Sekwencjonowanie DNA w nanoporach do metagenomicznej analizy gleby

Podsumowanie

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł ma szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów, monitorowania bezpieczeństwa żywności, analizy genomicznej, metagenomicznego monitorowania środowiska i charakterystyki oporności bakterii na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę metagenomicznego sekwencjonowania DNA gleby w celu identyfikacji gatunków z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nanoporowego.

Streszczenie

Ten artykuł opisuje etapy budowy biblioteki DNA z gleby, przygotowanie i użycie komórki przepływowej nanoporów oraz analizę sekwencji DNA zidentyfikowanych za pomocą oprogramowania komputerowego. Sekwencjonowanie DNA w nanoporach to elastyczna technika, która pozwala na szybkie sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów w celu identyfikacji gatunków bakterii i wirusów, scharakteryzowania szczepów bakteryjnych oraz wykrycia mutacji genetycznych, które nadają oporność na antybiotyki. Zalety sekwencjonowania nanoporowego (NS) w naukach przyrodniczych obejmują jego niską złożoność, obniżone koszty i szybkie sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym oczyszczonego genomowego DNA, amplikonów PCR, próbek cDNA lub RNA. NS jest przykładem "sekwencjonowania nici", które polega na sekwencjonowaniu DNA poprzez prowadzenie jednoniciowej cząsteczki DNA przez nanopory, które są wprowadzane do syntetycznej membrany polimerowej. Na membranie doprowadzony jest prąd elektryczny, więc gdy poszczególne zasady przechodzą przez nanopory, prąd elektryczny jest zakłócany w różnym stopniu przez cztery zasady nukleotydowe. Identyfikacja każdego nukleotydu odbywa się poprzez wykrycie charakterystycznej modulacji prądu elektrycznego przez różne zasady przechodzące przez nanopory. System NS składa się z ręcznego, zasilanego przez USB urządzenia przenośnego i jednorazowej celi przepływowej, która zawiera matrycę nanoporową. Przenośne urządzenie podłącza się do standardowego laptopa, który odczytuje i rejestruje sekwencję DNA za pomocą oprogramowania komputerowego.

Wprowadzenie

Celem tej procedury jest zademonstrowanie kroków wymaganych do przygotowania środowiskowej biblioteki DNA do sekwencjonowania, wykorzystania urządzenia do sekwencjonowania komórek przepływowych nanoporowych, oraz przeprowadzenie analizy wygenerowanych sekwencji DNA za pomocą oprogramowania systemowego i narzędzi bioinformatycznych National Center for Biotechnology Information (NCBI) do identyfikacji gatunków drobnoustrojów w glebie. Obecnie większość platform sekwencjonowania DNA wymaga znacznych inwestycji w szkolenia techniczne i złożone oprzyrządowanie, co nie jest wykonalne w środowiskach o ubogich zasobach lub w zastosowaniach terenowych. Platforma sekwencjonowania nanoporowego (NS) eliminuje te problemy dzięki ekonomicznemu, prostemu w użyciu protokołowi przygotowania biblioteki oraz przenośnemu urządzeniu do sekwencjonowania i analizowania różnych typów kwasów nukleinowych^1,3. Włączyliśmy platformę NS do kilku zajęć laboratoryjnych dla studentów studiów magisterskich.

