Artykuł metodologiczny

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

DOI:

10.3791/55932

⸱

10 października 2017

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białko tau związane z mikrotubulami jest białkiem neuronalnym, które lokalizuje się głównie w aksonach. Ogólnie rzecz biorąc, tau jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania neuronów, ponieważ bierze udział w tworzeniu i stabilizacji mikrotubul. Oprócz neuronów, tau ulega ekspresji w ludzkim raku piersi, prostaty, żołądka, jelita grubego i trzustki, gdzie wykazuje prawie podobną budowę i pełni podobne funkcje jak neuronalne tau. Ilość tau i jego fosforylacja mogą zmienić jego funkcję jako stabilizatora mikrotubul i prowadzić do rozwoju sparowanych spiralnych włókien w różnych zaburzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera. Istotne jest określenie stanu fosforylacji tau i jego charakterystyki wiązania mikrotubul. Ponadto badanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji tau jest ważne w różnych chorobach. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje standardowe protokoły pomiaru fosforylacji tau i wiązania tau z mikrotubulami w komórkach raka jelita grubego z lub bez kurkuminy i leczenia LiCl. Zabiegi te mogą być stosowane w celu zatrzymania proliferacji i rozwoju komórek rakowych. Wewnątrzkomórkową lokalizację tau bada się za pomocą immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej przy użyciu niewielkich ilości przeciwciał. Testy te mogą być stosowane powtarzalnie do badań przesiewowych związków, które wpływają na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul. Nowatorskie terapie stosowane w różnych tauopatiach lub pokrewnych środkach przeciwnowotworowych można potencjalnie scharakteryzować za pomocą tych protokołów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau zostało pierwotnie zidentyfikowane jako stabilne termicznie białko związane z mikrotubulami, które zostało oczyszczone z tubuliną1. Tau jest wyrażane wyłącznie u wyższych eukariontów2,3,4. Główną funkcją tau jest kontrola montażu mikrotubul1,5,6. Przyczynia się również do polimeryzacji mikrotubul7, transport aksonalny8, zmiany średnicy aksonów9, powstawanie polaryzacji nerwiaka i neurodegeneracja10. Tau działa również jako rusztowanie białkowe do kontrolowania niektórych szlaków sygnałowych. Badania mózgu szczurów sugerują, że tau jest specyficzne dla neuronów i że lokalizuje się głównie w aksonach11. Ponieważ tau jest niezbędne do polimeryzacji mikrotubul i rozwoju neuronów, postawiono hipotezę, że tau odgrywa główną rolę w rozwoju aksonów w ośrodkowym układzie nerwowym; Hipoteza ta została później zweryfikowana w eksperymentach in vitro i in vivo. Oprócz neuronów, tau ulega ekspresji w różnych komórkach nieneuronalnych, w tym w komórkach wątroby, nerek i mięśni12,13. Tau ulega również ekspresji w ludzkich liniach komórkowych i tkankach raka piersi, prostaty, jelita grubego, żołądka i trzustki14,15,16,17,18,19. Tau występuje również w zapaleniu mięśni ciała inkluzji jako skręcone rurki w ciałach inkluzyjnych20.

