Artykuł metodologiczny

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

DOI:

10.3791/55946

⸱

11 września 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalna pozycja chromosomalna danego elementu DNA była/była określana przez losową insercję za pośrednictwem transpozonu, po której następowała selekcja dopasowania. W przypadku bakterii wpływ kontekstu genetycznego na funkcję elementu genetycznego może być trudny do oceny. Kilka mechanizmów, w tym efekty topologiczne, interferencja transkrypcyjna z sąsiednimi genami i/lub dawkowanie genów związane z replikacją, może wpływać na funkcję danego elementu genetycznego. W tym miejscu opisujemy metodę, która pozwala na losową integrację elementu DNA z chromosomem Escherichia coli i wybranie najkorzystniejszych lokalizacji za pomocą prostego eksperymentu konkurencji wzrostu. Metoda wykorzystuje dobrze opisany system losowej insercji oparty na transpozonach, w połączeniu z wyborem najlepiej dopasowanego klonu (klonów) według przewagi wzrostu, procedurę, którą można łatwo dostosować do potrzeb eksperymentalnych. Charakter najlepiej przystosowanego klonu (klonów) można określić poprzez sekwencjonowanie całego genomu w złożonej populacji wieloklonalnej lub przez łatwe chodzenie po genach w celu szybkiej identyfikacji wybranych klonów. W tym przypadku jako przykład użyto niekodującego regionu DNA DARS2, który kontroluje inicjację replikacji chromosomów u E. coli. Wiadomo, że na funkcję DARS2 wpływa dawkowanie genów związane z replikacją; im bardziej DARS2 zbliża się do początku replikacji DNA, tym bardziej staje się aktywny. DARS2 został losowo wprowadzony do chromosomu szczepu z delecją DARS2. Powstałe w ten sposób klony zawierające indywidualne insercje zostały połączone i rywalizowały ze sobą przez setki pokoleń. Na koniec scharakteryzowano najlepiej przystosowane klony i stwierdzono, że zawierają DARS2 umieszczony w bliskiej odległości od pierwotnej lokalizacji DARS2.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na funkcję dowolnego elementu genetycznego może mieć wpływ jego lokalizacja w genomie. U bakterii wynika to głównie z interferencji przez transkrypcję sąsiednich genów, lokalną topologię DNA i/lub dawkowanie genów związane z replikacją. W szczególności procesy replikacji i segregacji DNA są kontrolowane, przynajmniej częściowo, przez niekodujące regiony chromosomowe1, a prawidłowe funkcjonowanie tych regionów zależy od lokalizacji/kontekstu genomu. W przypadku E. coli przykładami są miejsce dif, wymagane do rozdzielczości chromosomu siostrzanego2; Sekwencje KOPS, wymagane do segregacji chromosomów3; oraz regiony datA, DARS1 i DARS2, wymagane do prawidłowej kontroli replikacji chromosomów (poniżej; 4). Przedstawiamy metodę pozwalającą na losowe przemieszczanie, selekcję i określenie optymalnego kontekstu genetycznego danego elementu genetycznego, czego przykładem jest badanie regionu niekodującego DARS2.