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł wykazała szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów bakteryjnych i wirusowych^1,2,6, badania różnorodności biologicznej środowiska, monitorowanie bezpieczeństwa żywności, analiza genomiczna^3,5, oraz charakterystyka oporności bakterii na antybiotyki⁴. NS to szybka i dokładna metoda sekwencjonowania kwasów nukleinowych, która opiera się na zasadzie "sekwencjonowania nici" poprzez wykrywanie zakłóceń elektrycznych przez poszczególne zasady nukleotydowe, gdy jednoniciowy DNA przechodzi przez nanopory wprowadzone do naelektryzowanej syntetycznej membrany polimerowej. Etapy związane z przygotowaniem DNA do NS obejmują fragmentację genomu, naprawę końców i ogonowanie 3' dA fragmentów genomu, wyżarzanie adaptera i linki do DNA, oczyszczanie biblioteki DNA i ładowanie biblioteki do urządzenia z komórką przepływową nanoporów. Fragmentacja genomu na rozmiary ~8 kb odbywa się poprzez odwirowanie 1 - 2 μg genomowego DNA przez rurkę do fragmentacji g-tube. Rozdrobnione końce genomu są następnie naprawiane i ogoniaste za pomocą poly dA za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Jednoniciowe sekwencje adaptera, które są kompatybilne z białkiem motorycznym nanoporowym, są dodawane do końców DNA, które są używane do prowadzenia sekwencji DNA przez nanopory (Rysunek 1). Sekwencje uwięzi są wymagane do oczyszczania DNA i lokalizowania cząsteczek DNA w błonie porowej. Spinka do włosów jest generowana przez podwiązanie adaptera spinki do włosów na jednym końcu biblioteki ogoniastej dA. Struktury spinki do włosów na końcach DNA umożliwiają odczyt nici sensu i antysensu, gdy DNA przechodzi przez nanopory (Rysunek 2). Przygotowana biblioteka genomowa jest następnie oczyszczana z reakcji za pomocą kulek streptawidyny przy użyciu pola magnetycznego, a następnie ładowana jest próbka do komórki przepływowej nanoporów w celu analizy.

Zsekwencjonowane DNA jest oceniane pod kątem jakości, a odczyty sekwencjonowania, które są akceptowalne do analizy, są następnie poddawane kilku narzędziom bioinformatycznym w celu identyfikacji mikrobów. Sekwencje są "tłumaczone" na FASTQ z formatu FAST5. W formacie FASTQ sekwencje mogą być następnie wykorzystane w analizie BLAST.

Protokół

Uwaga: Metagenomiczne DNA jest oczyszczane z gleby (Hrabstwo Baltimore, Maryland) za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji genomu glebowego (zobacz Tabelę Materiałów). Przy użyciu spektrofotometru UV (patrz tabela materiałów) oczyszczone genomowe DNA powinno mieć stosunek 260/280 (nm) >1,8 i stosunek 260/230 między 2,0 - 2,2, aby zapewnić, że próbka jest wolna od zanieczyszczeń. Ilość genomowego DNA wymagana dla NS waha się od 200 ng do 2 μg.

1. Metoda szybkiego przygotowania biblioteki (krótki protokół)

UWAGA: To jest krótki protokół. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z zestawem do szybkiego sekwencjonowania.

1. Do cienkościennej probówki o pojemności 0,2 ml (patrz tabela materiałów) dodać 200 ng DNA o wysokiej masie cząsteczkowej do końcowej objętości 7,5 μl wody destylowanej.
2. Dodać 2,5 μl mieszanki do rozdrabniania (FM) z zestawu do szybkiego przygotowania biblioteki i delikatnie wymieszać przez odwrócenie. Wirówka pulsacyjna do odwirowania (1 000 x g przez 5 s).
3. Umieścić próbkę w termocyklerze (patrz tabela materiałów) na jeden cykl w temperaturze 30 °C przez 1 minutę, a następnie w temperaturze 75 °C przez 1 minutę. Wyjmij probówkę i wirówkę pulsacyjną, aby odwirować próbkę.
4. Dodać 1 μl szybkiego adaptera i 0,2 μl głównej mieszanki/TA ligazy, a następnie przechowywać dostosowaną i na uwięzi bibliotekę na ice.
   UWAGA: W przypadku korzystania z krótkiego protokołu przejdź do kroku 8

2. Protokół sekwencjonowania ligacji (długi protokół): metagenomiczna fragmentacja DNA

Uwaga: Zobacz Tabelę materiałów dla zestawu do sekwencjonowania podwiązania.

1. Rozcieńczyć 1 μg oczyszczonego genomowego DNA do końcowej objętości 46 μl w wodzie dejonizowanej.
2. Przenieść próbkę do probówki do fragmentacji DNA (patrz tabela materiałów) i wirować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej przy 8 000 x g za pomocą mikrowirówki (patrz tabela materiałów) w celu wytworzenia ~8 kb fragmentów genomu. Upewnij się, że cały płyn przeszedł do probówki zbiorczej.
3. Odwróć probówkę do fragmentacji, wróć do wirówki i wiruj przez 1 minutę, aby zebrać rozdrobnione genomowe DNA do dolnej komory.
4. Przenieś pofragmentowane genomowe DNA do sterylnej probówki o niskiej zawartości wiązania DNA o pojemności 1,5 ml i przeanalizuj porcję na niskoprocentowym żelu agarozowym (0,6%), aby potwierdzić fragmentację do >30 kb.

