Tradycyjne eksperymenty z elektroforezą żelową (SGE) wymagają skomplikowanej aparatury i dużego zużycia chemikaliów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który opisuje tanią metodę separacji fragmentów DNA w krótkim czasie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie separacji fragmentów DNA w czasie rzeczywistym za pomocą smartfona
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektroforeza żelowa (SGE) jest najpowszechniejszą metodą rozdzielania fragmentów DNA, dlatego jest szeroko stosowana w dziedzinie biologii i innych. Jednak tradycyjny protokół SGE jest dość żmudny, a eksperyment zajmuje dużo czasu. Co więcej, zużycie środków chemicznych w eksperymentach SGE jest bardzo wysokie. W niniejszej pracy zaproponowano prostą metodę separacji fragmentów DNA w oparciu o chip SGE. Chip jest wytwarzany przez maszynę do grawerowania. Dwa arkusze z tworzywa sztucznego służą do długości fal wzbudzenia i emisji sygnału optycznego. Sygnał fluorescencyjny prążków DNA jest zbierany przez smartfon. Aby potwierdzić tę metodę, rozdzielono drabinki DNA o długości 50, 100 i 1000 pz. Wyniki pokazują, że drabina DNA mniejsza niż 5000 pz może być rozdzielona w ciągu 12 minut i z wysoką rozdzielczością przy użyciu tej metody, co wskazuje, że jest to idealny substytut tradycyjnej metody SGE.
Wprowadzenie
Elektroforeza żelowa (SGE) jest najskuteczniejszą metodą separacji fragmentów DNA1,2,3,4,5 i dlatego jest uważana za wszechstronne narzędzie w analizach biochemicznych i biologicznych6,7,8. Jednak wiele eksperymentów wskazuje, że SGE jest ograniczony przez następujące cztery problemy: (1) separacje trwają wiele godzin, a nawet dni; (2) zużycie chemikaliów jest bardzo wysokie; (3) wymaga skomplikowanej aparatury (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Podstawowy projekt układu SGE
- Użyj dowolnego przezroczystego tworzywa sztucznego, takiego jak polimetakrylan metylu (PMMA) lub poliwęglan.
Uwaga: Układ SGE jest pokazany w Rysunek 1B. Chip SGE składa się z cylindrycznych otworów na bufor TBE, kanałów do separacji DNA oraz dwóch linii osadzonych wzdłuż otworów na elektrodę. - Wytwarzanie układów kanałów SGE w bloku PMMA za pomocą maszyny do grawerowania laserowego.
Uwaga: Parametry geometryczne chipa zależą od wielkości DNA, które ma zostać oddzielone. Na przykład optymalne parametry kanału dla chipa SGE to 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (szerokość x głębokość ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 4, Rysunek 5 oraz Rysunek 6 przedstawiają typowy wynik po elektroforezie żelowej markerów DNA 50, 100 i 1 000 bp. Po zakończeniu eksperymentu fragmenty DNA zostały dobrze rozdzielone. Ponadto te same próbki rozdzielono w 4 kanałach chipu SGE, co wykazało, że fragmenty DNA o tej samej wielkości przemieszczają się na tę samą odległość w każdym eksperymencie.
Wydajność rozdziału drabinki DNA można oc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Elektroforeza w żelu agarozowym jest szeroko stosowana do oddzielania DNA, RNA i białka. W niniejszej pracy zaproponowano nową metodę, która zastąpi tradycyjny protokół elektroforezy żelowej. Wyniki pokazują, że drabinki DNA o długości 50, 100 i 1000 pz mogą być dobrze oddzielone w tak małym zmontowanym urządzeniu. Ogromną zaletą tej metody jest to, że nie tylko może ona oddzielić kwasy nukleinowe przy niewielkim zużyciu środków chemicznych, ale może również rejestrować proces separacji. Chociaż na r.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłasza się konfliktu interesów.
Podziękowania
Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 21205078) oraz Funduszu Badawczego dla Programu Doktorskiego Szkolnictwa Wyższego Chin (nr 20123120110002). Prace te były częściowo wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFB1102303), Narodowy Program Badań Podstawowych Chin (973Program; 2015CB352001) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (61378060).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 i razy; TBE | Beijing Solarbio Nauka & Technologia Co., Sp. z o.o. | T1051 | |
| 50 pz drabinka DNA | Takara Bio Inc. | 3421A Drabinka | |
| DNA 100 pz | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp Drabinka DNA | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR ZIELONY | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich V900510 |
Bibliografia
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