U E. coli, DnaA jest białkiem inicjującym odpowiedzialnym za otwarcie nici DNA na początku pojedynczej replikacji, oriC, oraz za rekrutację helikazy DnaB5,6,7. DnaA należy do białek AAA+ (tj. ATPaz związanych z różnorodną aktywnością) i może wiązać zarówno ATP, jak i ADP z podobnymi wysokimi powinowactwami5. PoziomDnaA ATP osiąga szczyt w momencie inicjacji8, gdzieDnaA ATP tworzy multimer na oriC, który wyzwala otwieranie DNA duplex9. Po inicjacji, oriC staje się tymczasowo niedostępny do ponownej inicjacji z powodu sekwestracji przez mechanizm obejmujący wiązanie białka SeqA z hemimetylowanym oriC10,11. Podczas sekwestracji poziomDnaA ATP jest obniżany przez co najmniej dwa mechanizmy: regulacyjną inaktywację DnaA (RIDA)12,13 i zależną od datA hydrolizęDnaA ATP (DDAH)14,15. Zarówno RIDA, jak i DDAH promują konwersjęDnaA ATP do DnaAADP. Przed nową rundą inicjacji, DnaAADP jest reaktywowany do DnaAATP w określonych sekwencjach reaktywujących DnaA (DARS): DARS1 i DARS216,17. Chromosomalne regiony datA, DARS1 i DARS2 są niekodujące i działają w sposób podobny do chaperonu, modulując interkonwersję DnaAATP / DnaAADP. Regiony te, znajdujące się poza początkiem replikacji, umożliwiają składanie kompleksu DnaA dla inaktywacji (datA;14) lub aktywacja (DARS1 i DARS2;17) DnaA. Usunięcie DARS2 w komórce nie zmienia czasu podwojenia masy, ale powoduje inicjację replikacji asynchronicznej15,16,18. Jednak komórki z niedoborem DARS2 mają koszt przystosowania w porównaniu z izogenicznym typem dzikim, zarówno podczas ciągłej konkurencji wzrostu w bogatej pożywce, jak i podczas ustanawiania kolonizacji w jelicie myszy 18. Oznacza to, że nawet niewielkie zmiany w stężeniu asynchronicznym/pierwotnym mają negatywny wpływ na sprawność bakterii. U E. coli występuje presja selekcyjna na utrzymanie symetrii chromosomów (tj. dwa prawie równej długości ramiona replikacyjne)19. Regiony datA, DARS1 i DARS2 mają tę samą względną odległość od oriC we wszystkich szczepach E. coli sekwencjonowanych18, pomimo dużych różnic w wielkości chromosomów.

Tutaj używamy regionu DARS2 E. coli jako przykładu do identyfikacji pozycji chromosomów optymalnej dla jego funkcji. DARS2 został wstawiony do transpozonu NKBOR, a powstały transpozon NKBOR::DARS2 został następnie losowo wstawiony do genomu MG1655 ΔDARS2. W ten sposób wygenerowaliśmy zbiór komórek, z których każda posiada DARS2 umieszczony w innym miejscu na chromosomie. Przeprowadzono eksperyment konkurencji in vitro, w którym wszystkie komórki w kolekcji zostały połączone i rywalizowały ze sobą podczas ciągłego wzrostu LB przez około 700 pokoleń. Wynik eksperymentu konkursowego był monitorowany/określany za pomocą Southern blot, łatwego chodzenia po genach i sekwencjonowania całego genomu (WGS; Rysunek 1). Klony punktów końcowych rozdzielone przez łatwe chodzenie po genach scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny parametrów cyklu komórkowego. W analizie cytometrii przepływowej można zmierzyć wielkość komórki, zawartość DNA i synchronizację inicjacji dla dużej liczby komórek. Podczas cytometrii przepływowej przepływ pojedynczych komórek przepuszcza wiązkę światła o odpowiedniej długości fali, aby wzbudzić wybarwione DNA, które jest następnie jednocześnie rejestrowane przez fotopowielacze, które zbierają emitowaną fluorescencję, miarę zawartości DNA, pod warunkiem, że komórki są barwione pod kątem DNA. Światło rozproszone do przodu jest miarą masy komórki20.

Eksperyment konkursowy in vitro, który tutaj prezentujemy, służy do odpowiedzi na pytania dotyczące znaczenia pozycji chromosomalnej i kontekstu genomowego elementu genetycznego. Metoda jest bezstronna i łatwa w użyciu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kolekcja Biblioteki Transposon

UWAGA: Chromosomalny locus DARS2 został sklonowany do transpozonu opartego na mini Tn10, NKBOR (on pNKBOR)21, co daje w wyniku NKBOR::DARS2 (pJFM1). pNKBOR można uzyskać online22. pNKBOR to wektor samobójczy oparty na R6K, który wymaga białka inicjującego π do replikacji23. Plazmid pJFM1 jest zatem zdolny do replikacji w szczepie E. coli (np. Dh5α λ pir) zawierającym chromosomalną kopię genu pir. Jednakże, gdy pJFM1 jest przekształcany w MG1655 z niedoborem Pir, pJFM1 nie może się replikować, co prowadzi do selekcji klonów opornych na kanamycynę generowanych przez losowe inserpcje NKBOR::DARS2 do chromosomu bakteryjnego. Dla uproszczenia nazywa się je wstawkami DARS2. Zobacz Rysunek 1 dla schematycznego przedstawienia metodologii.

