Artykuł metodologiczny

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

DOI:

10.3791/55969

⸱

4 sierpnia 2017

 , 
1College of Life Sciences, Key Laboratory of Plant Gene Resources and Biotechnology for Carbon Reduction and Environmental Improvement, Capital Normal University, 2College of Life Science, Shanxi Normal University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę wysoce przewidywalną naturę ich rozwoju, zarodki Arabidopsis były używane jako model do badań morfogenezy roślin. Jednak zarodki roślin we wczesnym stadium rozwoju są małe i zawierają niewiele komórek, co utrudnia ich obserwację i analizę. Opisano tutaj metodę charakteryzowania tworzenia się wzorców w zarodkach roślinnych pod mikroskopem przy użyciu organizmu modelowego Arabidopsis. Po usunięciu świeżych zalążków za pomocą roztworu Hoyera można było zaobserwować liczbę komórek i morfologię zarodków, a ich stadium rozwojowe można było określić za pomocą mikroskopii kontrastowej interferencyjnej różnicowej przy użyciu soczewki immersyjnej ze 100-krotnym olejkiem. Ponadto monitorowano ekspresję specyficznych białek markerowych oznaczonych białkiem zielonej fluorescencji (GFP) w celu adnotacji specyfikacji tożsamości komórki podczas modelowania zarodków za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W związku z tym metoda ta może być stosowana do obserwacji tworzenia się wzorców w zarodkach roślin typu dzikiego na poziomie komórkowym i molekularnym oraz do scharakteryzowania roli określonych genów w tworzeniu się zarodków poprzez porównanie tworzenia wzorców w zarodkach z roślin typu dzikiego i mutantów letalnych dla zarodków. Dlatego metoda może być stosowana do charakterystyki embriogenezy u Arabidopsis.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriogeneza jest najwcześniejszym wydarzeniem w rozwoju roślin wyższych. Dojrzały zarodek powstaje z zygoty poprzez podział i różnicowanie komórek pod ścisłą kontrolą genetyczną1,2. Zarodki rzodkiewnika są użytecznym modelem do badania kontroli morfogenezy, ponieważ sekwencja podziałów komórkowych podczas embriogenezy jest zgodna z oczekiwanym wzorcem3,4. Jednak zarodek Arabidopsis zawierający od jednej do kilku komórek jest zbyt mały, aby można go było zaobserwować i przeanalizować. Ponadto mutacja niektórych genów może powodować śm....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół składa się z trzech części: 1) obserwowanie formowania się wzorca w zarodkach Arabidopsis typu dzikiego za pomocą mikroskopii DIC; 2) scharakteryzowanie powstawania wzorca zarodka poprzez obserwację ekspresji białka markerowego za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej; oraz 3) określenie roli konkretnego genu w embriogenezie (na przykładzie mutanta NAA10).

1. Oczyszczanie zalążka

  1. Przygotowanie materiału roślinnego
    UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przykładem, jak uprawiać zdrowe rośliny; Działają również inne sposoby uprawy zdrowych roślin. <....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym artykule może być wykorzystana do obserwacji embriogenezy bezpośrednio pod mikroskopem, do opisywania specyfikacji tożsamości komórki podczas embriogenezy za pomocą specyficznych markerów oraz do charakteryzowania roli konkretnego genu podczas embriogenezy.

Reprezentatywne wyniki analizy wzorców zarodków (od stadium wydłużonej zygoty do stadium dojrzałej laski) u Arabidopsis typu dzikiego są pokazan.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klirens zalążka jest przydatną metodą wykrywania podziału komórek i oceny morfologii podczas embriogenezy u Arabidopsis; przy użyciu tej techniki zarodki można obserwować bezpośrednio pod mikroskopią DIC 5,12. Krytycznym etapem usuwania zalążka jest krok 1.3.4. Czas potrzebny do usunięcia zalążka w kroku 1.3.4 jest zmienny. Zarodki w stadium 2/4-komórkowym można wyraźnie zaobserwować po 2 godzinach w roztworze Hoyera, natomiast po 12 godzinach wyglądają .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Jessice Habashi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Dziękujemy dr Xianyong Shengowi z Centrum Obrazowania, Kolegium Nauk Przyrodniczych, Capital Normal University (Pekin, Chiny), za przeprowadzenie lokalizacji testu DR5-GFP. Prace te były wspierane przez granty z Fundacji Naukowej Samorządu Miejskiego Pekinu (CIT&TCD20150102) oraz z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31600248).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrat chloraluSigma15307
Murashige and Skoog Basal Medium SigmaM5519
PhytagelSigmaP8169
HygromycynaRoche10843555001
Komora wzrostowaPercivalCU36L5
Mikroskop fluorescencyjnyZeiss OberkochenZeiss Image M2aparat: AxioCam 506 kolorowa
konfokalna laserowa mikroskopia skaningowaZeiss OberkochenZeiss LSM 5filtry: BP 495 - 555 nm
stereoskopAparat Zeiss OberkochenAxio Zoom V16: AxioCam MRc5
bogata w składniki odżywczegleba KLASMANN, Niemcy
Rurka 50 mlCorning Inc.
Probówka 1,5 mlCorning Inc.
10% roztwórKrajowy odczynnik analityczny
sacharozaKrajowy odczynnik analityczny
KOHKrajowy odczynnik analityczny
glicerol
naczynieKrajowe dostawy
wermikulituArtykuły gospodarstwa
igła strzykawkiArtykuły domowe
podchlorynu sodu Domowe do hodowli odczynników analitycznych domowego szkiełko szkiełko Artykuły domowepęseta z cienką końcówką Artykuły gospodarstwa domowego super czysta ławka Sprzęt gospodarstwa domowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
  2. Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev P....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Embriogeneza Arabidopsisformowanie wzorca zarodkaoczyszczanie zal kamikroskopia kontrastowa r nicowakonfokalna skaningowa mikroskopia laserowaanaliza ekspresji GFPprzygotowanie roztworu Hoyeraprotok sterylizacji nasionprzygotowanie po ywki MSokre lanie stadium rozwoju zarodka

Powiązane artykuły