Method Article

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

DOI:

10.3791/55942

⸱

December 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysie modele chorób są niezbędne do badań naukowych. Jednak wiele narzędzi diagnostycznych, takich jak endoskopia lub obrazowanie tomograficzne, nie jest rutynowo stosowanych w modelach zwierzęcych. Konwencjonalne odczyty eksperymentalne często opierają się na analizach post mortem i ex vivo, które uniemożliwiają przeprowadzanie wewnątrzindywidualnych badań kontrolnych i zwiększają liczbę potrzebnych badanych zwierząt. Tomografia fluorescencyjna umożliwia nieinwazyjną, powtarzalną, ilościową, trójwymiarową ocenę sond fluorescencyjnych. Jest bardzo czuły i pozwala na użycie generatorów molekularnych, co pozwala na specyficzne wykrywanie i charakteryzowanie różnych celów molekularnych. W szczególności sondy celowane stanowią innowacyjne narzędzie do analizy aktywacji genów i ekspresji białek w stanach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych, infekcjach, chorobach naczyniowych, migracji komórek, nowotworzeniu itp. W tym artykule przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące tej wyrafinowanej technologii obrazowania do wykrywania i charakteryzowania stanu zapalnego in vivo (tj. infiltracji makrofagów F4/80-dodatnich) w szeroko stosowanym mysim modelu zapalenia jelit. Technika ta może być również stosowana w innych obszarach badawczych, takich jak śledzenie komórek odpornościowych lub komórek macierzystych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele zwierzęce są szeroko stosowane w badaniach naukowych, a istnieje wiele nieinwazyjnych procedur monitorowania aktywności i witalności choroby, takich jak kwantyfikacja zmian masy ciała lub analiza krwi, moczu i kału. Są to jednak tylko pośrednie parametry zastępcze, które również podlegają zmienności międzyosobniczej. Muszą one być często uzupełniane analizami post mortem próbki tkanki, co uniemożliwia seryjną obserwację w powtarzających się punktach czasowych i bezpośrednią obserwację procesów fizjologicznych lub patologicznych in vivo. Pojawiły się wyrafinowane techniki obrazowania małych zwierząt, w tym obrazowanie przekrojowe, obrazowanie optyczne i endoskopia, które umożliwiają bezpośrednią wizualizację tych procesów, a także pozwalają na powtarzalne analizy tych samych zwierząt1,2,3. Dodatkowo, możliwość powtarzalnego monitorowania różnych stanów chorobowych u tego samego zwierzęcia może zmniejszyć liczbę potrzebnych zwierząt, co może być pożądane z punktu widzenia etyki zwierząt.

Istnieje kilka różnych technik obrazowania optycznego dla obrazowania fluorescencyjnego in vivo. Pierwotnie, obrazowanie konfokalne było wykorzystywane do badania powierzchniowych i podpowierzchniowych zdarzeń fluorescencyjnych4,5. Ostatnio jednak opracowano systemy tomograficzne, które pozwalają na ilościową trójwymiarową ocenę tkanek6. Udało się to osiągnąć dzięki opracowaniu sond fluorescencyjnych, które emitują światło w widmie bliskiej podczerwieni (NIR), oferując niską absorpcję, czułe detektory i monochromatyczne źródła światła7. Podczas gdy tradycyjne techniki obrazowania przekrojowego, takie jak tomografia komputerowa (CT), rezonans magnetyczny (MRI) lub ultrasonografia (US), opierają się głównie na parametrach fizycznych i wizualizacji morfologii, obrazowanie optyczne może dostarczyć dodatkowych informacji na temat podstawowych procesów molekularnych przy użyciu endogennych lub egzogennych sond fluorescencyjnych8.

Postępy w biologii molekularnej ułatwiły tworzenie inteligentnych i ukierunkowanych fluorescencyjnych sond molekularnych dla coraz większej liczby celów. Na przykład wychwyt i dystrybucja za pośrednictwem receptora w danym obszarze docelowym może być wizualizowana za pomocą przeciwciał znakowanych pochodną karbocyjaniny9. Mnogość dostępnych przeciwciał, które można oznaczyć jako specyficzne znaczniki w inaczej niedostępnych obszarach ciała, zapewnia bezprecedensowy wgląd w procesy molekularne i komórkowe w modelach nowotworzenia oraz chorób neurodegeneracyjnych, sercowo-naczyniowych, immunologicznych i zapalnych7.