  1. Przygotuj elektrokompetentny MG1655 ΔDARS2 z aktywnie rosnących komórek w bulionie lizogenicznym (LB) hodowanym w temperaturze 37 °C24.
  2. Elektroporować pJFM1 do elektrokompetentnego MG1655 ΔDARS2, według Gonzalesa i wsp.24
    1. Dodać 1 μg pJFM1 (w 1 μl wody) do 40 μl elektrokompetentnego E. coli MG1655 ΔDARS2 i przenieść tę mieszaninę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety o średnicy 0,2 cm. Włóż kuwetę do komory elektroporacji. Elektroporacja przy napięciu 18 kV, 500 Ω i 25 μF; Stała czasowa powinna wynosić ~5,0 ms i nie powinno wystąpić wyładowanie łukowe.
    2. Szybko odzyskaj zawiesinę bakteryjną, umieszczając ją ponownie w 1 ml podgrzanego bulionu LB i przenosząc do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Pozwól komórkom zregenerować się poprzez inkubację w napowietrzonych warunkach wzrostu w temperaturze 37 °C przez 30 minut, bez selekcji antybiotyków. Umieść bakterie na płytkach agarowych LB uzupełnionych 50 μg/ml kanamycyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Policz kolonie z elektroporacji: jedna kolonia jest równa jednej insercji transpozonu chromosomowego.
    UWAGA: Kolonie można liczyć na oko lub za pomocą licznika kolonii. Liczba kolonii jest odwrotnie proporcjonalna do średniej odległości dzielącej transpozony znajdujące się w chromosomie każdego klonu.
  4. Dodaj 1 ml bulionu LB do każdej płytki i zmyj wszystkie kolonie; 1 ml bulionu LB powinien wystarczyć do zmycia ~ 100 000 kolonii. Użyj ponownie tego samego 1 ml bulionu LB, aby zwiększyć stężenie bakterii. Zbierz wszystkie kolonie w tej samej probówce o pojemności 50 ml.
  5. Zwirować rurkę i zamrozić materiał wyjściowy (t = 0). Aby go zamrozić, wymieszaj 1 ml zawiesiny komórkowej z 1 ml 50% glicerolu na lodzie. Przenieś probówki do suchego lodu na 10 minut. Po zamrożeniu kultur przenieś je do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Na tym etapie spodziewane jest stężenie komórek na poziomie co najmniej 50 000 CFU/ml.

2. Eksperyment konkursowy w LB

  1. Rozmrozić bibliotekę transpozonów od -80 °C na lodzie. Wymieszać pipetując.
  2. Przenieś 100 μl biblioteki transpozonów do 10 ml LB w probówce o pojemności 15 ml.
  3. Hodować komórki, napowietrzane przez ciągłe wytrząsanie (250 obr./min), przez 8 godzin w temperaturze 37 °C do fazy stacjonarnej (tj. OD600 = ~4,0). Dostosuj te parametry do różnych warunków wzrostu, zgodnie z potrzebami.
  4. Rozmnażaj populację bakterii przez ciągłe transfery do świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki co ~10 pokoleń. Zrób to, przenosząc 10 μl kultury z poprzedniej fazy stacjonarnej do 10 ml świeżego LB i rosnąc przez kolejne 8 godzin do fazy stacjonarnej (tj. OD600 = ~ 4,0).
    UWAGA: Ponieważ początkowa i końcowa gęstość optyczna są takie same, 1000-krotne rozcieńczenie odpowiada ~10 generacjom wzrostu (210 = 1,024). Populację bakterii można rozmnażać bezpośrednio na świeże, wstępnie ogrzane podłoże lub przechowywać w temperaturze 0-4 °C (na lodzie) i rozmnażać następnego dnia. LB został tutaj użyty, aby zapewnić jak najwięcej podwojeń komórkowych w jak najkrótszym czasie (czas podwojenia bliski 22 minutom).
  5. Po każdych 100 generacjach zawodów zachowaj pięć próbek o pojemności 1 ml w temperaturze -80 °C (zgodnie z opisem w kroku 3.3).
  6. Jeśli oczekuje się, że różnice w dopasowaniu między komórkami zawierającymi poszczególne insercje transpozonów będą niewielkie, czas trwania konkurencji powinien być długi; tutaj użyto 700 pokoleń (t = 700).

