Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Summary

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Abstract

Białka na powierzchni komórki pośredniczą w szerokim zakresie funkcji. W wielu przypadkach ich aktywność jest regulowana przez procesy endocytarne, które modulują ich poziom na błonie plazmatycznej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dla 2 metod, które ułatwiają badanie takich procesów, z których obie opierają się na zasadzie biotynylacji białek powierzchniowych komórek. Pierwszy z nich został zaprojektowany, aby umożliwić półilościowe określenie względnych poziomów określonego białka na powierzchni komórki. W nim reszty lizyny białek błony komórkowej komórek są najpierw znakowane ugrupowaniem biotyny. Po lizie komórek białka te mogą być następnie specyficznie wytrącone za pomocą streptawidyny immobilizowanej agarozą, wykorzystując naturalne powinowactwo tej ostatniej do biotyny. Wyizolowane w ten sposób białka mogą być następnie analizowane za pomocą standardowego podejścia western blotting. Druga metoda umożliwia określenie szybkości endocytarnej określonego celu na powierzchni komórki w pewnym okresie czasu. Białka na powierzchni komórki są najpierw modyfikowane pochodną biotyny zawierającą rozszczepialne wiązanie dwusiarczkowe. Komórki są następnie przenoszone z powrotem do normalnych warunków hodowli, co powoduje endocytarny wychwyt części biotynylowanych białek. Następnie wiązania dwusiarczkowe niezinternalizowanych grup biotyny są redukowane za pomocą nieprzepuszczalnego dla błony środka redukującego glutationu. Dzięki takiemu podejściu białka endocytozowane mogą być zatem izolowane i oznaczane ilościowo z wysokim stopniem swoistości.

Introduction

Białka na powierzchni komórki odgrywają różne role kluczowe dla utrzymania funkcji komórki. W wielu przypadkach ich aktywność jest zależna od procesów endocytarnych, które albo tymczasowo sekwestrują je w miejscach wewnątrzkomórkowych, albo kierują je w stronę szlaków degradacji^1,2,3,4,5. W tym miejscu zwracamy uwagę na 2 podejścia oparte na biotynylacji, zaprojektowane tak, aby umożliwić użytkownikowi specyficzne znakowanie i izolowanie białek ulegających ekspresji w błonie plazmatycznej oraz tych nowo zinternalizowanych. Za pomocą tych metod można określić ilościowo ekspresję na powierzchni komórki i tempo endocytarne dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, co pozwala na jaśniejszą ocenę jego regulacji.

Określanie względnej ekspresji białek na powierzchni komórki za pomocą biotynylacji

Biotyna, lub witamina B7, wcześniej znana jako witamina H⁶, to mała rozpuszczalna w wodzie cząsteczka, która może być używana do chemicznej modyfikacji reaktywnych grup aminowych, sulfhydrylowych i karboksylowych cząsteczek biologicznych. Obecny zbiór odczynników biotynylacji na powierzchni komórki składa się głównie z nieprzerobionych błonowo sulfonowanych sulfonowanych N-hydroksysukcynimidów (sulfo-NHS) biotyny lub jej pochodnych, zaprojektowanych do reagowania z aminami obecnymi w łańcuchach bocznych reszt lizyny białek ulegających ekspresji na powierzchni komórki, gdy ulegają one deprotonacji w warunkach podstawowych, w wyniku czego te ostatnie tworzą wiązanie amidowe z ugrupowaniem biotyny⁷. Tak zmodyfikowane białka powierzchniowe komórki mogą być następnie izolowane za pomocą awidyny, tetramerycznego białka o masie 66 - 69 kDa o dużym powinowactwie do biotyny, wiążącego się z tą ostatnią ze stałą dysocjacji około ^10-15, co oznacza, że jest to jedno z najsilniejszych znanych oddziaływań niekowalencyjnych^8,9.

W poprzednich badaniach stosowano wiele alternatywnych metod ilościowego określania ekspresji białek na powierzchni komórki. Znakowanie nieprzepuszczalnych komórek za pomocą znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał specyficznych dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, na przykład, jest powszechnie stosowanym podejściem, ale w dużym stopniu zależy od dostępności przeciwciał, które mogą wiązać się z epitopami zewnątrzkomórkowymi. Ostatnio z powodzeniem zastosowano również metody polegające na wykorzystaniu białek chimerycznych zawierających fluorofory wrażliwe na pH, które reagują na wystawienie na działanie kwaśnych mediów¹⁰. Jednak takie testy zwykle obejmują egzogenną ekspresję tych konstruktów w liniach komórkowych, w których białko będące przedmiotem zainteresowania nie występuje natywnie. Podejścia te są jednak w stanie dostarczyć cennych informacji na temat lokalizacji subkomórkowej i trasy egzocytarnej białka docelowego, a zatem powinny być stosowane w połączeniu z opisanymi tutaj podejściami opartymi na biotynylacji, jeśli dostępne są narzędzia.

