Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby zapewnić przetrwanie, organizmy muszą być w stanie unikać niekorzystnych środowisk, zapewniając jednocześnie stałe źródło pokarmu. Caenorhabditis elegans zmieniają swoje wzorce ruchowe po wykryciu różnorodnych bodźców środowiskowych i mogą modyfikować zakres reakcji behawioralnych w reakcji na warunki głodu. Glistnice zazwyczaj wykazują zmniejszoną reakcję odwrażliwą, gdy są usuwane ze źródła pokarmu na ponad 30 minut. Obserwacja zmian zachowania w odpowiedzi na zmieniający się status żywieniowy może dostarczyć wglądu w mechanizmy regulujące przejście ze stanu dobrze wykarmionych na głód.
Opracowaliśmy test, który mierzy zdolność nicienia do przekroczenia bariery odwrażliwiającej (czyli miedzi) i dotarcia do źródła pokarmu przez dłuższy okres czasu. Ten protokół opiera się na wcześniejszych pracach, integrując wiele zmiennych w sposób, który umożliwia ciągłe zbieranie danych, gdy organizmy przechodzą w coraz bardziej wygłodniony stan. Ponadto, ten test pozwala na zwiększenie wielkości próby, dzięki czemu można jednocześnie ocenić większe populacje nicieni.
Organizmy, które mają wadę w wykrywaniu lub reagowaniu na miedź, natychmiast przekraczają barierę chemiczną, podczas gdy nicienie typu dzikiego są początkowo odpychane. Gdy nicienie typu dzikiego są coraz bardziej wygłodnione, zaczynają przekraczać barierę i dochodzić do źródła pokarmu. Zaprojektowaliśmy ten test, aby ocenić mutanta, który jest niezdolny do reagowania na różnorodne bodźce środowiskowe, w tym odczuwanie pokarmu lub wykrywanie odwrażliwiających chemikaliów. Gdy są oceniane za pomocą tego protokołu, wadliwe organizmy natychmiast przekraczają barierę, ale są również niezdolne do wykrycia źródła pokarmu. Stąd te mutanty wielokrotnie przekraczają barierę chemiczną, mimo że czasowo dochodzą do źródła pokarmu. Ten test może bezpośrednio przetestować populacje nicieni, aby ocenić potencjalne defekty ścieżek związane z odwrażliwieniem i głodem.
Wprowadzenie
Caenorhabditis elegans jest używana jako model w badaniach nad neurobiologią od dziesięcioleci ze względu na stosunkowo łatwą analizę obwodu nerwowego składającego się tylko z 302 neuronów1. Ponieważ organizm ten opiera się na reakcji na bodźce środowiskowe, dużą część układu nerwowego poświęca się na regulowanie integracji sygnałów środowiskowych2. Mimo prostoty układu nerwowego, C. elegans może wykrywać i reagować na różne sygnały środowiskowe, w tym repelenty3, atraktory4, temperaturę5 i nawet wilgotność6.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie organizmów eksperymentalnych
- 24 godziny przed rozpoczęciem badania wybierz 10 nicieni L4 na szczep, aby upewnić się, że organizmy są młodymi dorosłymi podczas badania. Dla każdego badanego mutanta lub kontrolnego nicienia wybierz 10 nicieni L4 (10 na kontrolę i 10 na badanie).
- Utrwal nicienie L4 za pomocą standardowych metod26,27 przez 24 godziny na standardowych płytkach agarowych zasiedlonych OP50 Escherichia coli. Jeśli organizmy zostaną utracone podczas kolejnych etapów płukania, zrekompensuj to zwiększając początkową wielkość próbki (t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystano szczep typu dzikiego (N2), npr-9(tm1652), oraz nieokreślony npr-9 szczep z nadekspresją, t.j. npr-9(GF) (IC836 -npr-9::npr-9;sur-5::gfp;odr-1::rfp), w celu oceny odpowiedzi na głodzenie oraz awersję do miedzi. Organizmy typu dzikiego są zdolne do wykrywania bariery miedzi wywołującej awersję i reagowania na nią, podczas gdy npr-9(GF) mutanty nie wykazują reakcji unikowej na miedź w ciągu 4-godzinnego testu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten test projekt modyfikuje test wyścigu pokarmowego24 w celu wprowadzenia roztworu miedzi w celu stworzenia nieprzyjemnej bariery pośrodku i na krawędzi płytki, aby zapobiec utracie nicieni. Organizmy są testowane pod kątem zdolności do przekroczenia nieprzyjemnej bariery i dotarcia do plamki pokarmowej w ciągu 4 godzin. W kontekście npr-9(GF), wykorzystaliśmy ten test, aby ocenić, jak warunki głodu mogą wpływać na reakcje awersywne i wykrywanie pokarmu. Mając na względzie, że uprzednio .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 dla William G. Bendena.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Autoklawuj przed użyciem w celu sterylizacji.] | Produkowany w laboratorium | ||
| Siarczan miedzi | Sigma | C-1297 | Użyj wody do odpowiedniego zawieszenia do stężenia 0,5M |
Bibliografia
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. e....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