3. Analiza Southern Blot w celu monitorowania eksperymentu konkurencji w czasie

  1. Przygotuj sondę do Southern blot (1-kb sekcja NKBOR), wykonując amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu określonych starterów: NKBOR_Probe_FW: gatgttggacgagtcggaat i NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. Inkubować w temperaturze 98 °C przez 30 s w celu wstępnej denaturacji. Następnie wykonaj 35 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s. Do ostatecznego przedłużenia użyj 72 °C przez 10 min.
      UWAGA: Matrycą do reakcji PCR był oczyszczony plazmid pNKBOR21.
    2. Oznacz wynikowy fragment PCR za pomocą [α-32P]dATP przy użyciu systemu losowych starterów, zgodnie z Smith25.
  2. Przygotuj całkowite DNA komórkowe zgodnie z Løbnerem-Olesenem i von Freiesleben26 dla t = 0 i wybranych punktów czasowych do t = 700 szacowanych pokoleń konkurencji.
  3. Trawić całkowite DNA komórkowe za pomocą PvuI, który przecina NKBOR zawierający obszar zainteresowania tylko raz w regionie nieobjętym sondą; 1 jednostka PvuI może być użyta do całkowitego strawienia 1 μg substratu DNA.
    UWAGA: Sonda rozpozna fragmenty zawierające część transpozonu, wraz z chromosomalnym DNA o różnej długości, w zależności od miejsca wprowadzenia.
  4. Wykonaj Southern blot przy użyciu 0,7% żelu agarozowego zgodnie z Løbner-Olesen i von Freiesleben26.

