Ocena upośledzenia pamięci przestrzennej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu przy użyciu promienistego labiryntu z bieżnika wodnego

Summary

Tutaj prezentujemy protokół testu poznawczego specyficznego dla myszy, który nie wymaga pływania. Ten test może być wykorzystany do skutecznego odróżnienia kontrolowanych myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu wywołanym uderzeniem kory mózgowej od pozorowanych kontroli.

Abstract

Pomimo niedawnego wzrostu wykorzystania modeli mysich w badaniach naukowych, badacze nadal korzystają z zadań poznawczych, które zostały pierwotnie zaprojektowane i zatwierdzone do użytku na szczurach. Test labiryntu pamięci przestrzennej Radial Water Tread (RWT) (zaprojektowany specjalnie dla myszy i niewymagający pływania) wykazał wcześniej, że skutecznie odróżnia kontrolowane myszy TBI wywołane uderzeniem kory mózgowej od kontroli pozorowanych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół tego zadania. Labirynt RWT wykorzystuje naturalną tendencję myszy do unikania otwartych przestrzeni na rzecz przytulania się do boków aparatu (thigmotaxis). Ściany labiryntu są wyłożone dziewięcioma otworami ewakuacyjnymi umieszczonymi nad podłogą aparatu, a myszy są szkolone w używaniu wskazówek wizualnych do zlokalizowania otworu ewakuacyjnego, który prowadzi z labiryntu. Labirynt jest wypełniony calem zimnej wody, wystarczającej do zmotywowania do ucieczki, ale nie na tyle głębokiej, aby mysz musiała pływać. Okres akwizycji trwa tylko cztery dni treningowe, z testem zachowania pamięci w piątym dniu i testem pamięci długotrwałej w dniu 12. Przedstawione tutaj wyniki sugerują, że labirynt RWT jest wykonalną alternatywą dla zatwierdzonych na szczurach, opartych na pływaniu testów poznawczych w ocenie deficytów pamięci przestrzennej w mysich modelach TBI.

Introduction

Zaburzenia pamięci są jednymi z najczęstszych objawów zgłaszanych przez pacjentów po urazowym uszkodzeniu mózgu (TBI)^1,2. Dokładna identyfikacja i ocena analogicznych deficytów pamięci w zwierzęcych modelach TBI są zatem niezbędne do zrozumienia tego schorzenia i jego leczenia. W tym miejscu przedstawiamy protokół do testowania pamięci przestrzennej w mysim modelu TBI z wykorzystaniem labiryntu Radial Water Tread (RWT). Wcześniej wykazano, że aparat ten ocenia deficyty poznawcze w mysich modelach TBI³ i stanowi potencjalną alternatywę dla zatwierdzonych przez szczury, opartych na pływaniu testów poznawczych.

Rosnąca różnorodność i dostępność transgenicznych modeli myszy doprowadziła do niedawnego wzrostu wykorzystania myszy w stosunku do szczurów w badaniach naukowych⁴. Pomimo tej zmiany, naukowcy nadal polegają na zadaniach behawioralnych i poznawczych, które zostały pierwotnie zaprojektowane i zatwierdzone do użytku na szczurach. Najczęstsze testy używane obecnie do oceny funkcji poznawczych u myszy, labirynt wodny Morrisa (MWM) i labirynt kołowy Barnesa, zostały specjalnie zaprojektowane, aby wykorzystać instynktowne zachowania znalezione u szczurów^5,6. Biorąc pod uwagę różnice genetyczne, neuroetologiczne i poznawcze, które istnieją między tymi dwoma gatunkami⁴, nie jest zaskakujące, że myszy konsekwentnie nie radzą sobie z tymi zadaniami^7,8.