Tau może zawierać kilka modyfikacji potranslacyjnych. Ze wszystkich modyfikacji potranslacyjnych fosforylacja jest najczęstsza. Zwiększona fosforylacja tau zmniejsza jego powinowactwo do mikrotubul, ostatecznie destabilizując cytoszkielet. Opisano osiemdziesiąt pięć miejsc fosforylacji w białku tau wyizolowanym z tkanek mózgowych człowieka z chorobą Alzheimera. Spośród tych miejsc 53% składa się z seryny, 41% treoniny, a tylko 6% reszt tyrozyny21,22,23. Fosforylacja tau wpływa na jego lokalizację, funkcję, wiązanie, rozpuszczalność i podatność na inne modyfikacje potranslacyjne. Również fosforylacja tau w stopniu większym niż normalnie (lub w pełni nasycona grupami fosforanowymi) jest znana jako hiperfosforylacja, która replikuje strukturalne i funkcjonalne cechy choroby Alzheimera24. Tau utrzymuje prawidłowe funkcjonowanie mikrotubul aksonalnych i zapewnia prawidłowe funkcjonowanie neuronów w warunkach fizjologicznych. Jednak hiperfosforylowane tau nie utrzymuje dobrze zorganizowanego wiązania mikrotubul, powodując utratę neuronów z powodu demontażu mikrotubul. Normalne poziomy fosforylacji tau są wymagane do prawidłowego funkcjonowania tau, ale tau nie funkcjonuje normalnie, jeśli jego charakterystyczny poziom fosforylacji jest zmieniony i jeśli jest hiperfosforylowany25. W chorobie Alzheimera i niektórych innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem tau ulega hiperfosforylacji i tworzy sparowane włókna spiralne i splątki neurofibrylarne26,27. Dlatego ważne są metody oznaczania fosforylacji tau i wiązania mikrotubul.

Rak jelita grubego, rak związany ze starzeniem się, jest trzecim najczęściej diagnozowanym nowotworem i trzecim najczęściej powodującym zgony nowotworem zarówno dla mężczyzn, jak i kobiet28. Rak jelita grubego jest jednym z głównych nowotworów powodujących zgony w świecie zachodnim29. Ponieważ zarówno rak jelita grubego, jak i choroba Alzheimera są związane ze starzeniem się i występują głównie w krajach rozwiniętych, gdzie ludzie mają podobne nawyki żywieniowe, te dwie choroby mogą być w jakiś sposób skorelowane. Ponadto tau-dodatnie i tau-ujemne komórki nowotworowe różnie reagują na chemioterapeutyki, np. paklitaksel16.

Kurkumina jest jedną z głównych pochodnych Curcuma longa, indyjskiej przyprawy kurkuma30. Od wieków populacje Azji Południowej codziennie spożywały kurkumę w swojej diecie. Kurkumina jest stosowana w leczeniu różnych chorób, w tym raka jelita grubego, choroby Alzheimera, cukrzycy, mukowiscydozy, nieswoistego zapalenia jelit, zapalenia stawów, hiperlipidemii, miażdżycy i choroby niedokrwiennej serca31,32,33,34,35,36,37,38. Lit może również zabijać komórki raka jelita grubego lub zapobiegać ich namnażaniu39. Lit może być również stosowany w leczeniu choroby Alzheimera40, ponieważ zmniejsza agregację tau i zapobiega jego hiperfosforylacji, co zaobserwowano w transgenicznym modelu myszy41,42,43,44.