W tym badaniu opisujemy zastosowanie tomografii fluorescencyjnej w mysim modelu zapalenia jelita grubego. Zapalenie jelita grubego wywołane siarczanem sodu dekstranu (DSS) jest standardowym, chemicznie indukowanym mysim modelem zapalenia jelit, który przypomina nieswoiste zapalenie jelit (IBD)10. Jest to szczególnie przydatne do oceny udziału wrodzonego układu odpornościowego w rozwoju zapalenia jelit11. Ponieważ rekrutacja, aktywacja i infiltracja monocytów i makrofagów stanowią kluczowe etapy w patogenezie IBD, wizualizacja ich rekrutacji i kinetyka infiltracji są niezbędne do monitorowania, na przykład, wpływu potencjalnych substancji terapeutycznych w warunkach przedklinicznych12. Opisujemy indukcję zapalenia jelita grubego DSS i demonstrujemy charakterystykę nacieku makrofagów do błony śluzowej jelit za pośrednictwem tomografii za pomocą fluorescencyjnej tomografii molekularnej w celu specyficznej wizualizacji markera monocytów / makrofagów F4 / 8013. Dodatkowo ilustrujemy procedury pomocnicze i uzupełniające, takie jak znakowanie przeciwciałami; konfiguracja eksperymentalna; oraz analiza i interpretacja uzyskanych obrazów, w korelacji z konwencjonalnymi odczytami, takimi jak wskaźniki aktywności choroby, cytometria przepływowa i analiza histologiczna oraz immunohistochemia. Omówiono ograniczenia tej techniki i porównania z innymi metodami obrazowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (Tierschutzgesetz).

