Artykuł metodologiczny

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

DOI:

10.3791/55955

⸱

22 lipca 2017

 ,  ,  , 
1London Research and Development Centre, Agriculture & Agri-Food Canada, 2Department of Biology, University of Western Ontario, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Western Ontario

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalny projekt naśladujący naturalne interakcje między roślinami a mikroorganizmami jest bardzo ważny dla nakreślenia złożonych procesów sygnalizacji roślina-mikroorganizm. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens stanowi doskonały system modelowy do badania patogenezy bakterii i interakcji między roślinami. Wcześniejsze badania interakcji roślina-Agrobacterium w dużej mierze opierały się na kulturach zawiesinowych komórek roślinnych, sztucznym ranieniu roślin lub sztucznej indukcji mikrobiologicznych czynników wirulencji lub obrony roślin przez syntetyczne chemikalia. Jednak metody te różnią się od naturalnej sygnalizacji w planta, gdzie rośliny i drobnoustroje rozpoznają i reagują w sposób przestrzenny i czasowy. W pracy przedstawiono hydroponiczny system kouprawy, w którym nienaruszone rośliny są podtrzymywane przez metalowe sita siatkowe i współuprawiane z Agrobacterium. W tym systemie kouprawy nie jest uzupełniany żaden syntetyczny fitohormon ani substancja chemiczna, która indukuje zjadliwość mikrobiologiczną lub obronę roślin. Hydroponiczny system kouprawy bardzo przypomina naturalne interakcje roślina-mikroorganizm i sygnalizacyjną homeostazę w roślinach. Korzenie roślin można oddzielić od pożywki zawierającej Agrobacterium, a sygnalizację i reakcje zarówno gospodarzy roślin, jak i oddziałujących drobnoustrojów można badać jednocześnie i systematycznie. W dowolnym punkcie czasowym/interwale tkanki roślinne lub bakterie mogą być zbierane oddzielnie w celu przeprowadzenia różnych analiz "omicznych", demonstrując moc i skuteczność tego systemu. System kouprawy hydroponicznej można łatwo dostosować do badania: 1) wzajemnej sygnalizacji różnych systemów roślina-mikroorganizm, 2) sygnalizacji między gospodarzem rośliny a wieloma gatunkami drobnoustrojów (tj. konsorcjami mikrobiologicznymi lub mikrobiomami), 3) w jaki sposób składniki odżywcze i substancje chemiczne są zaangażowane w sygnalizację roślina-mikroorganizm oraz 4) w jaki sposób drobnoustroje wchodzą w interakcje z gospodarzami roślin i przyczyniają się do tolerancji roślin na stresy biotyczne lub abiotyczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmy związane z roślinami odgrywają ważną rolę w obiegu biogeochemicznym, bioremediacji, łagodzeniu zmian klimatycznych, wzroście i zdrowiu roślin oraz tolerancji roślin na stresy biotyczne i abiotyczne. Mikroorganizmy oddziałują z roślinami zarówno bezpośrednio poprzez kontakt ze ścianą komórkową rośliny, jak i pośrednio poprzez wydzielanie chemiczne i sygnalizację1,2,3. Jako organizmy siedzące, rośliny rozwinęły bezpośrednie i pośrednie mechanizmy odporności na infekcje patogenami. Obrona bezpośrednia obejmuje obronę strukturalną i ekspresję białek obronnych, podczas gdy obrona pośrednia obejmuje wtórną produkcję metabolitów roślinnych i przyciąganie organizmów antagonistycznych do atakujących patogenów4,5. Wysięki z korzeni pochodzenia roślinnego, wydzieliny, śluzy, śluz i lizaty zmieniają właściwości fizyczno-chemiczne ryzosfery, aby przyciągać lub odpychać drobnoustroje w kierunku ich gospodarzy6. Skład chemiczny wydzieliny korzeniowej jest specyficzny dla gatunku, służąc w ten sposób jako filtr selektywny, który pozwala niektórym mikroorganizmom zdolnym do rozpoznawania takich związków rozwijać się w ryzosferze6. W ten sposób kompatybilne gatunki drobnoustrojów mogą być stymulowane do aktywacji i wzmacniania swoich asocjacji, z korzyścią lub niekorzyścią dla gospodarza rośliny1.

Zrozumienie interakcji roślina-mikroorganizm w ryzosferze jest kluczem do zwiększenia produktywności roślin i funkcjonowania ekosystemu, ponieważ większość ekspozycji na mikroorganizmy i chemikalia występuje w strukturze korzeni i na granicy glebowo-powietrznej2,6,7,8. Jednak badanie podziemnych interakcji między roślinami a mikroorganizmami i wzajemnych reakcji było wyzwaniem ze względu na ich intrygująco złożoną i dynamiczną naturę oraz brak odpowiednich modeli eksperymentalnych z naturalną strukturą korzeni i morfologią roślin w ściśle kontrolowanych warunkach wzrostu. Jako jeden z najintensywniej przebadanych fitopatogenów, Agrobacterium infekuje szeroką gamę roślin o znaczeniu rolniczym i ogrodniczym, w tym wiśnię, jabłko, gruszkę, winogrono i różę9. Agrobacterium jest ważnym organizmem modelowym dla zrozumienia interakcji roślina-patogen i jest potężnym narzędziem w transformacji roślin i inżynierii roślin10,11,12,13,14.

