Artykuł metodologiczny

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

DOI:

10.3791/55969

⸱

4 sierpnia 2017

 , 
1College of Life Sciences, Key Laboratory of Plant Gene Resources and Biotechnology for Carbon Reduction and Environmental Improvement, Capital Normal University, 2College of Life Science, Shanxi Normal University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę wysoce przewidywalną naturę ich rozwoju, zarodki Arabidopsis były używane jako model do badań morfogenezy roślin. Jednak zarodki roślin we wczesnym stadium rozwoju są małe i zawierają niewiele komórek, co utrudnia ich obserwację i analizę. Opisano tutaj metodę charakteryzowania tworzenia się wzorców w zarodkach roślinnych pod mikroskopem przy użyciu organizmu modelowego Arabidopsis. Po usunięciu świeżych zalążków za pomocą roztworu Hoyera można było zaobserwować liczbę komórek i morfologię zarodków, a ich stadium rozwojowe można było określić za pomocą mikroskopii kontrastowej interferencyjnej różnicowej przy użyciu soczewki immersyjnej ze 100-krotnym olejkiem. Ponadto monitorowano ekspresję specyficznych białek markerowych oznaczonych białkiem zielonej fluorescencji (GFP) w celu adnotacji specyfikacji tożsamości komórki podczas modelowania zarodków za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W związku z tym metoda ta może być stosowana do obserwacji tworzenia się wzorców w zarodkach roślin typu dzikiego na poziomie komórkowym i molekularnym oraz do scharakteryzowania roli określonych genów w tworzeniu się zarodków poprzez porównanie tworzenia wzorców w zarodkach z roślin typu dzikiego i mutantów letalnych dla zarodków. Dlatego metoda może być stosowana do charakterystyki embriogenezy u Arabidopsis.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriogeneza jest najwcześniejszym wydarzeniem w rozwoju roślin wyższych. Dojrzały zarodek powstaje z zygoty poprzez podział i różnicowanie komórek pod ścisłą kontrolą genetyczną1,2. Zarodki rzodkiewnika są użytecznym modelem do badania kontroli morfogenezy, ponieważ sekwencja podziałów komórkowych podczas embriogenezy jest zgodna z oczekiwanym wzorcem3,4. Jednak zarodek Arabidopsis zawierający od jednej do kilku komórek jest zbyt mały, aby można go było zaobserwować i przeanalizować. Ponadto mutacja niektórych genów może powodować śmiertelność zarodka5, co wskazuje na kluczową rolę tych genów w embriogenezie. Charakterystyka tworzenia się wzorców u mutantów letalnych dla zarodków stanowi podstawę do zrozumienia mechanizmu molekularnego, za pomocą którego niezbędne geny regulują rozwój zarodka.

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana do charakterystyki tworzenia się wzoru zarodka u modelowej rośliny Arabidopsis poprzez bezpośrednią obserwację mikroskopową. Metoda polega na usunięciu zalążka, a następnie obserwacji mikroskopowej zarodka. Opisano również charakterystykę mutanta śmiertelnego dla zarodka.

Morfologia zarodków na różnych etapach rozwoju może być bezpośrednio określona za pomocą mikroskopii przy użyciu zalążków, które zostały oczyszczone roztworem Hoyera6,7. Takie zalążki wykazują wysoki współczynnik załamania światła; w związku z tym ta metoda oczyszczania zalążków jest szczególnie korzystna w przypadku próbek, które muszą być obserwowane za pomocą mikroskopii kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC).

Ponadto, geny, które ulegają ekspresji w określonej komórce lub ograniczonej liczbie komórek podczas embriogenezy, mogą być używane jako markery do identyfikacji komórek w embrionie. W związku z tym specyfikację tożsamości komórki podczas embriogenezy można oznaczyć poprzez monitorowanie ekspresji białek markerowych znakowanych GFP za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. I odwrotnie, obserwacja wzorca ekspresji nieznanej funkcjonalnej fuzji genu z GFP podczas embriogenezy może zapewnić związek między wzorcem zarodka a ekspresją tego genu i ułatwić identyfikację nowych genów, które są wymagane do embriogenezy u Arabidopsis.

