Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

Summary

Tutaj prezentujemy wyrafinowany protokół, który skutecznie ujawnia znakowanie biotynylowanej aminy dekstranu (BDA) metodą barwienia fluorescencyjnego poprzez wzajemną ścieżkę neuronową. Nadaje się do analizy drobnej struktury znakowania BDA i odróżniania jej od innych elementów nerwowych pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.

Abstract

Wysokocząsteczkowa biotynylowana amina dekstranu (BDA) była używana jako bardzo czuły znacznik neuroanatomiczny przez wiele dziesięcioleci. Ponieważ na jakość jego znakowania miały wpływ różne czynniki, tutaj przedstawiamy wyrafinowany protokół stosowania BDA o wysokiej masie cząsteczkowej do badania optymalnego znakowania neuronalnego w ośrodkowym układzie nerwowym. Po stereotaktycznym wstrzyknięciu BDA do brzusznego tylno-przyśrodkowego jądra (VPM) wzgórza u szczura za pomocą delikatnej szklanej pipety, BDA wybarwiono fluorescencyjną streptawidyną-Alexa (AF) 594 i przeciwbarwiono fluorescencyjnym barwnikiem Nissl AF500/525. Na tle zielonego barwienia Nisslem, czerwone znakowanie BDA, w tym ciała komórek neuronalnych i zakończenia aksonalne, było wyraźniej widoczne w korze somatosensorycznej. Ponadto przeprowadzono podwójne barwienie fluorescencyjne dla BDA i parwalbuminy białka wiążącego wapń (PV) w celu zaobserwowania korelacji znakowania BDA i interneuronów PV-dodatnich w celu korowym, co dało możliwość zbadania lokalnych obwodów neuronalnych i ich charakterystyki chemicznej. Tak więc ta udoskonalona metoda nadaje się nie tylko do wizualizacji wysokiej jakości znakowania neuronalnego za pomocą BDA o wysokiej masie cząsteczkowej poprzez wzajemne ścieżki neuronowe między wzgórzem a korą mózgową, ale także pozwoli na jednoczesną demonstrację innych markerów neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej histochemii lub immunochemii.

Introduction

Wysoka masa cząsteczkowa BDA (10 000 masa cząsteczkowa), bardzo czuły znacznik, jest używany do śledzenia ścieżek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym od ponad 20 lat¹. Chociaż użycie BDA jest powszechną techniką śledzenia dróg nerwowych, na jakość etykietowania BDA u zwierząt mogą mieć wpływ różne czynniki^1,2,3. Nasze ostatnie badania wykazały, że optymalna struktura znakowania BDA jest nie tylko związana z odpowiednim czasem przeżycia po iniekcji, ale także skorelowana z metodą barwienia⁴. Do tej pory konwencjonalny kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC), izotiocyjanian streptawidyny-fluoresceiny i streptawidyna-AF594 były stosowane w celu ujawnienia znakowania BDA w poprzednich badaniach^2,3,4,5. Dla porównania, barwienie fluorescencyjne dla BDA można łatwo wykonać.

W celu rozszerzenia zastosowania BDA o wysokiej masie cząsteczkowej, w niniejszym badaniu wprowadzono udoskonalony protokół. Po wstrzyknięciu BDA do VPM wzgórza w mózgu szczura, znakowanie BDA zostało ujawnione za pomocą zwykłej metody standardowego barwienia ABC, jak również przez barwienie podwójnie fluorescencyjne, które przeprowadzono w celu obserwacji korelacji znakowania BDA i podstawowych elementów nerwowych lub interneuronów w celu korowym ze streptawidyną-AF594 i fluorescencyjną histochemią Nissla lub PV-immunochemią, odpowiednio. Poprzez wzajemne ścieżki neuronowe między VPM a pierwszorzędową korą somatosensoryczną (S1)^6,7,8, skupiliśmy naszą obserwację na znakowaniu BDA w aksonach rzutowanych wzgórzowo-korowych i somy komórek rzutowanych korowo-wzgórzowych w S1. Spodziewaliśmy się, że dzięki temu procesowi dostarczymy nie tylko szczegółowy protokół uzyskiwania wysokiej jakości znakowania neuronalnego za pomocą BDA o wysokiej masie cząsteczkowej, ale także wyrafinowany protokół łączenia fluorescencyjnego znakowania BDA i innych fluorescencyjnych markerów nerwowych z histochemią lub immunochemią. Takie podejście jest preferowane do badania lokalnych obwodów neuronalnych i ich charakterystyki chemicznej pod konfokalną laserową mikroskopią skaningową.

