Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55955

⸱

22 lipca 2017

 ,  ,  , 
1London Research and Development Centre, Agriculture & Agri-Food Canada, 2Department of Biology, University of Western Ontario, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Western Ontario

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Streszczenie

Eksperymentalny projekt naśladujący naturalne interakcje między roślinami a mikroorganizmami jest bardzo ważny dla nakreślenia złożonych procesów sygnalizacji roślina-mikroorganizm. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens stanowi doskonały system modelowy do badania patogenezy bakterii i interakcji między roślinami. Wcześniejsze badania interakcji roślina-Agrobacterium w dużej mierze opierały się na kulturach zawiesinowych komórek roślinnych, sztucznym ranieniu roślin lub sztucznej indukcji mikrobiologicznych czynników wirulencji lub obrony roślin przez syntetyczne chemikalia. Jednak metody te różnią się od naturalnej sygnalizacji w planta, gdzie rośliny i drobnoustroje rozpoznają i reagują w sposób przestrzenny i czasowy. W pracy przedstawiono hydroponiczny system kouprawy, w którym nienaruszone rośliny są podtrzymywane przez metalowe sita siatkowe i współuprawiane z Agrobacterium. W tym systemie kouprawy nie jest uzupełniany żaden syntetyczny fitohormon ani substancja chemiczna, która indukuje zjadliwość mikrobiologiczną lub obronę roślin. Hydroponiczny system kouprawy bardzo przypomina naturalne interakcje roślina-mikroorganizm i sygnalizacyjną homeostazę w roślinach. Korzenie roślin można oddzielić od pożywki zawierającej Agrobacterium, a sygnalizację i reakcje zarówno gospodarzy roślin, jak i oddziałujących drobnoustrojów można badać jednocześnie i systematycznie. W dowolnym punkcie czasowym/interwale tkanki roślinne lub bakterie mogą być zbierane oddzielnie w celu przeprowadzenia różnych analiz "omicznych", demonstrując moc i skuteczność tego systemu. System kouprawy hydroponicznej można łatwo dostosować do badania: 1) wzajemnej sygnalizacji różnych systemów roślina-mikroorganizm, 2) sygnalizacji między gospodarzem rośliny a wieloma gatunkami drobnoustrojów (tj. konsorcjami mikrobiologicznymi lub mikrobiomami), 3) w jaki sposób składniki odżywcze i substancje chemiczne są zaangażowane w sygnalizację roślina-mikroorganizm oraz 4) w jaki sposób drobnoustroje wchodzą w interakcje z gospodarzami roślin i przyczyniają się do tolerancji roślin na stresy biotyczne lub abiotyczne.

Wprowadzenie

Mikroby związane z roślinami odgrywają istotną rolę w cyklach biogeochemicznych, bioremediacji, łagodzeniu zmian klimatu, wzroście i zdrowiu roślin oraz ich tolerancji na stresy biotyczne i abiotyczne. Mikroorganizmy oddziałują na rośliny zarówno bezpośrednio poprzez kontakt ze ścianą komórkową rośliny, jak i pośrednio za pomocą sekrecji chemicznej i sygnalizacji1,2,3. Jako organizmy osiadłe, rośliny wykształciły bezpośrednie i pośrednie mechanizmy oporności na infekcje patogenami. Obrona bezpośrednia obejmuje bariery strukturalne oraz ekspresję białek obronnych, natomiast obrona pośrednia obejmuje produkcję wtórnych metabolitów roślinnych i przyciąganie organizmów antagonistycznych wobec naciekających patogenów4,5. Pochodzące z roślin eksudaty korzeniowe, wydzieliny, śluzy, mucigel oraz lizaty zmieniają właściwości fizykochemiczne ryzosfery, aby przyciągać lub odpychać mikroby od ich gospodarzy6. Skład chemiczny wydzielin korzeniowych jest specyficzny dla danego gatunku, pełniąc tym samym rolę selektywnego filtra, który pozwala na rozwój w ryzosferze określonych mikroorganizmów zdolnych do rozpoznawania takich związków6. W ten sposób kompatybilne gatunki mikrobów mogą być stymulowane do aktywacji i zacieśniania swoich powiązań, co może przynieść korzyść lub szkodę roślinie-gospodarzowi1.

Zrozumienie oddziaływań między roślinami a mikroorganizmami w ryzosferze ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia produktywności roślin i funkcjonowania ekosystemów, ponieważ większość ekspozycji mikrobiologicznej i chemicznej zachodzi w strukturze korzeni oraz na granicy gleba-powietrze2,6,7,8. Jednakże badanie podziemnych oddziaływań roślina-mikrob oraz wzajemnych odpowiedzi stanowiło wyzwanie ze względu na ich intrygująco złożoną i dynamiczną naturę oraz brak odpowiednich modeli eksperymentalnych z naturalną strukturą korzeni i morfologią roślin w ściśle kontrolowanych warunkach wzrostu. Jako jeden z najintensywniej badanych fitopatogenów, Agrobacterium infekuje szeroki zakres roślin o znaczeniu rolniczym i ogrodniczym, w tym wiśnię, jabłoń, gruszę, winorośl i różę9. Agrobacterium jest ważnym organizmem modelowym dla zrozumienia oddziaływań patogen-roślina i stanowi potężne narzędzie w transformacji i inżynierii roślin10,11,12,13,14.

