szkiełka w PBS/glicerolu (1:3).
    UWAGA: Po zakończeniu tych procedur należy jak najszybciej obserwować szkiełka, ponieważ sygnał fluorescencyjny szybko wygaśnie.

6. Obserwacja

  1. Detekcja chromogenna
    1. Obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu optycznego. Wybierz soczewki obiektywowe 10X, 20X i 40X, aby obserwować wyniki detekcji chromogenicznej.
    2. Użyj oprogramowania DP-BSW, aby przeanalizować wyniki i uchwycić obrazy.
  2. Detekcja TSA
    1. Obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Geny znakowane DIG powinny być obserwowane w świetle o długości fali 543 nm, o barwie czerwonej, a geny znakowane biotyną powinny być obserwowane w świetle o długości fali 488 nm, o zielonym kolorze. Kiedy się pojawiają, mają żółty kolor.
    2. Wybierz soczewki obiektywowe 20X i 40X, aby obserwować wyniki detekcji TSA.
    3. Użyj oprogramowania FV1000, aby przeanalizować wyniki i uchwycić obrazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku wykrywania chromogenicznego niewielki podzbiór komórek czułkowych w każdym przekroju czułka dorosłego osobnika został oznaczony sondami antysensownymi doznanymi DIG skierowanymi przeciwko LmigOR1 i LmigOR2 (Rycina 3). Badanie lokalizacji LmigOR1 i LmigOR2 metodą RNA ISH na kolejnych przekrojach wykazało, że komórki czułkowe eksprymujące te dwa geny znajdowały się w skupiskach neuronów receptorycznych (ORN) ekspr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Trudno jest wykonać RNA ISH w celu zlokalizowania genów OR w czułkach owadów, ponieważ poziomy ekspresji genów OR, z wyjątkiem ORco, są bardzo niskie, a zachowanie histologicznych wycinków czułków owadów jest bardzo trudne. Ponadto wykrywanie TSA jest również bardzo trudne. Aby rozwiązać te problemy, należy podjąć następujące środki. Czułki są wybierane spośród nowo liniejących dorosłych szarańczy, które mają cienkie i miękkie skórki czułkowe, które zachowują swoją morfologię na szkiełku. Zamrożone próbki dzieli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają żadnych innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (No.31472037). Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tym artykule ma na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
2&razy; TSINGKETM Master MixTSINGKE, ChinyTSE004
Bez RNaz H2OTIANGEN, ChinyRT121-02
REGULAR AGAROSE G-10BIOWEST, HISZPANIA91622
Bufor wiążącyTIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, ChinyDP209-02
Bufor balansującyTIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, ChinyDP209-02
Roztwór do myciaTIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, ChinyDP209-02
T VectorPromega, USAA362A
T4 DNA LigazaPromega, USAM180A
Escherichia coli DH5αTIANGEN, ChinyCB101
AmpicillinSigma, USAA-6140
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydInalco, USA1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozydSBS Genetech, ChinyGX1-500
Nco IBioLabs, Nowa AngliaR0193S
Spe IBioLabs, Nowa AngliaRNA R0133M
RNARoche, Szwajcaria11175025910
Zestaw do znakowania RNA biotynyRoche, Szwajcaria11685597910
Zestaw do znakowania RNA DNase DIG, Roche, Szwajcaria11175025910
LiClSinopharm, Chiny10012718
EtanolSinopharm, Chiny10009257
Kwas octowyBEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, Chiny10000292
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Holandia4583
SlajdyTINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, ChinyFISH0010
HClSinopharm, Chiny80070591
MillexMillipore, Stany ZjednoczoneSLGP033RS
Tween 20AMRESCO, Stany Zjednoczone0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chlorek / 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan toluidynysól Roche, Szwajcaria11175041910
GlycerolSinopharm, Chiny10010618
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solutions
1&razy; Tris-octan-EDTASigma, USAV900483-1KG0,04 mol/L Tris-Base
1 razy; Tris-acetate-EDTABEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, Chiny100002920,12% kwasu octowego
1 razy; Tris-octan-EDTASigma, Stany Zjednoczone03677Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)
Płynne podłoże Luria-Bertani (LB)Sinopharm, Chiny1001939210 g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) płynne podłożeMERCK, NiemcyVM33523110 g/L Pepton z kazeiny (Trypton)
Płynne podłoże Luria-Bertani (LB)MERCK, NiemcyVM3615265 g/L Ekstrakt drożdżowy
Płyta z twardym podłożem LBSinopharm, Chiny1001939210 g/L NaCl
LB płyta z podłożem stałymMERCK, NiemcyVM33523110 g/L Pepton z kazeiny (tryptonu)
LB płyta z podłożem stałymMERCK, NiemcyVM3615265 g/L Ekstrakt drożdżowy
Płytka z podłożem stałym LBŻUBR ING, Kanada800-010-CG15 g/L Agar klasy bakteriologicznej
10 i razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,1)Sinopharm, Chiny100193928,5% NaCl
10 razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,1)Sigma, USAV900041-500G14 mM KH2PO4
10&razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,1)Sigma, USAV900268-500G80 mM Na2HPO4
