Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

Summary

Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej.

Abstract

Komórki dendrytyczne (DC) są wysoce zdolne do przetwarzania i prezentowania zinternalizowanych egzogennych antygenów na głównych cząsteczkach klasy zgodności tkankowej (MHC) I, znanych również jako prezentacja krzyżowa (CP). CP odgrywa ważną rolę nie tylko w stymulacji naiwnych limfocytów T CD8 ⁺ i limfocytów T pamięci CD8 ⁺ w celu uzyskania odporności zakaźnej i nowotworowej, ale także w inaktywacji samoczynnych naiwnych limfocytów T przez anergię limfocytów T lub delecję limfocytów T. Chociaż krytyczny mechanizm molekularny CP pozostaje do wyjaśnienia, coraz więcej dowodów wskazuje, że antygeny egzogenne są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym (ERAD) po eksporcie z nieklasycznych kompartmentów endocytarnych. Do niedawna charakterystyka tych przedziałów endocytarnych była ograniczona, ponieważ nie było specyficznych markerów molekularnych innych niż antygeny egzogenne. Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczenie tych przedziałów endocytarnych. Używając tego oczyszczonego mikrosomu, odtworzyliśmy podobny do ERAD transport, ubikwitynację i przetwarzanie egzogennego antygenu in vitro, co sugeruje, że układ ubikwityna-proteasom przetworzył egzogenny antygen po eksporcie z tego przedziału komórkowego. Protokół ten można dalej zastosować do innych typów komórek w celu wyjaśnienia mechanizmu molekularnego CP.

Introduction

Cząsteczki MHC I są wyrażane na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych, za pomocą krótkich peptydów antygenowych pochodzących z antygenów endogennych, które są przetwarzane przez układ ubikwityna-proteasom w cytozolu¹. Po przetworzeniu peptydy antygenowe są transportowane do światła retikulum endoplazmatycznego (ER) przez transporter peptydów TAP. W świetle ER szereg specyficznych białek opiekuńczych wspomaga ładowanie peptydów i prawidłowe fałdowanie kompleksu MHC I. Ta seria cząsteczek nazywana jest kompleksem ładującym peptydy (PLC), co wskazuje, że ER jest centralnym przedziałem do ładowania peptydów na MHC I². Po załadowaniu peptydami cząsteczki MHC I są transportowane na powierzchnię komórki i odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnym układzie odpornościowym jako automarkery i umożliwiają cytotoksycznym limfocytom T CD8 ⁺ (CTL) wykrywanie komórek rakowych lub czynników zakaźnych przez peptydy antygenowe z białek innych niż selfs³.

W komórkach prezentujących antygen (APC), peptydy antygenowe z antygenów egzogennych są również prezentowane na MHC I^4,5,6,7^,8 przez CP, który jest głównie realizowany przez DCs^9,10,11. CP jest niezbędny zarówno do aktywacji naiwnych limfocytów T CD8 ⁺ i limfocytów T pamięci CD8 ⁺ do przeciwzakaźnych i przeciwnowotworowych CTL^12,13, jak i do utrzymania tolerancji immunologicznej poprzez inaktywację samoczynnych naiwnych limfocytów T^14,15. CP odgrywa wiele ważnych ról w adaptacyjnym układzie odpornościowym, jednak mechanizmy molekularne CP nie zostały jeszcze szczegółowo opisane. Wcześniejsze badania CP wykazały, że antygeny egzogenne były zlokalizowane zarówno w ER, jak i endosomie i były przetwarzane przez ERAD, co sugeruje, że antygeny egzogenne są transportowane z endosomu do ER w celu przetwarzania podobnego do ERAD i ładowania peptydów¹⁶. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że obciążenie peptydowe CP nie odbywa się w ER, ale raczej w nieklasycznych przedziałach endocytarnych, które również mają charakterystyczne cechy ER (Rysunek 1)^{17,18,19,20,21}. Aby uniknąć degradacji prekursorów peptydów antygenowych przez wysoką aktywność aminopeptydazy²² w cytozolu, przetwarzanie i ładowanie peptydów w CP zachodzi w proksymalnym obszarze tych nieklasycznych przedziałów endocytarnych (Figura 1). Chociaż charakterystyka tych przedziałów endocytarnych jest kontrowersyjna, w tym przedziale nie ma istniejących specyficznych cząsteczek innych niż antygeny egzogenne.