Zależne od gatunku różnice w zdolności testowania są szczególnie niepokojące w testach poznawczych opartych na pływaniu, takich jak MWM. Podczas gdy zarówno szczury, jak i myszy są biegłymi pływakami, naukowcy zidentyfikowali kilka szczepów myszy, które wyjątkowo słabo radzą sobie z zadaniami poznawczymi opartymi na pływaniu9^,10,11,12,13. Nawet u dzikich zwierząt szczury na ogół przewyższają myszy^7,8. Chociaż może to być interpretowane jako specyficzna dla gatunku różnica w pamięci przestrzennej, analogiczne testy uzupełniające z użyciem labiryntu na suchym lądzie nie wykazały żadnych zależnych od gatunku różnic w wydajności poznawczej⁸. Szereg czynników niezwiązanych z funkcjami poznawczymi może odpowiadać za to odkrycie, w tym zależne od gatunku różnice w zdolności pływania lub strategii wyszukiwania. Rzeczywiście, analiza czynnikowa strategii wyszukiwania specyficznych dla myszy w MWM pokazuje, że czynniki niekognitywne (w szczególności tigomotaksja i pasywność [tj. pływanie]) mogą odgrywać bardziej znaczącą rolę w wydajności MWM niż uczenie przestrzenne¹⁴.

Tutaj demonstrujemy użycie testu kognitywnego zaprojektowanego do wykorzystania instynktownego zachowania myszy, który nie wymaga pływania, do pomiaru upośledzenia pamięci przestrzennej w mysim modelu TBI wywołanego przez CCI. Podczas gdy labirynt RWT (Rysunek 1A-B) został pomyślany jako nowatorska hybryda okrągłego labiryntu MWM i Barnesa, został specjalnie zaprojektowany, aby wykorzystać instynktowne zachowanie tigmotraktyczne u myszy^15,16. Urządzenie składa się z ocynkowanej stalowej wanny o średnicy 32 cali, w której wywiercono dziewięć równomiernie rozmieszczonych otworów wyjściowych. Otwory są wyśrodkowane 2-1/4 cala nad podłogą wanny i są dobrane tak, aby pasowały do powszechnie dostępnych adapterów pułapek 1-1/2 cala ABS DWV SPG x SJ. Osiem wyjść jest zakrytych od zewnątrz i zaślepionych do głębokości 1 cala gumowymi korkami. Dziewiąty jest połączony kolankiem z akrylonitrylu i butadienu (ABS) pod kątem 90° z nieprzezroczystym plastikowym pudełkiem, z którego mysz można łatwo wyjąć po przetestowaniu. W ciągu krótkiego okresu akwizycji mysz jest szkolona w korzystaniu z unikalnych wskazówek wizualnych wyściełających labirynt, aby zlokalizować tę skrzynkę ucieczki. Podczas testów labirynt jest wypełniony calem zimnej wody (12-14 °C), wystarczająco awersyjnej, aby ułatwić ucieczkę, ale nie na tyle głębokiej, aby mysz musiała pływać.

Labirynt RWT stanowi tanią, łatwą w utrzymaniu alternatywę dla MWM i był z powodzeniem stosowany u starszych i transgenicznych myszy ^15,17,18,19, oraz mysie modele TBI³. Przedstawiony tutaj protokół stanowi prostą i skuteczną metodę pomiaru upośledzenia pamięci przestrzennej, która nie wymaga treningu przed urazem i może być łatwo zmodyfikowana w celu dostosowania do szczególnych potrzeb laboratorium badawczego.

Protocol

Wszystkie procedury i obchodzenie się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami wydanymi przez National Institutes of Health oraz przez University of Washington Animal Care and Use Committee.