Opisana tutaj metoda może być również użyta do scharakteryzowania fenotypu zarodkowo-letalnego mutanta oraz do określenia wpływu uszkodzonego genu na embriogenezę na poziomie komórkowym. Ponadto, w połączeniu z porównaniem wzorca ekspresji genów markerowych podczas embriogenezy między roślinami typu dzikiego i zmutowanym, metoda może dostarczyć wskazówek na temat mechanizmów molekularnych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w embriogenezę8,9. Rzeczywiście, metoda została zastosowana do roślin naa10 i stwierdzono, że nieprawidłowy podział przysadki mózgowej u mutanta może być spowodowany zmianą dystrybucji auksyny podczas embriogenezy5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół składa się z trzech części: 1) obserwowanie formowania się wzorca w zarodkach Arabidopsis typu dzikiego za pomocą mikroskopii DIC; 2) scharakteryzowanie powstawania wzorca zarodka poprzez obserwację ekspresji białka markerowego za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej; oraz 3) określenie roli konkretnego genu w embriogenezie (na przykładzie mutanta NAA10).

1. Oczyszczanie zalążka

  1. Przygotowanie materiału roślinnego
    UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przykładem, jak uprawiać zdrowe rośliny; Działają również inne sposoby uprawy zdrowych roślin.
    1. Dodaj 100 nasion do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 1 ml 1,5% podchlorynu sodu (zmieszaj 15 ml 10% chloru z 85 ml wody), aby sterylizować nasiona przez 5 minut. Odwróć probówkę kilka razy, aby upewnić się, że nasiona i roztwór są dobrze wymieszane, aby całkowicie wysterylizować nasiona powierzchniowe.
    2. Wyciśnij nasiona na dno probówki przez wirowanie przez 30 s przy 1,200 x g, usuń supernatant i umyj nasiona sterylną wodą cztery razy na stole w celu usunięcia pozostałości podchlorynu sodu.
    3. Dodać 4,4 g mieszaniny soli podstawowej Murashige i Skoog (MS) oraz 10 g sacharozy do 1 l ultraczystej wody. Wymieszaj mieszaninę, aby rozpuścić sole i sacharozę. Doprowadzić roztwór do pH 5,8 za pomocą 1 M KOH, dodać 3 g środka żelującego, takiego jak Phytagel, do roztworu MS-sacharozy i sterylizować roztwór w temperaturze 121 °C przez 15 minut, aby uzyskać pożywkę MS.
    4. Wlej 30 ml pożywki MS do 12-milimetrowego naczynia hodowlanego, aby uzyskać płytki z pożywką MS.
    5. Umieść wysterylizowane nasiona na talerzu MS. Przenieść szalkę do komory wzrostowej i przechowywać ją w warunkach długiego dnia (22 °C przez 16 godzin w świetle i 18 °C przez 8 godzin w ciemności) po stratyfikacji nasion (3 dni w temperaturze 4 °C w ciemności).
    6. Po 8 dniach wzrostu przenieś rośliny do gleby (wymieszaj glebę bogatą w składniki odżywcze i wermikulit w stosunku 1:1) na tacy, przykryj tacę białą, przezroczystą pokrywką na 5 dni, aby uniknąć utraty wody, i pozostaw szczelinę, aby uniknąć zeszklenia roślin.