1. Materiały i konfiguracja eksperymentalna

  1. Opieka nad zwierzętami.
    1. Użyj myszy dopasowanych pod względem płci i wieku dowolnego szczepu podatnego na DSS (np. C57BL/6) o masie ciała 20-25 g.
    2. Zaplanuj co najmniej pięć lub więcej myszy na grupę eksperymentalną i trzymaj myszy zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
    3. Zapewnij standardową dietę dla gryzoni i autoklawowaną wodę pitną ad libitum.
    4. Usuń standardową karmę i zastąp ją karmą wolną od lucerny co najmniej trzy dni przed skanowaniem, aby zmniejszyć autofluorescencję endoluminalną.
  2. Indukcja ostrego zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS.
    1. Rozpuść 2 g DSS (masa cząsteczkowa ~40 000 Da) w 100 ml autoklawowanej wody pitnej, aby uzyskać 2% (w/v roztwór).
    2. Napełnij zapas napojów myszy wyłącznie roztworem DSS i oszacuj 5 ml płynu na mysz dziennie. Dostarcz tę samą wodę pitną bez DSS myszom kontrolnym10.
      UWAGA: Monitoruj myszy codziennie do końca eksperymentu. Poddaj eutanazji myszy, które tracą więcej niż 20% swojej początkowej masy ciała lub które stają się w stanie agonalnym (tj. uporczywie zgarbiona postawa, zmniejszony ruch, utrudnione oddychanie, wyraźnie wyprostowana sierść) zgodnie z lokalnymi obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
  3. Przygotowanie tomografii fluorescencyjnej.
    1. Oznaczyć pożądane przeciwciało (np. szczurze przeciwciało anty-mysie F4/80) barwnikiem fluorescencyjnym (np. cyjanina7,wzbudzenie λ: 750 nm,emisja λ: 776 nm) zgodnie z opisem w protokole producenta. Oczyszczone przeciwciało należy dializować w odpowiedniej membranie dializacyjnej (wielkość porów < 50-100 kDa) w stosunku do 1 l 0,15 M chlorku sodu przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
      1. Przenieść przeciwciało do 1 l 0,1 MNaHCO3 i dializować przez co najmniej 2 godziny.
      2. Rozpuścić wymaganą ilość barwnika fluorescencyjnego w dimetylosulfotlenku (DMSO) (10,8 μl/mg przeciwciała) i dodać go do roztworu przeciwciała. Użyj barwnika fluorescencyjnego w 20-krotnym nadmiarze molowym, aby uzyskać stosunek barwnika do białka 1:3.
      3. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Usunąć nieznakowane przeciwciało przez dializę przeciwko 1 litrowi 0,15 M sodu lub przy użyciu kolumny odsalającej PD-10 i rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stosowania in vivo.
      4. Określić końcowe stężenie przeciwciał i współczynnik znakowania za pomocą spektrofotometrii.
      5. Zmierz stężenie białka przy absorpcji 250-330 nm i rozważ dodatkowe wchłanianie przez barwnik. Skorygować maksymalną absorpcję przy 280 nm (białko) o 11% maksymalnej absorpcji przy 750 nm (następny krok) dla znakowania cyjaniną7.
      6. Zmierzyć rozcieńczenie związku (zwykle 1:10) przy 250-800 nm i wyekstrahować stężenie cyjaniny7 przy 750 nm.
      7. Określ stosunek barwnika do białka jako: barwnik/przeciwciało = maksymalna absorpcja przy 750 nm / 200 000 / (maksymalna absorpcja przy 280 nm - 0,11 x maksymalna absorpcja przy 750 nm) / 170 000.
      8. Roztwór przeciwciał należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem, aby uniknąć bielenia przed wstrzyknięciem.
    2. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy umieścić niezbędną objętość roztworu przeciwciał w sterylnej strzykawce i chronić przed światłem do czasu jego użycia.
    3. Określ optymalny czas wstrzyknięcia sondy i procedury skanowania, w zależności od farmakokinetyki znacznika.
    4. Znieczulić myszy za pomocą 1,5 - 2,5% wziewnego izofluranu w tlenie lub umieścić je bezpiecznie w specjalnym ograniczniku do wstrzykiwania znakowanych przeciwciał do żyły ogonowej.
    5. W przypadku przeciwciał o pełnej długości należy wstrzyknąć znakowane przeciwciało co najmniej 24 godziny przed skanowaniem, na przykład w celu wizualizacji makrofagów F4/80 przeciwko mysim mięśniom w mysim zapaleniu jelita grubego. Wstrzyknąć myszom dożylnie (dożylnie) przez żyłę ogonową znakowane przeciwciało w ilości odpowiadającej 2,0 nmol barwnika.
    6. Stosować jednakowo znakowane nieswoiste przeciwciała (np. szczurzą IgG lub inny izotyp odpowiadający dziedzictwu przeciwciał pierwotnych) jako kontrolę izotypu w dawkach równoważnych dawkom specyficznej sondy.
      UWAGA: Wyniki skanów in vivo po wstrzyknięciu związku kontrolnego mogą służyć jako odniesienie do interpretacji konkretnych danych obrazowania sondy.
    7. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić sierść zwierzęcia w okolicy brzucha, aby zminimalizować odbicie i absorpcję światła.

2. Wyposażenie techniczne

  1. Użyj weterynaryjnego urządzenia do tomografii fluorescencyjnej (FMT) do fluorescencji małych zwierząt ( Rysunek 4).
  2. Utwórz nowe badanie dla każdego projektu, klikając przycisk "nowe badanie" i dołącz do opisu badania odpowiednie znaczniki, w tym parametry obrazowania i dawki do wykorzystania w przyszłości.
  3. W ramach tego badania należy utworzyć grupy badawcze zgodnie z odpowiednim projektem badania (np. dla specyficznego znacznika i kontroli izotypu niespecyficznego), klikając przycisk "nowa grupa badawcza". Wyposaż każdą badaną grupę w odpowiednią liczbę zwierząt.
  4. Skalibruj system dla konstrukcji znacznikowych.
    1. Wykonaj kalibrację dla każdej partii znaczników, aby znormalizować różnice w etykietowaniu i umożliwić pomiar ilościowy na podstawie danych OI.
    2. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta urządzenia dotyczącymi kalibracji każdego pojedynczego systemu; po wybraniu opcji "dodaj nowy znacznik" system zapewni przewodnik przez kolejne kroki. Podać rozcieńczenie zastosowanego roztworu przeciwciała i obliczone bezwzględne stężenie znacznika w sondzie.
    3. W przypadku FMT należy użyć fantomu naśladującego tkankę o określonej grubości i charakterystyce wchłaniania (przypominającego żywą tkankę) i wypełnić go określoną objętością użytego roztworu przeciwciała. Zmierz to na urządzeniu FMT.
      UWAGA: System użyje pomiaru referencyjnego dostarczonej sondy wraz z podanym stężeniem do obliczenia bezwzględnych stężeń znaczników z przyszłych pomiarów in vivo.
  5. Użyj podgrzewanej kasety badawczej o temperaturze 42 °C.
    UWAGA: Zapobiega to hipotermii myszy podczas badania.

