Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białko tau związane z mikrotubulami jest białkiem neuronalnym, które lokalizuje się głównie w aksonach. Ogólnie rzecz biorąc, tau jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania neuronów, ponieważ bierze udział w tworzeniu i stabilizacji mikrotubul. Oprócz neuronów, tau ulega ekspresji w ludzkim raku piersi, prostaty, żołądka, jelita grubego i trzustki, gdzie wykazuje prawie podobną budowę i pełni podobne funkcje jak neuronalne tau. Ilość tau i jego fosforylacja mogą zmienić jego funkcję jako stabilizatora mikrotubul i prowadzić do rozwoju sparowanych spiralnych włókien w różnych zaburzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera. Istotne jest określenie stanu fosforylacji tau i jego charakterystyki wiązania mikrotubul. Ponadto badanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji tau jest ważne w różnych chorobach. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje standardowe protokoły pomiaru fosforylacji tau i wiązania tau z mikrotubulami w komórkach raka jelita grubego z lub bez kurkuminy i leczenia LiCl. Zabiegi te mogą być stosowane w celu zatrzymania proliferacji i rozwoju komórek rakowych. Wewnątrzkomórkową lokalizację tau bada się za pomocą immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej przy użyciu niewielkich ilości przeciwciał. Testy te mogą być stosowane powtarzalnie do badań przesiewowych związków, które wpływają na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul. Nowatorskie terapie stosowane w różnych tauopatiach lub pokrewnych środkach przeciwnowotworowych można potencjalnie scharakteryzować za pomocą tych protokołów.
Wprowadzenie
Tau zostało pierwotnie zidentyfikowane jako stabilne termicznie białko związane z mikrotubulami, które zostało oczyszczone z tubuliną1. Tau jest wyrażane wyłącznie u wyższych eukariontów2,3,4. Główną funkcją tau jest kontrola montażu mikrotubul1,5,6. Przyczynia się również do polimeryzacji mikrotubul7, transport aksonalny8, zmiany średnicy aksonów9, powstawanie polaryzacji nerwiaka i neuro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Dodać 10 μl (1 mM) roztworu fluorku fenylometylosulfonylu, 10 μl (1x ze 100x bulionu) roztworu koktajlowego inhibitora proteazy i 10 μl (1x ze 100x bulionu) roztworu koktajlowego inhibitora fosfatazy do 1 ml 1x buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA), aby przygotować kompletny bufor do lizy RIPA.
- Przygotować 10x bufor ogólnego buforu tubuliny (PEM).
- Dodać 800 mM (6,0474 g) kwasu piperazyno-N-N'-bis-2-etanosulfonowego, 10 mM (95,1 mg) glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego, 10 mM (51 mg) MgCl2 i 1,25 M (3 ml 10 M) NaOH w probówce o pojemności....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ekspresję całkowitego białka tau oraz fosfo-tau badano po potraktowaniu komórek różnymi stężeniami kurkumy lub LiCl (Rycina 1). Potraktowanie komórek trzema różnymi stężeniami kurkumy obniżyło poziomy ekspresji tau; jednak ekspresja fosfo-tau wzrosła po zastosowaniu niskiego stężenia kurkumy, natomiast spadła po potraktowaniu komórek wyższymi stężeniami kurkumy. Do detekcji fosfo-tau użyto przeciwciał anty-fosfo-tau (Ser396). Poziomy zarówno całkowitego tau, .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W manuskrypcie tym ustalono różne warunki proceduralne wykrywania całkowitego tau i fosforylowanego tau w komórkach raka jelita grubego leczonych kurkuminą i LiCl. Aby ocenić ogólny stan fosforylacji tau w próbkach białek, opisano test fosfatazy. Test ten może być potencjalnie wykorzystany do zbadania stanu fosforylacji dowolnego białka.
Test ten opiera się na zasadzie, że ufosforylowane białko porusza się wolniej niż jego stan nieufosforylowany. W tym protokole stosuje się fosfatazę alkaliczn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Te badania zostały przeprowadzone w ramach projektu zatytułowanego 'Rozwój i industrializacja wysokiej jakości surowców kosmetycznych z morskich mikroalg', finansowanego przez Ministerstwo Oceanów i Rybołówstwa, Korea, i były wspierane przez grant (2Z04930) z KIST Gangneung Institute of Natural Products.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclon | SH30024.01 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| penicylina-streptomycyna | Hyklon | SV30010 | |
| roztwór trypsyny-EDTA | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm | Corning | 430161 | |
| 6-dołkowa płytka | Corning | Coster 3516 | |
| Przeciwciało anty-Tau 13 | abcam | ab19030 | |
| Ditiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Temperatura przechowywania: 2– 8 & stopnie; C |
| Wirówki mikrolitrowe | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Temperatura przechowywania 2– 8 & stopnie; C |
| Kurkumina | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Temperatura przechowywania 2– 8 & stopnie; C |
| Mikrotubule (MT) | Cytoszkielet | MT001 | Przechowywać w 4 & stopni; C (suchy) |
| Podłoże montażowe z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C w ciemności |
| Wodorotlenek sodu | Sigma | 72068 | |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Dysmubrator soniczny | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultrawirówka | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| RURY | Sigma | P1851 | |
| Surowica bydlęca Albumina (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Obrazownik molekularny | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C |
| Odczynnik barwnikowy do oznaczania białek | Bio-Rad | 500-0006 | |
| &alfa;-tubulina (11H10) MAb królika | Sygnalizacja komórkowa | 2125 | |
| GAPDH (14C10) MAb królika | Sygnalizacja komórkowa | 2118 | |
| Przeciwciało anty-Tau (fosfo S396) | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| FastAP Termoczuła fosfataza alkaliczna | Thermo Scientific | EF0651 | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| Inhibitor fosfatazy Sygnalizacja komórkowa | koktajlu 5870 | Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C | |
| Inhibitor proteazy Koktajl | komórkowy Sygnalizacja | 5871 | Przechowywać w 4 & stopni; C |
| Bufor RIPA | Sigma | R 0278 | Temperatura przechowywania 2– 8 & stopnie; C |
| Tau-352 człowiek | Sigma | T 9950 | Przechowuj pod kątem -20 & deg; C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Sklep na około 25 & deg; C |
| Membrana PVDF | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Kozie przeciwciało anty-mysie IgG Wtórne | przeciwciało ThermoFisher | A-11005 | Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C w ciemności |
| Mikroskopia konfokalna | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Test białka | Bio-Rad | 500-0006 | Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z |
Bibliografia
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neuro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