Molekularne interakcje roślina-Agrobacterium są dobrze badane od kilku dziesięcioleci, a obecna wiedza na temat patogenności Agrobacterium jest obszerna9,11,15,16. Patogeniczność Agrobacterium jest w dużej mierze przypisywana jego rozwiniętym zdolnościom do odbierania sygnałów pochodzenia roślinnego, co skutkuje precyzyjną modulacją jego programu wirulencji i komunikacji międzykomórkowej, tak zwanym quorum sensing17. Program wirulencji Agrobacterium jest regulowany przez kilka sygnałów dostępnych w ryzosferze i obejmuje dwa zestawy układów dwuskładnikowych, układ ChvG/I i układ VirA/G. Kwaśne warunki w ryzosferze aktywują transkrypcję chvG/I, virA/G i kilku innych genów zaangażowanych w patogenność Agrobacterium, w tym virE0, virE1, virH1, virH2 i genów układu wydzielania typu VI (T6SS)18. Związki fenolowe pochodzenia roślinnego, w tym acetosyringon (4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenon), aktywują 2-składnikowy układ VirA/G poprzez mechanizmy sygnalizacji fosforylacji19. VirA/G następnie aktywuje cały regulator wirusa, co powoduje przeniesienie i integrację ~20 kb bakteryjnego fragmentu DNA zwanego transferowym DNA (T-DNA) z plazmidu indukującego nowotwór (Ti) do jądra roślinnego16. T-DNA zawiera geny odpowiedzialne za syntezę hormonów roślinnych kwasu indolo-3-octowego (IAA) (iaaM i iaaH) oraz cytokininy (ipt), a po ekspresji w komórkach roślinnych wytwarzane są duże ilości tych fitohormonów. Powoduje to nieprawidłową proliferację tkanek i rozwój nowotworów roślin, znany jako choroba żółciowa korony, która jest przewlekłym i odradzającym się problemem dla roślin9,11,20. IAA działa również wspólnie z kwasem salicylowym i kwasem gamma-aminomasłowym w celu ograniczenia zjadliwości Agrobacterium lub zmniejszenia wyczuwania kworum Agrobacterium (QS)17,21,22. Aby przeciwdziałać tej represji, T-DNA przenosi również geny biosyntezy opiny, która aktywuje Agrobacterium quorum sensing w celu promowania patogeniczności Agrobacterium, a także służy jako źródło składników odżywczych dla patogenu22,23.

Pomimo ogólnego głębokiego zrozumienia interakcji Agrobacterium z rośliną i wynikającego z tego transferu T-DNA do gospodarza roślinnego, złożone zdarzenia sygnalizacyjne na początkowym etapie interakcji są mniej dobrze poznane. Wynika to częściowo z ograniczeń konwencjonalnych podejść do badania sygnalizacji roślinnej Agrobacterium. Hodowle zawiesiny komórek roślinnych i sztuczne zranienia specyficzne dla miejsca są powszechnie stosowane do badania molekularnych interakcji roślina-mikroorganizm24,26,27. Jednak zawiesiny komórkowe nie mają typowej morfologii roślinnej; W szczególności komórki zawiesiny roślinnej nie mają struktur korzeniowych i wysięków korzeniowych, które są bardzo ważne dla aktywacji chemotaksji mikrobiologicznej i zjadliwości28,29. Utrzymanie morfologii roślin i struktury korzeni zostało rozwiązane poprzez sztuczne okaleczanie roślin, co ułatwia infekcję specyficzną dla danego miejsca, co skutkuje wykryciem indukowanych genów związanych z obroną roślin w bezpośrednio zakażonej tkance roślinnej30,31. Jednak sztuczne zranienie znacznie różni się od infekcji patogenem w naturze, szczególnie że zranienie prowadzi do akumulacji kwasu jasmonowego (JA), który systemowo zakłóca naturalną sygnalizację i obronę roślin26. Ponadto syntetyczne substancje chemiczne są zwykle używane do sztucznego wywoływania reakcji gospodarzy roślin lub zjadliwości patogenów. Chociaż suplementacja takich związków chemicznych odzwierciedlających stężenia w planta jest możliwa, taka suplementacja nie uwzględnia stopniowej dyfuzji wysięków korzeniowych do otaczającej ryzosfery, co generuje gradient chemotaktyczny wykrywany przez drobnoustroje28,32. Biorąc pod uwagę ograniczenia konwencjonalnych podejść do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami, dokładność i szczegółowość uzyskanych danych może być utrudniona i restrykcyjna, a wiedza uzyskana dzięki konwencjonalnym metodom może nie przekładać się bezpośrednio na rośliny. Wiele aspektów sygnalizacji roślina-Agrobacterium nie jest jeszcze w pełni poznanych, szczególnie na wczesnym etapie interakcji, kiedy objawy choroby jeszcze się nie rozwinęły.