Ten manuskrypt ma na celu: 1) zmierzenie całkowitego poziomu ekspresji tau i fosfo-tau w leczonych komórkach; 2) opisać test fosfatazy w celu pomiaru ogólnej fosforylacji tau; 3) zbadać wiązanie tau przez mikrotubule; i 4) zlokalizować tau za pomocą mikroskopii konfokalnej w liniach komórkowych raka jelita grubego leczonych kurkuminą lub LiCl. Wyniki pokazują, że leczenie komórkowe kurkuminą, która jest rzekomo dobrym środkiem chemioterapeutycznym w przypadku raka jelita grubego, oraz leczenie LiCl może zmniejszyć ekspresję zarówno całkowitego tau, jak i fosforylowanego tau w liniach komórkowych raka jelita grubego. Zabiegi te mogą również powodować translokację jądrową tau. Jednak nieoczekiwanie kurkumina nie poprawia wiązania tau z mikrotubulami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. Dodać 10 μl (1 mM) roztworu fluorku fenylometylosulfonylu, 10 μl (1x ze 100x bulionu) roztworu koktajlowego inhibitora proteazy i 10 μl (1x ze 100x bulionu) roztworu koktajlowego inhibitora fosfatazy do 1 ml 1x buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA), aby przygotować kompletny bufor do lizy RIPA.
  2. Przygotować 10x bufor ogólnego buforu tubuliny (PEM).
    1. Dodać 800 mM (6,0474 g) kwasu piperazyno-N-N'-bis-2-etanosulfonowego, 10 mM (95,1 mg) glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego, 10 mM (51 mg) MgCl2 i 1,25 M (3 ml 10 M) NaOH w probówce o pojemności 50 ml, wymieszać z 15 ml wody destylowanej i rozpuścić za pomocą wiru. Sprawdź pH (powinno wynosić 6,9). Jeśli pH > 6,9, wyrzuć bufor i przygotuj nową partię.
      UWAGA: NaOH powinien być poniżej 1,25 M, aby zapewnić, że pH nie przekroczy 6,9. Nie zaleca się stosowania HCl do regulacji pH >6,9.
    2. Dodawaj NaOH kroplami, aż pH wyniesie 6,9. Dodaj wodę destylowaną, aby uzupełnić do 25 ml 10X buforu PEM. Na koniec przefiltruj za pomocą strzykawki i filtra strzykawkowego 0,2 μm. Podzielić ten bufor na podwielokrotności w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować 5x bufor do próbek ze środkiem redukującym i barwnikiem.
    1. Wymieszaj 300 μl (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 ml (25%) 50% glicerolu, 1 ml (2%) 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1,2 ml wody destylowanej, aby uzupełnić 5 ml 5 ml buforu próbki 5x SDS. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Ponieważ glicerol jest lepki, pomiar 1,25 ml glicerolu jest trudny. Jeden ml 100% glicerolu waży 1,26 g. Tak więc najpierw zważ 1,575 g 100% glicerolu (co odpowiada 1,25 ml 100% lub 2,5 ml 50% glicerolu) w probówce o pojemności 15 ml; Dobrze wymieszaj z pozostałymi składnikami.