4. Identyfikacja najlepiej dopasowanych klonów

  1. Stosuj łatwe chodzenie po genach, jak opisano przez Harrisona i wsp.27, aby zidentyfikować miejsca insercji DARS2 z pojedynczych klonów (wyizolowanych na płytkach LB) po 700 szacowanych generacjach konkurencji; im więcej prążków na Southern blot, tym więcej izolatów jest potrzebnych do pokrycia wszystkich insercji transpozonów.
    1. Wyizoluj genomowe DNA do matrycy PCR. Rozprowadzić bakterie na płytce agarowej LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Hodować pojedyncze kolonie przez noc w bulionie LB w temperaturze 37 °C, a następnie przenieść 20 μl do 200 μl autoklawowanej wody destylowanej (lub zastosować oczyszczanie DNA, jak w kroku 3.2).
      1. Wirować do mieszania. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 100 °C przez 10 minut i odwirowywać z maksymalną prędkością przez 5 minut. Zachowaj lizat komórkowy w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
    2. Zaprojektuj trzy zagnieżdżone startery do wyżarzania w wybranym transpozonie (patrz Rysunek 2 dla graficznej reprezentacji strategii PCR).
      UWAGA: Projektowanie zagnieżdżonych starterów powinno zapewnić, że zagnieżdżony starter 3 leży najbliżej znanego końca 5' transpozonu DNA, a następnie zagnieżdżone startery 2 i 1. Odstęp między zagnieżdżonym starterem 3 a końcem 5' znanego transpozonu DNA powinien być wystarczający do odczytania sekwencji ze znanego DNA do nieznanego DNA (w celu znalezienia specyficznego miejsca insercji transpozonu chromosomowego). Dla NKBOR użyto następujących zagnieżdżonych starterów: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg i pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Stosuje się również losowe startery zawierające miejsca rozpoznawania znanych enzymów restrykcyjnych. Aby zapewnić wynik, należy użyć co najmniej dwóch różnych losowych starterów. Miejsca restrykcyjne dla enzymów restrykcyjnych (np. Sau3AI i HindIII) powinny znajdować się na końcu 3' i być poprzedzone dziesięcioma losowymi zasadami, tak aby 5'-NNNNNNNNNNGATC-3' i 5'-NNNNNNNNNNAAGCTT-3' były starterami zawierającymi odpowiednio miejsce Sau3AI (GATC) i miejsce HindIII (AAGCTT), gdzie N = A, T, G lub C.
    3. Użyj 200 ng genomowego DNA w 20 μl reakcji PCR. Inkubować w temperaturze 98 °C przez 30 s w celu wstępnej denaturacji. Wykonaj 25 cykli w temperaturze 98 °C przez 30 s, 50 °C przez 15 s i 72 °C przez 4 minuty. Do ostatecznego przedłużenia użyj 72 °C przez 10 minut. Użyj par starterów składających się z zagnieżdżonego startera 1 i jednego z losowych starterów.
    4. Użyć par starterów składających się z zagnieżdżonego startera 2 i tego samego losowego startera z drugiego wzmocnienia, używając 1 μl jego poprzedniej reakcji jako matrycy.
    5. Powtórz krok 4.1.4 z parami starterów składającymi się z zagnieżdżonego startera 3 i tego samego losowego startera.
    6. Uruchom produkty z końcowej reakcji PCR na 1,5% żelu agarozowym i zabarwić bromkiem etydyny. Wytnij pasmo w zakresie 100-800 pz i wyizoluj DNA za pomocą dowolnego dostępnego zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie ze wskazówkami producenta. Ponownie zawiesić DNA w 15 μl wody.
      UWAGA: Uwaga. Bromek etydyny jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    7. Zsekwencjonuj pasmo wyizolowane w poprzednim kroku (krok 4.1.6), z zagnieżdżonym starterem 3 jako starterem sekwencjonowania, używając sekwencjonowania Sangera u komercyjnego dostawcy.
  2. Wykonaj WGS.
    1. Wykonaj WGS na całkowitym DNA wyekstrahowanym z wybranych próbek pobranych podczas eksperymentu konkursowego, zgodnie z opisem Frimodt-Møller et al4.
  3. Wykonaj analizę sekwencjonowania.
    1. Wyrównaj odczyty sparowanych końców do 150 Ns ciągłych do NKBOR, AF310136.1 1,904...2,204 za pomocą Bowtie228 z interwałem między podciągami źródłowymi (S,1,1.15) i maksymalną liczbą niejednoznacznych znaków (L,0,0.9).
    2. Wybierz wyrównane odczyty, a następnie ponownie wyrównaj do obu MG1655 ref|NC_000913.3 oraz NKBOR gb|AF310136 przy użyciu blastN29
    3. Przypisz pozycje wstawiania transpozycji na skrzyżowaniach MG1655-NKBOR.