3. Znieczulenie zwierząt

  1. Do znieczulenia myszy należy użyć ciągłego przepływu izofluranu o stężeniu 1,5 - 2% obj. ([2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan]) i 1,5 lO2/min. Używaj specjalnie zaprojektowanych systemów inhalacyjnych do znieczulenia gryzoni (parownik izofluranu), aby łatwo kontrolować głębokość znieczulenia i zminimalizować narażenie personelu.
  2. Umieść mysz w szczelnej komorze indukcyjnej i włącz parownik w celu dostarczenia izofluranu (100% (v/v), 5% obj. tlenu, 3 l/min). Monitoruj mysz, dopóki nie położy się i nie straci przytomności.
  3. Umieść go w kasecie z badaniem do tomografii, z ciągłą inhalacją izofluranu przez stożek nosowy w dawce 100% v/v, 1,5% obj. tlenu, 1,5 l/min, aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas badania. W przypadku zabiegów trwających dłużej niż 5 minut należy nałożyć maść na oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
  4. Oceń głębokość znieczulenia, sprawdzając odruchy. Połóż mysz na plecach; Jeśli znieczulenie jest wystarczające, mysz nie powinna się odwracać. Delikatnie ściśnij mysz między palcami; Jeśli znieczulenie jest wystarczające, noga nie zostanie wycofana (etap tolerancji chirurgicznej).

4. Tomografia za pośrednictwem fluorescencji

UWAGA: Dostosuj następujące szczegóły, które są specyficzne dla systemu FMT użytego w tym badaniu (zobacz Tabelę materiałów) do alternatywnych urządzeń do obrazowania fluorescencji lub systemów FMT, zgodnie z potrzebami.

  1. Umieść znieczuloną mysz na plecach w kasecie z badaniami.
  2. Wykonaj procedurę skanowania.
    1. Włóż kasetę do systemu obrazowania i natychmiast ją zamknij, aby zapewnić ciągłe znieczulenie. Należy wybrać odpowiednią próbę z utworzonej wcześniej grupy analitycznej. Wybierz podany znacznik z menu rozwijanego, aby upewnić się, że wartości stężenia znacznika są prawidłowo obliczone.
    2. Uzyskaj obraz odbicia fluorescencji o odpowiedniej długości fali (720 nm dla cyjaniny7) w celu zaplanowania skanowania i nakreśl pole skanowania, klikając przycisk "uzyskaj obraz".
    3. Sprawdź, czy pole skanowania pojawia się jako nakładka na obraz odbicia fluorescencji. Dopasuj go do interesującego Cię obszaru (np. okrężnicy lub brzucha), omijając powietrze lub obszary pozostałej sierści. W zależności od docelowego obrazu ustaw liczbę punktów danych obrazu w polu skanowania, wybierając rozdzielczość pola skanowania od zgrubnej do średniej i dokładnej w menu po prawej stronie.
      UWAGA: Należy pamiętać, że dokładne pole skanowania może oferować lepszą rozdzielczość przestrzenną kosztem znacznie dłuższego czasu skanowania.
    4. Rozpocznij akwizycję danych/obrazu na wybranej długości fali, klikając "skanuj"
      UWAGA: Czas skanowania w przypadku średnio dokładnego skanu całego brzucha wyniesie około 5 minut; W tym czasie każdy punkt danych jest oddzielnie oświetlany przez laser wzbudzający, a uzyskana fluorescencja jest rejestrowana.
    5. Po zakończeniu skanowania wyjmij zwierzę z kasety obrazowej i pozwól zwierzęciu całkowicie dojść do siebie przed umieszczeniem go z powrotem w klatce.
    6. Powtórzyć FMT, jeśli uzna to za konieczne, w różnych punktach czasowych podczas eksperymentu (np. dni 0, 5 i 9 - 10 (koniec eksperymentu)), ale należy wziąć pod uwagę akumulację przeciwciał w organizmie, zwiększając w ten sposób sygnał fluorescencji tła.

