Artykuł metodologiczny

A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia

DOI:

10.3791/55939

⸱

26 lipca 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zapewnić przetrwanie, organizmy muszą być w stanie unikać niekorzystnych środowisk, zapewniając jednocześnie stałe źródło pokarmu. Caenorhabditis elegans zmieniają swoje wzorce ruchowe po wykryciu różnorodnych bodźców środowiskowych i mogą modyfikować zakres reakcji behawioralnych w reakcji na warunki głodu. Glistnice zazwyczaj wykazują zmniejszoną reakcję odwrażliwą, gdy są usuwane ze źródła pokarmu na ponad 30 minut. Obserwacja zmian zachowania w odpowiedzi na zmieniający się status żywieniowy może dostarczyć wglądu w mechanizmy regulujące przejście ze stanu dobrze wykarmionych na głód.

Opracowaliśmy test, który mierzy zdolność nicienia do przekroczenia bariery odwrażliwiającej (czyli miedzi) i dotarcia do źródła pokarmu przez dłuższy okres czasu. Ten protokół opiera się na wcześniejszych pracach, integrując wiele zmiennych w sposób, który umożliwia ciągłe zbieranie danych, gdy organizmy przechodzą w coraz bardziej wygłodniony stan. Ponadto, ten test pozwala na zwiększenie wielkości próby, dzięki czemu można jednocześnie ocenić większe populacje nicieni.

Organizmy, które mają wadę w wykrywaniu lub reagowaniu na miedź, natychmiast przekraczają barierę chemiczną, podczas gdy nicienie typu dzikiego są początkowo odpychane. Gdy nicienie typu dzikiego są coraz bardziej wygłodnione, zaczynają przekraczać barierę i dochodzić do źródła pokarmu. Zaprojektowaliśmy ten test, aby ocenić mutanta, który jest niezdolny do reagowania na różnorodne bodźce środowiskowe, w tym odczuwanie pokarmu lub wykrywanie odwrażliwiających chemikaliów. Gdy są oceniane za pomocą tego protokołu, wadliwe organizmy natychmiast przekraczają barierę, ale są również niezdolne do wykrycia źródła pokarmu. Stąd te mutanty wielokrotnie przekraczają barierę chemiczną, mimo że czasowo dochodzą do źródła pokarmu. Ten test może bezpośrednio przetestować populacje nicieni, aby ocenić potencjalne defekty ścieżek związane z odwrażliwieniem i głodem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans jest używana jako model w badaniach nad neurobiologią od dziesięcioleci ze względu na stosunkowo łatwą analizę obwodu nerwowego składającego się tylko z 302 neuronów1. Ponieważ organizm ten opiera się na reakcji na bodźce środowiskowe, dużą część układu nerwowego poświęca się na regulowanie integracji sygnałów środowiskowych2. Mimo prostoty układu nerwowego, C. elegans może wykrywać i reagować na różne sygnały środowiskowe, w tym repelenty3, atraktory4, temperaturę5 i nawet wilgotność6. Nieprawidłowa integracja sygnałów środowiskowych została powiązana z wieloma zaburzeniami behawioralnymi i stanami neurodegeneracyjnymi w modelowych systemach ssaków7,8,9. Dzięki zakresowi dostępnych modeli chorób układu nerwowego10 w C. elegans oraz rozwojowi badań farmakologicznych na nicieniach11, ten organizm okazał się być przydatnym systemem do badań nad neurobiologią. Biorąc pod uwagę dostępność zmapowanego łącznika nerwowego nicieni1 oraz mutacje niemal każdego genu w genomie nicieni12, nasze zrozumienie układu nerwowego nicieni, a zatem i naszego własnego, jest częściowo ograniczone przez projekt kreatywnie odpowiednich testów.

Przez ostatnie 40 lat opracowano wiele testów chemotaktyksy, aby ocenić reakcje nicieni na różne bodźce odrażające3,4,13,14,15. Wczesne eksperymenty polegały na wprowadzeniu ostrego bodźca środowiskowego, podczas gdy pojedynczy nicień poruszał się na płytce agarowej3,14,16. Rejestrowano natychmiastowe zmiany w reakcjach lokomotorycznych. Na przykład lotny odorant octanol można nałożyć na włos i rozwiewać przed nosem nicienia, aby stymulować inicjację ruchu w tył u dzikich nicieni17. Opracowano również bardziej złożone testy, aby uwzględnić wiele zmiennych jako środek oceny wyboru behawioralnego18. Wariant tego testu polega na użyciu roztworu miedzi w celu stworzenia odrażającej bariery środkowej4. Na jednej stronie bariery chemicznej umieszczano atraktant, a mianowicie diacetyl, a nicienie przenoszono z dala od źródła diacetylu. Nicienie o uszkodzonych reakcjach na miedzi natychmiast przekraczały barierę, aby dotrzeć do diacetylu, podczas gdy dzikiego typu nicienie były początkowo odpychane przez barierę. Reakcje były punktowane, gdy nicienie po raz pierwszy zbliżyły się do bariery miedziowej bez długoterminowych obserwacji.