Aby zmienić ograniczenia konwencjonalnych metod, ta praca przedstawia niedrogi, ściśle kontrolowany i elastyczny system kouprawy hydroponicznej, który pozwala badaczom uzyskać głębszy wgląd w złożone szlaki sygnalizacji i odpowiedzi na początkowym etapie molekularnych interakcji roślina-mikroorganizm. Hydroponika jest szeroko stosowana do badania składników odżywczych roślin, wysięków korzeniowych, warunków wzrostu i wpływu toksyczności metali na rośliny33,34. Istnieje kilka zalet modeli hydroponicznych, w tym małe wymagania przestrzenne, dostępność różnych tkanek roślinnych, ścisła kontrola warunków odżywczych/środowiskowych oraz zwalczanie szkodników/chorób. Systemy hydroponiczne są również mniej ograniczające wzrost roślin w porównaniu z technikami posiewu agaru/fitoagaru, które zwykle ograniczają wzrost po 2-3 tygodniach. Co ważne, utrzymanie struktur całej rośliny ułatwia naturalne wydzielanie korzeni niezbędne do chemotaksji mikrobiologicznej i indukcji wirulencji8,29. Opisany tutaj system jest prostszy i mniej pracochłonny niż alternatywy33,34. Zużywa mniej części i nie wymaga żadnych narzędzi poza standardowymi nożyczkami. Wykorzystuje metalową siatkę (w przeciwieństwie do nylonu33) jako silne wsparcie wzrostu roślin i prostą metodę napowietrzania w sterylnych warunkach poprzez wstrząsanie w celu wsparcia wzrostu drobnoustrojów. Ponadto system może wykorzystywać metalową siatkę o różnych rozmiarach do wspomagania wzrostu roślin, która jest dostosowana do różnych gatunków roślin bez ograniczania szerokości ich korzeni.

W przedstawionym tutaj systemie kouprawy hydroponicznej, rośliny są uprawiane w sterylnym systemie hydroponicznym, gdzie korzenie roślin wydzielają związki organiczne wspomagające wzrost zaszczepionych bakterii. W tym systemie kouprawy nie są uzupełniane żadne sztuczne chemikalia, takie jak hormony roślinne, elicitor obronny lub substancje chemiczne wywołujące zjadliwość, co odzwierciedla naturalną homeostazę sygnalizacji komórkowej podczas interakcji roślina-mikroorganizm. Dzięki temu hydroponicznemu systemowi kouprawy możliwe było jednoczesne określenie ekspresji genów w tkance korzenia Arabidopsis thaliana Col-0 po zakażeniu Agrobacterium, a także aktywacji genów Agrobacterium podczas kohodowli z Arabidopsis. Wykazano ponadto, że system ten jest odpowiedni do badania przyczepiania się Agrobacterium do korzeni roślin, a także profilu sekretomu korzeni roślin podczas kouprawy (zakażenia) z Agrobacterium (ryc. 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd systemu kouprawy hydroponicznej wraz z analizami próbek. Rośliny są uprawiane na siatce (pędy nad siatką), a korzenie są zanurzone w podłożu hydroponicznym, które jest następnie zaszczepiane bakteriami w celu kokultury. Tkanki roślinne i bakterie są następnie oddzielane w celu jednoczesnej ekstrakcji i analizy. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Planowanie eksperymentalne

  1. Określ konkretne cele eksperymentu.
  2. Zapoznaj się z całym protokołem poniżej. Określ, które sekcje są istotne dla konkretnych celów i czy należy wprowadzić jakieś modyfikacje. Poniżej znajdują się przykłady.
    1. Zastanów się, czy w eksperymentach zostaną wykorzystane rośliny A. thaliana i bakteria A. tumefaciens, jak poniżej, czy inna kombinacja roślina i mikroorganizm.
      UWAGA: Chociaż można stosować różne gatunki roślin, grubość korzeni roślin może wymagać siatki o różnej wielkości (krok 3.3), a parametry wzrostu (kroki 3.10-3.11 i 4.4) oraz wielkość zbiornika hydroponicznego i średnia objętość (krok 4.2) mogą również wymagać dostosowania ( Rysunek 2). Drobnoustroje można łatwo zaszczepić jako czyste kultury, gatunki mieszane (konsorcja) lub z próbek środowiskowych (mikrobiomy), ale wszelkie zmiany mogą mieć wpływ na protokół, szczególnie krok 4.5.
    2. Rozważ typy eksperymentów, które zostaną użyte do analizy próbek.
      UWAGA: Mikroskopia fluorescencyjna (krok 5) wymaga organizmów, które są znakowane fluorescencyjnym konstruktem reporterowym.
  3. Zaprojektuj odpowiednie kontrolki. Uwzględnij zbiorniki hydroponiczne bez sadzonek, które są zaszczepione bakteriami kontrolnymi i zbiorniki z sadzonkami kontrolnymi, które nie są zaszczepione bakteriami.
  4. Zaplanuj eksperymenty z odpowiednią liczbą nasion i zbiorników hydroponicznych. Należy wziąć pod uwagę kontrole, kontrpróby biologiczne (co najmniej 3) oraz ilości tkanek wymagane do wszystkich analiz.
  5. Określ odpowiednią długość kouprawy dla celów eksperymentalnych (krok 4.8).
  6. W razie potrzeby popraw wszystkie poniższe kroki.