W typowym teście biotynylacji, komórki są najpierw dokładnie myte w 4 °C PBS. Usuwa to wszelkie ślady białek surowicy wprowadzonych przez pożywkę hodowlaną, zapewniając w ten sposób, że nie będą one zużywać nadmiernych ilości biotyny w następnym etapie. Co ważniejsze, obniżenie temperatury powoduje znaczne spowolnienie endocytozy. Następnie dodaje się odczynnik do biotynylacji. Następnie komórki są ponownie myte, a następnie inkubowane z buforem wygaszającym zawierającym glicynę lub NH₄Cl, którego celem jest dezaktywacja wszystkich pozostałych śladów nieprzereagowanej biotyny. Komórki są następnie poddawane lizie, po czym dodaje się streptawidynę unieruchomioną agarozą w celu wytrącenia biotynylowanych białek. Analiza jest zwykle przeprowadzana za pomocą western blot, co pozwala na ilościowe określenie względnej ekspresji różnych białek na powierzchni komórki.

Ze względu na podstawę tego testu, nadaje się on do stosowania tylko z białkami, których części są wystawione na działanie środowiska zewnątrzkomórkowego. Wieloprzebiegowe białka transbłonowe, które prawdopodobnie posiadają pewną liczbę reaktywnych lizyn w swoich regionach pętli, są najbardziej podatne na tę metodę, podczas gdy białka jednoprzebiegowe są mniej podatne na biotynylację. Nawet w takich przypadkach istnieje możliwość, że zmiany konformacyjne lub interakcje międzycząsteczkowe mogą blokować pewne miejsca reaktywne, co skutkuje niższą niż oczekiwano wydajnością biotynylacji.

Określanie szybkości internalizacji białek na powierzchni komórki za pomocą biotynylacji

Zasady tego testu są w dużej mierze podobne do zasad biotynylacji na powierzchni komórki, z wieloma wyjątkami, z których najważniejszym jest użycie odwracalnych odczynników do biotynylacji. Grupy biotyny (spośród nich) posiadają wiązania dwusiarczkowe w swoich strukturach, które są podatne na czynniki redukujące; Jest to wykorzystywane w celu zapewnienia, że tylko białka na powierzchni komórki pobrane do miejsc wewnątrzkomórkowych w okresie oznaczania pozostaną biotynylowane. Test zazwyczaj odbywa się w następujący sposób. Komórki są najpierw myte i biotynylowane zimnymi odczynnikami, następnie ponownie wprowadza się pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, a komórki są zwracane do inkubatora; Powoduje to, że znakowane białka na powierzchni komórki ulegają endocytozie. Środek redukujący glutation - który nie może przeniknąć przez błonę - jest następnie dodawany w celu zerwania wiązań dwusiarczkowych ugrupowań biotyny przyłączonych do białek pozostających na powierzchni komórki. Na koniec zerwane wiązania dwusiarczkowe reagują z jodoacetamidem, zużywając labilne grupy tiolowe i zapobiegając reformowaniu wiązań. Tak jak poprzednio, komórki są następnie poddawane lizie, a znakowane białka są wytrącane za pomocą streptawidyny-agarozy.

Ograniczenia omówione w poprzedniej sekcji obowiązują również tutaj ze względu na podobieństwa między metodami. Ponadto warto pamiętać, że zmiany temperatury związane z tym testem uniemożliwiają dokładne określenie, ile białka jest endocytozowane w każdym kroku czasu, szczególnie w przypadku białek szybko internalizowanych lub szybko poddawanych recyklingowi. Test zapewnia zatem jedynie półilościowe oszacowanie wskaźników endocytarnych. Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem może być wykorzystana do śledzenia wychwytu każdego obciążonego pęcherzyka i zapewnienia bardziej precyzyjnego pomiaru kinetyki endocytozy. Może zatem stanowić bardzo użyteczne uzupełnienie tego testu, zakładając, że dostępny jest fluorescencyjnie znakowany chimeryczny konstrukt białka będącego przedmiotem zainteresowania¹¹.