1. Chirurgia

1. Znieczulić mysz 5% izofluranem w pudełku indukcyjnym do utraty przytomności. Potwierdź znieczulenie poprzez zmniejszenie częstości oddechów i brak odruchu wycofania po uszczypnięciu palca
.
2. Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy na poziomie 2-2,5% przez cały czas operacji. Monitoruj częstość oddechów przez cały czas operacji, aby upewnić się, że mysz pozostaje nieprzytomna.
3. Połóż mysz na poduszce grzewczej i umieść mysz w urządzeniu stereotaktycznym za pomocą pasków nausznych, upewniając się, że głowa jest bezpieczna i płaska.
4. Usuń włosy ze skóry głowy za pomocą kremu do depilacji. Dokładnie spłucz skórę głowy solą fizjologiczną.
5. Oczyść miejsce operacji naprzemiennym płukaniem jodem i 70% etanolem.
6. Podać podskórnie wstrzyknięcie lidokainy i bupiwakainy (1 mg/kg) w skórę głowy.
7. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj podłużne nacięcie linii środkowej i cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę.
8. Za pomocą piły trepanacyjnej 5 mm należy wykonać kraniotomię nad lewą korą czołowo-ciemieniową z punktem środkowym 2,5 mm za bregmą i 2,5 mm na lewo od linii środkowej. Ostrożnie usuń krąg kości, aby odsłonić mózg.
9. Ustawić urządzenie udarowe na prędkość 6 m/s i czas oczekiwania 200 ms.
10. Ustaw urządzenie udarowe tak, aby wypukła końcówka uderzeniowa o średnicy 3 mm lekko dotykała powierzchni mózgu w odległości 2,5 mm za bregmą i 2,55 mm na lewo od linii środkowej. Cofnąć końcówkę udarową i obniżyć o 1 mm (głębokość uderzenia). Gdy będziesz gotowy, odpal urządzenie, generując pożądany efekt.
11. Przykryj kraniotomię sterylnym krążkiem polipropylenowym przycementowanym do skóry właściwej za pomocą kleju tkankowego i zszyj nacięcie w zamknięciu.
12. Usunąć mysz ze znieczulenia i wstrzyknąć IP buprenorfinę (0,5 mg/kg).
13. Pozwól myszy dojść do siebie w czystej klatce, ogrzanej poduszką grzewczą. Mysz powinna być monitorowana pod kątem oznak bólu lub niepokoju przez następne 24 godziny
    UWAGA: Fikcyjne kontrole powinny być traktowane identycznie jak powyżej, z pominięciem kroków 1.8-1.9.

2. Konstrukcja labiryntu z radialnym bieżnikiem wodnym

1. Wywierć 9 otworów wyjściowych, wystarczająco dużych, aby pomieścić adaptery syfonu 1-1/2 cala ABS DWV SPG x SJ, w równych odstępach na obwodzie wanny ze stali ocynkowanej o średnicy 32 cali. Wyśrodkuj te otwory wyjściowe około 2-1/4 cala nad podłogą wanny.
2. Zamontuj adapter syfonu 1-1/2 cala ABS DWV SPG x SJ do każdego z otworów wyjściowych i zabezpiecz dołączonymi nakrętkami pierścieniowymi.
3. Za pomocą gumowych korków zakryj osiem z dziewięciu wyjść z zewnątrz aparatu. Ostatnie, niezamknięte wyjście będzie służyło jako droga ewakuacyjna. Nie ma znaczenia, które wyjście jest wyznaczone jako droga ewakuacyjna.
4. Przymocuj kolanko ABS 90° do zewnętrznego końca pozostałego wyjścia. Łuk pod kątem 90° służy do uniemożliwienia osobom testowym wizualnego określenia prawidłowej drogi ucieczki z wnętrza labiryntu.
5. Zbuduj skrzynkę ewakuacyjną z dowolnego nieprzezroczystego pudełka, które można zdezynfekować i ma wymiary około 30 cm x 15 cm x 15 cm. Wytnij otwór z boku skrzynki, bezpośrednio nad podłogą, wystarczająco duży, aby pomieścić kolanko ABS 90°.
6. Przymocuj skrzynkę ewakuacyjną do końcówki kolanka ABS 90°.
7. Lekko podnieś skrzynkę ewakuacyjną (mniej niż jeden cal) ponad powierzchnię podłogi. Pozwala to na umieszczenie pod skrzynką ewakuacyjną dużej ilości miejsca na elektryczną poduszkę grzewczą lub inne źródło ciepła.
8. Wydrukuj i zalaminuj co najmniej 5 unikalnych, wizualnych wskazówek. Używaj prostych obrazów o wysokim kontraście, które można łatwo dostrzec z wnętrza aparatu. Zalecane są czarno-białe kształty clipart (trójkąt, kwadrat, koło).
9. Za pomocą magnesów przyklej wskazówki wizualne do wewnętrznych ścianek aparatu. Wskazówki powinny znajdować się w mniej więcej równej odległości od siebie, na całym obwodzie aparatu.