2. Hodowla komórkowa, leczenie kurkuminą lub LiCl oraz badanie ekspresji białek

  1. Dodać ~1 x 106 komórek HCT 116 do 100-milimetrowych szalek do hodowli tkankowych zawierających minimalną ilość niezbędnych pożywek (MEM) uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Po jednym dniu hodowli komórki osiągną 60-70% konfluencji.
    UWAGA: Liczba potrzebnych płytek zależy od liczby zabiegów opisanych poniżej.
  2. Gdy komórki osiągną ~65% konfluencji (przybliżonej za pomocą mikroskopii), usuń pożywkę uzupełnioną MEM i dodaj MEM bez surowicy z kurkuminą 5 μM, 10 μM i 30 μM lub 25 mM, 50 mM i 100 mM LiCl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  3. 24 godziny po poddaniu działaniu roztworu należy przemyć komórki 1 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zeskrobane komórki przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować przez 4 minuty w temperaturze 1 800 x g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek komórek.
  4. Poddać ogniwa lizie, zawieszając granulki w 100 μl kompletnego bufora RIPA w temperaturze 4 °C na 20 minut, regularnie stukając w probówki. Krótko poddać próbki działaniu sonikacji.
  5. Odwirować homogenaty komórkowe w wirówce stołowej o stężeniu 22 570 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do innych znakowanych probówek za pomocą pipety.
  6. Zmierz stężenie białka w supernatantach za pomocą testu Bradford45 przy użyciu komercyjnych zestawów do oznaczania białek.
  7. Przygotować próbki o równym stężeniu białka (10 μg białka/13 μl próbki) lizatów komórkowych z 4-krotnym buforem ładującym żel SDS. Przygotowany 4x świeży bufor żelowy SDS zawierający 400 mM ditiotreitol (DTT).
    UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  8. Próbki inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Wymieszać próbki za pomocą wiru i odczekać na ich ostygnięcie przez ~10-15 minut.
  9. Zmontuj system elektroforezy.
    1. Załadować 10 μg białka (13 μl próbki) na studzienkę na 10% żel poliakryloamidowy SDS do elektroforezy (SDS-PAGE). Załaduj drabinę o masie cząsteczkowej na żel na jeden pas.
      UWAGA: Gdy rozpocznie się elektroforeza, drabinka białkowa rozpadnie się na pasma białkowe o pozornej masie cząsteczkowej. Użyj tych prążków, aby oszacować masy cząsteczkowe nieznanych prążków białkowych.
    2. Po załadowaniu próbek podłącz elektrody dodatnie i ujemne systemu elektroforezy do źródła zasilania, aby utrzymać stałe napięcie. Początkowo należy rozpocząć od napięcia 70 V przez 20 minut, aby przenieść próbki białka z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego. Następnie zwiększ napięcie do 125 V na około 70-120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu.
    3. Po zakończeniu elektroforezy należy przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą mokrego systemu do elektrobibuły. Przenoszenie przez ~100 min przy napięciu 100 V. Zablokowanie błony w 4% buforze blokującym albuminę surowicy bydlęcej (BSA) na 90 minut w temperaturze pokojowej około 25 °C.
  10. Zaznacz plamę, przecinając ją z boku drabiną o masie cząsteczkowej. Do przecięcia kleksa użyj przezroczystego plastikowego arkusza i ostrego noża. Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych (anty-tau w stosunku 1:5 000; anty-fosfo-tau w stosunku 1:4 000) i inkubować blot w tym roztworze w temperaturze 4 °C przez noc.
  11. Po całonocnej inkubacji przemyć blot przez 7 minut czterokrotnie w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej Tween-20 (PBST).
  12. Przygotować odpowiednie roztwory przeciwciał drugorzędowych (kozi anty-królik lub anty-mysie IgG w stosunku 1:5 000) i inkubować blot w tym roztworze przez 90 minut w temperaturze pokojowej około 25 °C. Przemyć w PBST cztery razy po 7 minut każdy.
  13. Opracuj blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z zaleceniami producenta. Przykryj blot przezroczystą folią. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencji dla chemiluminescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

3. Test fosfatazy

  1. Potraktować lizaty komórkowe (od kroku 2.5) fosfatazą alkaliczną w buforze fosfatazy alkalicznej.
    1. Zarówno w przypadku próbek kontrolnych, jak i poddanych działaniu substancji należy przygotować 20 μl próbek zawierających 20 μg białka całkowitego. Dodać objętość lizatów komórkowych zawierających 20 μg białka ogółem, a następnie 2 μl buforu fosfatazy alkalicznej i 10 μl fosfatazy alkalicznej. Dodać wodę destylowaną do 20 μl.
  2. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zatrzymać reakcję przez dodanie kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o końcowym stężeniu 50 mM lub przez dodanie ortowanadanu sodu (Na3VO4) o końcowym stężeniu 10 mM. Reakcję można również zatrzymać przez ogrzewanie w temperaturze 75 °C przez 5 minut.
  3. Przed zakończeniem inkubacji próbek z fosfatazą należy przygotować próbki o tym samym stężeniu bez dodawania fosfatazy w celu porównania z próbkami poddanymi działaniu fosfatazy.
  4. Dodaj świeżo przygotowany bufor 4X SDS do ładowania żelu zawierający 400 mM naziemnej telewizji cyfrowej.
  5. Inkubować próbki w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Wymieszać próbki za pomocą wiru. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez ~ 10-15 min.
  6. Zmontuj system elektroforezy do uruchamiania 10% żelu poliakryloamidowego firmy SDS-PAGE.
    1. Załaduj 10 μg białka (13 μl próbki) na studzienkę na 10% żel poliakrylamidowy. Załaduj drabinę o masie cząsteczkowej.
    2. Po załadowaniu próbki podłącz elektrody dodatnie i ujemne systemu elektroforezy do źródła zasilania, aby utrzymać stałe napięcie. Początkowo należy rozpocząć od napięcia 70 V przez 20 minut, aby przenieść próbki białka z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego. Następnie zwiększ napięcie do 125 V i uruchom żel na około 70-120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu.
    3. Po zakończeniu elektroforezy należy przenieść żel na membranę PVDF za pomocą mokrego systemu do elektrobibuły. Przesył przez ~100 min przy 100 V.
    4. Zaznacz plamę, wykonując małe nacięcie z boku drabiny o masie cząsteczkowej. Do przecięcia kleksa użyj przezroczystego plastikowego arkusza i ostrego noża.
  7. Zablokować membranę w 4% buforze blokującym BSA na 90 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Inkubować blot w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (anty-tau w stosunku 1:5 000) w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj blot w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.
  9. Przygotować odpowiedni roztwór przeciwciała drugorzędowego (kozia anty-mysia IgG w stosunku 1:5 000) i inkubować blot przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Umyj w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.
  10. Opracuj blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z zaleceniami producenta. Przykryj plamę przezroczystą folią spożywczą. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencji dla chemiluminescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

