Method Article

Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

DOI:

10.3791/55949

⸱

August 21st, 2017

 ,  ,  , 
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są wysoce zdolne do przetwarzania i prezentowania zinternalizowanych egzogennych antygenów na głównych cząsteczkach klasy zgodności tkankowej (MHC) I, znanych również jako prezentacja krzyżowa (CP). CP odgrywa ważną rolę nie tylko w stymulacji naiwnych limfocytów T CD8 + i limfocytów T pamięci CD8 + w celu uzyskania odporności zakaźnej i nowotworowej, ale także w inaktywacji samoczynnych naiwnych limfocytów T przez anergię limfocytów T lub delecję limfocytów T. Chociaż krytyczny mechanizm molekularny CP pozostaje do wyjaśnienia, coraz więcej dowodów wskazuje, że antygeny egzogenne są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym (ERAD) po eksporcie z nieklasycznych kompartmentów endocytarnych. Do niedawna charakterystyka tych przedziałów endocytarnych była ograniczona, ponieważ nie było specyficznych markerów molekularnych innych niż antygeny egzogenne. Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczenie tych przedziałów endocytarnych. Używając tego oczyszczonego mikrosomu, odtworzyliśmy podobny do ERAD transport, ubikwitynację i przetwarzanie egzogennego antygenu in vitro, co sugeruje, że układ ubikwityna-proteasom przetworzył egzogenny antygen po eksporcie z tego przedziału komórkowego. Protokół ten można dalej zastosować do innych typów komórek w celu wyjaśnienia mechanizmu molekularnego CP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cząsteczki MHC I są wyrażane na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych, za pomocą krótkich peptydów antygenowych pochodzących z antygenów endogennych, które są przetwarzane przez układ ubikwityna-proteasom w cytozolu1. Po przetworzeniu peptydy antygenowe są transportowane do światła retikulum endoplazmatycznego (ER) przez transporter peptydów TAP. W świetle ER szereg specyficznych białek opiekuńczych wspomaga ładowanie peptydów i prawidłowe fałdowanie kompleksu MHC I. Ta seria cząsteczek nazywana jest kompleksem ładującym peptydy (PLC), co wskazuje, że ER jest centralnym przedziałem do ładowania peptydów na MHC I2. P....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek i dodawanie antygenów egzogennych

  1. Przygotować bOVA za pomocą zestawu do znakowania biotyny i białka zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Zwykle bOVA zawiera średnio 2 M biotyny na 1 M OVA.
  2. Hoduj komórki DC2.4 w RPMI-1640 uzupełnione 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 55 mM 2-merkaptoetanolu, 10 mM HEPES (pH 7,5) i 10% płodowej surowicy cielęcej (zwanej dalej RPMI) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze (dalej bez wzmianki, komórki są inkubowane w tym stanie). Możliwe jest również stosowanie DMEM uzupełnionego o 10% płod....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyjaśnić molekularny mechanizm CP, konieczne jest zidentyfikowanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są transportowane i przetwarzane jak ERAD. Podczas gdy obserwacje za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej lub mikroskopii elektronowej zidentyfikowały przedział komórkowy, w którym gromadziły się antygeny egzogenne16,17,18,1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W poprzednich badaniach CP włączone antygeny egzogenne gromadziły się w ograniczonym obszarze późnego endosomu lub ER za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej 16,30,31,32. Szacuje się, że podobny do ERAD transport i przetwarzanie egzogennych antygenów odbywa się w tych wyspecjalizowanych obszarach ER lub późnego endosomu, ponieważ przedział komórkowy został zidentyfikowany przez wirowanie w.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Uniwersytet Zdrowia i Opieki Społecznej w Takasaki.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Surowica bydlęcaEquitech bioSFB30
Pirogronian sodugibco by life technologies11360-070
MEM endogenne aminokwasygibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-merkaptoetanolgibco firmy life technologies21985-023
L-glutaminagibco firmy life technologies25030-164
Penistycylina-sreptomycynagibco firmy life technologies15140-122
DMEMgibco firmy life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
Biotyna-białko zestaw do etykietowaniaThermo Fisher ScientificF6347
MG-132Santa Cruz Biotechnology201270
laktacystynaSIGMAL6785
Homogenizator DounceIUCHI131703
koktajle inhibitorów proteazySIGMAP8340
jodixanolCosmo bio1114542
Koraliki magnetyczne SANew England Biolabs201270
kontrolne kulki magnetyczneChemagenM-PVA012
Stojak magnetycznyBD Biosciences552311
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Fisher Scientific23225
Cosmo bio423413
Lysate retikulocytówPromega
Flaga oznaczona ubikwitynąSIGMAU5382
anty-albumina jaja kurzego (OVA,mysz)Sklep z przeciwciałamiHYB 094-06
ant-multi-ubikwityna (mysz)MBLD058−
antyflagowe (mysz)SIGMAF3165
trypsynaSIGMA85450C
płodu Zestawy do barwienia srebra 17307143

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cross presentationEndoplasmic Reticulum associated DegradationExogenous Antigen ProcessingDendritic Cell IsolationVesicle Purification ProtocolMicrosome PreparationERAD like TransportUbiquitination AssayAntigen PresentationCellular Compartment Purification

Related Articles