5. Cytometria przepływowa

  1. Pobrać próbki do cytometrii przepływowej.
    1. Zrównoważ każdą kulturę, utrzymując ją w fazie wykładniczego wzrostu przez co najmniej 10 pokoleń. Sprawdź OD600 i upewnij się, że nigdy nie przekracza 0.3.
    2. Pobrać dwa rodzaje próbek przepływowych.
      1. W przypadku bicia RIF przenieść 1 ml kultury do 15 ml probówki zawierającej 30 μl RIF-CEF (300 μg/ml ryfampicyny i 36 μg/ml cefaleksyny rozpuszczonych w 12,5 mM NaOH). Pozostawić w temperaturze 37 °C na minimum 4 godziny wstrząsania.
        UWAGA: Ryfampicyna pośrednio blokuje inicjację replikacji chromosomów, jednocześnie pozwalając na kontynuowanie trwających rund replikacji aż do zakończenia. Cefaleksyna zapobiega podziałom komórkowym, co skutkuje wyczerpaniem replikacji (RIF-runout) i akumulacją komórek z w pełni zreplikowanymi chromosomami. Liczba w pełni zreplikowanych chromosomów jest równa liczbie początków w momencie leczenia ryfampicyną i cefaleksyną20.
      2. W przypadku próbki EXP przenieś 1 ml wykładniczo rosnącej kultury do probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.
  2. Napraw komórki w następujący sposób. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 15 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 100 μl lodowatego 10 mM Tris pH 7,5 i dodać 1 ml lodowatego 77% etanolu. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Zabarwić komórki w następujący sposób. Zebrać 100-300 μl komórek utrwalonych przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 130 μl "roztworu do barwienia DNA" (90 μg/ml mitramycyny, 20 μg/ml bromku etydyny, 10 mM MgCl2 i 10 mM Tris pH 7,5). Umieść próbki na lodzie i w ciemności; Próbki są gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej po 10 minutach
    UWAGA: Można również użyć innych barwień DNA niż bromek etydyny i mitramycyna30,31.
  4. Określ pochodzenie na komórkę, względną masę komórki i względną zawartość DNA za pomocą analizy cytometrii przepływowej.
    1. Wykonaj cytometrię przepływową, jak opisano wcześniej32. Uruchomić próbki RIF-runout i EXP, korzystając z instrukcji producenta cytometru przepływowego. W przypadku komórek barwionych bromkiem mithramycyny i etydyny należy użyć fal wzbudzenia o długości 395 i 440 nm i zebrać fluorescencję powyżej 565 nm.
      1. Aby określić względną masę komórki i względną zawartość DNA, uruchom próbki EXP w celu uzyskania jednoparametrowego rozproszenia światła do przodu w funkcji histogramów liczby komórek i intensywności fluorescencji w stosunku do histogramów liczby komórek dla co najmniej 30 000 zdarzeń odpowiadających sygnałowi komórkowemu.
      2. Użyj rozkładu światła rozproszonego do przodu jednoparametrowego, aby zmierzyć średnią względną masę komórki.
        UWAGA: Światło rozproszone do przodu jest miarą średniej masy komórki20.
      3. Użyj rozkładów intensywności fluorescencji jednoparametrowej, aby zmierzyć średnią zawartość DNA20.
      4. Stężenie DNA należy obliczyć jako stosunek średniej zawartości DNA do średniej masy komórki20.
    2. Określ liczbę punktów początkowych w komórce.
      1. Uruchom próbki bicia RIF, aby uzyskać jednoparametrową intensywność fluorescencji w porównaniu z histogramami liczby komórek dla co najmniej 30 000 zdarzeń odpowiadających sygnałowi komórkowemu.
      2. Użyj rozkładów jednoparametrowych intensywności fluorescencji, aby określić liczbę chromosomów w każdej komórce20.
  5. Oblicz wskaźnik asynchroniczności (Ai).
    1. Oblicz Ai, zgodnie z opisem Løbnera-Olesena i wsp.32, używając rozkładu intensywności fluorescencji pojedynczych parametrów próbek wybijanych RIF i wzoru Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), gdzie fx to komórki frakcji z liczbą x w pełni zreplikowanych chromosomów. Rozważ inicjacje asynchroniczne, gdy A >0.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzono Southern blot, aby sprawdzić, czy DARS2 jest losowo dystrybuowany po chromosomie w bibliotece transpozonów (t = 0) i czy najlepiej dopasowane klony przetrwają w czasie. Southern blot przeprowadzono na DNA wyekstrahowanym z początkowej puli transpozonów (przy t = 0) i co około 100 z 700 pokoleń konkurencji (Ryc. 3). W tym przypadku całkowite DNA komórkowe z każdego punktu czasowego zostało strawione za pomocą enzymu restrykcyjnego PvuI, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowana tu metodologia wykorzystuje najnowocześniejsze techniki, aby odpowiedzieć na trudne pytanie dotyczące optymalnej pozycji genomowej elementu genetycznego. Losowe wprowadzenie elementu genetycznego (za pośrednictwem transpozonu) umożliwia szybkie i łatwe zebranie tysięcy klonów, które następnie mogą konkurować ze sobą w celu wybrania optymalnej pozycji badanego elementu genetycznego (tj. najlepiej przystosowanego klonu).