Kiedy nicienie są oceniane po poddaniu warunkom głodu, ich wrażliwość na bodźce środowiskowe spada19. Kiedy lotny odrażający chemikalia octanol jest rozwiewany przed nosem nicienia, organizmy dzikiego typu stymulują ruch w tył w ciągu 3 - 5 s, gdy są na pokarmie. Po tym, jak te organizmy są pozbawione pokarmu przez 10 min, wykazują opóźnioną reakcję 8 - 10 s20. Tak więc, wraz ze wzrostem głodu, nicienie wykazują zmniejszoną reakcję odrażającą na szkodliwe sygnały środowiskowe, ponieważ poszukiwanie pokarmu staje się bardziej kluczowe dla przetrwania. Z kolei nicienie, które nadmiernie eksprezują receptor neuropeptydu 9 (npr-9), nie reagują na octanol, niezależnie od obecności pokarmu i wykazują niezdolność do reagowania na wiele odrażających bodźców21. Te npr-9(GF) organizmy również nie modulują częstotliwości odwracania w obecności pokarmu, ale mogą się odwracać w odpowiedzi na silne stymulacje dotykowe, co wskazuje, że są zdolne do ruchu w tył21. Ocenialiśmy również mutanty npr-9(LF) , ponieważ wykazują nienormalnie zmniejszoną częstotliwość odwracania bez pokarmu, ale mogą modulować swoje zachowanie w obecności pokarmu21. Połączenie stanu żywienia nicienia z wprowadzeniem ostrego bodźca zewnętrznego pomogło w wyjaśnieniu mechanizmów, za pomocą których ścieżka związana z pokarmem może ogólnie modulować ścieżki sygnałowe sensoryczne22,23. Obecność pokarmu w środowisku nicieni została również wykorzystana do oceny reakcji na wycofanie alkoholu24. W tym eksperymencie nicienie były inkubowane w różnych stężeniach alkoholu, a następnie umieszczano na płytce agarowej z plamką pokarmu zwaną "testem wyścigu pokarmowego". Plama pokarmu była umieszczana na jednym brzegu płytki, podczas gdy nicienie umieszczano z dala od źródła po

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie organizmów eksperymentalnych

  1. 24 godziny przed rozpoczęciem badania wybierz 10 nicieni L4 na szczep, aby upewnić się, że organizmy są młodymi dorosłymi podczas badania. Dla każdego badanego mutanta lub kontrolnego nicienia wybierz 10 nicieni L4 (10 na kontrolę i 10 na badanie).
    1. Utrwal nicienie L4 za pomocą standardowych metod26,27 przez 24 godziny na standardowych płytkach agarowych zasiedlonych OP50 Escherichia coli. Jeśli organizmy zostaną utracone podczas kolejnych etapów płukania, zrekompensuj to zwiększając początkową wielkość próbki (tj. wybierz 20 robaków zamiast 10).
      Uwaga: Zachowanie jest wrodzonym zmiennym fenotypem. Wykonaj metodę trzykrotnie dla każdego szczepu w trzech osobnych dniach. Uwzględnij dodatkowe szczepy kontrolne i warunki dla nowych szczepów, jak podkreślono w sekcji dyskusji.
  2. Natychmiast przed badaniem przenieś organizmy eksperymentalne na płytkę agarową bez bakterii i pozwól nicieniom swobodnie poruszać się przez 1 min, aby usunąć nadmiar bakterii.
    1. Jeśli organizmy eksperymentalne były narażone na warunki zanieczyszczenia w ciągu 24 godzin przed badaniem, wyrzuć je.
  3. Za pomocą pipety nanieś 1 mL M9 na wolną od bakterii płytkę, aby spłukać robaki do mikrocentryfugowej probówki.
  4. Centryfuguj przez 1 min. przy 3000 x g. Robaki powinny utworzyć osiadłość na dnie probówki. Odssawaj roztwór M9 bez uszkodzenia osiadłości robaków. Dodaj 1 mL M9 do osiadłości robaków, odwróć probówkę, aby wymieszać robaki z roztworem.
  5. Powtórz kroki 1.4 jeszcze trzykrotnie.
    1. Jeśli początkowo z robakami zostało przeniesiona nadmierna ilość bakterii, powtórz razem pięć razy. Żadne bakterie nie powinny zostać przeniesione na miedziane płytki z pokarmem. Jeśli pokarm zostanie przeniesiony na płytkę badawczą, spowoduje to zakłócenie dokładnego zbierania danych.
  6. Po ostatnim płukaniu odssawaj nadstan do momentu, gdy pozostanie 100 μL M9 i osiadłość robaków.
    Uwaga: Zachowania związane z głodem stają się widoczne po 30 min. W związku z tym robaki powinny być natychmiast przeniesione z roztworu po zakończeniu etapów płukania.