figure-protocol-1
Rysunek 2. Przykłady innych roślin, które mogą być uprawiane w systemie hydroponicznym, wsparte na platformie z metalowej siatki. Kompatybilność zestawu metalowych siatek do różnych nasion roślin i uprawy. (A) Siatka spawalnicza ze stali nierdzewnej typu 304 3×3 siatka ×,047 cala drut o średnicy do Vicia faba. (B) Siatka spawalnicza ze stali nierdzewnej typu 304 o siatce 4×4 siatki ×,035 cala do Zea mays. (C) Siatka spawalnicza ze stali nierdzewnej typu 304 o siatce 4×4 siatki ×,032 cala drut o średnicy do glicyny max (soja). (D) Siatka spawalnicza ze stali nierdzewnej typu 304 o oczkach 6×6 ×,047 cala drut o średnicy dla Raphanus sativus (rzodkiew zimowa). (E) Siatka spawalnicza ze stali nierdzewnej typu 304 o siatce 6×6 siatki ×,047 "dla Triticum spp. (F) Siatka spawalnicza ze stali nierdzewnej typu 304 o siatce 6×6 ×,035" do Cucumis sativus. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Sterylizacja powierzchni nasion roślin

  1. Wymieszaj (z dużą prędkością) około 200 nasion A. thaliana z 500 μl wody dejonizowanej w probówce mikrowirówkowej. W przypadku gatunków roślin o większych nasionach użyj dużej tuby, aby ułatwić sterylizację powierzchni.
  2. Odwiruj to przy około 9 000 x g przez 30 s w mikrowirówce stołowej. Usunąć wodę (supernatant) za pomocą pipety.
  3. Dodaj 300 μl 2% podchlorynu sodu do nasion i odwiruj. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 min. W przypadku gatunków roślin z większymi nasionami użyj większych objętości, aby przykryć nasiona.
  4. Wirować przy około 9 000 x g przez 30 s w mikrowirówce stołowej. Usunąć roztwór podchlorynu sodu za pomocą pipety.
  5. Dodaj 500 μl sterylnej, dejonizowanej wody do nasion i wiruj. Wirować przy około 9 000 x g przez 30 s i usunąć wodę za pomocą sterylnej pipety.
  6. Powtórz krok 2.5 dodatkowo 4 razy.
  7. Dodaj 500 μl 70% etanolu do nasion i wiruj. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 min.
  8. Wirować przy około 9 000 x g przez 30 s w mikrowirówce stołowej. Usuń 70% etanolu za pomocą pipety.
  9. Powtórz krok 2.5 dodatkowo 5 razy.
  10. Ponownie zawiesić wysterylizowane nasiona w 500 μl sterylnej, ultraczystej wody.

