Metoda obliczeniowa do ilościowego określania aktywności okołodobowej much

Summary

Przedstawiono metodę ilościowego określania głównych cech czasowych obserwowanych w rytmach okołomotorycznych much. Kwantyfikacja jest osiągana poprzez dopasowanie aktywności muchy do wieloparametrycznego kształtu fali modelowej. Parametry modelu opisują kształt i wielkość porannych i wieczornych szczytów dziennej aktywności.

Abstract

U większości zwierząt i roślin, zegary okołodobowe koordynują procesy behawioralne i molekularne oraz synchronizują je z codziennym cyklem światło-ciemność. Podstawowe mechanizmy, które leżą u podstaw tej czasowej kontroli, są szeroko badane na przykładzie muszki owocowej Drosophila melanogaster jako organizmu modelowego. U much zegar jest zwykle badany poprzez analizę wielodniowego zapisu lokomotorycznego. Takie nagranie pokazuje złożony wzorzec bimodalny z dwoma szczytami aktywności: porannym szczytem, który ma miejsce około świtu, i wieczornym szczytem, który ma miejsce o zmierzchu. Te dwa piki razem tworzą kształt fali, który bardzo różni się od sinusoidalnych oscylacji obserwowanych w genach zegara, co sugeruje, że mechanizmy oprócz zegara mają głęboki wpływ na tworzenie obserwowanych wzorców w danych behawioralnych. W tym miejscu podajemy instrukcje dotyczące korzystania z niedawno opracowanej metody obliczeniowej, która matematycznie opisuje wzorce czasowe w aktywności much. Metoda dopasowuje dane dotyczące aktywności do modelowego kształtu fali, który składa się z czterech wyrazów wykładniczych i dziewięciu niezależnych parametrów, które w pełni opisują kształt i wielkość porannych i wieczornych szczytów aktywności. Wyodrębnione parametry mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów kinetycznych substratów, które leżą u podstaw powszechnie obserwowanych wzorców aktywności bimodalnej w rytmach lokomotorycznych much.

Introduction

Zegar okołodobowy jest endogennym oscylatorem biochemicznym o okresie około 24 godzin i jest prawie wszechobecny u zwierząt i roślin^1,2. Zegar pomaga zsynchronizować wewnętrzne procesy i zachowanie organizmu z zewnętrznym cyklem ciemności światła. Struktura genetyczna zegara okołodobowego jest szeroko badana od lat sześćdziesiątych XX wieku przy użyciu muszki owocowej D. melanogaster. U tego owada rdzeń zegara okołodobowego składa się z czterech białek: PERIOD, TIMELESS, CLOCK i CYCLE. Te podstawowe składniki wraz z innymi cząsteczkami tworzą pętlę sprzężenia zwrotnego, która wytwarza prawie sinusoidalne oscylacje genów zegara^3,4. Zegar okołodobowy u much jest szeroko badany za pomocą wielodniowych zapisów lokomotyw, w których aktywność much jest wykrywana za pomocą pojedynczej wiązki podczerwonej przecinającej środek pojedynczej rury⁵. Typowy zapis muchy ma złożony wzorzec bimodalny z dwoma dobrze rozróżnialnymi szczytami: poranny szczyt (M), który zaczyna się pod koniec nocy i osiąga maksimum, gdy włączają się światła; oraz Szczyt wieczorny (E), który rozpoczyna się pod koniec dnia i osiąga maksimum, gdy wyłączają się światła⁶. Co ciekawe, kształt takiego zapisu behawioralnego bardzo różni się od prostych oscylacji sinusoidalnych obserwowanych na poziomie molekularnym, co sugeruje działanie dodatkowych mechanizmów składających się na obserwowane wzorce czasowe. Aby lepiej zrozumieć te ukryte mechanizmy, opracowaliśmy narzędzie obliczeniowe, które zapewnia ilościowy opis wzorców czasowych.

W naszej pracy rytmy lokomotoryczne są definiowane w kategoriach kształtu fali, który naśladuje wzorzec aktywności muchy. Ponieważ proste fale sinusoidalne nie mogą być używane do modelowania obserwowanych rytmicznych zmian aktywności, przetestowaliśmy różne kształty sygnału, aby wybrać najprostszy, który uchwyci wszystkie istotne cechy widoczne na nagraniach. Zachowanie okołodobowe muszki owocowej jest kontrolowane przez aktywność neuronów zegarowych, które często mają wykładnicze wzorce aktywacji i dezaktywacji⁷. Dynamika wykładnicza i wizualna analiza danych zmotywowały nas do zbudowania modelu z wyrazami wykładniczymi składającego się z czterech wykładników z dziewięcioma niezależnymi parametrami i bardzo przypominającego wzorzec aktywności muchy⁸. Oprócz danych dotyczących lokomotywy analizujemy również jej spektrum mocy. Typowe spektrum aktywności muchy wykazuje wiele pików przy harmonicznych T₀/2, T₀/3 itd., oprócz oczekiwanego podstawowego piku w okresie okołodobowym T₀. Zgodnie z twierdzeniem Fouriera, tylko czysta fala sinusoidalna wytwarza pojedynczy pik w widmach mocy, podczas gdy bardziej złożone przebiegi wykazują wiele pików widmowych w harmonicznych okresu pierwotnego (Rysunek 1). W związku z tym, biorąc pod uwagę niesinusoidalny wzorzec czasowy w aktywności much⁸, wieloszczytowe widmo mocy danych jest matematycznie oczekiwane i niekoniecznie oznacza obecność wielu okresów oscylacji. Co ważne, widmo mocy proponowanego modelowego kształtu fali pokazuje również piki na wszystkich harmonicznych okresu pierwotnego, podobnie jak w przypadku nagrań lokomotyw muchowych, podkreślając w ten sposób wysoką wierność, z jaką nasz model opisuje dane o muchach zarówno w czasie, jak i częstotliwości.