    7. Zdejmij pokrywkę z tacki i uprawiaj rośliny w komorze typu walk-in w warunkach długiego dnia (patrz 1.1.5). Włącz światło o 6:00 i wyłącz o 22:00. Po około 20 dniach wzrostu w komorze walk-in rośliny zakwitną i wytworzą krzemionki.
    8. Zaznacz pąki kwiatowe nitką w miejscu łodyg nasiennych w kwiatostanie o godzinie 20:00 (nie używaj pierwszych do trzecich pąków kwiatowych; krzemionki powstałe z tych pąków kwiatowych zwykle rozwijają kilka poronionych nasion, co może zmienić proporcję normalnych do nieprawidłowych zalążków). Zdefiniuj początek zapylania zalążka jako moment, w którym zaznaczony pączek otwiera się do kwitnienia o 8:00 rano następnego ranka.
  2. Przygotowanie roztworu Hoyera
    1. Dodaj 24 g hydratu chloralu do probówki o pojemności 50 ml i owiń probówkę całkowicie folią aluminiową (roztwory hydratu chloralu nie są stabilne w świetle).
    2. Następnie dodaj 9 ml ultraczystej wody i 3 ml glicerolu do powyższego roztworu i wstrząśnij probówką, aby rozpuścić hydrat chloralu. Aby przygotować roztwór Hoyera, odstaw probówkę na noc w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki.
  3. Separacja i klirens zalążków
    1. Przymocuj kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka mikroskopowego. Umieść krzemionkę uprawianą przez żądaną liczbę dni po zapyleniu (DAP) na szkiełku z przegrodą rzekomą prostopadłą do powierzchni; ułatwi to dzielenie słupków (Rysunki 1A i 1B).
    2. Podziel owocolistki po obu stronach przegrody rzekomej za pomocą igły strzykawkowej i przymocuj dwa wypreparowane owocolistki do szkiełka tak, aby zalążki w krzemionce były widoczne pod stereoskopem (Ryc. 1C i 1D).
    3. Dozować 70 μl roztworu Hoyera na szkiełko podstawowe, a następnie zwilżyć końcówkę pęsety z cienką końcówką roztworem Hoyera, zanurzając ją. Za pomocą stereoskopu przenieś zalążki do roztworu Hoyera na szkiełku za pomocą pęsety, aby oczyścić zarodki. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    4. Gotowe szkiełko wkładamy do pudełka w ciemnym pomieszczeniu na 2 - 12 godzin (im bardziej dojrzały jest zalążek, tym więcej czasu będzie potrzebne) w temperaturze pokojowej. Zarodki w stadium 2/4 komórki (1 - 2 DAP) można obserwować mikroskopowo po 2 godzinach, natomiast zarodki między stadiami oktanowymi i wczesnymi kulistymi (3 DAP) można obserwować po 4 godzinach. Bardziej dojrzałe zarodki (4 - 8 DAP) można zaobserwować po 12 godzinach.
    5. Zbadaj oczyszczone zalążki za pomocą funkcji DIC mikroskopu. Umieść zarodki w polu o niskiej mocy (10X), a następnie zmień na pole o dużej mocy (soczewka olejkowa 100X), aby obserwować wzór komórkowy w rozwiniętych zarodkach.
    6. Zbadaj zarodki na różnych etapach rozwoju.