2. Przygotowanie płytek badawczych

  1. Przygotuj standardowe płytki agarowe NGM dwa dni przed badaniem.
    1. Jeśli płytki są przechowywane w wilgotnym środowisku, przygotuj płytki agarowe trzy dni przed badaniem. Alternatywnie, usuń pokrywkę płytki na 3 - 6 godzin, aby zapewnić odpowiednie wysuszenie (jeśli jest to sterylne środowisko).
  2. Z grubym trwałym markerem narysuj linię na dolnej stronie płytki wzdłuż zewnętrznej krawędzi i kolejną, aby utworzyć środkową barierę linię (Rysunek 1). Środkowa linia bariery powinna być równo oddalona od każdej krawędzi płytki. Użyj linijki, aby zapewnić precyzyjne pomiary. Linie te posłużą jako wskazówka podczas przenoszenia bakterii i roztworu miedzi. Pod warunkiem, że E. coli zostanie przeniesiona przed roztworem miedzi, linie te posłużą jako wskaźniki.
  3. Zasiedl płytkę 50 μL OP50 E. coli tylko na jednej stronie miedziane bariery, aby stworzyć jednolity kociątko (Rysunek 2). Stężenie bakterii powinno pozostać spójne w badaniach; jednakże, niewiele zmienności zostało zaobserwowane w odpowiedzi na lekkie różnice w stężeniu.
    1. Użyj zaznaczonych linii na dolnej stronie płytki, aby upewnić się, że bakterie nie wchodzą w kontakt z roztworem miedzi. Pod warunkiem, że roztwór miedzi wysłania krawędź płytki i tworzy środkową barierę linię, przenieś bakterie tak, aby roztwór miedzi nie wchodził w kontakt z źródłem pokarmu.
  4. Oznacz drugi zestaw płytek i nie przenieś OP50 E. coli na nie (Rysunek 2). Te płytki posłużą do oceny kontroli negatywnej. Te płytki powinny również mieć zaznaczenie na połowie płytki, aby oznaczyć początkowe miejsce przeniesienia.
  5. Pozwól bakteriom wyschnąć, a następnie inkubauj płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Upewnij się, że łaty bakterii nie są zakłócane podczas przenoszenia do inkubatora lub pomieszczenia w temperaturze 37 °C. Nadmierne zakłócenia mogą zmienić lokalizację lub kształt łaty pokarmu.

3. Chemotaksja

  1. Przygotuj świeżo 0,5 M roztwór siarczanu miedzi (II) przed rozpoczęciem badania. Pod warunkiem, że 125 μL roztworu jest używane na płytkę, skaluj tę objętość w zależności od liczby użytych płytek badawczych (np.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystaliśmy dziką odmianę (N2), npr-9(tm1652), oraz szczep z nadekspresją npr-9, tj. npr-9(GF) (IC836 -npr-9::npr-9;sur-5::gfp;odr-1::rfp), aby ocenić reakcje na głód i uniknięcie miedzi. Dziką odmianę organizmów można wykryć i reagować na odpychającą barierę miedzi, podczas gdy npr-9(GF) mutanty nie inicjują odpowiedzi odpychającej na miedź w ciągu 4-godzinnego badania21. Po 30 minutach głodu, około 50 - 60...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test projekt modyfikuje test wyścigu pokarmowego24 w celu wprowadzenia roztworu miedzi w celu stworzenia nieprzyjemnej bariery pośrodku i na krawędzi płytki, aby zapobiec utracie nicieni. Organizmy są testowane pod kątem zdolności do przekroczenia nieprzyjemnej bariery i dotarcia do plamki pokarmowej w ciągu 4 godzin. W kontekście npr-9(GF), wykorzystaliśmy ten test, aby ocenić, jak warunki głodu mogą wpływać na reakcje awersywne i wykrywanie pokarmu. Mając na względzie, że uprzednio ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 dla William G. Bendena.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Autoklawuj przed użyciem w celu sterylizacji.]Produkowany w laboratorium
Siarczan miedziSigmaC-1297Użyj wody do odpowiedniego zawieszenia do stężenia 0,5M

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  4. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
  5. Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
  6. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  7. van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
  8. Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
  9. Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
  10. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  11. O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).
  12. Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
  13. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  14. Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
  15. Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
  16. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
  17. Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
  18. Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
  19. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  20. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  21. Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
  22. Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
  23. Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
  24. Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
  25. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
  27. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).
  28. Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
  29. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
  30. Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
  31. Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
  32. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
  33. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nutritional Status AnalysisBehavioral NeuroscienceNematode LocomotionFood Source DetectionAversive Chemical ResponseStarvation Condition TestingMutant Phenotype EvaluationExtended Time Period

Powiązane artykuły