ERAD to ścieżka komórkowa, która usuwa nieprawidłowo sfałdowane białka z ER. W szlaku ERAD nieprawidłowo sfałdowane białka są wstecznie transportowane przez błonę ER do cytoplazmy i przetwarzane przez układ ubikwityna-proteasom^23,24,25. Kiedy duże cząsteczki, takie jak białka, są transportowane przez dwuwarstwę lipidową, cząsteczki te przechodzą przez aparat molekularny zwany translokonem, taki jak kompleks Sec61 i kompleks Derlin w klasie ER26, oraz kompleks Tom i kompleks Tim w mitochondriach²⁷. Kiedy egzogennie dodane antygeny są transportowane przez błonę ER, muszą przeniknąć do dwuwarstwy lipidowej w kompleksie z translokonami, takimi jak kompleks Sec61. Opisana tutaj metoda oczyściła docelowy pęcherzyk, wykorzystując te cząsteczki przenikające przez błonę jako markery przedziałów endocytarnych.

Opisana tutaj metoda to nowy protokół oczyszczania pęcherzyków przy użyciu linii komórkowej podobnej do DC2.4²⁸ i biotynylowanej albuminy jaja kurzego (bOVA) jako egzogennego antygenu. Przedziały endocytarne oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny (SA) przy użyciu przenikającego przez błonę bOVA jako wytwórcy. W tym oczyszczonym mikrosomie niektóre egzogennie dodane bOVA były nadal zachowane we frakcjach błonowych, ale zostały przetransportowane na zewnątrz mikrosomu, a następnie ubikwitynowane i przetworzone in vitro²⁹. Ten oczyszczony mikrosom zawierał nie tylko białka specyficzne dla endocytarnych kompartmentów, ale także białka rezydujące w ER dla ERAD i kompleksu ładowania peptydów; sugerując, że przedział komórkowy jest prospektywnym przedziałem endocytarnym dla CP²⁹. Protokół ten nie jest zależny od rodzaju egzogennych antygenów i ma również zastosowanie do innych podzbiorów DC i innych typów komórek, takich jak makrofagi, limfocyty B i komórki śródbłonka, w celu wyjaśnienia dokładnego mechanizmu molekularnego DC dla biegłego CP.

Protocol

1. Hodowla komórek i dodawanie antygenów egzogennych

1. Przygotować bOVA za pomocą zestawu do znakowania biotyny i białka zgodnie z protokołem producenta.
   UWAGA: Zwykle bOVA zawiera średnio 2 M biotyny na 1 M OVA.
2. Hoduj komórki DC2.4 w RPMI-1640 uzupełnione 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 55 mM 2-merkaptoetanolu, 10 mM HEPES (pH 7,5) i 10% płodowej surowicy cielęcej (zwanej dalej RPMI) w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze (dalej bez wzmianki, komórki są inkubowane w tym stanie). Możliwe jest również stosowanie DMEM uzupełnionego o 10% płodową surowicę cielęcą, 3,7 g/L NaHCO₃ (dalej DMEM) zamiast RPMI.
3. Dzień przed oczyszczeniem podziel komórki na RPMI na 1 x 10⁵ komórek/ml na płytce do hodowli tkankowej. Unikaj utrzymywania komórek w stanie zlewania się. Komórki DC2.4 mogą w dużym stopniu włączać antygeny egzogenne aż do stanu półzlewu, ale szybko tracą tę zdolność po osiągnięciu stanu nadmiernego zlewania się.
4. Zanim komórki DC2.4 staną się częściowo zlewne, dodaj 250 μg/ml bOVA dla 1 x 10⁶ komórek/ml i inkubuj przez 2 - 4 godziny
   UWAGA: Podczas dalszych eksperymentów wszystkie i odczynniki są przechowywane w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej.

2. Przygotowanie mikrosomów

1. Pobrać komórki DC2.4 przez delikatne pipetowanie z płytki tkankowej do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
2. Odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut, 4 °C i ostrożnie usunąć pożywkę z bOVA przez aspirację.
3. Przepłukać komórki DC2.4 dwukrotnie 40 ml buforu PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO₄) przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut, 4 °C i odrzucić supernatant za każdym razem przez aspirację.
4. Zawiesić osad w kroku 2,3 w 1 - 2 ml (1/20-1/10 objętości pożywki hodowlanej) pożywki homogenizacyjnej (0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) z 1/1,000 objętości koktajli inhibitorów proteazy i przenieść zawieszone komórki DC2.4 do lodowatego homogenizatora Dounce.
5. Delikatnie rozbić zawieszone komórki DC2.4 za pomocą 10 - 20 pociągnięć za pomocą lodowatego homogenizatora Dounce.
   UWAGA: Podczas etapu przerywania homogenizator Dounce jest schładzany na lodzie.
6. Przenieść zawiesinę rozłożoną na komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
7. Dodać 8 - 9 ml pożywki homogenizacyjnej do 10 ml ogółem i odwirować stożkową probówkę przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g i 4 °C.
8. Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek i jąder, a następnie ponownie odwirować probówkę stożkową przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.
9. Przenieść supernatant do nowej probówki do ultrawirowania i wirować przez 45 minut przy 100 000 x g i 4 °C.
10. Odessać supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad w 1-2 ml pożywki homogenizacyjnej z 1/1000 objętości koktajli inhibitorów proteazy, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę iw dół, aby uzyskać frakcję mikrosomową do dalszych eksperymentów.
11. Przenieść frakcję mikrosomową do nowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Po tym etapie możliwe jest wzbogacenie obiektywnych mikrosomów poprzez wirowanie w gradicycie gęstości jodiksanolu zgodnie z protokołem producenta, w celu usunięcia niespecyficznych mikrosomów. Frakcje pikowe antygenów egzogennych są zbierane, a następnie poddawane kolejnemu etapowi oczyszczania (etap 3).