Protocol

1. Określanie względnej ekspresji białek na powierzchni komórki w astrocytach za pomocą biotynylacji

UWAGA: Tutaj ilustrujemy zastosowanie tej techniki biotynylacji do badania wpływu cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej lamininy na lokalizację na powierzchni komórki przepuszczalnego dla wody kanału akwaporyny-4 (AQP4). Specjalistyczne materiały wymagane do tego testu obejmują sulfo-NHS-LC-biotynę i żywicę streptawidyno-agarozową (patrz tabela materiałów).

1. Stosując metodę opisaną w Noel i wsp.¹², przygotuj kultury astrocytów korowych około 2 tygodnie przed testem i hoduj je w 75 cm² wentylowanych kolbach hodowlanych. Gdy astrocyty są zlewające się w 80 - 90%, należy je oderwać od powierzchni hodowli za pomocą 0,05% trypsyny, a następnie przejść je w stosunku 1:3.
2. Po 48 godzinach przed badaniem, gdy komórki są ponownie zlewające się w 80 - 90%, astrocyty pasują 1:3 (uwzględniając zmianę formatu hodowli) na 60-milimetrowe szalki do hodowli komórkowych, tak aby w dniu, w którym ma się odbyć eksperyment, były w >70% zlewane. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone między naczyniami.
3. Po 16 godzinach przed badaniem pipetować lamininę do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 24 nM i inkubować w temperaturze 37 °C.
4. Bezpośrednio przed oznaczeniem należy przygotować następujące substancje, a następnie umieścić je na lodzie lub wstawić do lodówki: CM-PBS (100 mg/L MgCl₂∙6H₂O i 100 mg/L CaCl₂ w 1X PBS, pH 7,4), bufor biotyny (0,5 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotyna w CM-PBS), bufor wygaszający (50 mM NH₄Cl w CM-PBS), bufor do lizy (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicyny, 150 mM NaCl i 5 mM EDTA, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy), 3X bufor ładujący (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerol, 300 mM DTT i 0,01% błękitu bromofenolowego) i bufor do przemywania (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, koktajl inhibitorów proteazy 1X).
5. Wyjąć z inkubatora szalki zawierające kultury astrocytów i wyrzucić pożywkę.
6. Umyj komórki trzykrotnie schłodzonym CM-PBS o pojemności 4 ml i umieść naczynia na kruszonym lodzie.
7. Odpipetuj 2 ml buforu biotyny do każdego dołka i delikatnie przechyl szalki kilka razy w przód i w tył, aby zapewnić pełne pokrycie. Pozostaw na lodzie na 30 minut.
8. Usunąć bufor biotyny za pomocą aspiratora i zastąpić go 4 ml buforem hartującym. Pozostaw na lodzie na 10 minut.
9. Zassać bufor hartowniczy i zastąpić go równoważną objętością. Ponownie pozostaw na lodzie na 10 minut.
10. Odrzucić bufor hartowniczy i trzykrotnie przemyć komórki 4 ml schłodzonego CM-PBS.
11. Zeskrobać komórki do 1 ml schłodzonego CM-PBS za pomocą podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej.
12. Osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 100 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu do lizy.
13. Pozostawić próbki na lodzie na 30 minut, wirując co 5 minut, lub umieścić je na rotatorze typu "koniec do końca" w temperaturze 4 °C.
14. Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wszelkich materiałów nierozpuszczalnych w detergentach. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
    1. Zaoszczędź 50 μl tego lizatu i dodaj do niego bufor ładujący. Następnie poddać go denaturacji poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C w suchej kąpieli; Jest to frakcja "wejściowa", zawierająca zarówno biotynylowane białka powierzchniowe komórek, jak i niebiotynylowane białka cytozolowe.
15. Poszerz otwór końcówki pipety, odcinając około 0,5 cm materiału od jej końca za pomocą ostrych nożyczek. Za pomocą tej końcówki pipety przenieść 75 μl kulek streptawidyny-agarozy (normalnie przechowywanych w temperaturze 4 °C) do lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na wytrząsarce/kołysce.
    1. Ponieważ paciorkowcowo-agaroza jest często sprzedawana w postaci zawiesiny zawierającej 50% objętości kulek, zawieszonych w roztworze przeciwdrobnoustrojowym, należy rozprowadzić zawiesinę, aby zapewnić równomierne zawieszenie kulek, a następnie odpipetować 150 μl zawiesiny do każdej próbki.
16. Granulki streptawidyny-agarozy przez odwirowanie w temperaturze 1500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
    1. Zaoszczędź 50 μl supernatantu (dodaj bufor ładujący i denaturuj go w temperaturze 95 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym); reprezentuje on frakcję "wewnątrzkomórkową" i składa się głównie z niebiotynylowanych białek cytozolowych.
17. Ponownie zawiesić granulowane kulki w 1 ml buforze do przemywania i kołysać go przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Granulki osadu (jak w kroku 1.16) i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces 4x, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.
Granulki osadzać
18. przez odwirowanie (1500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C) i wyrzucić leżący nad nimi bufor do płukania. Dodać 50 μl 1X buforu ładującego (rozcieńczonego za pomocą buforu do lizy). Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C; Frakcja ta powinna zawierać wyłącznie biotynylowane białka powierzchniowe (frakcja "powierzchnia komórki").
    1. Oddziel frakcje wejściowe, powierzchniowe komórkowe i wewnątrzkomórkowe według SDS-PAGE ¹³ i analizuj według western blotting ¹⁴.
       UWAGA: Podczas gdy w naszych eksperymentach użyliśmy 4 - 20% prefabrykowanego żelu gradientowego, 12 - 14% żel separujący z 4% warstwą układania (każda zawierająca 0,1% SDS) powinna wystarczyć dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Należy również stosować wzorzec masy cząsteczkowej o odpowiednim zakresie wielkości. Należy zauważyć, że czasami może wystąpić zauważalne przesunięcie w górę pozornych mas cząsteczkowych biotynylowanych białek.