5. Po skanowaniu

  1. Umieść mysz w osobnej klatce na ręczniku papierowym pod podgrzewającą lampą z czerwonym światłem i monitoruj mysz pod kątem oznak dyskomfortu lub niepokoju, aż do pełnego wyzdrowienia. Umieść mysz z powrotem w odpowiedniej klatce, gdy jest w pełni obudzona.
  2. Poddaj myszy eutanazji pod koniec eksperymentu poprzez dostarczenie CO2 do izolatora w dawce 100% (v/v), 100% obj. i 3 l/min. Nie napełniaj komory CO2 , ponieważ nagłe narażenie na wysokie stężenia CO2 może spowodować niepokój. Zweryfikuj śmierć po tym, jak mysz przestanie oddychać, poprzez późniejszy wtórny tryb eutanazji, taki jak szybkie zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Usunąć okrężnicę przez laparotomię brzuszną i wykonać skan ex vivo eksplantowanej okrężnicy, jak wyjaśniono w krokach 4.2.1 - 4.2.4. Każdą okrężnicę należy otworzyć wzdłużnie za pomocą nożyczek chirurgicznych Metzenbaum i dokładnie spłukać roztworem soli fizjologicznej przed przygotowaniem jej do dalszej analizy.
  4. Za pomocą skalpela wytnij 0,5-centymetrowy fragment z dystalnej części okrężnicy i natychmiast umieść go w 1,5 ml probówki kriogenicznej. Zamrozić go w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszego użycia (np. pomiary mieloperoksydazy (MPO)).
  5. Za pomocą drewnianego patyczka zwiń pozostałą podłużnie otwartą okrężnicę od dystalnego do bliższego końca, z błoną śluzową na zewnątrz ("technika szwajcarskiego rolla") do analiz histologicznych. Umieścić preparat w utrwalaczu (patrz Tabela Materiałów) i zamrozić w temperaturze -80 °C14.

6. Rekonstrukcja i interpretacja danych

  1. Użyj narzędzia do rekonstrukcji odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby utworzyć mapy 3D rozkładu fluorescencji na podstawie surowych danych obrazowych; skany są automatycznie dodawane do narzędzia do rekonstrukcji, gdy podczas skanowania wybrana jest funkcja "dodaj do kolejki rekonstrukcji".
    1. W przeciwnym razie wybierz skany z menu rozwijanego pod odpowiednim badaniem i grupą badawczą, kliknij skan prawym przyciskiem myszy i wybierz "dodaj do rekonstrukcji".
  2. W celu dalszej analizy załaduj zestaw danych do oprogramowania analitycznego. Z menu rozwijanego na górnym pasku wybierz odpowiednie badanie, a następnie wybierz grupę badawczą i pojedyncze zwierzę z menu po prawej stronie; Zostaną wyświetlone wszystkie skany wykonane dla tego zwierzęcia. Wybierz właściwe skanowanie i kliknij "załaduj."
    UWAGA: Rekonstrukcja 3D rozkładu znacznika pojawi się po lewej stronie jako nakładka początkowo uzyskanego obrazu odbicia fluorescencji. Model można obracać i powiększać w celu łatwiejszej analizy.
  3. Zidentyfikuj ogniska akumulacji niespecyficznej etykiety (np. wątroba lub pęcherz moczowy) na zrekonstruowanych mapach 3D i odróżnij je od tkanek docelowych (np. jelita lub jelita).
  4. Na górnym pasku wybierz kształt ROI najbardziej odpowiedni dla celu. Oznacz tkankę docelową jako obszary zainteresowania (ROI), umieszczając odpowiednie narzędzia pomiarowe w oprogramowaniu analitycznym; oprogramowanie zapewni intensywność fluorescencji dla ROI, a także (piko-)molowe ilości znacznika, dla którego skan został skalibrowany.
  5. Wybierz całkowitą ilość znacznika w odpowiednim ROI, znormalizowaną dla wielkości ROI, jako najbardziej odpowiedni równoważnik do oceny aktywności choroby w korelacji z naciekiem zapalnym (histologia).
    UWAGA: Inne cechy ROI można wybrać w razie potrzeby jako reprezentatywne dla konkretnego modelu.