3. Oczyszczanie mikrosomów za pomocą bOVA w trakcie ERAD

1. Dodać 1/100 objętości świeżych kulek magnetycznych SA do frakcji mikrosomowej z kroku 2.11 w probówce o okrągłym dnie 5 ml.
   UWAGA: Przed tym etapem możliwe jest wstępne oczyszczenie frakcji mikrosomowej za pomocą kontrolnych kulek magnetycznych w celu zmniejszenia zanieczyszczenia mikrosomami niespecyficznymi.
2. Delikatnie dobrze wymieszać i powoli obracać rurkę z okrągłym dnem przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
3. Dodaj 2-3 ml pożywki homogenizacyjnej do łącznie 4 ml do probówki z okrągłym dnem i delikatnie wymieszaj.
4. Umieścić probówkę z okrągłym dnem na stojaku magnetycznym i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponieważ kulki związane z pęcherzykami są przyciągane do magnesu, brązowe mikrokulki będą stopniowo gromadzić się na ściance rurki znajdującej się najbliżej magnesu.
5. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie wyrzuć supernatanty przez aspirację w celu usunięcia niezwiązanych pęcherzyków.
6. Przemyć kulki magnetyczne związane z pęcherzykami dwukrotnie 5 ml pożywki homogenizacyjnej za pomocą stojaka magnetycznego przez 10 minut w temperaturze 4 °C i za każdym razem odrzucić supernatant przez ostrożne zasysanie.
   UWAGA: Bez podstawy magnetycznej możliwe jest również oczyszczanie przez wirowanie przy 2 000 x g przez 10 minut, 4 °C.
7. Ostrożnie zawiesić kulki magnetyczne związane z pęcherzykami w pożywce homogenizacyjnej o pojemności 100 μl, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół.
8. Przenieś zawieszone pęcherzyki do nowej mikroprobówki jako oczyszczony mikrosom do dalszych eksperymentów.
   UWAGA: Zazwyczaj można wyizolować 50 μl frakcji mikrosomowej zawierającej 5 - 20 μg białek z 1 x 10⁷ komórek.

4. Analiza oczyszczonych mikrosomów

1. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne związane z pęcherzykami z kroku 3.8 za pomocą 100 - 200 μl buforu TNE (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) z 1/1,000 objętości koktajli inhibitorów proteazy zamiast pożywki homogenizującej.
2. Przenieś lizat z kroku 4.1 do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
3. Określić stężenie białka w kroku 4.2 za pomocą zestawu do oznaczania BCA zgodnie z protokołem producenta.
   UWAGA: Zazwyczaj do określenia stężenia białka wystarcza 5 - 10 μl lizatu z kroku 4.2.
4. Przenieś lizat z kroku 4.2 (2 μg białka do barwienia srebrem i 10 μg białka do Western blotting) do nowych mikroprobówek.
5. Umieść mikroprobówki na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C i gotuj białka w 1x buforze ładującym żel SDS (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 200 mM ditiotreitol, 4% SDS, 0,2% błękit bromofenolowy, 20% glicerol) przez 5 minut.
6. Odwirować mikroprobówki przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty do nowych mikroprobówek w celu usunięcia nierozpuszczalnych frakcji.
7. Analizować rozwiązane białka w kroku 4.6 (2 μg) za pomocą standardowej SD-PAGE.
8. Zwizualizuj prążki białkowe przez barwienie srebrem za pomocą zestawu do barwienia srebra zgodnie z protokołem producenta.
9. Analizuj rozwiązane białka w kroku 4.6 (10 μg) za pomocą standardowego SD-PAGE i Western-blotting. Użyj odczynnika (SA-HRP) zgodnie z protokołem producenta i wizualizuj za pomocą fluorografii.

