Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Śledzenie separacji fragmentów DNA w czasie rzeczywistym za pomocą smartfona

14.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55926

⸱

1 czerwca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Lab of Modern Optical System, University of Shanghai for Science and Technology, 2Department of Applied Physics, Graduate School of Engineering, Osaka University, 3East China University of Science and Technology, Department of Physics Faculty of Science

W tym artykule

Podsumowanie

Tradycyjne eksperymenty z elektroforezą żelową (SGE) wymagają skomplikowanej aparatury i dużego zużycia chemikaliów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który opisuje tanią metodę separacji fragmentów DNA w krótkim czasie.

Streszczenie

Elektroforeza żelowa (SGE) jest najpowszechniejszą metodą rozdzielania fragmentów DNA, dlatego jest szeroko stosowana w dziedzinie biologii i innych. Jednak tradycyjny protokół SGE jest dość żmudny, a eksperyment zajmuje dużo czasu. Co więcej, zużycie środków chemicznych w eksperymentach SGE jest bardzo wysokie. W niniejszej pracy zaproponowano prostą metodę separacji fragmentów DNA w oparciu o chip SGE. Chip jest wytwarzany przez maszynę do grawerowania. Dwa arkusze z tworzywa sztucznego służą do długości fal wzbudzenia i emisji sygnału optycznego. Sygnał fluorescencyjny prążków DNA jest zbierany przez smartfon. Aby potwierdzić tę metodę, rozdzielono drabinki DNA o długości 50, 100 i 1000 pz. Wyniki pokazują, że drabina DNA mniejsza niż 5000 pz może być rozdzielona w ciągu 12 minut i z wysoką rozdzielczością przy użyciu tej metody, co wskazuje, że jest to idealny substytut tradycyjnej metody SGE.

Wprowadzenie

Elektroforeza żelowa (SGE) jest najskuteczniejszą metodą separacji fragmentów DNA1,2,3,4,5 i dlatego jest uważana za wszechstronne narzędzie w analizach biochemicznych i biologicznych6,7,8. Jednak wiele eksperymentów wskazuje, że SGE jest ograniczony przez następujące cztery problemy: (1) separacje trwają wiele godzin, a nawet dni; (2) zużycie chemikaliów jest bardzo wysokie; (3) wymaga skomplikowanej aparatury (np. ogniwa do elektroforezy 2D, zasilacza do elektroforezy i systemu obrazowania żelowego); (4) system obrazowania żelowego może obserwować oddzielone fragmenty DNA dopiero po zakończeniu eksperymentu. Ponadto bromek etydyny (EtBr), który jest powszechnie stosowany w SGE9,10, jest mutagenny i rakotwórczy11,12. Dlatego podczas wręczania żeli zawierających EtBr należy zawsze nosić rękawiczki.

Elektroforeza kapilarna (CE) ma wiele zalet13,14,15,16,17 w porównaniu do SGE, takich jak automatyczna praca, krótki czas separacji i niższe zużycie. Jednak instrument CE jest dość drogi. Dlatego, aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano system (ryc. 1) do separacji DNA. Taki system może nie tylko znacznie zmniejszyć zużycie chemikaliów i zaoszczędzić czas eksperymentu SGE (<8 min), ale może również śledzić w czasie rzeczywistym proces separacji DNA w żelu agarozowym za pomocą smartfona. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tym protokole, studenci powinni być w stanie zaprojektować i wyprodukować chip SGE, przygotować żel agarozowy w chipie, skonfigurować prosty system SGE za pomocą smartfona i zarejestrować proces migracji DNA w żelu agarozowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Podstawowy projekt układu SGE

  1. Użyj dowolnego przezroczystego tworzywa sztucznego, takiego jak polimetakrylan metylu (PMMA) lub poliwęglan.
    Uwaga: Układ SGE jest pokazany w Rysunek 1B. Chip SGE składa się z cylindrycznych otworów na bufor TBE, kanałów do separacji DNA oraz dwóch linii osadzonych wzdłuż otworów na elektrodę.
  2. Wytwarzanie układów kanałów SGE w bloku PMMA za pomocą maszyny do grawerowania laserowego.
    Uwaga: Parametry geometryczne chipa zależą od wielkości DNA, które ma zostać oddzielone. Na przykład optymalne parametry kanału dla chipa SGE to 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (szerokość x głębokość x długość), jeśli fragment DNA jest mniejszy niż 1 000 pz.
  3. W oparciu o projekt SGE wyprodukuj grzebienie, aby stworzyć dołki w chipie do ładowania próbki DNA.