3. Kiełkowanie nasion i uprawa roślin półstałych

  1. Przygotować półstałe podłoże Murashige i Skoog (MS): 2,165 g/l soli podstawowych MS, 10 g/l sacharozy, 0,25 g/l MES i 59 ml/l mieszanki witamin B5, pH 5,75, z 4 g/l fitoagaru.
  2. Autoklawować pożywkę MS. Wlej 25 ml do każdej sterylnej, głębokiej szalki Petriego (100 x 25 mm2).
  3. Dla każdej szalki Petriego wytnij kwadrat o wymiarach 90 x 90 mm o oczkach ze stali nierdzewnej.
    UWAGA: Zalecana siatka dla A. thaliana ma klasę 304 (klasa standardowa), liczbę oczek (liczba otworów na cal liniowy) 40 x 40 i średnicę drutu 0,01" (0,0254 cm). W przypadku większych zbiorników hydropinowych lub wyższych platform wymagany jest większy kwadrat siatki.
  4. Zegnij rogi każdej kwadratowej siatki na tyle, aby siatka zmieściła się wewnątrz płytki Petriego. Zegnij rogi pod kątem 90° do dużej części siatki, aby umożliwić podparcie siatki przez rogi, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca poniżej na rozwój korzeni (Rysunek 3a).
  5. Pocięte kwadraty siatki włożyć do zlewki, przykryć folią aluminiową i sterylizować w autoklawie w 30-minutowym cyklu suszenia.
  6. Gdy podłoże zestali się na szalkach Petriego, a siatka stanie się sterylna, umieść każdy wysterylizowany kwadrat siatki na wierzchu półstałego podłoża, z zagiętymi rogami skierowanymi w dół.
  7. Popchnij siatkę tak, aby rogi przechodziły przez medium, a większość siatki dotykała górnej powierzchni podłoża (Rysunek 3b).
  8. Użyj pipety transferowej o pojemności 200 μl, aby pobrać pojedyncze, wysterylizowane powierzchniowo nasiona A. thaliana (nasiona pozostaną na końcówce pipety ze względu na siłę podciśnienia) i delikatnie przenieś każde ziarno na wierzch siatki. Umieść nasiona tak, aby były rozmieszczone w odpowiednich odstępach do potrzeb eksperymentalnych (np. 4 6 nasion na talerz).
  9. Uszczelnij płytki Petriego pokrywkami, umieszczając porowatą taśmę chirurgiczną wokół krawędzi.
  10. Rozwarstwić nasiona, umieszczając całą szalkę Petriego w temperaturze 4 °C przez 2 dni w ciemności (np. zawinąć w folię aluminiową, aby symulować ciemność).
  11. Hoduj nasiona na szalce Petriego w temperaturze 22-24 °C z 16-godzinnym fotoperiodem przez 10-14 dni (Rysunek 3c).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Hydroponiczny system kouprawy roślin i mikroorganizmów. Lewy panel przedstawia schemat blokowy przedstawiający sześć kluczowych kroków w montażu i obsłudze hydroponicznego systemu wspólnej uprawy. Prawy panel demonstruje rzeczywiste materiały eksperymentalne, sprzęt i procedury operacyjne dla hydroponicznego systemu kouprawy podczas badania interakcji Arabidopsis-Agrobacterium. Pokazany jest teraz etap inokulacji i ostatni etap pobierania próbek roślin lub bakterii. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Hydroponiczny system kouprawy