Molekularna biologia roślin-Agrobacterium oddziaływania były przedmiotem wnikliwych badań przez kilka dekad, a obecny stan wiedzy na temat Agrobacterium patogenność jest rozległa9,11,15,16. Agrobacterium patogenność przypisuje się w dużej mierze wyewoluowanym zdolnościom do odbierania sygnałów pochodzenia roślinnego, co skutkuje precyzyjną modulacją programu wirulencji oraz komunikacją międzykomórkową, zwaną quorum sensing17. The Agrobacterium program wirulencji jest regulowany przez kilka sygnałów dostępnych w ryzosferze i obejmuje dwa zestawy układów dwuskładnikowych: układ ChvG/I oraz układ VirA/G. Zakwaszone warunki w ryzosferze aktywują transkrypcję chvG/I, virA/Goraz kilka innych genów zaangażowanych w Agrobacterium patogenność, w tym virE0, virE1, virH1, virH2oraz geny systemu sekrecji typu VI (T6SS)18Związki fenolowe pochodzenia roślinnego, w tym acetosyringon (4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenon), aktywują dwuskładnikowy system VirA/G poprzez mechanizmy sygnalizacji fosforylacyjnej.19Następnie VirA/G aktywuje cały Wirus regulon, co skutkuje przeniesieniem i integracją fragmentu bakteryjnego DNA o wielkości ok. 20 kb, zwanego DNA transferowym (T-DNA), z plazmidu Ti (tumor-inducing) do jądra komórkowego rośliny16T-DNA niesie geny odpowiedzialne za syntezę fitohormonów: kwasu indolem-3-octowego (IAA) (iaaM i iaaH) i cytokininę (ipt), a po ekspresji w komórkach roślinnych produkowane są duże ilości tych fitohormonów. Prowadzi to do nieprawidłowej proliferacji tkanek i rozwoju nowotworów roślinnych, znanych jako choroba raka korzeni, która stanowi chroniczny i nawracający problem dla roślin9,11,20IAA działa również wspólnie z kwasem salicylowym i kwasem gamma-aminomasłowym w celu represji Agrobacterium wirulencji lub w celu zmniejszenia Agrobacterium wyczuwanie kworum (QS)17,21,22. Aby przeciwdziałać tej represji, T-DNA niesie również geny biosyntezy opin, która aktywuje Agrobacterium wyczuwanie kworum w celu promowania Agrobacterium patogeniczność oraz służy jako źródło składników odżywczych dla patogenu22,23.

Mimo ogólnego, głębokiego zrozumienia oddziaływań między Agrobacterium a roślinami oraz wynikającego z nich transferu T-DNA do roślinnego gospodarza, złożone zdarzenia sygnalizacyjne na początkowym etapie interakcji są słabiej poznane. Wynika to częściowo z ograniczeń konwencjonalnych metod badania sygnalizacji Agrobacterium-roślina. Do badania molekularnych interakcji roślina-mikrob powszechnie wykorzystuje się zawiesinowe kultury komórek roślinnych oraz sztuczne, specyficzne dla danego miejsca rany24,26,27. Jednak zawiesiny komórkowe pozbawione są typowej morfologii rośliny; w szczególności komórki w zawiesinie nie posiadają struktur korzeniowych ani eksudatów korzeniowych, które są bardzo ważne dla aktywacji chemotaksji i wirulencji drobnoustrojów28,29. Próby zachowania morfologii rośliny i struktury korzeni podejmowano poprzez sztuczne ranienie roślin, co ułatwia infekcję w konkretnym miejscu, prowadząc do wykrycia indukowanych genów związanych z obroną rośliny w bezpośrednio zainfekowanej tkance30,31. Jednak sztuczne ranienie znacząco różni się od naturalnej infekcji patogenem, szczególnie że ranienie prowadzi do akumulacji kwasu jasmonowego (JA), który systemowo zakłóca naturalną sygnalizację i obronę rośliny26. Ponadto do sztucznego indukowania odpowiedzi gospodarza roślinnego lub wirulencji patogenu zazwyczaj stosuje się substancje chemiczne. Choć możliwe jest dodawanie takich związków chemicznych w stężeniach odpowiadających warunkom in planta, taka suplementacja nie uwzględnia stopniowej dyfuzji eksudatów korzeniowych do otaczającej ryzosfery, co generuje gradient chemotaktyczny wykrywany przez mikroby28,32. Biorąc pod uwagę ograniczenia konwencjonalnych metod badania interakcji roślina-mikrob, dokładność i głębia uzyskanych danych mogą być ograniczona, a wiedza wygenerowana za pomocą tych metod może nie przekładać się bezpośrednio na warunki in planta. Wiele aspektów sygnalizacji roślina-Agrobacterium nie jest jeszcze w pełni zrozumiałych, szczególnie na wczesnym etapie interakcji, zanim jeszcze rozwiną się objawy choroby.