3. Przygotowanie końcowe rozdrobnionego genomowego DNA

1. Używając 800 ng rozdrobnionego genomowego DNA w 45 μl wody dejonizowanej, dodaj 7 μl buforu reakcyjnego do przygotowania końcówek (patrz tabela materiałów), 3 μl mieszanki enzymów (patrz tabela materiałów) i 5 μl wody wolnej od nukleaz.
2. Wymieszać za pomocą wirówki inwersyjnej i pulsacyjnej (1 000 x g przez 5 s).
3. Przenieść próbkę do cienkościennej probówki o pojemności 0,2 ml i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze 20 °C, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
4. Wirówka pulsacyjna, aby doprowadzić zawartość na dno probówki.
5. Przenieś próbkę do probówki wirówkowej o niskiej zawartości DNA o niskiej zawartości DNA.
6. Przygotuj koraliki magnetyczne (patrz tabela materiałów). Dodać 60 μl zawieszonych kulek do reakcji przygotowania końcowego z kroku 3.5 i wymieszać pipetując.
7. Inkubować na mieszalniku rotatorowym z prędkością 100 obr./min (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Pulsacyjnie odwiruj próbkę, aby osadzać kulki, a następnie umieść próbkę obok magnesu.
9. Gdy kulki przykleją się do magnesu, odpipetować supernatant i wyrzucić.
10. Wyjmij rurkę z magnesu i umyj kulki 200 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu, delikatnie pipetując próbkę w górę iw dół.
11. Wirówka pulsacyjna do granulowania kulek i powrotu do magnesu.
12. Usunąć supernatant i wyrzucić. Powtórz etap mycia ponownie, używając 200 μl 70% etanolu.
13. Pulsacyjnie odwiruj probówkę, wróć do magnesu i usuń całe 70% płukanie etanolem.
14. Przy otwartej pokrywie probówki do mikrowirówki pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
15. Wyjmij probówkę z magnesu i zawieś osad w 31 μl sterylnej, wolnej od nukleaz wody. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
16. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, aż wszystkie kulki pokryją się granulatem, a eluat będzie klarowny.
17. Przenieść eluat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Używając 1 μl próbki, oznacz ilościowo DNA z preparowaną końcówką za pomocą spektrofotometru UV o długości fali 260 nm (patrz tabela materiałów).
    Uwaga: Procent odzysku powinien wynosić ~70% (700 ng) od początkowego stężenia 1 μg genomowego DNA.

4. Dodatek adaptera i uwięzi do preparowanych fragmentów genomowego DNA

1. Wymieszaj wszystkie / główne probówki z ligazą TA przez odwrócenie, a następnie odwiruj impulsowo, aby sprowadzić zawartość na dno.
2. Używając 30 μl DNA przygotowanego na końcu, dodaj 20 μl mieszanki adaptera i 50 μl mieszanki głównej/TA ligacji.
3. Wymieszać przez inwersję, odwirować pulsacyjnie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

5. Przygotowanie do drukumagnetycznego

1. Zwiruj kulki, a następnie przenieś 50 μl zawieszonych kulek do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
2. Umieść rurkę na magnesie, aby granulować kulki, aż eluat się zniknie.
3. Usunąć supernatant i wyrzucić.
4. Dodać 100 μl bufora do wiązania kulek (patrz Tabela materiałów dla zestawu kulek) do kulek, przetrząsnąć w celu ponownego zawieszenia kulek, osadzać kulki na magnesie, usuwać supernatant i wyrzucać. Powtórzyć płukanie ze 100 μl buforu wiążącego.
5. Do umytych kulek dodać 100 μl buforu do wiązania perełek. Wir, aby ponownie zawiesić koraliki.

