Method Article

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

DOI:

10.3791/55957

⸱

August 11th, 2017

 ,  , 
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria unaczynionych konstruktów tkankowych i organoidów była historycznie wyzwaniem. W tym artykule opisujemy nowatorską metodę opartą na biodruku mikroprzepływowym w celu wygenerowania rusztowania z wielowarstwowymi przeplatającymi się mikrowłóknami hydrożelowymi. Aby uzyskać płynny biodruk, zaprojektowano i zamontowano mikroprzepływową głowicę drukującą z rdzeniem i osłoną, zawierającą kompozytową formułę biotuszu wytłaczaną ze strumienia rdzenia i roztwór sieciujący przenoszony przez przepływ osłony, który został zamontowany na biodrukarce. Mieszając żelatynowy metakryloyl (GelMA) z alginianem, polisacharydem, który ulega natychmiastowemu sieciowaniu jonowemu w obecności wybranych jonów dwuwartościowych, a następnie wtórnemu fotosieciowaniu składnika GelMA w celu uzyskania trwałej stabilizacji, przy użyciu tej strategii biodruku można uzyskać rusztowanie mikrofibrowe. Co ważne, komórki śródbłonka zamknięte w biodrukowanych mikrowłóknach mogą tworzyć struktury przypominające światło przypominające naczynia krwionośne w trakcie hodowli przez 16 dni. Śródbłonkowe rusztowanie mikrofibrowe może być dalej wykorzystywane jako łożysko naczyniowe do budowy unaczynionej tkanki poprzez późniejsze wysiewanie wtórnego typu komórek do przestrzeni śródmiąższowej mikrowłókien. Biodruk mikroprzepływowy zapewnia uogólnioną strategię wygodnej inżynierii unaczynionych tkanek z wysoką dokładnością.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkankowa ma na celu generowanie funkcjonalnych substytutów tkanek, które mogą być używane do zastępowania, przywracania lub wzmacniania osób uszkodzonych lub chorych w ludzkim ciele1,2,3,4, często poprzez kombinację pożądanych typów komórek, bioaktywnych cząsteczek5,6, oraz biomateriałów7,8,9,10. Ostatnio technologie inżynierii tkankowej są równi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiomiocyty noworodków szczurów użyte w tym protokole zostały wyizolowane od 2-dniowych szczurów Sprague-Dawley zgodnie z dobrze ustaloną procedurą56 zatwierdzoną przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Brigham and Women's Hospital.

1. Oprzyrządowanie biodrukarki

  1. Włóż mniejszą igłę (np. 27G, 1 cal) jako rdzeń do środka większej igły (np. 18G, 1/2 cala) jako osłonę, aby zbudować dwuwarstwową, koncentryczną mikroprzepływową głowicę drukującą; upewnij się, że igła rdzeniowa wystaje nieco (~1 mm) dłużej niż zewnętrzna powłoka (Rysunek 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia biodruku mikroprzepływowego pozwala na bezpośrednie biodrukowanie rusztowań mikrowłóknistych za pomocą biotuszów o niskiej lepkości54,55. Jak pokazano w Rysunek 2A, rusztowanie o rozmiarach 6 × 6 × 6 mm3 zawierające >30 warstw mikrowłókien może zostać wydrukowane biologicznie w ciągu 10 minut. Natychmiastowe sieciowanie jonowe składnika alginianowego z CaCl

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstrukcja współosiowej głowicy drukującej stanowi kluczowy krok w kierunku udanego biodruku mikroprzepływowego, aby umożliwić jednoczesne dostarczanie zarówno biotuszu z rdzenia, jak i środka sieciującego z osłony. Chociaż w tym protokole przykładowa głowica drukująca została stworzona przy użyciu igły 27G jako rdzenia i igły 18G jako powłoki, można ją łatwo rozszerzyć do różnych kombinacji przy użyciu różnych rozmiarów igieł. Jednak zmiana rozmiarów igieł, która powoduje zmianę ilości przepływu dostarczanego w każdej .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy przyznają National Cancer Institute nagrody National Institutes of Health Pathway to Independence Award (K99CA201603).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sól sodowa kwasu alginowego z alg brunatnychSigma-AldrichA0682BioReagent, testowana hodowla komórek roślinnych, niska lepkość, proszek
Żelatyna typu A ze skóry świniSigma-AldrichG2500Moc żelu 300
Irgacure 2959 (2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon)Sigma-Aldrich41089698%
bufor HEPESSigma-AldrichH08871 M, pH 7,0 - 7,6, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Surowica bydlęca płodu Thermo Fisher Scientific10438026Kwalifikowane, inaktywowane termicznie, zatwierdzone przez USDA regiony
Dwuwodny chlorek wapniaSigma-AldrichC5080BioXtra, ≥ 99,0%
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fisher Scientific10010023pH 7,4 Ludzkie
komórki śródbłonka żyły pępowinowejAngio-ProteomiecAP-0001Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)Ludzkie komórki śródbłonka
wyrażające GFPAngio-ProteomiecAP-0001GFPLudzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej wyrażające GFP (GFPHUVEC)
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonkaLonzaCC-3162EGM-2 BulletKit
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średni Thermo Fisher Scientific12430054HEPES
Sylgard 184EllsworthAdhesives 184 SIL ELAST KIT 0,5 kgPrzezroczysty 0,5 kg System
lamp utwardzających UVExcelitas TechnologiesOmniCure S2000Punktowy system utwardzania światłem UV z inteligentnym czujnikiem UV
żyły pępowinowej Zestaw elastomerów silikonowych o wysokiej zawartości glukozy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in Tissue Engineering. Sci. Am. 300 (5), 64-71 (2009).
  3. Langer, R. Tissue Engineering: Status and Challenges. E-Biomed: J.Regen. Med.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic BioprintingVascularized TissueOrganoid EngineeringCore Sheath PrintheadGelMA Alginate BioinkIonic PhotocrosslinkingEndothelial Cell EncapsulationLumen Like StructuresSecondary Cell SeedingConfocal Microscopy

Related Articles