Protocol

To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyki Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (numer referencyjny 20160014). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano cztery dorosłe samce szczurów (o masie ciała 250-280 g). Wszystkie zwierzęta trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością, z możliwością swobodnego dostępu do pożywienia i wody. Instrumenty i materiały użyte w niniejszym badaniu zostały pokazane w Rysunek 1. Przed operacją wszystkie instrumenty, takie jak rama stereotaktyczna i szklana pipeta, zostały oczyszczone przy użyciu 70% etanolu.

1. Zabiegi chirurgiczne

1. Określ obszar zainteresowania współrzędnych w VPM za pomocą atlasu stereotaktycznego⁹ (Rysunek 2A).
2. Przygotuj mikrostrzykawkę o pojemności 1 μl wyposażoną w szklaną mikropipetę (o średnicy końcówki około 10-20 μm) (Rysunek 1D) i przetestuj ją ciekłą parafiną.
3. Znieczulić szczury 7% hydratem chloralu (0,7 ml/100 g) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.
4. Gdy głębokie znieczulenie zostanie potwierdzone za pomocą szczypania ogona i odruchu wycofania pedału, ogol czubek głowy zwierzęcia elektryczną maszynką do golenia i wyszoruj miejsce operacji 3 razy odpowiednio 10% jodowidonu, a następnie 70% etanolu.
5. Umieść szczura w urządzeniu stereotaktycznym, umieszczając paski uszne w uszach i umieść górne siekacze szczura w uchwycie ust (Rysunek 1E), a następnie nałóż maść okulistyczną na oczy.
6. Ponownie oczyść skórę głowy w miejscu operacji przy użyciu 70% etanolu. Używaj sterylnych rękawic chirurgicznych i ręczników, aby utrzymać operację w sterylnych warunkach.
7. Wykonaj strzałkowe nacięcie w skórze skalpelem wzdłuż szwu strzałkowego (Ryc. 1F).
8. Zeskrob mięsień i okostną z czaszki za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką przez cały czas trwania operacji, aby zatamować krwawienie (Ryc. 1F).
9. Korzystając z predefiniowanych współrzędnych z atlasu (Rysunek 2A), określ lokalizację (-3,3 mm punkt Bregma, 2,6 mm od prawej do linii środkowej) kraniotomii (Rysunek 1G).
10. Wykonaj kraniotomię za pomocą wiertła do zadziorów z wiertłem z okrągłą końcówką (#106) ( Rysunek 1H) i kontynuuj wiercenie na głębokość około 1 mm w ciągu kilku minut, aż dotrzesz do opon mózgowych (Rysunek 1I).
11. Wytnij oponę twardą za pomocą mikrokleszczyków, aby odsłonić korę mózgową nad miejscem wstrzyknięcia (Rysunek 1I).
12. Zamień ciekłą parafinę w mikrostrzykawce na 10% roztwór BDA (10 000 mas cząsteczkowych, w wodzie destylowanej) (Rysunek 1J).
13. Zamontuj strzykawkę w aparacie do mikroiniekcji i podłącz do mikropompy (Rysunek 1K).
    UWAGA: Wstrzykiwana objętość zależy od prędkości mikropompy. Tutaj został on dostosowany do 30 nL/min (Rysunek 1L).
14. Pod mikroskopem stereoskopowym wprowadzić szklaną mikropipetę ręcznie za pomocą aparatu do mikroiniekcji do VPM przez korową powierzchnię mózgu na głębokości 5,8 mm (Ryc. 1M).
15. Wstrzykiwać ciśnieniowo 100 nL 10% BDA do VPM przez 3 minuty (35 nL/min) za pomocą mikropompy (Rysunek 1L, M).
16. Po wstrzyknięciu należy trzymać pipetę na miejscu przez dodatkowe 5 minut, a następnie powoli ją wyjmować.
17. Zszyj ranę sterylną nicią (Rysunek 1N). Postępuj zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami dotyczącymi analgezji przed- i pooperacyjnej.
18. Umieść szczura w ciepłym miejscu do rekonwalescencji, aż odzyska przytomność i w pełni wyzdrowieje.
19. Zwróć odzyskanego szczura z powrotem do klatki.