2. Charakterystyka wzorca zarodka i tożsamości komórki poprzez obserwację ekspresji białka markerowego

  1. Przygotowanie materiałów roślinnych
    1. Sklonuj sekwencję promotora i kodującą gen markera lub element odpowiedzi hormonalnej, a następnie połącz go z białkiem fluorescencyjnym (takim jak GFP); następnie wprowadź konstrukt do wektora binarnego (takiego jak pCambia1300). Tutaj element odpowiedzi auksyny DR5 jest przedstawiony jako przykład10.
    2. Wprowadź otrzymany plazmid DR5-GFP do roślin typu dzikiego za pomocą transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens11. Wybierz rośliny T1 za pomocą pożywek MS zawierających higromycynę (50 mg/ml roztworu macierzystego, rozcieńczonego w stosunku 1:1000). Rośliny transgeniczne będą miały długie korzenie i będą wytwarzać dwa liście rozety po 8 dniach wzrostu w warunkach opisanych w ppkt 1.1.5.
    3. Przenieść rośliny transgeniczne do gleby i uprawiać je zgodnie ze wskazaniami w ppkt 1.1.6 i 1.1.7.
    4. Zbierz nasiona T2 z niezależnych linii T1. Wysiewaj nasiona na płytkach MS-higromycyny, wybierz rośliny posiadające jedną kopię insercji DR5-GFP (stosunek roślin odpornych do wrażliwych wyniesie około 3:1) i przenieś je do gleby.
    5. Uprawiać rośliny T2 zgodnie z ppkt 1.1.6 i 1.1.7.
    6. Zbierz nasiona T3 z roślin T2. Wysiewaj nasiona na płytkach MS-higromycyny, wybierz homozygotyczne rośliny transgeniczne (wszystkie rośliny z jednej linii będą wykazywać odporność na higromycynę) i przenieś je do gleby.
    7. Zaznacz pąki kwiatowe homozygotycznych roślin T3, jak wskazano w 1.1.8.
  2. Obserwacja sygnału GFP
    1. Wymieszaj 3 ml glicerolu z 47 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 6% roztwór glicerolu.
    2. Przymocować kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szklanego szkiełka mikroskopowego i przymocować krzemionkę, jak wskazano w ppkt 1.3.1.
    3. Rozciąć owocolistki po obu stronach przegrody rzekomej za pomocą igły strzykawkowej i przymocować dwa wypreparowane słupki do szkiełka pod stereoskopem, jak wskazano w ppkt 1.3.2.
    4. Dozuj 30 μl 6% glicerolu na szkiełko podstawowe i umieść wszystkie zalążki z wypreparowanych owocolistków w roztworze za pomocą pęsety z cienką końcówką. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku.
    5. Ponieważ okrywa nasienna i bielmo w każdym zalążku mogą uniemożliwić obserwację sygnałów GFP w zarodku, należy wyekstrahować zarodek z zalążka. Postukaj w szkiełko szybko i delikatnie, aby wysunąć zarodek z zalążka (im bardziej dojrzały jest zalążek, tym mniejszą siłę należy przyłożyć do szkiełka).
    6. Zbadaj szkiełko pod kątem fluorescencji GFP za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Znajdź izolowane zarodki w polu o niskiej mocy (10X) i zarejestruj ich lokalizację, a następnie zmień na pole o dużej mocy (soczewka immersyjna olejowa 100X), aby obserwować ekspresję DR5-GFP w zarodkach, ustawiając źródło światła wzbudzającego na 488 nm w celu wykrycia sygnału GFP.
    7. Wykryj ekspresję GFP w zarodkach, aby wybrać odpowiednią linię T3 do dalszej analizy.

3. Charakterystyka tworzenia się wzorca zarodka u zarodkowo-letalnego mutanta poprzez klirens zalążka i obserwację białka markerowego: Naa10 jako przykład

  1. Modelowanie zarodków w roślinach z mutacją naa10
    1. Przygotuj materiał roślinny, jak wskazano w ppkt 1.1.1-1.1.7.
    2. Zidentyfikuj rośliny naa10 +/- metodą PCR za pomocą starterów specyficznych dla genu 5, a następnie zaznacz pąki kwiatowe roślin naa10 +/- , jak wskazano w 1.1.8.
    3. Przeprowadzić klirens zalążków i badanie mikroskopowe zarodków naa10+/- zgodnie ze wskazaniami w ppkt 1.2 i 1.3.
  2. Analiza białek markerowych z wykorzystaniem zarodków naa10
    1. Uzyskać odpowiednie linie transgeniczne DR5-GFP stosując procedurę opisaną w ppkt 2.1 - 2.2.
    2. Skrzyżowanie homozygotycznej linii transgenicznej DR5-GFP z rośliną naa10 +/- , aby uzyskać rośliny naa10 +/- , które są homozygotyczne pod względem markera fluorescencji GFP w pokoleniu F2 (zidentyfikowanego przez PCR specyficzny dla genu), aby scharakteryzować naa10 +/- <sup class="xref">5 i obserwować sygnał GFP pod mikroskopem przy użyciu homozygotycznej linii DR5-GFP.
    3. Zaznacz pąki kwiatowe roślin naa10 +/- , które są homozygotyczne pod względem DR5-GFP, jak wskazano w 2.1.7.
    4. Poszukiwania sygnału GFP w zarodkach naa10, które są homozygotyczne pod względem DR5-GFP, jak wskazano w 2.2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym artykule może być wykorzystana do obserwacji embriogenezy bezpośrednio pod mikroskopem, do opisywania specyfikacji tożsamości komórki podczas embriogenezy za pomocą specyficznych markerów oraz do charakteryzowania roli konkretnego genu podczas embriogenezy.