Przy rozdzielczościach czasowych wynoszących kilka minut lub mniej, dane o aktywności lotu wydają się zaszumione, co utrudnia wydobycie parametrów bezpośrednio z surowych danych. Grupowanie danych w dłuższe interwały czasowe może zmniejszyć poziom szumu, ale może zmienić dane w sposób, który może mieć wpływ na szacowanie parametrów modelu. W związku z tym uzyskujemy parametry z widm mocy zapisów, używając wyrażenia analitycznego dla oczekiwanych widm mocy obliczonych z transformaty Fouriera funkcji modelu⁸ (patrz Plik dodatkowy 1 w odnośniku⁸). Takie podejście polegające na uzyskiwaniu parametrów z widm mocy daje dokładne wartości parametrów bez żadnych dodatkowych manipulacji, takich jak kategoryzowanie lub filtrowanie surowych danych dotyczących aktywności. Szczegóły matematyczne modelu i zastosowania do danych typu dzikiego i zmutowanego są opisane w reference⁸. Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na instrukcjach krok po kroku dotyczących korzystania z narzędzia obliczeniowego.

Protocol

1. Pomiar lokomocji much za pomocą monitora aktywności Drosophila (DAM)

UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, zobacz reference⁵.

1. Przygotuj pojedyncze rurki na muchy z jedzeniem na jednym końcu i bawełną z drugiej. Koniec z jedzeniem powinien być szczelnie zamknięty, aby zapobiec wysychaniu żywności.
   1. Umieść 5-6 g pokarmu na muchy w zlewce o pojemności 50 ml. Pokrój jedzenie na małe kawałki, aby łatwiej było je stopić.
   2. Połącz 32 pojedyncze szklane rurki za pomocą gumowej opaski.
   3. Rozpuść żywność w zlewce, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej przez 10-15 s. Zatrzymaj kuchenkę mikrofalową co 5 sekund i ostrożnie potrząśnij zlewką, aby zapewnić równomierne stopienie żywności.
   4. Gdy pokarm jest jeszcze płynny, włóż przygotowane pojedyncze probówki do zlewki z jedzeniem. Przesuwaj rurki w górę i w dół, aby były równomiernie wypełnione.
   5. Pozostaw żywność do ostygnięcia i zestalenia się przez około 1 godzinę.
   6. Gdy pokarm stwardnieje, wyjmij rurki z żywnością ze zlewki.
   7. Uszczelnij koniec zawierający żywność za pomocą wosku. Najpierw ostrożnie wyczyść tubkę ręcznikiem papierowym, a następnie dociśnij rurkę do wosku. Sprawdź wzrokowo jakość uszczelki i, jeśli to konieczne, powtórz uszczelnienie ponownie.
   8. Zamknij drugi koniec rurki bawełną; bawełna pozwoli na przepływ powietrza, jednocześnie utrzymując muchę zablokowaną w tubie.
2. Umieść pojedynczą muchę w każdej pojedynczej rurce i umieść rurki w DAM.
3. Umieść monitory w inkubatorze, który utrzymuje stałą temperaturę i wilgotność. Na podstawie eksperymentu ustaw odpowiednie warunki światła/ciemności w następujący sposób.
   1. W przypadku eksperymentów światło/ciemność utrzymuj muchy w cyklu światło/ciemność przez cały eksperyment. W analizie nie należy wykorzystywać pierwszego dnia pomiarów.
   2. W przypadku eksperymentów z ciągłą ciemnością, najpierw trzymaj muchy przez dwa dni w jasnych/ciemnych warunkach w celu porwania i synchronizacji zegarów, a następnie przełącz się na ciągłą ciemność. W analizie nie należy wykorzystywać pomiarów z pierwszego dnia ciągłej ciemności.
4. Zbierz dane z co najmniej czterech dni, które można wykorzystać w analizie.
   UWAGA: System DAM wyśle pojedynczy plik z nagraniem lokomocji wszystkich much w monitorze.