2. Określanie szybkości internalizacji białek powierzchniowych komórek w astrocytach za pomocą biotynylacji

UWAGA: Poniżej opisujemy typowy eksperyment biotynylacji z pogonią za impulsem, używany w tym przypadku do śledzenia endocytozy AQP4 w astrocytach. Metoda ta opiera się na metodzie zastosowanej przez Madrida i wsp.¹⁵. Wymagane specjalistyczne materiały to sulfo-NHS-SS-biotyna, żywica streptawidyno-agarozowa, zredukowany glutation i jodoacetamid (zobacz Tabelę Materiałów).

1. Przygotuj kultury astrocytów korowych myszy w szalkach o średnicy 60 mm, stosując metody opisane w poprzednim rozdziale. Upewnij się, że komórki zlewają się w około 70% w dniu testu i że każda szalka zawiera równoważną liczbę komórek.
2. Bezpośrednio przed badaniem należy przygotować następujące składniki i umieścić na lodzie lub w lodówce: CM-PBS (100 mg/L MgCl₂∙6H₂O i 100 mg/L CaCl₂ w 1X PBS, pH 7,4), bufor biotyny (0,5 mg/ml sulfo-NHS-SS-biotyny w CM-PBS), bufor redukujący (50 mM zredukowany glutation, 75 mM NaCl i 75 mM NaOH), bufor gaszący (50 mM jodoacetamid, 1% BSA, w CM-PBS), bufor do lizy (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicyny, 150 mM NaCl i 5 mM EDTA, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy), 3X bufor ładujący (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerol, 300 mM DTT i 0,01% błękitu bromofenolowego) i bufor do przemywania (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy).
3. Przygotuj świeże podłoże do hodowli komórkowych (DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydową (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy) i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Usuń kultury astrocytów z inkubatora i odessaj pożywkę za pomocą aspiratora.
5. Umyj komórki trzykrotnie schłodzonym CM-PBS o pojemności 4 ml i umieść naczynia na kruszonym lodzie.
6. Odpipetuj 3 ml buforu biotyny do każdego naczynia, przechyl naczynia kilka razy w przód i w tył, aby upewnić się, że bufor jest dobrze rozprowadzony, i pozostaw go na lodzie na 30 minut.
7. Odessać bufor biotyny i zastąpić go 5 ml ciepłej pożywki. Inkubować szalkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a drugą szalkę w tej samej temperaturze przez 30 minut. Pozostawić inne naczynie w temperaturze 4 °C jako próbkę 0 min.
8. Pod koniec okresu inkubacji wyrzucić pożywkę i trzykrotnie umyć komórki 4 ml schłodzonego CM-PBS. Odpipetować 6 ml buforu redukcyjnego na komórkach i pozostawić na lodzie na 15 minut.
9. Usuń bufor redukcyjny, a następnie zastąp go 6 ml świeżym buforem redukującym. Umieść na lodzie na dodatkowe 15 minut.
10. Usunąć roztwór redukujący i zastąpić go 6 ml buforu hartującego. Pozostaw na lodzie na 15 minut.
11. Powtórz krok hartowania jeszcze raz.
12. Odrzucić bufor gaszący i przemyć komórki trzykrotnie 4 ml schłodzonego PBS.
13. Zeskrobać komórki do 1 ml schłodzonego PBS za pomocą podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki.
14. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforze do lizy
.
15. Pozostaw to na lodzie na 30 minut i wiruj co 5 minut. Alternatywnie, umieść próbki na rotatorze typu end---end w temperaturze 4 °C na ten czas.
16. Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia materiałów nierozpuszczalnych w detergentach, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj 50 μl tego lizatu, dodaj do niego bufor ładujący i denaturuj w temperaturze 95 °C w suchej kąpieli; Jest to frakcja "wejściowa", zawierająca zarówno biotynylowane białka endocytozowane, jak i białka niebiotynylowane.
17. Za pomocą odciętej końcówki pipety dodać 150 μl zawiesiny streptawidyny i agarozy do lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na wytrząsarce/kołysce. Zobacz 1.15, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat tego kroku.
18. Granulki streptawidyny i agarozy przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
19. Zawiesić kulki w 1 ml buforu do przemywania i kołysać przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Granulki (jak w kroku 2.18) i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces 4x, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.
20. Granulki osadkować przez odwirowanie w stężeniu 1 500 x g przez 30 s, w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić leżący nad nimi bufor do płukania. Dodać 50 μl 1X buforu ładującego (rozcieńczonego za pomocą buforu do lizy). Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C; Frakcja ta powinna zawierać tylko zinternalizowane białka powierzchniowe komórki (frakcja "endocytozowana").
21. Oddziel ułamki wejściowe, powierzchnię komórki i niezwiązane przez SDS-PAGE¹³ i analizuj według western blotting¹⁴.
    UWAGA: Podczas gdy w naszych eksperymentach użyliśmy 4 - 20% prefabrykowanego żelu gradientowego, 12 - 14% żel separujący z 4% warstwą układania (każda zawierająca 0,1% SDS) powinna wystarczyć dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Należy również stosować wzorzec masy cząsteczkowej o odpowiednim zakresie wielkości. Należy zauważyć, że czasami może wystąpić zauważalne przesunięcie w górę pozornych mas cząsteczkowych biotynylowanych białek.