10&razy; Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS, pH 7,5)Sigma, USAV900483-1KG1 M Tris-Base
10&razy; Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS, pH 7,5)Sinopharm, Chiny100193921,5 M
bufor do wykrywania NaCl (DAP)           detekcja chromogenna pH 9,5            Detekcja TSA pH 8.0Sigma, USAV900483-1KG100 mM
Bufor detekcyjny Tris-Base (DAP)           detekcja chromogenna pH 9,5            Detekcja TSA pH 8,0Sinopharm, Chiny10019392100 mM
Bufor detekcyjny NaCl (DAP)           detekcja chromogenna pH 9,5            Detekcja TSA pH 8,0Sigma, USAV900020-500G50 mM MgCl2· 6H2O
20 razy; cytrynian soli i sodu (pH 7,0)Sinopharm, Chiny100193923 M NaCl
20 razy; sól fizjologiczno-sodowa cytrynian (pH 7,0)Sigma, USAV900095-500G0,3 M Na-cytrynian
4% roztwór paraformaldehydu (PFA, pH 9,5)Sigma, USAV900894-100G4% paraformaldehyd
Bufor węglanu soduSigma, USAV900182-500G0,1 M NaHCO3
Bufor węglanu sodu (pH 10,2)Sigma, USAV900182-500G80 mM NaHCO3
węglanu sodu sub> (pH 10,2)Sigma, USAS7795-500G120 mM Na2CO3
Roztwór formamidu (pH 10,2)MPBIO, USAFORMD002 50% Dejonizowany roztwór formamidu formamidu
(pH 10,2)5&razy; Bufor blokujący cytrynian soli soli
w TBSRoche, Szwajcaria111750419101%
Bufor blokujący blot w TBSAMRESCO, USA0694-500ML0,03% Bufor blokujący Triton X-100
w TBS1 razy; Buforowany roztworem
fosfatazy alkalicznejRoche, Szwajcaria111750419101,5 U/ml przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną anty-digoksygeniny
Bufor blokujący w TBS
przeciwciało
Fosfataza alkaliczna / roztwór peroksydazy chrzanowejZestaw TSA, Perkin Elmer, USANEL701A001KT 1% przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową antybiotyną streptawidyny - przeciwciało sprzężone
fosfatazą alkaliczną / roztworemBufor blokujący w
buforze hybrydyzacyjnymTBS MPBIO, USAFORMD00250% dejonizowana
hybrydyzacja formamidu Bufor2 razy; Bufor hybrydyzacyjny solowo-sodowy cytrynian
sodu Sigma, USAD8906-50G10% siarczan dekstranu
Bufor hybrydyzacyjnyinvitrogen, USAAM711920 i mikro; g / ml drożdży t-RNA
Bufor hybrydyzacyjnySigma, USAD3159-10G0,2 mg / ml DNA plemników śledzia
Fosforan 2-hydroksy-3-naftoinowy-2'-fenylanilidu / 4-chloro-2-metylobenzenodiazonium substrat soli hemi-chlorkuRoche, Szwajcaria117588880011% fosforan kwasu 2-hydroksy-3-naftoinowego-2'-fenylanilidu (10 mg / ml)
Fosforan kwasu 2-hydroksy-3-naftoinowego-2'-fenylanilidu / substrat soli chlorku hemi-4-chloro-2-metylobenzenodiazoniumRoche, Szwajcaria117588880011% sól hemi chlorku 4-chloro-2-metylobenzenodiazonium (25 mg / ml)
kwasu 2-hydroksy-3-naftoinowego-fosforan 2'-fenylanilidu / substrat soli hemi chlorku 4-chloro-2-metylobenzenodiazoniumBufor detekcji
substrat wzmacniającyZestaw TSA, Perkin Elmer, USANEL701A001KT 2% fluoresceiny-tyramidy
Podłoże do wzmacniania sygnału TyramidZestaw TSA, Perkin Elmer, USANEL701A001KT Rozcieńczalnik do amplifikacji
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrument
Zamrażanie mikrotomLeica, Nussloch, NiemcyJung CM300 krioskop
SpektrofotometrThermo SCIENTIFIC, USANANODROP 2000
Mikroskop optycznyOlympus, Tokio, JaponiaMikroskop Olympus IX71
Mikroskop konfokalnyOlympus, Tokio, JaponiaOlympus BX45 mikroskop
Zestaw do znakowania Tris Fosfataza alkaliczna / roztwór peroksydazy chrzanowej Roche, Szwajcaria 11175041910 1,5 U/ml sprzężona fosfataza alkaliczna anty-digoksygeniny z peroksydazy chrzanu Sygnał tyramidowy konfokalny

Bibliografia

  1. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  2. Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
  3. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  4. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
  5. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  6. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  7. Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
  8. Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
  9. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
  10. Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
  11. Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412(2013).
  12. Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50(2013).
  13. Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
  14. Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
  15. You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
  16. Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33(2016).
  17. Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2(1992).
  18. Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
  19. Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
  20. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
  21. Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

neurony receptorowe węchowechemosensilladwukolorowa hybrydyzacja fluorescencyjnagen markerowy Orcodetekcja chromogennadetekcja TSAmikroskopia konfokalna
Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.