  1. Przygotuj płynne podłoże Murashige i Skoog (MS): 2,165 g/l soli podstawowych MS, 10 g/l sacharozy, 0,25 g/l MES i 59 ml/l mieszanki witamin B5, pH 5,75.
  2. Podłoże należy sterylizować w autoklawie. Wlej 18 ml do każdego sterylnego cylindrycznego szklanego lub przezroczystego plastikowego zbiornika (naczynia krystalizujące, 100 x 80 mm2) ze sterylnymi pokrywkami.
    UWAGA: Wstępnie wysterylizuj zbiorniki i pokrywki, owijając je folią aluminiową i sterylizując w autoklawie.
  3. W wysterylizowanym okapie przepływowym użyj sterylnych kleszczyków, aby delikatnie przenieść każdy kwadrat siatki z 10-14-dniowymi sadzonkami z półstałego podłoża do hydroponicznego cylindrycznego zbiornika (Rysunek 3d). Uszczelnij pokrywy zbiorników za pomocą porowatej taśmy chirurgicznej.
  4. Uprawiaj sadzonki na siatce w zbiorniku przez 72 godziny w temperaturze 22-24 °C, z 16-godzinnym fotoperiodem i wstrząsaniem przy 50 obr./min w celu napowietrzenia (Rysunek 3e).
    UWAGA: Pozwala to roślinom przystosować się do środowiska hydroponicznego przed inokulacją (kouprawą) mikroorganizmami. Ten okres oczekiwania pozwoli również na wykrycie przypadkowego zanieczyszczenia mikrobiologicznego przed inokulacją.
    1. Rozpocznij następny krok dzień przed końcem okresu inkubacji.
  5. Hodować A. tumefaciens w pożywce AB (0,5% w/v ekstraktu drożdżowego, 0,5% w/v tryptonu, 0,5% w/v sacharozy, 50 mMMgSO4, pH 7,0) w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przez noc, aż kultura osiągnie końcową gęstość optyczną 1,0 przy 600 nm (OD600), mierzoną za pomocą spektrofotometru, z nieinokulowaną pożywką AB jako ślepą próbą.
    UWAGA: OD600 wynoszący 1,0 odpowiada około 109 komórkom / ml.
  6. Umyj A. tumefaciens trzy razy w równej objętości 0,85% NaCl. Zawiesić ponownie w równej objętości sterylnej podwójnie destylowanej wody.
  7. Przed inokulacją należy dokładnie zbadać zbiornik z sadzonkami, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia; pożywka w niezanieczyszczonych zbiornikach powinna być czysta i przezroczysta.
    1. Wyrzuć każdy zbiornik z mętną cieczą (zanieczyszczeniem) i ponumeruj pozostałe zbiorniki. Pobrać niewielką ilość (20 μl) pożywki hydroponicznej z każdego ponumerowanego zbiornika i umieścić ją na szalce Petriego wypełnionej bulionem Luria (LB). Inkubować naczynie w temperaturze 28 °C.
  8. Natychmiast dodaj 50 μl zawiesiny A. tumefaciens (około 5 x 107 komórek, oszacowanych na podstawie OD600) do każdego numerowanego zbiornika hydroponicznego. Współhoduj siewki A. thaliana i A. tumefaciens w temperaturze 22-24 °C z 16-godzinnym fotoperiodem i wstrząsając przy 50 obr./min (Rysunek 3f).
    1. Zbadać nakrapianą płytkę LB z kroku 4.7.1. po 12 i 28 godzinach inkubacji w celu sprawdzenia sterylności zbiorników. Jeśli występuje jakiekolwiek zanieczyszczenie, nie należy używać odpowiedniego numerowanego zbiornika (zaszczepionego bakteriami) do dalszych testów.
  9. W razie potrzeby monitoruj wzrost A. tumefaciens w regularnych odstępach czasu, usuwając próbkę pożywki ze zbiornika i mierząc OD600 za pomocą spektrofotometru z pożywką z niezaszczepionej kontroli jako ślepą próbę (Rysunek 4).
    UWAGA: Objawy choroby roślin powinny być widoczne po 7 dniach (Rysunek 5).
  10. Oddziel korzenie A. thaliana od zawiesiny bakteryjnej, podnosząc płytkę siatki; czas wykonania tego kroku zależy od dalszych procesów. Zobacz kroki 5-8, aby uzyskać szczegółowe informacje.
  11. Jeśli używasz korzeni do kolejnych analiz, szybko opłucz korzenie w wodzie podwójnie destylowanej. Jeśli używasz liścia lub innej tkanki, odetnij tkankę. W przypadku analiz RNA należy od razu przejść do kroku 7.1.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Wzrost Agrobacterium w hydroponicznym systemie kouprawy. Wzrost Agrobacterium w obecności lub braku żywiciela roślinnego (Arabidopsis) monitorowano co 4 godziny. Komórki Agrobacterium hodowano w pożywce AB O/N, przemywano 3x 0,85% NaCl i inokulowano do systemu hydroponicznego, z lub bez kohodowli Arabidopsis, z początkowego OD600 około 0,1. Wartości OD600 są średnią trzech kontrprób biologicznych, z odchyleniami standardowymi (OD600 wynoszące 1,0 = 1 x 109 komórek/ml).

figure-protocol-4
Rysunek 5: Reprezentatywne fenotypy roślin i obserwowalne objawy chorobowe podczas kouprawy. W ciągu 4 dni po inokulacji nie są widoczne żadne objawy chorobowe (A) w porównaniu z roślinami nieinokulowanymi (B). Po 7 dniach kouprawy (infekcji) objawy chorobowe obserwuje się u porażonych roślin (C), podczas gdy rośliny niezaszczepione pozostają zdrowe (D).

5. Mikroskopia fluorescencyjna

  1. Użyj A. tumefaciens zawierającego konstrukt reporterowy dla białka autofluorescencyjnego do konfiguracji kouprawy w kroku 4.5.
    UWAGA: Zmodyfikowany plazmid pJP2 wyrażający pCherry, pochodna dsRed36, jest tutaj używany.
  2. Po odpowiedniej wspólnej uprawie (np. 48 godzin) w kroku 4.8, oddziel poszczególne korzenie wtórne (boczne gałęzie korzenia głównego) za pomocą sterylnych nożyczek.
  3. Opłucz korzenie w podwójnie destylowanej wodzie, aby usunąć luźno związany materiał. Zanurz każdy korzeń w 30 μl wody na szkiełku mikroskopowym i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby zapobiec odwodnieniu korzeni.
  5. Wizualizacja przyczepiania się A. tumefaciens do korzeni A. thaliana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    UWAGA: W tym przypadku mikroskop konfokalny ze wzbudzeniem z lasera helowo-neonowego (He-Ne) 543/594 nm służy do wizualizacji fluorescencji pCherry red przy 590-630 nm pod odwróconym obiektywem z soczewką wodną 63X o aperturze numerycznej 1,4 (Rysunek 6).

figure-protocol-5
Rycina 6: Przyczep korzenia Agrobacterium, określony za pomocą mikroskopii konfokalnej. Agrobacterium znakowane czerwoną fluorescencją pCherry zwizualizowano przy długości fali 590-630 nm, ze wzbudzeniem za pomocą lasera helowo-neonowego (He-Ne) o długości fali 543/594 nm. Wizualizacja została przeprowadzona pod odwróconym obiektywem z soczewką wodną 63x o aperturze numerycznej 1,4. Podziałka = 11 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Analizy transkryptów bakteryjnych

