Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

Summary

Tutaj prezentujemy wyrafinowany protokół, który skutecznie ujawnia znakowanie biotynylowanej aminy dekstranu (BDA) metodą barwienia fluorescencyjnego poprzez wzajemną ścieżkę neuronową. Nadaje się do analizy drobnej struktury znakowania BDA i odróżniania jej od innych elementów nerwowych pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.

Abstract

Wysokocząsteczkowa biotynylowana amina dekstranu (BDA) była używana jako bardzo czuły znacznik neuroanatomiczny przez wiele dziesięcioleci. Ponieważ na jakość jego znakowania miały wpływ różne czynniki, tutaj przedstawiamy wyrafinowany protokół stosowania BDA o wysokiej masie cząsteczkowej do badania optymalnego znakowania neuronalnego w ośrodkowym układzie nerwowym. Po stereotaktycznym wstrzyknięciu BDA do brzusznego tylno-przyśrodkowego jądra (VPM) wzgórza u szczura za pomocą delikatnej szklanej pipety, BDA wybarwiono fluorescencyjną streptawidyną-Alexa (AF) 594 i przeciwbarwiono fluorescencyjnym barwnikiem Nissl AF500/525. Na tle zielonego barwienia Nisslem, czerwone znakowanie BDA, w tym ciała komórek neuronalnych i zakończenia aksonalne, było wyraźniej widoczne w korze somatosensorycznej. Ponadto przeprowadzono podwójne barwienie fluorescencyjne dla BDA i parwalbuminy białka wiążącego wapń (PV) w celu zaobserwowania korelacji znakowania BDA i interneuronów PV-dodatnich w celu korowym, co dało możliwość zbadania lokalnych obwodów neuronalnych i ich charakterystyki chemicznej. Tak więc ta udoskonalona metoda nadaje się nie tylko do wizualizacji wysokiej jakości znakowania neuronalnego za pomocą BDA o wysokiej masie cząsteczkowej poprzez wzajemne ścieżki neuronowe między wzgórzem a korą mózgową, ale także pozwoli na jednoczesną demonstrację innych markerów neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej histochemii lub immunochemii.

Introduction

Wysoka masa cząsteczkowa BDA (10 000 masa cząsteczkowa), bardzo czuły znacznik, jest używany do śledzenia ścieżek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym od ponad 20 lat¹. Chociaż użycie BDA jest powszechną techniką śledzenia dróg nerwowych, na jakość etykietowania BDA u zwierząt mogą mieć wpływ różne czynniki^1,2,3. Nasze ostatnie badania wykazały, że optymalna struktura znakowania BDA jest nie tylko związana z odpowiednim czasem przeżycia po iniekcji, ale także skorelowana z metodą barwienia⁴. Do tej pory konwencjonalny komple....

Protocol

To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyki Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (numer referencyjny 20160014). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano cztery dorosłe samce szczurów (o masie ciała 250-280 g). Wszystkie zwierzęta trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością, z możliwością swobodnego dostępu do pożywienia i wody. Instrumenty i materiały użyte w niniejszym badaniu zostały pokazane w Rysunek 1. Przed o....

Results

Przetrwanie 10 dni po wstrzyknięciu BDA do VPM było wystarczające do wytworzenia intensywnego znakowania neuronalnego na odpowiednich obszarach kory mózgowej ipsilateralnie do strony iniekcyjnej (Rysunek 2). Zarówno konwencjonalne procedury barwienia ABC, jak i fluorescencyjnego dla BDA ujawniły podobny wzór znakowania neuronalnego na S1, w tym znakowane następczo aksony korowo-wzgórzowe i wstecznie znakowane neurony korowo-wzgórzowe (Figu.......

Discussion

Wybór odpowiedniego znacznika jest kluczowym krokiem dla udanego eksperymentu ze śledzeniem neuronowym. W rodzinie BDA zaleca się preferowany transport BDA o wysokiej masie cząsteczkowej (10 000 masy cząsteczkowej) przez następczy szlak nerwowy, w przeciwieństwie do BDA o niskiej masie cząsteczkowej (3 000 masy cząsteczkowej)2,3,11,12,13. Jednak wiele badań su.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotynylowana dekstranoamina (BDA)	Sondy molekularne	D1956	10 000 masa cząsteczkowa
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Sondy molekularne	S32356	Chronić przed światłem
500/525 zielona fluorescencyjna plama Nissl	Sondy molekularne	N21480	Chronić przed światłem
Instrument stereotaksji mózgu	Narishige	SR-50
Mikrotom do zamrażania	Thermo	Microm International GmbH
Obrazowanie konfokalne	System
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Instytut Laboratoryjnych Nauk o Zwierzętach, Chińska Akademia Nauk Medycznych	SCKX (JUN) 2012-004
Zestaw ABC	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus preparaty mikroskopowe	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop i ilustracja	Adobe	CS5