4. Test wiązania mikrotubul

  1. W przypadku testu wiązania mikrotubul powtórzyć kroki 2.1-2.6.
  2. Przygotować 1X (2 ml) bufor PEM z 10X buforu PEM przechowywanego w temperaturze 4 °C, dodając 20 μM (40 μL) paklitakselu i 1 mM (20 μL) GTP. Pobrać wywar z mikrotubul (MT) z zamrażarki w temperaturze -80 °C, a materiał roboczy tau E. coli z zamrażarki w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować próbki zgodnie z tabelą 1.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Ultrawirować w temperaturze 25 °C przez 60 minut w temperaturze 100 000 x g.
  5. Przenieść 120 μl supernatantów zawierających niezwiązane tau do czystych i oznakowanych probówek.
  6. Dodać 120 μl (taka sama objętość jak supernatant) 5-krotnego buforu do próbki do osadu zawierającego związany tau i dokładnie wymieszać. Przenieś roztwór do czystych, oznakowanych probówek i dokładnie wymieszaj.
  7. Zmierzyć stężenie białka (patrz krok 2.6).
    UWAGA: Podczas przygotowywania próbek należy użyć objętości roztworu (krok 4.6) do przygotowania zarówno próbek osadu, jak i supernatantu.
  8. Przygotować próbki o równoważnym stężeniu białka i dodać świeżo przygotowany 4x SDS bufor do napełniania żelem zawierający DTT (400 mM).
    UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  9. Powtórz kroki 3.5-3.10.
próbkaNazwaPotrzebne mikrotubulePotrzebne główne białkoPEM-GTP-PTX
1HCT 116-Control (6,21 μg/μl)2 μl9,66 μl (60 μg)108.34 μl
cyfra arabskaHCT 116-kurkumina 10 μM (4,81 μg/μl)2 μl16.63 μl (80 μg )101.37 μl
3HCT 116-kurkumina 20 μM (3,28 μg/μl)2 μl30.49 μl (100 μg)87.51 μl
4HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl)2 μl18,42 μl (100 μg)99.58 μl
5E. coli tau2 μl1 μl tau-352117 μl
6MT2 μlX118 μl
120 μl każdy

Tabela 1: Przygotowanie próbki do testu wiązania mikrotubul.