6. Oczyszczanie biblioteki

1. Za pomocą mikropipety P200 dodaj 40 μl kulek z poprzedniego etapu do przystosowanego/uwiązanego genomowego DNA. Ostrożnie wymieszać próbkę przez pipetowanie.
2. Inkubować próbkę na mieszalniku rotatorowym z prędkością 100 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Umieść próbkę na magnesie i pozwól, aby kulki opadły. Odpipetować supernatant i wyrzucić.
4. Zawiesić kulki w 140 μl buforu do wiązania kulek przez pipetowanie. Umieścić próbkę na magnesie, odrzucić supernatant i ponownie przemyć kolejnym 140 μl buforu do wiązania kulek.
5. Pulsacyjnie odwirować probówkę, umieścić probówkę na magnesie na 2 minuty. Usuń pozostały bufor wiążący kulki z granulki.

7. Eliminacja biblioteki z koralików magnetycznych

1. Zawiesić kulki magnetyczne w 15 μl buforu elucyjnego przez pipetowanie. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przyłóż rurkę do magnesu, aby granulować koraliki. Gdy roztwór się klaruje, usuń 15 μl eluatu i przenieś do probówki do mikrofugu o pojemności 1,5 ml, a następnie umieść próbkę na lodzie.
3. Określ ilościowo bibliotekę za pomocą spektrofotometru UV.
   UWAGA: Procentowy odzysk powinien wynosić ~25% (250 ng) od początkowego stężenia 1 μg genomowego DNA.

8. Rozpoczęcie biegu/Kontrola jakości

1. Wyjmij komorę przepływową z opakowania i podłącz ją do przenośnego sekwencera działającego w czasie rzeczywistym (patrz Tabela materiałów).
2. Podłącz sekwencer do komputera za pomocą USB i uruchom oprogramowanie do sekwencjonowania (patrz Tabela materiałów).
3. Kliknij "Połącz" urządzenie za pomocą oprogramowania do sekwencjonowania, wybierz "NC_Platform_QC.py" i kliknij "Start".
4. Kontrola jakości (QC) trwa około 6 - 7 minut; poszukaj "morza zieleni" (duże obszary wyjściowe) na odczycie kontroli jakości, aby potwierdzić, że jest wystarczająco dużo aktywnych porów (>800) do sekwencjonowania DNA.

9. Rozpoczynanie sekwencjonowania

1. Otwórz program do sekwencjonowania, a pojawi się okno dialogowe. W polu Identyfikator próbki nazwij przykład.
2. Kliknij pole "Identyfikator komórki przepływu" i wprowadź kod znajdujący się na naklejce w górnej części komórki przepływu.
3. Otwórz pokrywę komory przepływowej, a następnie przesuń pokrywę portu próbki w prawo (zgodnie z ruchem wskazówek zegara), tak aby port próbki był widoczny. Gdy port jest otwarty, sprawdź, czy nie ma małego bąbelka. Usuń kilka mikrolitrów buforu, w tym bańkę.
4. Upewnij się, że w poprzek tablicy czujników znajduje się bufor. Przygotować bufor zalewowy, mieszając 480 μl bieżącego buforu z mieszanką paliwową (RBF-1, patrz Tabela Materiałów) (należy pamiętać, aby najpierw dokładnie wymieszać) z 520 μl wody wolnej od nukleaz.
5. Dodać 800 μl buforu zasysającego do portu zasysającego. Ostrożnie podnieś pokrywę "SpotOn", aby była dostępna.
6. Po 5 minutach dodać dodatkowe 200 μl buforu zalewającego do portu zasysającego.

10. Wczytywanie biblioteki

1. Przed przygotowaniem biblioteki umieść na lodzie następujące odczynniki: RBF-1 (z zestawu do sekwencjonowania), bibliotekę przystosowaną i na uwięzi oraz koraliki do ładowania biblioteki (LLB; z zestawu do sekwencjonowania).
2. Do probówki wirówkowej o pojemności 0,2 ml dodaj 25,5 μl RBF i 12 μl wody wolnej od nukleaz utrzymywanej w temperaturze pokojowej.
3. Wymieszaj LLB, pipetując w górę i w dół. Dodaj 26,5 μl LLB do probówki 0,2 μl. Wymieszaj odczynniki, pipetując w górę i w dół.
   UWAGA: LLB ma tendencję do osiadania w mieszaninie.
4. Dodaj 11 μl dostosowanej i podłączonej biblioteki do probówki 0,2 μl. Wymieszać przez odwrócenie i odwirować przez wirowanie impulsowe.
5. Stopniowo dodawać 75 μl próbki z kroku 9.4 do portu "SpotOn". Upewnij się, że każda kropla wpływa do portu przed dodaniem następnej.
6. Ostrożnie załóż pokrywę portu próbki, tak aby korek wszedł do portu, i załóż pokrywę urządzenia.