2. Przygotowanie żelu agarozowego

  1. Przygotować 0,5× TBE, mieszając 10× TBE (1× TBE = 89 mM Tris, 89 mM kwasu borowego i 2 mM EDTA; pH 8,4) i wody destylowanej w stosunku 1:19.
  2. Przygotuj 1,0% żel agarozowy do separacji drabinek DNA 100-pz.
    Uwaga: Stężenie agarozy w 0,5-krotnym buforze TBE zależy od wielkości fragmentów DNA, które mają zostać oddzielone.
  3. Umieścić 0,1 g agarozy w kolbie i dodać 10 ml 0,5 x buforu TBE.
    Uwaga: Objętość przygotowanego roztworu powinna być mniejsza niż 1/3 pojemności kolby.
  4. Uszczelnić kolbę folią konserwującą, a następnie podgrzać mieszaninę agarozy i buforu w kuchence mikrofalowej (pożywka, 1,0 min). Przed włożeniem kolby do kuchenki mikrofalowej należy zrobić kilka otworów w folii konserwującej na wypadek wybuchu.
  5. Wlej 2,7 ml stopionego roztworu agarozy do 4 kanałów chipa SGE. Umieść grzebień w roztworze agarozy, aby utworzyć dołki.
    Uwaga: Stopiony roztwór agarozy ostygnie do stanu żelu w temperaturze pokojowej 3 minuty później.
  6. Wyjmij grzebień z żeli i dodaj 0,9 ml 0,5x buforu TBE, aby pokryć żel.

3. Uruchamianie elektroforezy w chipie SGE

  1. Włącz źródło światła LED i umieść filtr pasmowoprzepustowy od 425 do 505 nm nad źródłem światła.
  2. Wymieszaj 14,4 μl drabinki DNA o stężeniu 100 pz i 1,6 μl SYBR Green za pomocą wirownika.
  3. Załaduj 4 μl mieszaniny do każdego dołka żelu agarozowego w chipie SGE (Rysunek 2).
  4. Umieść elektrodę na dwóch torach chipa SGE.
  5. Umieść filtr pasmowoprzepustowy od 550 do 700 nm nad chipem SGE.
  6. Włącz źródło zasilania. Ustaw napięcie elektryczne na 180 V (20 V/cm). Włącz smartfon, aby nagrać proces separacji fragmentów DNA (Rysunek 3).
  7. Gdy elektroforeza zostanie zakończona 10 minut później, wyłącz źródło zasilania i światło LED.
  8. Wyczyść chip SGE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 4, Rysunek 5 oraz Rysunek 6 przedstawiają typowy wynik po elektroforezie żelowej drabin DNA 50, 100 i 1 000 bp. Po zakończeniu eksperymentu fragmenty DNA zostały dobrze rozdzielone. Ponadto te same próbki rozdzielono w 4 kanałach chipa SGE, co wykazało, że fragmenty DNA o tej samej wielkości przebywają taką samą odległość w każdym eksperymencie.

Wydajność rozdzielania drabiny DNA można ocenić popr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Elektroforeza w żelu agarozowym jest szeroko stosowana do oddzielania DNA, RNA i białka. W niniejszej pracy zaproponowano nową metodę, która zastąpi tradycyjny protokół elektroforezy żelowej. Wyniki pokazują, że drabinki DNA o długości 50, 100 i 1000 pz mogą być dobrze oddzielone w tak małym zmontowanym urządzeniu. Ogromną zaletą tej metody jest to, że nie tylko może ona oddzielić kwasy nukleinowe przy niewielkim zużyciu środków chemicznych, ale może również rejestrować proces separacji. Chociaż na r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 21205078) oraz Funduszu Badawczego dla Programu Doktorskiego Szkolnictwa Wyższego Chin (nr 20123120110002). Prace te były częściowo wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFB1102303), Narodowy Program Badań Podstawowych Chin (973Program; 2015CB352001) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (61378060).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 i razy; TBEBeijing Solarbio Nauka & Technologia Co., Sp. z o.o.T1051
50 pz drabinka DNATakara Bio Inc.3421A Drabinka
DNA 100 pzTakara Bio Inc.3422A
1 kbp Drabinka DNATakara Bio Inc.3426A
SYBR ZIELONYTakara Bio Inc.5760A
AgaroseSigma-Aldrich V900510
korporacyjny

Bibliografia

  1. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
  2. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
  3. Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
  4. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
  5. Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
  6. Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
  7. Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
  8. Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
  10. Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
  11. Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
  12. Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
  13. Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
  14. Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
  15. Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
  16. Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
  17. Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
  18. Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektroforeza żelowa SNAPśledzenie za pomocą smartfonaprzygotowanie żelu agarozowegozastosowanie buforu TBEźródło światła LEDfiltr pasmowo-przepustowybarwienie SYBR Greensystem obrazowania żeli
Śledzenie separacji fragmentów DNA w czasie rzeczywistym za pomocą smartfona
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.