5. Lokalizacja i ekspresja Tau po leczeniu komórek kurkuminą

  1. Wyczyść szkiełko nakrywkowe przy użyciu 70% etanolu i wysusz je chusteczką laboratoryjną. Umieścić pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku znakowanej 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umieść płytkę w szafie bezpieczeństwa biologicznego i włącz światło UV na co najmniej 3 godziny.
  2. Zahoduj komórki i wysiewaj je do odpowiednich dołków 6-dołkowej płytki o wymiarach 2,5 x 105 komórek/basenik w zalecanej pożywce hodowlanej.
  3. Po ~24 godzinach zbadaj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu, używając zarówno obiektywów 10X, jak i 40X, aby sprawdzić zmiany morfologiczne komórek. W razie potrzeby zrób zdjęcia.
  4. Przepłucz komórki dwukrotnie za pomocą PBS. Utrwalić komórki w 3,7% formaldehydzie w inkubatorze o temperaturze 37 °C w ciemności.
    UWAGA: Utrwalanie formaldehydem w temperaturze pokojowej również działa dobrze. Podczas obchodzenia się z formaldehydem należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  5. Umyj komórki w PBS. Utrwalić komórki w lodowatym metanolu w temperaturze -20 °C przez 15 minut. Przepuszczalność komórek poprzez inkubację w 3% BSA i 0,1% Triton X-100 w PBS na lodzie przez 10 minut. Umyj komórki PBS.
  6. Inkubować komórki w buforze blokującym (3% BSA i 0,1% Tween-20 w roztworze PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Inkubacja przez 2 godziny w temperaturze 4 °C również działa dobrze.
  7. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (anty-tau w stosunku 1:200) w 3% BSA i 0,1% Tween-20 w PBS (np. 2 μL przeciwciała tau-13 w 0,4 ml buforu).
  8. Wytnij małe kawałki membrany PVDF tak, aby pasowały do każdego dołka płytki 6-dołkowej; namocz je w wodzie na 5 minut. Umieść pocięty PVDF w każdym dołku.
  9. Dodaj 60 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do pociętych kawałków PVDF w każdym dołku. Umieść szkiełka nakrywkowe w taki sposób, aby komórki mogły stykać się z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować w temperaturze 4 °C w ciemnej, wilgotnej komorze przez noc. Umyj w PBS cztery razy.
  10. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego (anty-mysią IgG 594 sprzężoną z fluoresceiną w stosunku 1:400) w 3% BSA i 0,1% Tween-20 w PBS.
  11. Wytnij małe kawałki membrany PVDF tak, aby dobrze pasowały do każdej studzienki 6-dołkowej płytki i zanurz je w wodzie przez 5 minut. Umieść pocięty PVDF w każdym dołku.
  12. Dodać 80 μl roztworu przeciwciała wtórnego do każdego z kawałków PVDF na płytce 6-dołkowej. Umieść szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby komórki mogły dotknąć roztworu przeciwciała wtórnego. Inkubować w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Umyj PBS cztery razy.
  13. Umieścić próbki w podłożu montażowym za pomocą 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i przymocować szkiełka nakrywkowe do szkiełek podstawowych.
    1. Dodaj jedną kroplę medium montażowego z DAPI na szkiełka podstawowe. Usuń szkiełka nakrywkowe z każdej studzienki i umieść je na szkiełkach zawierających podłoże montażowe z DAPI. Upewnij się, że powierzchnia każdego szkiełka nakrywkowego zawierającego poplamione komórki styka się z podłożem mocującym na odpowiednim szkiełku podstawowym.
    2. Nałóż lakier do paznokci wokół każdego szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić i szczelnie przymocować je do szkiełek podstawowych. W razie potrzeby wykonaj ten krok dwukrotnie.
  14. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze.
  15. Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając olejku immersyjnego na szkiełku nakrywkowym w ciemnym pomieszczeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja całkowitego tau i fosfo-tau została zbadana po potraktowaniu komórek różnymi stężeniami kurkuminy lub LiCl (Rysunek 1). Leczenie komórek trzema różnymi stężeniami kurkuminy zmniejszyło poziomy ekspresji tau; Jednak ekspresja fosfo-tau wzrastała po leczeniu niskim stężeniem kurkuminy, ale zmniejszała się po traktowaniu komórek o wyższych stężeniach kurkuminy. Do wykrywania fosfo-tau użyto anty-fosfo-tau (Ser396). Poziomy zarówno całkowitego tau, jak i fosfo-ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W manuskrypcie tym ustalono różne warunki proceduralne wykrywania całkowitego tau i fosforylowanego tau w komórkach raka jelita grubego leczonych kurkuminą i LiCl. Aby ocenić ogólny stan fosforylacji tau w próbkach białek, opisano test fosfatazy. Test ten może być potencjalnie wykorzystany do zbadania stanu fosforylacji dowolnego białka.