11. Uruchamianie skryptu protokołu oprogramowania do sekwencjonowania

1. Otwórz menu rozwijane w sekcji "Wybierz program" i wybierz "Sekwencjonowanie 48-godzinne".
2. Kliknij przycisk "Wykonaj", aby uruchomić skrypt.
3. Sprawdź wyniki skanowania Mux zgłoszone w strumieniu powiadomień pod kątem liczby aktywnych porów w skanowaniu MUX.
   UWAGA: Liczba ta może różnić się od liczby porów w przebiegu kontroli jakości, a duża różnica może wskazywać na problem.
   1. Jeśli nastąpi znaczne zmniejszenie aktywnych porów w wyniku przebiegu kontroli jakości, uruchom ponownie oprogramowanie, a jeśli nadal występuje znacząca różnica, uruchom ponownie komputer.
4. Sprawdź, czy temperatura radiatora wynosi 34 °C, zgodnie z informacją podaną w skrypcie oprogramowania do sekwencjonowania.
   UWAGA: Jeśli temperatura nie wynosi 34 °C, nie będzie wystarczającej ilości aktywnych porów do biegu.
5. Sprawdź histogram długości odczytu, aby określić, czy długości sekwencji są oczekiwane i odpowiednie dla projektu eksperymentalnego.
6. Zamknij agenta pulpitu za pomocą polecenia "close x". Zamknij oprogramowanie do sekwencjonowania, zamykając graficzny interfejs użytkownika. Odłącz urządzenie od komputera.

12. Analiza przebiegu i wyników

Uwaga: Podczas sekwencjonowania, dane mogą być monitorowane za pomocą programu "WYŚWIETL RAPORT" za pomocą agenta na pulpicie. W trakcie lub po zakończeniu przebiegu pliki są dostępne w formacie pliku FAST5 w folderze danych → odczytuje → przebiegu (domyślnie). Jeśli ten folder jest otwarty, gdy sekwencjonowanie jest aktywne, komputer może się zawiesić.

1. Aby wyświetlić sekwencje i manipulować nimi, pobierz plik "HDFViewer" .
2. Aby wyświetlić pliki sekwencjonowania, otwórz bezpośrednio przeglądarkę HDF → otwórz folder Dane, → wybierz opcję Wszystkie typy plików → wybierz opcję Dysk C: (ustawienie domyślne) → wybierz pozycję Dane → wybierz pozycję odczyty → wybierz pozycję pass.
3. Znajdź i wybierz plik FASTQ w menu rozwijanym po lewej stronie; pliki otworzą się i można je zapisać w formacie FASTQ.
   UWAGA: Na potrzeby eksperymentu studenckiego wybrano sekwencje 350 nukleotydów lub dłuższe do dalszej analizy. Dane wyjściowe z wywołania podstawowego umożliwiają użytkownikowi sortowanie odczytów sekwencji na podstawie rozmiaru. Pliki FASTQ mogą być analizowane za pomocą BLAST (NCBI) lub innych programów bioinformatycznych.

Wyniki

Projekt eksperymentalny i technologia nanoporowa zapewniły szybką i niedrogą metodę sekwencjonowania DNA gleby dla studentów. Reprezentatywny przebieg analizy spełnił parametry kontroli jakości, z ponad 800 porami dostępnymi do sekwencjonowania. W wyniku przebiegu uzyskano ponad 125 000 odczytów dostępnych do badań, przy medianie długości sekwencji wynoszącej 5,38 kb. Sekwencje otrzymały ocenę jakości i analizowano tylko te, które uzyskały akceptowalne wyniki. Ponieważ produkt reakcji sekwencjonowania jest w formacie FAST5, który nie jest obsługiwany przez programy takie jak BLAST (NCBI), sekwencje przeglądano w przeglądarce HDF, która konwertuje sekwencje do formatu FASTQ, kompatybilnego z analizą BLAST. W przyszłych wersjach oprogramowania dane będą dostępne w formacie FASTQ, co wyeliminuje konieczność korzystania z przeglądarki HDF. Patrz Ryciny uzupełniające 1, 2 i 3.