Aby wyeliminować ograniczenia konwencjonalnych podejść, niniejsza praca przedstawia niedrogi, ściśle kontrolowany i elastyczny hydroponiczny system kokultywacji, który pozwala badaczom na głębsze zrozumienie złożonych szlaków sygnalizacyjnych i odpowiedzi na początkowym etapie molekularnych interakcji roślina-mikrob. Hydroponika jest szeroko stosowana do badania składników odżywczych roślin, eksudatów korzeniowych, warunków wzrostu oraz wpływu toksyczności metali na rośliny33,34. Modele hydroponiczne oferują szereg zalet, w tym niewielkie wymagania przestrzenne, dostępność różnych tkanek roślinnych, ścisłą kontrolę nad warunkami odżywczymi i środowiskowymi oraz kontrolę nad szkodnikami i chorobami. Systemy hydroponiczne są również mniej ograniczające dla wzrostu roślin w porównaniu do technik wysiewu na agar/fitoagar, które zazwyczaj ograniczają wzrost po 2-3 tygodniach. Co istotne, zachowanie struktur całej rośliny ułatwia naturalną sekrecję korzeniową, niezbędną do chemotaksji mikrobów i indukcji wirulencji8,29. System opisany w niniejszej pracy jest prostszy i mniej pracochłonny niż alternatywy33,34. Wykorzystuje on mniej elementów i nie wymaga żadnych narzędzi poza standardowymi nożyczkami. Do zapewnienia stabilnego wsparcia dla wzrostu roślin zastosowano siatkę metalową (w przeciwieństwie do nylonowej33), a do wspierania wzrostu mikrobów wykorzystano prostą metodę napowietrzania w warunkach sterylnych poprzez wstrząsanie. Dodatkowo, w systemie można zastosować siatki metalowe o różnych rozmiarach w zależności od potrzeb wzrostowych roślin, co pozwala na hodowlę różnorodnych gatunków roślin bez ograniczania szerokości ich korzeni.

W przedstawionym tutaj systemie hydroponicznej kokultywacji rośliny są hodowane w sterylnym układzie hydroponicznym, w którym korzenie roślin wydzielają związki organiczne wspierające wzrost zaszczepionych bakterii. W tym systemie kokultywacji nie stosuje się żadnych sztucznych substancji chemicznych, takich jak hormony roślinne, elicytory obronne czy związki indukujące wirulencję, co odzwierciedla naturalną homeostazę sygnalizacji komórkowej podczas interakcji roślin-mikroby. Dzięki temu hydroponicznemu systemowi kokultywacji możliwe było jednoczesne określenie ekspresji genów w tkance korzeniowej Arabidopsis thaliana Col-0 po infekcji Agrobacterium, a także aktywacji genów Agrobacterium podczas kokultywacji z Arabidopsis. Wykazano ponadto, że system ten nadaje się do badania przywierania Agrobacterium do korzeni roślin oraz profilu sekretomu korzeni roślin po kokultywacji (infekcji) z Agrobacterium (Rycina 1).

Schemat procesu kokultywacji roślin i bakterii; analizy transkryptomiczne, genomiczne i metabolomiczne.
Rysunek 1: Przegląd hydroponicznego systemu kokultywacji wraz z analizami próbek. Rośliny są hodowane na siatce (pędy nad siatką), a korzenie są zanurzone w pożywce hydroponicznej, która następnie jest inokulowana bakteriami w celu kokultywacji. Następnie tkanki roślinne i bakterie są rozdzielane w celu jednoczesnej ekstrakcji i analizy. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie referencji35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Planowanie eksperymentu

  1. Określ konkretne cele eksperymentu.
  2. Przeczytaj cały poniższy protokół. Ustal, które sekcje są istotne dla konkretnych celów i czy konieczne są jakiekolwiek modyfikacje. Przykłady znajdują się poniżej.
    1. Rozważ, czy w eksperymentach zostaną wykorzystane rośliny A. thaliana i bakterie A. tumefaciens, jak opisano poniżej, czy inna kombinacja roślina-mikrob.
      UWAGA: Choć można zastosować różne gatunki roślin, grubość korzeni roślinnych może wymagać zastosowania siatki o innym rozmiarze (krok 3.3), a parametry wzrostu (kroki 3.10-3.11 oraz 4.4), rozmiar zbiornika hydroponicznego i objętość pożywki (krok 4.2) mogą również wymagać dostosowania (Rysunek 2). Mikroby można łatwo inokulować jako kultury czyste, gatunki mieszane (konsorcja) lub z próbek środowiskowych (mikrobiomy), jednak wszelkie zmiany mogą wpłynąć na protokół, w szczególności na krok 4.5.
    2. Rozważ rodzaje eksperymentów, które zostaną wykorzystane do analizy próbek.
      UWAGA: Mikroskopia fluorescencyjna (krok 5) wymaga organizmów znakowanych fluorescencyjną konstrukcją reporterową.
  3. Zaprojektuj odpowiednie kontrole. Uwzględnij zbiorniki hydroponiczne bez siewek, które są inokulowane bakteriami kontrolnymi, oraz zbiorniki z siewkami kontrolnymi, które nie są inokulowane bakteriami.
  4. Zaplanuj eksperymenty z odpowiednią liczbą nasion i zbiorników hydroponicznych. Uwzględnij kontrole, powtórzenia biologiczne (minimum 3) oraz ilość tkanek niezbędną do wszystkich analiz.
  5. Określ odpowiedni czas kokultywacji dla celów eksperymentalnych (krok 4.8).
  6. W razie potrzeby zmodyfikuj poniższe kroki.