2. Perfuzje i sekcje

1. Po okresie przeżycia wynoszącym zazwyczaj 10 dni należy wstrzyknąć zwierzęciu nadmierną dawkę 10% uretanu (2 ml/100 g) we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu wywołania eutanazji.
2. Wykonaj fuzję na szczurach doświadczalnych w kapturze (Rysunek 1O).
   1. Gdy oddech ustaje, za pomocą nożyczek i kleszczy otwórz klatkę piersiową szczura, aby uzyskać dostęp do serca. Wprowadzić cewnik dożylny do lewej komory w kierunku aorty, a następnie otworzyć prawą małżowinę uszną.
   2. Najpierw przetopić 0,9% solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze fizjologicznej (37 °C) około 1-2 minut, aż krew wypływająca z serca będzie czysta, a następnie kontynuować z 250-300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4).
3. Po perfuzji naciąć skórę głowy i otworzyć czaszkę, a następnie wypreparować mózg szczura. Po utrwaleniu wypreparowanego mózgu w 4% paraformaldehydzie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (26 °C), a następnie krioprotekcję w 30% sacharozy w 0,1 M PBS (pH 7,4) przez 3 dni w temperaturze 4 °C, aż mózg zostanie zanurzony w roztworze (Rysunek 1P).
4. Gdy mózg zostanie zanurzony w roztworze, podziel mózg na trzy bloki w kierunku koronalnym na matrycach mózgowych (Rysunek 1Q). Blok centralny zawiera VPM i S1.
5. Przeciąć centralny blok mózgu na głębokości 40 μm na etapie zamrażania, przesuwając system mikrotomowy w kierunku koronalnym. Zbierz te sekcje w uporządkowany sposób w 6-dołkowym naczyniu z 0,1 M PBS (pH 7,4) (Ryc. 1R, S).

3. Standardowe barwienie ABC

UWAGA: Swobodnie pływające sekcje z co trzeciej sekcji czołowej mózgu zostały użyte do wizualizacji etykietowania BDA za pomocą standardowej procedury ABC¹⁰.

1. Przepłukać skrawki w 0,1 M PBS przez około 1 minutę.
2. Inkubować skrawki w 1% roztworze ABC w 0,1 M PB (pH 7,4) zawierającym 0,3% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Umyj skrawki trzykrotnie w 50 mM buforze Tris (pH 7,4).
4. Wybarwić skrawki w roztworze zawierającym 0,02% tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i 0,01%_H2O2 2 w 50 mM buforze Tris przez około 2-5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Umyj skrawki trzykrotnie w 50 mM buforze Tris (pH 7,4).
6. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu standardowych technik histochemicznych (Rysunek 1T; patrz Dodatkowy plik wideo III, perfuzja i sekcje).
7. Wysuszyć sekcje na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.
8. Krótko odwodnić skrawki w serii roztworów alkoholu (50%, 70%, 95%, 100%). Zanurz szkiełka w każdym roztworze na około 15 s. Nie pozwól, aby szkiełka wyschły między każdym krokiem.
9. Oczyść skrawki z ksylenu trzy razy, około 20 minut.
10. Nałóż 2 lub 3 krople balsamu na plasterki, a następnie ułóż szkiełka nakrywkowe na kawałkach.

4. Podwójne barwienie fluorescencyjne dla BDA i podstawowych elementów nerwowych w korze mózgowej

UWAGA: W przeciwieństwie do tego, przeprowadzono podwójne barwienie fluorescencyjne w celu zaobserwowania korelacji znakowania BDA i podstawowych elementów nerwowych na sąsiednich odcinkach do wyżej użytego ze streptawidyną-AF594 i przeciwbarwionego fluorescencyjnym barwnikiem Nissl AF500/525.

1. Przepłukać skrawki w 0,1 M PBS przez około 1 minutę.
2. Skrawki inkubować w mieszanym roztworze streptawidyny-AF594 (1:500) i AF500/525 zielonego fluorescencyjnego barwnika Nissla (1:1,000) w 0,1 M PBS (pH 7,4) zawierającym 0,3% Triton X-100 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Umyć skrawki trzykrotnie w 0,1 M PB (pH 7,4).
4. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu standardowych technik histochemicznych. Suszyć sekcje na powietrzu przez około 1 godzinę.
5. Przed obserwacją nałóż szkiełka nakrywkowe na skrawki fluorescencyjne z 50% gliceryną w wodzie destylowanej.

5. Podwójne barwienie fluorescencyjne dla BDA i interneuronów w korze mózgowej

UWAGA: Przeprowadzono podwójne barwienie fluorescencyjne w celu obserwacji korelacji znakowania BDA i interneuronów na reprezentatywnych odcinkach w celu korowym ze streptawidyną-AF594 i PV-immunochemią.