5. Rekonstrukcja in vitro ERAD Ubikwitynacja bOVA przy użyciu oczyszczonych mikrosomów

1. Przenieś oczyszczone mikrosomy (5 - 10 μg białka) z kroku 3.8 z 50% objętością lizatu retikulocytów (RL), w 1x buforze reakcyjnym (50 mM Tris pH 7,4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl₂) i 0,2 pM ubikwityny znakowanej flagą w nowej mikroprobówce. Końcowa objętość tego eksperymentu to 20 - 40 μL.
2. Inkubować mikroprobówkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Jeśli ilość ubikwitynowanego bOVA w kroku 5.12 jest zbyt mała, aby można ją było wykryć za pomocą Western blot, dodaj 10 μM MG132 lub 2 μM laktacystyny, aby zahamować przetwarzanie ubikwitynowanej bOVA przez proteasomy.
3. Zatrzymaj reakcję, umieszczając mikroprobówkę na lodzie.
4. Rozpuścić mikrosomy, dodając 500 μl buforu TNE z 1/1,000 objętości koktajli inhibitorów proteazy.
5. Odwirować mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty do nowej mikroprobówki w celu usunięcia nierozpuszczalnych frakcji, które zawierają ubikwitynowane bOVA w DC2.4 przed testem ubikwitynacji in vitro.
6. Przenieść supernatant do nowej mikroprobówki i dodać 1/100 objętości nowych kulek magnetycznych SA (zwykle 5 μl na 500 μl supernatantów).
7. Delikatnie dobrze wymieszać i powoli obracać mikroprobówkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
8. Odwirować mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez aspirację w celu odzyskania bOVA i ubikwitynowanych bOVA związanych kulkami magnetycznymi SA.
9. Przemyć dwukrotnie zebrane kulki magnetyczne SA 1 ml buforu TNE przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za każdym razem przez aspirację.
10. Gotować kulki magnetyczne SA w 1x bufor ładujący żel SDS przez 5 minut w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym, aby rozpuścić oczyszczone białka za pomocą kulek magnetycznych SA.
11. Odwirować mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty do nowej mikroprobówki w celu usunięcia nierozpuszczalnych frakcji.
12. Przeanalizuj kulki magnetyczne SA związane z białkami za pomocą standardowej SD-PAGE i Western-bloting. Stosowanie przeciwciał (anty-Flag, anty-multi-Ub i anty-mysich IgG-HRP) oraz odczynnika (SA-HRP) jest zgodne z protokołem producenta i wizualizowane za pomocą fluorografii.

Results

Aby wyjaśnić molekularny mechanizm CP, konieczne jest zidentyfikowanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są transportowane i przetwarzane jak ERAD. Podczas gdy obserwacje za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej lub mikroskopii elektronowej zidentyfikowały przedział komórkowy, w którym gromadziły się antygeny egzogenne^16,17,18,1

Discussion

W poprzednich badaniach CP włączone antygeny egzogenne gromadziły się w ograniczonym obszarze późnego endosomu lub ER za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej ^16,30,31,32. Szacuje się, że podobny do ERAD transport i przetwarzanie egzogennych antygenów odbywa się w tych wyspecjalizowanych obszarach ER lub późnego endosomu, ponieważ przedział komórkowy został zidentyfikowany przez wirowanie w...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Surowica bydlęca	Equitech bio	SFB30
Pirogronian sodu	gibco by life technologies	11360-070
MEM endogenne aminokwasy	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-merkaptoetanol	gibco firmy life technologies	21985-023
L-glutamina	gibco firmy life technologies	25030-164
Penistycylina-sreptomycyna	gibco firmy life technologies	15140-122
DMEM	gibco firmy life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotyna-białko zestaw do etykietowania	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
laktacystyna	SIGMA	L6785
Homogenizator Dounce	IUCHI	131703
koktajle inhibitorów proteazy	SIGMA	P8340
jodixanol	Cosmo bio	1114542
Koraliki magnetyczne SA	New England Biolabs	201270
kontrolne kulki magnetyczne	Chemagen	M-PVA012
Stojak magnetyczny	BD Biosciences	552311
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Fisher Scientific	23225
	Cosmo bio	423413
Lysate retikulocytów	Promega
Flaga oznaczona ubikwityną	SIGMA	U5382
anty-albumina jaja kurzego (OVA,mysz)	Sklep z przeciwciałami	HYB 094-06
ant-multi-ubikwityna (mysz)	MBL	D058−
antyflagowe (mysz)	SIGMA	F3165
trypsyna	SIGMA	85450C