W tym przypadku DARS2 został wstawiony do tra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy zostali sfinansowani z grantów Fundacji Novo Nordisk, Fundacji Lundbeck i Duńskiej Narodowej Fundacji Badawczej (DNRF120) za pośrednictwem Centrum Odpowiedzi i Trwałości Stresu Bakteryjnego (BASP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Autoklawizowana wodaBrak
Kuwety do elektroporacji, 0,1 cmThermo Fisher ScientificP41050
Bio-Rad MicroPulser System elektroporacjiBio-Rad165-2100
LB BulionThermo Fisher Scientific12780029 
Agar LB, proszek (agar Lennox L)Thermo Fisher Scientific22700025
GlicerolThermo Fisher Scientific17904
Fisherbrand  Plastikowe szalki PetriegoFisher ScientificS33580A
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlFisher Scientific14-432-22
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlFisher Scientific14-959-53A
Nunc  Rurki kriogeniczneSigma-AldrichV7634 
Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion (2 U/&mikro; L)Thermo Fisher ScientificF530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &mikro; CiPerkinElmerBLU012H250UC
Zestaw do znakowania DNA DECAprime IIThermo Fisher ScientificAM1455
  SF/MBV/03.32Wirówka Pharmacia
Hermle      SF/MBV/03.46Hermle
Ole Dich  SF/MBV/03.29Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mLSigma-AldrichT9661
Eppendorftubes 2.0 mLSigma-AldrichT2795
Chlorek soduMerck6404
96% etanolSigma-Aldrich16368
Trizma HClSigma-AldrichT-3253
Fenol Ultra czystyBRL5509UA
ChloroformMerck2445
Rybonukleaza A typ II ASigma-AldrichR5000
Siarczan sodu (SDS)Merck13760
LizozymSigma-AldrichL 6876
IzopropanolSigma-Aldrich405-7
0,5 M Na-EDTA pH 8.0BRL5575 UA
Siarczan kanamycynySigma-Aldrich10106801001
PvuI (10 U/&mikro; L)Thermo Fisher ScientificER0621
UltraPure AgarozaThermo Fisher Scientific16500500
Barwnik ładujący żel DNA (6X)Thermo Fisher ScientificR0611
Bufor Tris-Boran-EDTASigma-AldrichT4415
Bromek etydynySigma-AldrichE7637
KwassolnySigma-Aldrich433160
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich71687
Whatman  Papiery 3MMSigma-AldrichWHA3030931
bufor SSC 20 razy; KoncentratSigma-AldrichS6639
Amersham Hybond-N+GE HealthcareRPN119B
Ficoll  400Sigma-AldrichF8016
PoliwinylopirolidonSigma-AldrichPVP40
Albumina surowicy bydlęcej - Frakcja VSigma-Aldrich85040C
Sól sodowa kwasu dezoksyrybonukleinowego z jąder łososiaSigma-AldrichD1626
Carestream Kodak   BioMax   film świetlnySigma-AldrichZ373494
GenElute   Zestaw do ekstrakcji żeluSigma-AldrichNA1111 
GenElute   Zestaw do czyszczenia PCRSigma-AldrichNA1020
T100  TermocyklerBio-Rad
SmartSpec Plus SpektrofotometrBio-Rad
RifampicinServa34514.01
CephalexinSigma-AldrichC4895
MithramycinServa29803.02
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-Aldrich246964
Instrument Apogee A10Apogee
Mili-Q Spektrofotometr Wirówka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
  2. Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
  3. Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
  4. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286(2016).
  5. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
  6. Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
  7. Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
  8. Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
  9. Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
  10. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
  11. Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
  12. Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
  13. Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
  14. Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
  15. Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
  16. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
  17. Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
  18. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011(2015).
  19. Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
  20. Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
  21. Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
  22. SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
  23. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  24. Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
  26. Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
  27. Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
  28. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  29. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  30. Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
  31. Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
  32. Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
  33. Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
  34. Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
  35. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  36. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  37. Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
  38. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

insercja za po rednictwem transpozon wkonkurencja wzrostowasekwencjonowanie ca ego genomugene walkingcytometria przep ywowaSouthern blottest run out z ryfampicynelement DARS2

Powiązane artykuły