Proces kiełkowania nasion na siatce, porównanie nasion na różnych etapach, układ doświadczalny.
Rycina 2. Przykłady innych roślin, które mogą być uprawiane w systemie hydroponicznym, wspartym platformą z metalowej siatki. Kompatybilność zestawu siatek metalowych dla różnych nasion roślin i ich uprawy. (A) Zgrzewana siatka ze stali nierdzewnej typu 304, oczka 3×3, drut o średnicy .047" dla Vicia faba. (B) Zgrzewana siatka ze stali nierdzewnej typu 304, oczka 4×4, drut o średnicy .035" dla Zea mays. (C) Zgrzewana siatka ze stali nierdzewnej typu 304, oczka 4×4, drut o średnicy .032" dla Glycine max (soja). (D) Zgrzewana siatka ze stali nierdzewnej typu 304, oczka 6×6, drut o średnicy .047" dla Raphanus sativus (rzodkiew zimowa). (E) Zgrzewana siatka ze stali nierdzewnej typu 304, oczka 6×6, drut o średnicy .047" dla Triticum spp. (F) Zgrzewana siatka ze stali nierdzewnej typu 304, oczka 6×6, drut o średnicy .035" dla Cucumis sativus. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Sterylizacja powierzchni nasion roślin

  1. W probówce do mikrowirówki wymieszaj w wirówce wortexowej (z dużą prędkością) około 200 nasion A. thaliana w 500 µL wody dejonizowanej. W przypadku gatunków roślin o większych nasionach należy użyć większej probówki, aby ułatwić sterylizację powierzchniową.
  2. Wiruj próbkę z prędkością około 9,000 x g przez 30 s w mikrowirówce stołowej. Usuń wodę (nadsącz) za pomocą pipety.
  3. Dodaj do nasion 300 µL 2% podchlorynu sodu i wymieszaj w wirówce wortexowej. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 min. W przypadku gatunków roślin o większych nasionach należy zastosować większe objętości, aby całkowicie przykryć nasiona.
  4. Wiruj z prędkością około 9,000 x g przez 30 s w mikrowirówce stołowej. Usuń roztwór podchlorynu sodu za pomocą pipety.
  5. Dodaj do nasion 500 µL sterylnej wody dejonizowanej i wymieszaj w wirówce wortexowej. Wiruj z prędkością około 9,000 x g przez 30 s i usuń wodę za pomocą sterylnej pipety.
  6. Powtórz krok 2.5 jeszcze 4 razy.
  7. Dodaj do nasion 500 µL 70% etanolu i wymieszaj w wirówce wortexowej. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 min.
  8. Wiruj z prędkością około 9,000 x g przez 30 s w mikrowirówce stołowej. Usuń 70% etanol za pomocą pipety.
  9. Powtórz krok 2.5 jeszcze 5 razy.
  10. Resuspenduj wysterylizowane nasiona w 500 µL sterylnej wody ultrapure.

3. Kiełkowanie nasion i hodowla roślin na podłożu półstałym

  1. Przygotować półstałe podłoże Murashige i Skoog (MS): 2,165 g/L soli podstawowych MS; 10 g/L sacharozy; 0,25 g/L MES; oraz 59 mL/L mieszanki witamin B5, pH 5,75, z dodatkiem 4 g/L fytoagaru.
  2. Podłoże MS wysterylizować w autoklawie. Odlać po 25 mL do każdej sterylnej głębokiej szalki Petriego (100 x 25 mm2).
  3. Dla każdej szalki Petriego wyciąć kwadrat o wymiarach 90 x 90 mm z siatki ze stali nierdzewnej.
    UWAGA: Zalecana siatka dla A. thaliana ma gatunek 304 (stop standardowy), gęstość oczek (liczba otworów na liniowy cal) 40 x 40 oraz średnicę drutu 0,01" (0,0254 cm). Większy kwadrat siatki jest wymagany dla większych zbiorników hydroponicznych lub wyższych platform.
  4. Zagiąć rogi każdego kwadratu siatki na tyle, aby siatka mieściła się w szalce Petriego. Rogi zagiąć pod kątem 90° względem głównej części siatki, aby siatka była podparta na rogach, pozostawiając wystarczającą przestrzeń poniżej na rozwój korzeni (Rysunek 3a).
  5. Wycięte kwadraty siatki umieścić w zlewce, przykryć folią aluminiową i wysterylizować w autoklawie, stosując 30-minutowy cykl suchy.
  6. Po zastygnięciu podłoża w szalkach Petriego i wysterylizowaniu siatki, położyć każdy sterylny kwadrat siatki na wierzchu półstałego podłoża zagiętymi rogami do dołu.
  7. Docisnąć siatkę tak, aby rogi wniknęły w podłoże, a główna część siatki dotykała górnej powierzchni podłoża (Rysunek 3b).
  8. Za pomocą pipety transferowej 200 µL pobrać pojedyncze, wysterylizowane powierzchniowo nasiona A. thaliana (nasiona pozostaną na końcówce pipety dzięki sile próżni) i delikatnie przenieść każde nasiono na wierzch siatki. Rozmieścić nasiona w odstępach odpowiednich dla potrzeb eksperymentalnych (np. 4–6 nasion/szalka).
  9. Zamknąć szalki Petriego pokrywkami, oklejając krawędzie porowatą taśmą chirurgiczną.
  10. Przeprowadzić stratyfikację nasion, umieszczając całe szalki Petriego w temperaturze 4 °C przez 2 dni w ciemności (np. owinąć folią aluminiową, aby zasymulować ciemność).
  11. Hodować nasiona w szalkach Petriego w temperaturze 22-24 °C przy 16-godzinnym fotoperiodzie przez 10-14 dni (Rysunek 3c).