  1. Po odpowiedniej wspólnej uprawie (np. 8 godzin) w kroku 4.8 należy oddzielić korzenie od podłoża hydroponicznego, jak w kroku 4.9. Przenieś 1,5 ml pożywki hydroponicznej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 12 000 x g przez 2 minuty w celu osadzenia komórek.
  2. Usunąć supernatant. Przenieś kolejne 1,5 ml pożywki hydroponicznej do tej samej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 12 000 g przez 2 minuty, aby granulować komórki.
  3. Usuń supernatant.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu poprzez zamrożenie próbek w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  4. Wyodrębnij RNA z komórek A. tumefaciens przy użyciu standardowych metod37 lub odpowiedniego komercyjnego zestawu do izolacji i oczyszczania RNA z obróbką DNazą, aby uniknąć zanieczyszczenia DNA.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, zamrażając porcje RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  5. Wyizolowany RNA należy wykorzystywać do różnych analiz przy użyciu standardowych metod, w tym poniższych.
    1. Użyj komercyjnej mikromacierzy zgodnie z protokołem producenta, aby wykryć zestawy genów, które ulegają różnej ekspresji w kulturze kohodowanej i kontrolnej.
    2. Użyj ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), aby wykryć ekspresję określonych genów lub zweryfikować dane z mikromacierzy38.

7. Analizy transkryptów roślin

  1. Po odpowiedniej kohodowli (np. 8 godzin) w kroku 4.8 należy oddzielić korzenie od podłoża hydroponicznego, jak w kroku 4.9, lub oddzielić inne tkanki w razie potrzeby. Natychmiast umieścić około 150 mg korzeni lub innych tkanek roślinnych w ciekłym azocie.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu poprzez zamrożenie próbek w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  2. Zmielić zamrożone próbki na proszek w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka.
  3. Wyekstrahuj RNA z proszku przy użyciu standardowych metod39 lub odpowiedniego komercyjnego zestawu do izolacji i oczyszczania RNA z obróbką DNazy, aby uniknąć zanieczyszczenia DNA.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, zamrażając porcje RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  4. Wyizolowany RNA należy wykorzystywać do różnych analiz przy użyciu standardowych metod, w tym poniższych.
    1. Użyj komercyjnej mikromacierzy zgodnie z protokołem producenta, aby wykryć zestawy genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w roślinach uprawianych wspólnie i kontrolnie.
    2. Użyj qRT-PCR do wykrycia zróżnicowanej ekspresji określonych genów lub do walidacji danych z mikromacierzy38.

8. Profilowanie sekretomu

  1. Po odpowiedniej kokultywacji (np. 72 h) w kroku 4.8, oddziel korzenie od podłoża hydroponicznego, jak w kroku 4.9. Wysterylizuj 18 ml pożywki hydroponicznej, przepuszczając ją przez filtr porowy 0,2 μm do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  2. Zamrażać próbki w temperaturze -80 °C O/N.
  3. Poluzuj nakrętki stożkowych probówek o pojemności 50 ml i umieść je w maszynie do liofilizacji na 36 godzin. Przystąp do przechowywania lub przetwarzania próbek (zgodnie z opisem poniżej) do analizy HPLC i wykrywania związków.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Zawiesić każdą próbkę w 5 ml podwójnie destylowanej wody w szczelnej probówce.
  5. Dodać 5 ml octanu etylu i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.
  6. Pozostaw fazy do rozdzielenia w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  7. Przenieść górną część (fazę organiczną) do nowego pojemnika za pomocą pipetowania. W razie potrzeby połącz wiele frakcji organicznych.
  8. Wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu gazowego (~45 min).
  9. Ponownie zawiesić próbkę w roztworze odpowiednim do HPLC (np. 100% metanolu).
  10. Wykonaj HPLC zgodnie ze standardowymi metodami40.
  11. Wykrywanie związków za pomocą odpowiednich środków.
    UWAGA: Spektrometria mas czasu przelotu z jonizacją elektrorozpylania (ESI-TOF-MS)40 jest tutaj używana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzrost w systemie wspólnej uprawy hydroponicznej