Reprezentatywne wyniki analizy wzorców zarodków (od stadium wydłużonej zygoty do stadium dojrzałej laski) u Arabidopsis typu dzikiego są pokazan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klirens zalążka jest przydatną metodą wykrywania podziału komórek i oceny morfologii podczas embriogenezy u Arabidopsis; przy użyciu tej techniki zarodki można obserwować bezpośrednio pod mikroskopią DIC 5,12. Krytycznym etapem usuwania zalążka jest krok 1.3.4. Czas potrzebny do usunięcia zalążka w kroku 1.3.4 jest zmienny. Zarodki w stadium 2/4-komórkowym można wyraźnie zaobserwować po 2 godzinach w roztworze Hoyera, natomiast po 12 godzinach wyglądają ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Jessice Habashi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Dziękujemy dr Xianyong Shengowi z Centrum Obrazowania, Kolegium Nauk Przyrodniczych, Capital Normal University (Pekin, Chiny), za przeprowadzenie lokalizacji testu DR5-GFP. Prace te były wspierane przez granty z Fundacji Naukowej Samorządu Miejskiego Pekinu (CIT&TCD20150102) oraz z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31600248).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrat chloraluSigma15307
Murashige and Skoog Basal Medium SigmaM5519
PhytagelSigmaP8169
HygromycynaRoche10843555001
Komora wzrostowaPercivalCU36L5
Mikroskop fluorescencyjnyZeiss OberkochenZeiss Image M2aparat: AxioCam 506 kolorowa
konfokalna laserowa mikroskopia skaningowaZeiss OberkochenZeiss LSM 5filtry: BP 495 - 555 nm
stereoskopAparat Zeiss OberkochenAxio Zoom V16: AxioCam MRc5
bogata w składniki odżywczegleba KLASMANN, Niemcy
Rurka 50 mlCorning Inc.
Probówka 1,5 mlCorning Inc.
10% roztwórKrajowy odczynnik analityczny
sacharozaKrajowy odczynnik analityczny
KOHKrajowy odczynnik analityczny
glicerol
naczynieKrajowe dostawy
wermikulituArtykuły gospodarstwa
igła strzykawkiArtykuły domowe
podchlorynu sodu Domowe do hodowli odczynników analitycznych domowego szkiełko szkiełko Artykuły domowepęseta z cienką końcówką Artykuły gospodarstwa domowego super czysta ławka Sprzęt gospodarstwa domowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
  2. Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
  3. Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
  4. ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
  5. Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
  6. Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
  7. Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
  8. Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
  9. Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
  10. Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
  11. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
  12. Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
  13. Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Embriogeneza Arabidopsisformowanie wzorca zarodkaoczyszczanie zal kamikroskopia kontrastowa r nicowakonfokalna skaningowa mikroskopia laserowaanaliza ekspresji GFPprzygotowanie roztworu Hoyeraprotok sterylizacji nasionprzygotowanie po ywki MSokre lanie stadium rozwoju zarodka

Powiązane artykuły