Schemat procesu uprawy hydroponicznej; stadia wzrostu; siatka metalowa; kokultywacja mikrobiologiczna.
Rycina 3: System hydroponicznej kokultywacji roślin i drobnoustrojów. Lewy panel przedstawia schemat blokowy opisujący sześć kluczowych kroków montażu i obsługi systemu hydroponicznej kokultywacji. Prawy panel prezentuje rzeczywiste materiały eksperymentalne, sprzęt oraz procedury operacyjne dla systemu hydroponicznej kokultywacji podczas badania interakcji Arabidopsis-Agrobacterium. Etap inokulacji oraz końcowy etap pobierania próbek roślin lub bakterii nie są obecnie pokazane. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Hydroponiczny system kokultywacji

  1. Przygotować płynną pożywkę Murashige i Skoog (MS): 2,165 g/L soli bazowych MS, 10 g/L sacharozy, 0,25 g/L MES oraz 59 mL/L mieszaniny witamin B5, pH 5,75.
  2. Pożywkę wysterylizować w autoklawie. Odlać 18 mL pożywki do każdego sterylnego cylindrycznego naczynia szklanego lub z przezroczystego tworzywa sztucznego (naczyń krystalizacyjnych, 100 x 80 mm2) z sterylnymi pokrywkami.
    UWAGA: Naczynia i pokrywki należy wysterylizować wcześniej, owijając je folią aluminiową i poddając autoklawowaniu.
  3. W sterylnym komorze z laminarnym przepływem powietrza, za pomocą sterylnej pęsety, ostrożnie przenieść każdy kwadrat siatki z siewkami w wieku 10-14 dni z pożywki półstałej do hydroponicznego naczynia cylindrycznego (Rycina 3d). Uszczelnić pokrywki naczyń za pomocą porowatej taśmy chirurgicznej.
  4. Kultywować siewki na siatce w naczyniu przez 72 h w temperaturze 22-24 °C, przy 16-godzinnym fotoperiodzie i wstrząsaniu z prędkością 50 rpm w celu napowietrzania (Rycina 3e).
    UWAGA: Pozwala to roślinom zaadaptować się do środowiska hydroponicznego przed inokulacją (kultywacją wspólną) z mikroorganizmami. Okres oczekiwania ten pozwoli również na ujawnienie przypadkowego zanieczyszczenia mikrobiologicznego przed inokulacją.
    1. Kolejny krok rozpocząć w dniu poprzedzającym koniec okresu inkubacji.
  5. Kulturować A. tumefaciens na pożywce AB (0,5% w/v ekstraktu drożdżowego, 0,5% w/v tryptonu, 0,5% w/v sacharozy, 50 mM MgSO4, pH 7,0) w temperaturze 28 °C z wstrząsaniem przez noc, aż kultura osiągnie końcową gęstość optyczną 1,0 przy 600 nm (OD600), zmierzoną spektrofotometrem, używając nieinokulowanej pożywki AB jako wzorca (blanku).
    UWAGA: Wartość OD600 równa 1,0 odpowiada w przybliżeniu 109 komórkom/mL.
  6. Przemyć A. tumefaciens trzykrotnie w równych objętościach 0,85% NaCl. Resuspendować w równej objętości sterylnej wody dwukrotnie destylowanej.
  7. Przed inokulacją dokładnie sprawdzić naczynia z siewkami, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń; pożywka w naczyniach niezanieczyszczonych powinna być klarowna i przezroczysta.
    1. Odrzucić każde naczynie z mętnym płynem (zanieczyszczenie) i ponumerować pozostałe naczynia. Pobrać niewielką ilość (20 µL) pożywki hydroponicznej z każdego ponumerowanego naczynia i nanieść ją na szalkę Petriego z bulionem Luria (LB). Inkubować szalkę w temperaturze 28 °C.
  8. Bezzwłocznie dodać 50 µL zawiesiny A. tumefaciens (około 5 x 107 komórek, oszacowanych na podstawie OD600) do każdego ponumerowanego naczynia hydroponicznego. Kultywować wspólnie siewki A. thaliana i A. tumefaciens w temperaturze 22-24 °C przy 16-godzinnym fotoperiodzie i wstrząsaniu z prędkością 50 rpm (Rycina 3f).
    1. Sprawdzić naniesioną płytkę LB z kroku 4.7.1 po 12 i 28 h inkubacji, aby zweryfikować sterylność naczyń. W przypadku stwierdzenia jakiegokolwiek zanieczyszczenia, nie używać odpowiadającego mu ponumerowanego naczynia (zinokulowanego bakteriami) do dalszych analiz.
  9. W razie potrzeby monitorować wzrost A. tumefaciens w regularnych odstępach czasu, pobierając próbkę pożywki z naczynia i mierząc OD600 za pomocą spektrofotometru, używając pożywki z nieinokulowanej kontroli jako wzorca (Rycina 4).
    UWAGA: Objawy choroby roślin powinny być widoczne po 7 dniach (Rycina 5).
  10. Oddzielić korzenie A. thaliana od zawiesiny bakteryjnej poprzez uniesienie płytki siatkowej; czas wykonania tego kroku zależy od dalszych procesów. Szczegóły znajdują się w krokach 5-8.
  11. Jeśli korzenie są wykorzystywane do dalszych analiz, szybko opłukać je w wodzie dwukrotnie destylowanej. W przypadku wykorzystania liści lub innej tkanki, odciąć odpowiednią tkankę. W przypadku analiz RNA przejść niezwłocznie do kroku 7.1.