7. Analizy ex vivo

  1. Barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie immunofluorescencyjne.
    1. Odparafinować skrawki, umieszczając je w 70% etanolu (EtOH) na 2 minuty, a następnie spłukać wodą destylowaną. Plamić roztworem hematoksyliny przez 5 minut, a następnie płukać ciepłą wodą z kranu przez 10 minut.
    2. Spłucz wodą destylowaną, zabarwij roztworem eozyny przez 2 minuty i ponownie spłucz wodą destylowaną.
    3. Umieść w 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH i ksylenie (2 razy) na 2 minuty każdy, aby odwodnić i oczyścić sekcje. Zamontuj za pomocą żywicznego medium montażowego.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne.
    1. Do barwienia immunofluorescencyjnego należy wykorzystać uzyskane wcześniej skrawki tkanek ("szwajcarska rolka") i przygotować kriogeniczne skrawki o wielkości 7 μm.
    2. Zablokować utrwalone acetonem i zamrożone skrawki jelita grubego w 5,0% surowicy szczura na 10 minut i inkubować przez noc z rozcieńczonym (1/500 v/v) biotynylowanym pierwotnym przeciwciałem przeciw myszom szczurzym F4/80. Przemyć skrawki trzykrotnie w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) i inkubować ze Streptavidin-FITC (1:100 v/v) w PBS/BSA (0,1% w/v) przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Umyj skrawki w TBS i zabarwij 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI, 1:1000 v/v), aby uzyskać kontrast. Przeanalizuj obrazy fluorescencyjne pod mikroskopem konfokalnym (patrz tabela materiałów; powiększenie 40x; kostka filtra N2.1 z filtrem wzbudzenia 515 - 560) i policz komórki F4/80-dodatnie na pole dużej mocy.
      UWAGA: Rozważ użycie przeciwciał o tym samym klonie i formacie podczas łączenia analiz histologicznych in vivo FMT i pośmiertnych, takich jak immunohistochemia lub barwienie immunofluorescencyjne, w zależności od zamierzonego celu. Do wykrywania makrofagów F4/80-dodatnich in vivo i ex vivo zastosowano różne formaty.
  3. Pomiary MPO w próbkach jelita grubego.
    1. Do pomiarów MPO należy użyć świeżo uzyskanych, przepłukanych PBS próbek jelita grubego lub rozmrożonej próbki. Zważyć wszystkie próbki i homogenizować tkankę w buforze do lizy dostarczonym w zestawie ELISA (patrz tabela materiałów) w objętości 20 μl buforu do lizy na mg tkanki.
    2. Sonikować przez 15 s (częstotliwość sonikacji: 20 kHz, moc: 70 W) i odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 200 x g i temperaturze 4 °C.
    3. Używaj dostępnego w handlu zestawu ELISA (patrz tabela materiałów) zgodnie z opisem producenta. Przeprowadź test w dwóch egzemplarzach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena zapalenia jelita grubego:

Zapalenie jelita grubego wywołane przez DSS to chemicznie wywołany mysi model zapalenia jelit, który przypomina ludzkie IBD i prowadzi do utraty wagi, krwawienia z odbytu, powierzchownego owrzodzenia i uszkodzenia błony śluzowej u podatnych myszy15. Szczególnie przydatne jest badanie udziału wrodzonego układu odpornościowego w rozwoju zapalenia jelit