Pięćdziesiąt sekwencji o długości ponad 350 nukleotydów poddano analizie za pomocą BLASTN (nukleotydy przeciwko bazie danych nukleotydów) lub BLASTX (nukleotydy przetłumaczone na sekwencję aminokwasów) (NCBI) w celu zidentyfikowania organizmów w próbce gleby. Biorąc pod uwagę ograniczenia czasowe zajęć oraz fakt, że głównym celem kursu są metody laboratoryjne, a nie bioinformatyka, studenci analizują sekwencje w ramach tych parametrów. Nasze zajęcia z bioinformatyki mogą wykorzystać te dane do opracowania narzędzi do analizy potokowej (pipeline analysis). Ten poziom analizy bioinformatycznej nie jest omawiany na zajęciach laboratoryjnych. Tabela 1 zawiera listę organizmów, które zostały zidentyfikowane przy wartościach e poniżej 4 e-04. Zazwyczaj wartości e mniejsze niż 4 e-04 wskazują na silne podobieństwo między sekwencją wejściową (zapytaniem) a sekwencją dopasowaną. Organizmy zidentyfikowane przez BLASTN (w odniesieniu do bazy nieredundantnej (nr)) pochodzą z szerokiej gamy gatunków i są dostępne do dalszych analiz genomicznych i białkowych. Ta próbka gleby, pobrana z ogrodu w hrabstwie Baltimore, MD, nigdy nie była badana, więc nie było wcześniejszych danych, na podstawie których można by określić, jakie organizmy mogą znajdować się w glebie. Analiza BLASTN (w odniesieniu do bazy nr) wykazała również obecność sekwencji nieposiadających podobieństw w bazie nr. Aby ustalić, czy są to rzeczywiście nowe sekwencje, konieczne są dalsze badania. Analiza kilku sekwencji za pomocą BLASTX ujawniła kilka białek z organizmów, które nie były reprezentowane w analizie BLASTN. Tabela 2 wymienia kilka potencjalnych białek, w tym endopeptydazy i białka podobne do ATPaz. Korzystając z tej biblioteki sekwencji, studenci mają możliwość zastosowania bardziej zaawansowanych narzędzi bioinformatycznych do przeprowadzenia dalszych analiz, jeśli zostaną tak skierowani przez instruktora.

Rycina 1: Przygotowanie biblioteki genomicznej. Kroki przygotowania biblioteki genomowego DNA do sekwencjonowania z wykorzystaniem technologii nanoporowej. Rycina została zmodyfikowana za zgodą właściciela praw autorskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2. Schemat sekwencjonowania DNA z użyciem nanoporu. DNA przechodzące przez membranę nanoporową z generowaniem sygnału elektrycznego i identyfikacją zasad. Rycina została zmodyfikowana za niezbędną zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Organizm	wartość e
Streptomyces sp..	3,00E-06
Nocardoides sp..	5,00E-04
Gordonia sp..	5,00E-04
Hyphomicrobium nitrativorens	1,00E-139
Starkeya novella	1,00E-31
Hyphomicrobium denitrificans	1,00E-30
Fibomicrobium sp..	5,00E-17
Pseudomonas sp..	2,00E-15
Rhodothemus marinus	1,00E-17
Turneiella parva	2,00E-24
*E. coli*	0,00E+00
Bradyrhizobium sp..	3,00E-30
Gemmatirosa kalamazoonesis	1,00E-20
Burkholderia sp..	8,00E-10
Sphingomonas sp..	8,00E-10
Cellumonas sp.	6,00E-11

Tabela 1: Wybrane wyniki analizy BLASTN.Sekwencje DNA z metagenomiki glebowej poddane poszukiwaniu podobieństwa BLASTN w nieredundantnej bazie nukleotydów NCBI. Przedstawione dane mają wartości e-value równe 4 x e-4 lub niższe.

Białko	Organizm
Białko hipotetyczne	Bakteria Acidobacter
Metylotransferaza zależna od SAM	H. denitrificans
ATPaza	Jannaschia sp.
Endopeptydaza	Shigella sonnei
Białko lizy	E. coli

Tabela 2: Wybrane wyniki analizy BLASTX. Sekwencje DNA z metagenomiki glebowej poddane analizie podobieństwa BLASTX w odniesieniu do nieredundancyjnej bazy białek NCBI.