Kinetyka wzrostu komórek; wykres gęstości optycznej (OD600nm); badanie kokultywacji w porównaniu z brakiem kokultywacji.
Rycina 4: Wzrost Agrobacterium w hydroponicznym systemie kokultywacji. Wzrost Agrobacterium w obecności lub w nieobecności rośliny gospodarza (Arabidopsis) monitorowano co 4 h. Komórki Agrobacterium hodowano w pożywce AB przez noc, przemyto 3x 0,85% NaCl i zaszczepiono do systemu hydroponicznego, z kokultywacją Arabidopsis lub bez niej, przy początkowej wartości OD600 wynoszącej około 0,1. Wartości OD600 stanowią średnie z trzech powtórzeń biologicznych wraz z odchyleniami standardowymi (OD600 1,0 = 1 x 109 komórek/mL).

Schemat porównawczy eksperymentu z kokultywacją roślin w szalkach Petriego demonstrujący różnice w wzroście.
Rycina 5: Reprezentatywne fenotypy roślin i obserwowalne objawy choroby podczas kokultywacji. W ciągu 4 d po inokulacji nie są widoczne żadne objawy choroby (A) w porównaniu z roślinami nieinokulowanymi (B). Po 7 d kokultywacji (infekcji) w roślinach zainfekowanych obserwuje się objawy choroby (C), podczas gdy rośliny nieinokulowane pozostają zdrowe (D).

5. Mikroskopia fluorescencyjna

  1. Zastosowanie A. tumefaciens zawierający konstrukt reporterowy dla białka autofluorescencyjnego do układu kokultywacji w krok 4.5.
    UWAGA: zmodyfikowany plazmid pJP2 wykazujący ekspresję pCherry, pochodnej dsRed36został tutaj zastosowany.
  2. Po odpowiedniej kokultywacji (np. 48 h) w kroku 4.8 oddzielić poszczególne korzenie boczne (odgałęzienia korzenia głównego) za pomocą sterylnych nożyczek.
  3. Przepłucz korzenie wodą dwukrotnie destylowaną, aby usunąć luźno związany materiał. Zanurz każdy korzeń w 30 µL wody na szkiełko przedmiotowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowe.
  4. Krawędzie szkiełka nakrywnego należy uszczelnić lakierem do paznokci, aby zapobiec odwodnieniu korzeni.
  5. Wizualizacja przyłączenia *A. tumefaciens* do A. thaliana korzenie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    UWAGA: W tym przypadku do wizualizacji czerwonej fluorescencji pCherry przy 590–630 nm wykorzystano mikroskop konfokalny z wzbudzeniem za pomocą lasera helowo-neonowego (He-Ne) 543/594 nm, przy użyciu odwróconego obiektywu imersyjnego wodnego 63X o aperturze numerycznej 1,4 (Rycina 6).