3. Protokół labiryntu z promieniowym bieżnikiem wodnym

UWAGA: Badanie labiryntu wodnego powinno rozpocząć się dopiero po zagojeniu się miejsca operacji (około tygodnia po operacji).

1. Przygotowanie do testowania.
   1. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem testowania.
   2. Zdezynfekuj urządzenie za pomocą sprayu z 70% etanolem.
   3. Napełnij urządzenie około 1 calem zimnej (12-14 °C) wody.
   4. Umieść elektryczną poduszkę grzewczą lub inne źródło ciepła bezpośrednio pod skrzynką ewakuacyjną. Utrzymuj skrzynkę ewakuacyjną ciemną i ciepłą przez cały czas trwania testów.
   5. Umieść jasne źródło światła nad urządzeniem.
      UWAGA: W przypadku korzystania z lampy, która może być widoczna dla zwierząt badawczych z samego urządzenia, należy upewnić się, że lampa jest umieszczona w tej samej pozycji każdego dnia. Sama lampa może stanowić kolejną wizualną wskazówkę dla myszy, aby zlokalizować skrzynkę ucieczki, a drastyczne przesuwanie jej z dnia na dzień może skomplikować wyniki.
2. Protokół testowy
   1. Delikatnie wyjmij mysz z klatki za ogon i umieść na środku aparatu.
   2. Gdy tylko zwierzę znajdzie się w aparacie, rozpocznij odmierzanie czasu.
   3. Gdy zwierzę znajdzie właściwe wyjście i zlokalizuje/wejdzie do skrzynki ewakuacyjnej, przerwij odmierzanie czasu i zapisz liczbę sekund potrzebną do znalezienia właściwej ścieżki.
   4. Jeśli zwierzę spróbuje wspiąć się do końcowej i nie wejdzie spontanicznie ponownie do labiryntu po 10 sekundach, poprowadź zwierzę z powrotem do środka labiryntu ręcznie.
   5. Jeśli zwierzę nie znajdzie właściwej drogi do skrzynki ewakuacyjnej w ciągu 3 minut (180 s), zalicz próbę jako porażkę i zapisz jako 180 s. Ostrożnie poprowadź zwierzę na właściwą ścieżkę ręcznie.
   6. Pozwól myszy pozostać w skrzynce ewakuacyjnej przez 1 minutę przerwy między próbami.
   7. Po upływie 1 minuty odpoczynku wyjmij zwierzę z pudełka ucieczkowego i wróć do jego klatki domowej.
   8. Dokładnie zdezynfekuj skrzynkę ewakuacyjną i wyjścia za pomocą sprayu z 70% etanolem, aby zapobiec używaniu przez mysz wskazówek węchowych do zlokalizowania właściwej drogi ucieczki. Ten krok nie powinien zająć więcej niż kilka sekund.
   9. Przywróć mysz do labiryntu na następną próbę.
   10. Powtarzaj kroki 3.2.1-3.2.9, aż mysz ukończy w sumie trzy próby i trzy razy znajdzie lub zostanie doprowadzona do skrzynki ucieczki.
   11. Po ostatnim 1 minutowym odpoczynku przywróć mysz do jej klatki domowej.
   12. Opróżnij i wymień wodę w aparacie między zwierzętami, aby zapewnić stałą temperaturę przez cały czas trwania badania.
   13. Powtórz kroki 3.2.1-3.2.12 dla każdej testowanej myszy.
   14. Następnego dnia powtórzyć kroki przygotowania 3.2.1-3.2.5. Zachowaj szczególną ostrożność, aby wskazówki wizualne pozostały w spójnych pozycjach między dniami testowymi.
   15. Zwierzęta doświadczalne przy użyciu powyższego codziennego protokołu testowania przez trzy próby dziennie przez cztery dni (okres treningu), z końcowym trzypróbnym testem na zachowanie pamięci w piątym dniu. Szósty trzypróbny test (Zachowanie Pamięci Długotrwałej) może być przeprowadzony w dwunastym dniu.
   16. Nie wykonuj żadnych testów między piątym a dwunastym dniem testowania.
3. analiza
   1. Jeśli mysz nie ukończy labiryntu w czasie krótszym niż 180 s w ciągu dowolnych dwóch dni (tj. w sumie 6 kolejnych prób, wszystkie punktowane po 180 s), należy wziąć pod uwagę, że mysz nie jest wystarczająco zmotywowana warunkami testowymi i należy ją usunąć z analizy.
   2. Oblicz średnie opóźnienie, aby ukończyć labirynt dla każdego obiektu według daty testu, uśredniając ich trzy codzienne próby z tego dnia.
   3. Uzyskaj różnice grupowe w zachowaniu pamięci za pomocą standardowych testów t, aby porównać grupy w dniu testu piątego dnia i testu pamięci długotrwałej. Jeśli porównywane są więcej niż dwie grupy, należy zamiast tego zastosować jednoczynnikową ANOVA, po której następuje odpowiednia analiza post hoc (taka jak test Tukeya) w celu sprawdzenia uzyskanego znaczenia.
   4. Uzyskaj różnice grupowe w okresie akwizycji (dni 1-4) poprzez analizę wariancji powtarzanych pomiarów.