Test ten opiera się na zasadzie, że ufosforylowane białko porusza się wolniej niż jego stan nieufosforylowany. W tym protokole stosuje się fosfatazę alkaliczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania zostały przeprowadzone w ramach projektu zatytułowanego 'Rozwój i industrializacja wysokiej jakości surowców kosmetycznych z morskich mikroalg', finansowanego przez Ministerstwo Oceanów i Rybołówstwa, Korea, i były wspierane przez grant (2Z04930) z KIST Gangneung Institute of Natural Products.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HCT 116 cellATCCCCL-247
MEM (EBSS)HyclonSH30024.01
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
penicylina-streptomycynaHyklonSV30010
roztwór trypsyny-EDTAWelGeneLS 015-01
100 mmCorning430161
6-dołkowa płytkaCorningCoster 3516
Przeciwciało anty-Tau 13abcamab19030
Ditiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Temperatura przechowywania: 2– 8 & stopnie; C
Wirówki mikrolitroweHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Temperatura przechowywania 2– 8 & stopnie; C
KurkuminaSigma-Aldrich (Fluka)78246Temperatura przechowywania 2– 8 & stopnie; C
Mikrotubule (MT)CytoszkieletMT001Przechowywać w 4 & stopni; C (suchy)
Podłoże montażowe z DAPIVector LaboratoriesH-1200Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C w ciemności
Wodorotlenek soduSigma72068
Chlorek magnezuSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
DPBSWelGeneLB 001-02
Dysmubrator sonicznyFisher ScientificModel 500
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima L-100 XP
RURYSigmaP1851
Surowica bydlęca Albumina (BSA)SigmaA7906
Obrazownik molekularnyBio-RadChemiDoc XRS+Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Odczynnik barwnikowy do oznaczania białekBio-Rad500-0006
&alfa;-tubulina (11H10) MAb królikaSygnalizacja komórkowa2125
GAPDH (14C10) MAb królikaSygnalizacja komórkowa2118
Przeciwciało anty-Tau (fosfo S396)abcamab109390
EGTASigmaE3889Przechowywać w temperaturze pokojowej
FastAP Termoczuła fosfataza alkalicznaThermo ScientificEF0651Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
PMSFSigmaP7626Przechowywać w temperaturze pokojowej
Inhibitor fosfatazy Sygnalizacja komórkowakoktajlu 5870Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Inhibitor proteazy Koktajlkomórkowy Sygnalizacja5871Przechowywać w 4 & stopni; C
Bufor RIPASigmaR 0278Temperatura przechowywania 2– 8 & stopnie; C
Tau-352 człowiekSigmaT 9950Przechowuj pod kątem -20 & deg; C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Sklep na około 25 & deg; C
Membrana PVDFBio-Rad162-0177
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG Wtórneprzeciwciało ThermoFisherA-11005Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C w ciemności
Mikroskopia konfokalnaLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Affymetrix75819
Test białkaBio-Rad500-0006Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z
Miska

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526(2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864(2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9(2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fosforylacja bia ka taulokalizacja bia ka taumikroskopia konfokalnaWestern blotanaliza aktywno ci fosfatazimmunohistochemiakurkuminachlorek litu

Powiązane artykuły