Mikroskopia fluorescencyjna białka mCherry z nałożonym obrazem w świetle przechodzącym; analiza struktury komórkowej.
Rycina 6: Przytwierdzanie korzeni Agrobacterium, określone za pomocą mikroskopii konfokalnej. Agrobacterium oznakowane czerwoną fluorescencją pCherry wizualizowano w zakresie 590-630 nm, przy wzbudzeniu laserem helowo-neonowym (He-Ne) 543/594 nm. Wizualizacji dokonano przy użyciu odwróconego obiektywu wodnego 63X z aperturą numeryczną 1,4. Paski skali = 11 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

6. Analizy transkryptomu bakteryjnego

  1. Po odpowiednim współhodowaniu (np. 8 h) opisanym w kroku 4.8, oddziel korzenie od pożywki hydroponicznej zgodnie z krokiem 4.9. Przenieś 1,5 mL pożywki hydroponicznej do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i wiruj przy 12 000 x g przez 2 min, aby uzyskać osad z komórek.
  2. Usuń nadsącz. Przenieś kolejne 1,5 mL pożywki hydroponicznej do tej samej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i wiruj przy 12 000 g przez 2 min, aby uzyskać osad z komórek.
  3. Usuń nadsącz.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, zamrażając próbki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  4. Wyizoluj RNA z komórek A. tumefaciens stosując standardowe metody37 lub odpowiedni komercyjny zestaw do izolacji i oczyszczania RNA z traktowaniem DNazą, aby uniknąć kontaminacji DNA.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, zamrażając alikwoty RNA w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  5. Wyizolowane RNA wykorzystaj do różnych analiz przy użyciu standardowych metod, w tym następujących:
    1. Użyj komercyjnej macierzy mikroarray zgodnie z protokołem producenta, aby wykryć zestawy genów wykazujące różnicową ekspresję w kulturze współhodowanej w porównaniu z kulturą kontrolną.
    2. Zastosuj ilościową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), aby wykryć ekspresję specyficznych genów lub zwalidować dane z mikroarray38.

7. Analizy transkryptomiczne roślin

  1. Po odpowiednim współhodowaniu (np. 8 h) opisanym w kroku 4.8, oddziel korzenie od pożywki hydroponicznej, zgodnie z krokiem 4.9, lub oddziel inne tkanki w zależności od potrzeb. Natychmiast umieść około 150 mg korzeni lub innej tkanki roślinnej w ciekłym azocie.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, zamrażając próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  2. Rozetrzyj zamrożone próbki na proszek w ciekłym azocie, używając moździerza i tłuczka.
  3. Wyizoluj RNA z proszku, stosując standardowe metody39 lub odpowiedni komercyjny zestaw do izolacji i oczyszczania RNA z zastosowaniem DNazy, aby uniknąć kontaminacji DNA.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, zamrażając alikwoty RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  4. Wykorzystaj wyizolowane RNA do różnych analiz z zastosowaniem standardowych metod, w tym następujących:
    1. Użyj komercyjnej mikromacierzy zgodnie z protokołem producenta, aby wykryć zestawy genów wykazujące różnicową ekspresję w roślinach współhodowanych w porównaniu z roślinami kontrolnymi.
    2. Zastosuj qRT-PCR, aby wykryć różnicową ekspresję specyficznych genów lub w celu walidacji danych z mikromacierzy38.

8. Profilowanie sekretomu

  1. Po odpowiedniej współuprawie (np. 72 h) w kroku 4.8, oddziel korzenie od pożywki hydroponicznej zgodnie z krokiem 4.9. Sterylizuj 18 mL pożywki hydroponicznej, przepuszczając ją przez filtr o porach 0,2 µm do stożkowych probówek 50 mL.
  2. Zamroź próbki w temperaturze -80 °C przez noc (O/N).
  3. Poluzuj nakrętki w stożkowych probówkach 50 mL i umieść je w liofilizatorze na 36 h. Przejdź do przechowywania lub przetwarzania próbek (zgodnie z opisem poniżej) w celu analizy HPLC i detekcji związków.
    UWAGA: Na tym etapie protokół można przerwać.
  4. Resuspenduj każdą próbkę w 5 mL wody dwukrotnie destylowanej w szczelnej probówce.
  5. Dodaj 5 mL octanu etylu i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.
  6. Pozostaw do rozdzielenia faz w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  7. Przenieś górną warstwę (fazę organiczną) do nowego naczynia za pomocą pipety. W razie potrzeby połącz kilka frakcji organicznych.
  8. Osusz pod delikatnym strumieniem azotu (~45 min).
  9. Resuspenduj próbkę w odpowiednim roztworze do HPLC (np. 100% metanol).
  10. Przeprowadź analizę HPLC zgodnie ze standardowymi metodami40.
  11. Wykryj związki odpowiednią metodą.
    UWAGA: W tym przypadku stosowana jest spektrometria mas z jonizacją elektrospray i pomiarem czasu przelotu (ESI-TOF-MS)40.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wzrost w hydroponicznym systemie współhodowli