Results

Wykorzystanie biotynylacji powierzchni komórki do oceny ekspresji AQP4 w błonie plazmatycznej astrocytów
Hodowle astrocytów traktowane lamininą i nieleczone komórki kontrolne poddano biotynylacji powierzchni komórki przy użyciu opisanych metod. Biotynylowane białka wytrącono streptawidyną sprzężoną z agarozą, a następnie rozdzielono za pomocą SDS-PAGE. Frakcje powierzchni komórek badano pod kątem AQP4 i β-dystroglikanu (β-DG) jako kontroli obciążenia powierzchni komór...

Discussion

Modyfikacje:
Ponieważ metody te zostały zaprojektowane do stosowania z komórkami adherentnymi, określiliśmy użycie PBS zawierającego 100 mg/L MgCl₂∙6H₂O i

100 mg/l CaCl₂ (CM-PBS) do etapów przemywania oraz jako podstawa niektórych, tak aby zapewnić, że komórki pozostają połączone z powierzchnią hodowli i że połączenia komórka-komórka nie są przerwane. Jednak protokoły mogą być również stosowane do nieprzylegających typów komórek, jeśli kom...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek amonu (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647-50
Błękit bromofenolowy	Bio-Rad	#1610404
cKompletny koktajl inhibitorów proteazy	Sigma-Aldrich	11697498001
Dihydrat dihydratu etylenodiaminotetraoctanu ( EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Ditiothreitol (DTT)	Bio-Rad	#1610611
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotyna	Thermo Fisher Scientific	#21331
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glicyna	Sigma-Aldrich	G8898
Jodoacetamid	Bio-Rad#	163-2109
Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm	Sigma-Aldrich	L2020	Rozmrażanie na lodzie.
L-glutamina	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-β-aktyny (AC-15)	Sigma-Aldrich	A5441
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-β-dystroglikanu (43DAG1/8D5)	Leica Biosystems	B-DG-CE
Penicylina/streptomycyna	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Peroksydaza AffiniPure Donkey anty-mysie IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
Peroksydaza AffiniPure Goat anty-królicza IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
Zredukowany glutation	Sigma-Aldrich	G6529
Chlorek sodu (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	862010
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Fisher Scientific	S318-100
Żywica agarozowa streptawidyny	Thermo Fisher Scientific	#20347
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-AQP4	Alomone	AQP-004
Baza Tris (zasada Trizma)	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500