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż techniki obrazowania medycznego szybko się rozwinęły w ostatnich latach, nadal mamy ograniczoną zdolność do wykrywania procesów zapalnych lub nowotworów, a także innych chorób w ich najwcześniejszych stadiach rozwoju. Ma to jednak kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu, inwazji lub rozwoju przerzutów guza i procesów komórkowych w rozwoju zaburzeń zapalnych oraz chorób zwyrodnieniowych, sercowo-naczyniowych i immunologicznych. Podczas gdy tradycyjne techniki obrazowania opierają się na parametrach fizycznych l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Pani Sonji Dufentester, Pani Elke Weber i Pani Klaudii Niepagenkämper za doskonałą pomoc techniczną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
odczynniki
dieta bez lucernyHarlan Laboritories, Madison, USA2014
Maść do oczu BepanthenBayer, Leverkusen, Niemcy80469764
Konsulat sodowy siarczanu dekstranu (DSS)TdB, Uppsala, SzwecjaDB001
EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcyE 4382
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)                                                 Sigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcyE 9884
Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, NiemcyB506
Haematoxylin                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcyHHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek compound                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Holandia4583utrwalacz do analiz histologicznych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBSLonza, Verviers, Belgia4629
Chlorek sodu 0,9%Braun, Melsungen, Niemcy5/12211095/0411
Wodorowęglan sodu w proszkuSigma Aldrich Deisenhofen, NiemcyS5761
Dieta standardowaAltromin, Lage, Niemcy1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Holandia4566
Hemoccult (test papierowy z gwajaku)Beckmann Coulter, Niemcy3060
Biotyna przeciwciało anty-mysie anty-F4/80Serotec, Oxford, Wielka BrytaniaMCA497B
Biotyna szczuro-anty-myszy anty-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy553125
Streptavidin-Alexa546, Darmstadt, NiemcyS-11225:  556/573nm
Przeciwciało anty-CD11b przeciwko mysom TCCalteg, Burlingame, USAR2b06
Oczyszczone przeciwciało anty-mysie F4/80BioLegend, Londyn, Wielka Brytania123102
DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, NiemcyD9542
Przeciwciało anty-Ly6C przeciw myszy szczura sprzężone z FITCBD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy553104
bufor FACSBD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy342003
Cy7 NHS EsterGE Healthcare  Europa, Fryburg Bryzgowijski, NiemcyPA17104
MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, NiemcyK 6631B
Cy5.5 znakowane przeciwciało anty-mysie F4/80BioLegend, Londyn, Wielka Brytania123127gotowe do użycia znakowane przeciwciała (alternatywa)
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyjanine5.5eBioscience, Waltham, USA45-4801-80gotowe do użycia znakowane przeciwciała (alternatywa)
DMSO (dimetylosulfotlenek)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy67-68-5
IsofluraneSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy792632
EtanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy64-17-5
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, NiemcyA4612
Roztwór soli fizjologicznej buforowany Tris (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, NiemcySRE0032
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
FACS System cytometrii przepływowej CaliburBD Biosciences GmbH, Heidelberg, Niemcy
System obrazowania in vivo FMT 2000PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
Oprogramowanie do analizy obrazowania True Quant 3.1PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAzawarte w FMT2000
Mikroskop fluorescencyjny Leica DMLBLeica,  35578 Wetzlar, Niemcy DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, NiemcyHomogenizator ultradźwiękowyHD 2070
Skalpel jednorazowy Nr 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, NiemcyZ692395-10EA
Nożyczki Metzenbaum 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Niemcy22398330
strzykawka luer lock 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, NiemcyZ248010
igły strzykawkoweSigma-Aldrich, Deisenhoffen, NiemcyZ192368 
Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgia352070
Sondy molekularne Maksymalne wzbudzenie/emisja

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
  3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
  4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
  5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
  6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
  7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
  8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
  9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
  10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
  12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
  13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
  14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
  15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
  16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678(2012).
  17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
  19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
  20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
  21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
  22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
  24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
  25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
  26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
  27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
  30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
  31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
  32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
  33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006(2013).
  34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
  35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
  36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence mediated TomographyMacrophage DetectionIntestinal InflammationMurine Colitis ModelF4 80 AntibodyNon invasive Imaging3D ReconstructionAntibody TracerDisease Activity MonitoringIn Vivo Tracking

Related Articles