Krzywa wzrostu A. tumefaciens C58 wykazała znaczącą fazę adaptacyjną w ciągu pierwszych 16 h kokultywacji, po której nastąpił bardzo stabilny wzrost podczas kokultywacji z A. thaliana Col-0, aż do osiągnięcia maksymalnej wartości OD600 wynoszącej około 0,9, począwszy od 48 h po inokulacji. W przeciwieństwie do tego, w kulturze kontrolnej bez A. thaliana<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę stopniowy charakter wydzielania korzeni, stężenie substancji chemicznych wywołujących zjadliwość wytwarzanych w roślinach i ich wpływ na dynamiczne interakcje roślina-mikroorganizm występuje w gradientach przestrzennych i czasowych. W tym hydroponicznym systemie wspólnej uprawy nie uzupełnia się syntetycznego fitohormonu ani substancji chemicznej, która indukuje zjadliwość drobnoustrojów lub mechanizmy obronne roślin. W przeciwieństwie do tego, przy użyciu konwencjonalnych podejść, dodanie synte...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Brianowi Weselowskiemu i Alexandrowi W. Eastmanowi za ich pomoc i przydatną dyskusję. Chcielibyśmy również podziękować doktorom Eugene'owi W. Nesterowi, Lingrui Zhangowi, Haitao Shenowi, Yuhai Cui i Gregowi Thornowi za ich pomoc, przydatne dyskusje i krytyczną lekturę manuskryptu. Badania te zostały sfinansowane przez Agriculture and Agri-Food Canada, Growing Forward-AgriFlex (RBPI numer 2555) oraz projekt Growing Forward II numer 1670, przeprowadzone przez autorów w ramach ich obowiązków. Badanie to zostało również częściowo sfinansowane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 przyznany Z-C Yuanowi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
nasiona roślin (Arabidopsis thaliana Col-0)Arabidopsis Biological Resource CentreCS7000https://abrc.osu.edu/order-stocks
bakterie (Agrobacterium tumefaciens C58)Uniwersytecie WaszyngtońskimN/A
opcjonalniew zależności od dalszych analiz
wir(różne)
Probówki do mikrowirówek(różne)
Mikrowirówka(różne)
5% podchloryn sodu(różne)
Woda podwójnie destylowana(różne)
Autoklaw(różne)
Mikropipeta (różne)
70% etanolu(różne)
Sole bazowe Murashige i Skoog (MS)Sigma-AldrichM5524
sacharoza(różne)
MES(różne)
Mieszanka witamin B5Fitoagar Sigma-AldrichG1019
(różne)
Głębokie szalki Petriego(różne)
siatka ze stali nierdzewnejFerrier Wire Goods Company LtdKlasa N/A: 304; liczba oczek: 40 i razy; 40; drut DIA: taśma
mikroporowa 0,01, 1 "3M1530-1
dobowa komora wzrostu(różne)
cylindryczne zbiorniki szklane, 100 & razy; 80 mm Można użyć Pyrex3250w innych rozmiarach, w takim przypadku zawartość płynu może wymagać regulacji
przepływu kaptur(różne)
forcepty(różne)
ekstrakt drożdżowy(różne)
trypton(różne)
MgSO4< / sub>(różne)
inkubator z wytrząsaniem(różne)
spektrofotometrróżne)
NaCl(różne)
wytrząsarka(różne)
nożyczki(różne), w zależności od dalszych analiz
mikroskop fluorescencyjnyróżne)opcjonalne, zależy od dalszego przepływu Analizy
Szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe(różne) Opcjonalnie,w zależności od dalszych analiz
Lakier do paznokci(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Zestaw do ekstrakcji bakteryjnego RNA(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Zestaw do ekstrakcji RNA w instalacji (RNeasy Plant Mini Kit)Qiagen74903 lub 74904opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
materiał i sprzęt do qRT-PCR(różne)opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
materiał i sprzęt do analizy mikromacierzy(różne)opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
ciekły azot(różne)opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
moździerz i tłuczek(różne)opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
0,2 i mikro; Filtr porowy m(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Probówki stożkowe 50 ml(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Liofilizator(różne)Opcjonalnie, w zależności od dalszych analiz
Zamykane probówkitestowe (różne)Opcjonalne, w zależności od dalszych analiz
Octan etylu(różne)opcjonalny, zależy od dalszych analiz
gazowy azot(różne)opcjonalne, zależy od dalszych analiz
materiał i sprzęt do HPLC(różne)opcjonalne, zależy od
dalszych analiz materiał i sprzęt do ESI-TOF-MS(różne)opcjonalne, zależy od dalszych analiz
Bakterie znakowane na , (opcjonalne(

Bibliografia

  1. Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
  2. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  3. Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
  4. Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  5. Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
  6. Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
  7. Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
  8. Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
  9. Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
  11. Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
  12. Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
  13. Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
  14. Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283(1999).
  15. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  16. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  17. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322(2014).
  18. Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
  19. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
  20. Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
  21. Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
  22. Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
  23. Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
  24. Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
  25. Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
  26. León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
  27. Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
  28. Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
  29. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  30. Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
  31. Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
  32. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252(2014).
  33. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69(2014).
  34. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4(2013).
  35. Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
  36. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  37. Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
  38. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  39. Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
  40. Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
  41. Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
  42. Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699(2015).
  43. Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
  44. Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcje roślin z mikroorganizmamiAgrobacterium tumefaciensArabidopsis thalianaanaliza przytwierdzenia korzeniprofilowanie ekspresji genówmikroskopia fluorescencyjnaprotokół sterylizacjihydroponiczne podłoże wzrostoweanaliza omiczna
Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.