1. Przepłukać reprezentatywne skrawki w 0,1 M PBS (pH 7,4) przez około 1 minutę.
2. Inkubować skrawki w roztworze blokującym zawierającym 3% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PBS przez 30 minut.
3. Przenieść skrawki do roztworu mysiej monoklonalnej anty-PV IgG (1:1 000) w 0,1 M PBS (pH 7,4) zawierającej 1% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 na noc w temperaturze 4 °C.
4. Następnego dnia umyj skrawki trzykrotnie w 0,1 M PBS (pH 7,4).
5. Wystawić skrawki na działanie mieszanego roztworu koziego przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego AF488 (1:500), streptawidyny-AF594 (1:500) i dichlorowodorku 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 1:40,000) w 0,1 M PBS (pH 7,4) zawierającego 1% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 przez 1 godzinę.
6. Powtórz kroki od 4.3 do 4.5.

6. Obserwacja

1. Zrób zdjęcia VPM, aksonów wzgórzowo-korowych i neuronów korowo-wzgórzowych.
   1. Obserwuj próbki fluorescencyjne za pomocą systemu obrazowania konfokalnego wyposażonego w soczewki obiektywowe (4x, NA: 0,13; 10x, NA: 0,40; i 40x, NA: 0,95). Użyj długości fal wzbudzenia i emisji 405 (niebieski), 488 (zielony) i 559 (czerwony) nm.
      UWAGA: W tym przypadku otworek konfokalny wynosi 152 μm (4x, 10x) i 105 μm (40x). Rozdzielczość przestrzenna przechwytywania obrazu wynosi 1024 × 1024 pikseli (4x, 10x) i 640 × 640 pikseli (40x).
   2. Wykonaj dwadzieścia zdjęć w kolejnych klatkach po 2 μm z każdej sekcji o grubości 40 μm (seria Z).
   3. Zintegruj obrazy w jeden ostry obraz z systemem oprogramowania do przetwarzania obrazu konfokalnego do analizy trójwymiarowej w następujący sposób: ustaw początkową płaszczyznę ogniskową → ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej → ustaw rozmiar kroku → wybierz wzór głębi → przechwytywanie obrazu → serii Z.
2. Zdjęcia w jasnym polu można wykonywać za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w kamerę cyfrową (obiektywy 4x, NA: 0,13; 10x, NA: 0,40; i 40x, NA: 0,95). Czas naświetlania wynosi 500 ms. Użyj oprogramowania do edycji zdjęć, aby dostosować jasność i kontrast obrazów oraz dodać etykiety.

Results

Przetrwanie 10 dni po wstrzyknięciu BDA do VPM było wystarczające do wytworzenia intensywnego znakowania neuronalnego na odpowiednich obszarach kory mózgowej ipsilateralnie do strony iniekcyjnej (Rysunek 2). Zarówno konwencjonalne procedury barwienia ABC, jak i fluorescencyjnego dla BDA ujawniły podobny wzór znakowania neuronalnego na S1, w tym znakowane następczo aksony korowo-wzgórzowe i wstecznie znakowane neurony korowo-wzgórzowe (Figu...

Discussion

Wybór odpowiedniego znacznika jest kluczowym krokiem dla udanego eksperymentu ze śledzeniem neuronowym. W rodzinie BDA zaleca się preferowany transport BDA o wysokiej masie cząsteczkowej (10 000 masy cząsteczkowej) przez następczy szlak nerwowy, w przeciwieństwie do BDA o niskiej masie cząsteczkowej (3 000 masy cząsteczkowej)2,3,11,12,13. Jednak wiele badań su...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotynylowana dekstranoamina (BDA)	Sondy molekularne	D1956	10 000 masa cząsteczkowa
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Sondy molekularne	S32356	Chronić przed światłem
500/525 zielona fluorescencyjna plama Nissl	Sondy molekularne	N21480	Chronić przed światłem
Instrument stereotaksji mózgu	Narishige	SR-50
Mikrotom do zamrażania	Thermo	Microm International GmbH
Obrazowanie konfokalne	System
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Instytut Laboratoryjnych Nauk o Zwierzętach, Chińska Akademia Nauk Medycznych	SCKX (JUN) 2012-004
Zestaw ABC	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus preparaty mikroskopowe	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop i ilustracja	Adobe	CS5