Krzywa wzrostu A. tumefaciens C58 wykazała znaczącą fazę opóźnienia w początkowych 16 godzinach kouprawy, po której nastąpił bardzo stabilny wzrost podczas wspólnej uprawy z A. thaliana Col-0, aż do maksymalnej wartościOD 600 wynoszącej około 0,9, począwszy od 48 godzin po szczepieniu. W przeciwieństwie do tego, zasadniczo nie zaobserwowano wzrostu bakter...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę stopniowy charakter wydzielania korzeni, stężenie substancji chemicznych wywołujących zjadliwość wytwarzanych w roślinach i ich wpływ na dynamiczne interakcje roślina-mikroorganizm występuje w gradientach przestrzennych i czasowych. W tym hydroponicznym systemie wspólnej uprawy nie uzupełnia się syntetycznego fitohormonu ani substancji chemicznej, która indukuje zjadliwość drobnoustrojów lub mechanizmy obronne roślin. W przeciwieństwie do tego, przy użyciu konwencjonalnych podejść, dodanie synte...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Brianowi Weselowskiemu i Alexandrowi W. Eastmanowi za ich pomoc i przydatną dyskusję. Chcielibyśmy również podziękować doktorom Eugene'owi W. Nesterowi, Lingrui Zhangowi, Haitao Shenowi, Yuhai Cui i Gregowi Thornowi za ich pomoc, przydatne dyskusje i krytyczną lekturę manuskryptu. Badania te zostały sfinansowane przez Agriculture and Agri-Food Canada, Growing Forward-AgriFlex (RBPI numer 2555) oraz projekt Growing Forward II numer 1670, przeprowadzone przez autorów w ramach ich obowiązków. Badanie to zostało również częściowo sfinansowane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 przyznany Z-C Yuanowi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
nasiona roślin (Arabidopsis thaliana Col-0)Arabidopsis Biological Resource CentreCS7000https://abrc.osu.edu/order-stocks
bakterie (Agrobacterium tumefaciens C58)Uniwersytecie WaszyngtońskimN/A
opcjonalniew zależności od dalszych analiz
wir(różne)
Probówki do mikrowirówek(różne)
Mikrowirówka(różne)
5% podchloryn sodu(różne)
Woda podwójnie destylowana(różne)
Autoklaw(różne)
Mikropipeta (różne)
70% etanolu(różne)
Sole bazowe Murashige i Skoog (MS)Sigma-AldrichM5524
sacharoza(różne)
MES(różne)
Mieszanka witamin B5Fitoagar Sigma-AldrichG1019
(różne)
Głębokie szalki Petriego(różne)
siatka ze stali nierdzewnejFerrier Wire Goods Company LtdKlasa N/A: 304; liczba oczek: 40 i razy; 40; drut DIA: taśma
mikroporowa 0,01, 1 "3M1530-1
dobowa komora wzrostu(różne)
cylindryczne zbiorniki szklane, 100 & razy; 80 mm Można użyć Pyrex3250w innych rozmiarach, w takim przypadku zawartość płynu może wymagać regulacji
przepływu kaptur(różne)
forcepty(różne)
ekstrakt drożdżowy(różne)
trypton(różne)
MgSO4< / sub>(różne)
inkubator z wytrząsaniem(różne)
spektrofotometrróżne)
NaCl(różne)
wytrząsarka(różne)
nożyczki(różne), w zależności od dalszych analiz
mikroskop fluorescencyjnyróżne)opcjonalne, zależy od dalszego przepływu Analizy
Szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe(różne) Opcjonalnie,w zależności od dalszych analiz
Lakier do paznokci(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Zestaw do ekstrakcji bakteryjnego RNA(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Zestaw do ekstrakcji RNA w instalacji (RNeasy Plant Mini Kit)Qiagen74903 lub 74904opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
materiał i sprzęt do qRT-PCR(różne)opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
materiał i sprzęt do analizy mikromacierzy(różne)opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
ciekły azot(różne)opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
moździerz i tłuczek(różne)opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
0,2 i mikro; Filtr porowy m(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Probówki stożkowe 50 ml(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Liofilizator(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Zamykane probówkitestowe (różne)Opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
Octan etylu(różne)opcjonalny, zależy od dalszych analiz
gazowy azot(różne)opcjonalne, zależy od dalszych analiz
materiał i sprzęt do HPLC(różne)opcjonalne, zależy od
dalszych analiz materiał i sprzęt do ESI-TOF-MS(różne)opcjonalne, zależy od dalszych analiz
Bakterie znakowane na , (opcjonalne(

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
  2. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  3. Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
  4. Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  5. Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
  6. Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
  7. Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
  8. Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
  9. Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
  11. Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
  12. Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
  13. Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
  14. Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283(1999).
  15. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  16. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  17. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322(2014).
  18. Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
  19. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
  20. Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
  21. Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
  22. Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
  23. Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
  24. Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
  25. Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
  26. León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
  27. Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
  28. Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
  29. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  30. Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
  31. Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
  32. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252(2014).
  33. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69(2014).
  34. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4(2013).
  35. Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
  36. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  37. Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
  38. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  39. Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
  40. Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
  41. Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
  42. Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699(2015).
  43. Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
  44. Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcje ro lin z mikroorganizmamiAgrobacterium tumefaciensArabidopsis thalianaanaliza przywierania korzeniprofilowanie ekspresji gen wmikroskopia fluorescencyjnaprotok sterylizacjihydroponiczne pod o e wzrostoweanaliza omiczna

Powiązane artykuły