Rycina dodatkowa 1: Wyniki kontroli jakości (QC) platformy. Przedstawiono wyniki kontroli jakości platformy. W prawym górnym rogu znajdują się wyniki QC dla aktywnych porów. Każdy kwadrant komórki przepływowej jest testowany pod kątem aktywnych porów. Strona główna jest dynamiczna i zmienia się w miarę testowania każdego kwadrantu. W tym przebiegu wykryto 1 414 pojedynczych porów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 2: Konwersja plików FAST5 na pliki FASTQ. Po prawej stronie przedstawiono dane wyjściowe z przebiegu sekwencjonowania. Każda linia reprezentuje pojedynczą sekwencję. Lewa strona ryciny pokazuje zaznaczoną sekwencję z prawej strony w przeglądarce HDF, która konwertuje sekwencję na plik FASTQ możliwy do wykorzystania w dalszych analizach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek dodatkowy 3: Przykład sekwencji FASTQ w przeglądarce HDF. Ta sekwencja (odczyt 803) znajduje się w pliku FASTQ, który konwertuje dane FAST5 na nukleotydy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Powstało wiele metod sekwencjonowania nowej generacji, z których każda zależy od sekwencjonowania przez syntezę, ale platformy wykrywania do identyfikacji nukleotydów różnią się. NS, najnowszy dodatek do rynku, wykorzystuje zupełnie inną metodę, która nie wymaga reakcji sekwencjonowania ani znakowanych nukleotydów. Metoda ta wykorzystuje różnicę ładunków już włączonych nukleotydów, gdy przechodzą one przez naelektryzowany por. Identyfikacja każdego nukleotydu odbywa się poprzez modulację prądu elektrycznego przez różne zasady przechodzące przez nanopory. Ten multipleksowany system pozwala użytkownikowi na sekwencjonowanie wielu fragmentów jednocześnie. Dzięki sekwencjonowaniu obu nici DNA dokładność sekwencji jest znacznie zwiększona, a oprogramowanie do sekwencjonowania, które można załadować na laptopa, przetwarza sygnały i dostarcza informacje o sekwencji, które można analizować.

W pirosekwencjonowaniu, metodzie sekwencjonowania przez syntezę (SBS), wykrywanie specyficznej zasady włączonej do matrycy zależy od testu lucyferazy i generowania sygnałów chemiluminescencyjnych⁸. W sekwencjonowaniu półprzewodników jonowych uwolniony jon wodorowy, który obniża pH, jest wykrywany przez czujnik jonowy⁹. Sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym zależy od falowodu w trybie zerowym (ZMW)¹⁰, który oświetla w celu wykrycia cząsteczkę fluorescencyjną znakowaną do wbudowanego nukleotydu. SBS wykorzystuje unikalną metodę amplifikacji docelowego DNA w taki sposób, że generowane są klastry unikalnych sekwencji¹³. Wykrywanie dodanego nukleotydu uzyskuje się, gdy rejestrowana jest fluorescencja znakowanego nukleotydu. Z drugiej strony NS ma wyjątkową przewagę nad innymi metodami, ponieważ wymaga ograniczonych zasobów technicznych, jest przenośny, generuje długie odczyty sekwencjonowania, nie wymaga wcześniejszej amplifikacji DNA i może być eksploatowany przy niższych kosztach w porównaniu z innymi metodami. Nasi studenci stwierdzili, że nowszy, szybki protokół przygotowania biblioteki jest prosty i można go dostosować do trzygodzinnych zajęć laboratoryjnych. Niektóre z problemów, które napotkaliśmy, to pęcherzyki w komórce przepływowej, które były trudne do usunięcia, wymagało to znacznej mocy komputera (jeden terabajt pamięci masowej), bieżące dane wyjściowe znajdują się w pliku FAST5, a komórka przepływu sekwencjonowania ma ograniczony okres trwałości, zanim ulegnie pogorszeniu. Ponadto innymi wadami protokołu sekwencjonowania ligacji NS (długi protokół) jest to, że wymaga on kilku etapów przygotowania biblioteki, wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie technik biologii molekularnej i generuje zmniejszoną wierność sekwencjonowania w porównaniu z niektórymi metodologiami sekwencjonowania³. Jednak ostatnie postępy w zakresie nowego zestawu do szybkiego przygotowania biblioteki wymagają tylko 10 minut na przygotowanie biblioteki i wykazały zmniejszony wskaźnik błędów sekwencjonowania. Nowa metoda przygotowania biblioteki była bardzo przydatna do zastosowania w klasie laboratoryjnej.

W protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, w szczególności w zakresie kontroli jakości komory przepływowej. Obejmuje to przeprowadzenie wstępnej kontroli jakości w ciągu pięciu dni od otrzymania komory przepływowej i użycie jej w ciągu 8 tygodni. Chociaż użyliśmy komórek przepływowych, które były dłuższe niż 8 tygodni, liczba otwartych/aktywnych porów jest znacznie zmniejszona. Ważne jest, aby eksperymenty były planowane w taki sposób, aby mieściły się w harmonogramie, w którym osiąga się maksymalne wykorzystanie komórek przepływowych. Zastosowaliśmy protokół czyszczenia i z powodzeniem ponownie wykorzystaliśmy komórki przepływowe.

Badania nad metagenomiką gleby stanowią niewykorzystany rezerwuar genetyczny różnorodności mikrobiologicznej. Na przykład szacuje się, że jeden gram gleby zawiera od 10⁷ do 10⁹ komórek prokariotycznych¹⁴. Ponadto organizmy glebowe są głównym źródłem nowych produktów naturalnych, enzymów i antybiotyków. W związku z tym analiza sekwencji DNA w metagenomice gleby stanowi cenne narzędzie instruktażowe dla uczniów na każdym poziomie edukacji. Łatwość użycia i niski koszt technologii NS sprawiają, że system ten jest bardzo skutecznym narzędziem dydaktycznym. Studenci potrafią sekwencjonować próbki środowiskowe, a po zakończeniu sekwencji korzystać z dostępnych narzędzi bioinformatycznych do identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów i sekwencji metagenomicznych w próbkach testowych. Korzystając z technologii NS, studenci mają prawdziwe praktyczne doświadczenie, które do tej pory było poza zasięgiem wykorzystania na kursach laboratoryjnych ze względu na zaawansowaną wiedzę techniczną i wysokie koszty odczynników, sprzętu i konserwacji na innych platformach sekwencjonowania. Niedawno jeden z naszych studentów (J. Harrison, komunikacja osobista) poinformował o zastosowaniu tej technologii w projekcie monitorowania środowiska gleb rolnych. Spodziewamy się, że zastosowań tej technologii w przestrzeni edukacyjnej będzie znacznie więcej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Thermal Cycler	LifeECO	BTC42096
Covaris g-TUBE	Covaris	520079
NEBNext End Repair Module	New England BioLab	E7546
Probówki wirówkowe Eppendorf LoBind	Sigma-Aldrich	Z666505
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix	New England BioLab	MO367
MyOne C1 Koraliki stropowidyny	Thermo Fisher	65001
Mikrowirówka Eppendorf Eppendorf			Model 5420
Spektrofotometr UV Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000	Model 2000
Wytrząsarka orbitalna Tancerka brzucha	Sigma-Aldrich	Z768499
Power Soil Zestaw do izolacji DNA	MO BIO	12888-50
Podwiązanie Zestaw do sekwencjonowania 2D	Oxford Nanopore	SQK-LSK208
Zestaw do szybkiego sekwencjonowania genomowego DNA	Oxford Nanopore	SQK-RAD002
Bufor reakcyjny do przygotowania końcowego i mieszanina enzymów (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)	New England BioLab	MO367
Kulki magnetyczne AmPure XP	Beckman Coulter	A63880
Podstawowy pakiet startowy	Nanopory oksfordzkie		Zawiera MinION  Urządzenie do sekwencjonowania i komórka
przepływowa Oprogramowanie MinKNOW	Oxford Nanopore
Zestaw do szybkiego sekwencjonowania genomowego DNA	Oxford Nanopore	SQK-RAD002	Zawiera bufor do pracy z paliwem (RBF), mieszankę fragmentacyjną (FRM), szybki adapter (RAD), bibliotekę kulek lokujących (LLB)