2. Analiza danych

1. Podziel plik wyjściowy monitora na wiele pojedynczych plików aktywności muchy; każdy plik powinien być jednokolumnowym plikiem ".txt" z indywidualnym pomiarem lokomocji much.
2. Uruchom funkcję "ModelFitPS3.m" w oknie poleceń Matlab z następującymi parametrami wejściowymi:
   1. W przypadku częstotliwości próbkowania ustaw interwał próbkowania danych w sekundach. Na przykład, jeśli aktywność była mierzona co minutę, wprowadź 60 jako częstotliwość próbkowania.
   2. W przypadku bin_interval ustaw przedział czasu w minutach, do którego dane będą grupowane, aby uzyskać lepszą wizualizację; zalecany interwał przedziału to 20-30 minut.
   3. W polu trend wprowadź wartość "1", jeśli dane pokazują trend bazowy, a w przeciwnym razie "0"; dane z trendem zostaną najpierw zdetrendyzowane przez dopasowanie wielomianu drugiego rzędu, a następnie odjęcie go od danych.
3. W wyskakującym okienku wybierz plik pojedynczej aktywności lotu.
   Uwaga: Pierwszy wykres to widmo mocy danych, a nie znany wykres aktywności. Z wykreślonego widma mocy wyznacz okres pierwotny T₀: Kliknij lewym przyciskiem myszy na szczycie okołodobowym lub prawym przyciskiem myszy na drugim piku harmonicznej (około T₀/2).
4. Na otwartym wykresie danych sprawdź, czy poranne i wieczorne szczyty są dobrze zwizualizowane. Jeśli nie, zmień wartość bin_interval, klikając prawym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu wykresu i wprowadzając nową wartość bin_interval w oknie dialogowym. Program przerysuje dane z nową wartością interwału. Aby zaakceptować wartość bin_interval, kliknij lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu wykresu.
5. Program ponownie narysuje dane i pokaże pierwsze pięć dni aktywności. Na tym wykresie kliknij pierwszy pik M, który zostanie wykorzystany w analizie (czasami konieczne jest pominięcie jednego lub dwóch dni).
   UWAGA: Program przerysuje wykres, zaczynając od wybranego porannego szczytu. Niebieskie i czerwone linie pokażą przybliżoną pozycję odpowiednio piku E i piku M następnego dnia, w oparciu o okres określony w kroku 2.4.
6. Na tym samym wykresie wybierz dane do wstępnego dopasowania danych do modelu: Kliknij następujące punkty (w tej kolejności; zwróć uwagę, że miejsce kliknięcia będzie oznaczone czerwoną gwiazdką na dole): (i) Szczyt szczytu M; (ii) koniec piku M; (iii) początek szczytu E; (iv) wierzchołek szczytu E; (v) koniec piku E; (vi) Wierzchołek szczytu M z dnia następnego.
7. Zauważ, że program prezentuje teraz widmo mocy.
   UWAGA: Oś x jest teraz podana w częstotliwości.
   1. W otwartym oknie z widmem mocy wskaż punkty, które zostaną użyte do dopasowania wyrażenia analitycznego dla widma mocy modelu. Okres wykryty w kroku 2.4 jest oznaczony czerwoną linią. Aby wybrać punkty dopasowania, najpierw z grubsza określ okres podstawowy, podobnie jak w kroku 2.4. Następnie za pomocą suwaka dostosuj wartość okresu podstawowego tak, aby punkty dopasowania (oznaczone czerwonymi kółkami, pojawią się po przesunięciu suwaka) były zamknięte do wartości szczytowych.
8. Po wizualnym wybraniu piku kliknij "Akceptuj", a program dopasuje wybrane punkty do wyrażenia analitycznego w celu obliczenia parametrów modelu.
9. Należy pamiętać, że parametry i błąd dopasowania spektralnego są zapisywane do pliku "model_fit_parameters.txt"; program dodatkowo zapisze 2 figury z pasowaniami danych lokomotywy i jej widma mocy.

Results

Przedstawiona tutaj metoda pozwala na ilościowe określenie głównych cech wzorca lokomocji much. Kwantyfikacja jest osiągana przez dopasowanie danych dotyczących aktywności do modelu, który składa się z czterech składników wykładniczych:

Model ma dziewięć niezależnych parametrów, które opisują wzorzec akt...

Discussion

W niniejszej pracy przedstawiono instrukcje dotyczące korzystania z narzędzia obliczeniowego, które dostarcza ilościowego opisu wzorca lokomocji much. Narzędzie dopasowuje dane dotyczące lokomocji do modelu matematycznego składającego się z czterech wyrazów wykładniczych, które razem opisują kształt i rozmiar pików M i E. Ostateczne wartości parametrów modelu uzyskuje się poprzez dopasowanie widm mocy danych, gdzie użycie surowych danych może uniknąć artefaktów, które grupowanie lub filtrowanie danych może nałożyć na war...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2, DAM5	Mierzy locootion much za pomocą pojedynczej wiązki podczerwieni
MatLab	Mathworks		Środowisko obliczeniowe i język programowania, MatLab powinien zawierać zestawy narzędzi do optymalizacji i matematyki symbolicznej
Drosophila melanogaster		per[S], per[L], iso31(typ dziki)	Naszą analizę można przeprowadzić na mutantach much w dowolnym okresie okołodobowym