Results

Labirynt RWT (Rysunek 1) został wykorzystany do zbadania deficytów pamięci przestrzennej zależnych od urazów u myszy losowo przydzielonych do otrzymania kontrolowanego TBI wywołanego uderzeniem w korę mózgową lub pozorowanej operacji. Uraz powstał w wyniku elektromagnetycznego uderzenia korowego z wypukłą końcówką o średnicy 3 mm i następującymi parametrami urazu: prędkość uderzenia 6 m/s, głębokość penetracji 1 mm i czas kontaktu 200 ms. Myszy otrzymały testy poznawcz...

Discussion

Przedstawiony tutaj protokół labiryntu RWT z powodzeniem odróżnia myszy TBI indukowane przez CCI od pozorowanych kontroli i stanowi wykonalną, skoncentrowaną na myszy, alternatywę dla labiryntu kołowego MWM i Barnesa. Podczas gdy przedstawione tutaj wyniki mówią tylko o zastosowaniu labiryntu RWT w modelu myszy TBI, aparat ten był z powodzeniem stosowany w modelach starszych i transgenicznych, w których niezgodność spowodowana stresem wynikająca z testów opartych na pływaniu wykonanych przy użyciu MWM^by...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 gal. Okrągła wanna ze stali zanurzonej na gorąco	Home Depot	Internet #206638142	Potrzebne: 1
1-1 / 2 cala. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Depot	Internet #100344703, SKU sklepu #188956	Potrzebne: 9
1-3/4 cala x 1-7/16 cala. gumowy korek	Home Depot	Internet #100114974 Sklep SKU #755844	Potrzebne: 8
1-1 / 2 cala. ABS DWV 90 stopni Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Sklep SKU #188603	Potrzebne: 1
HDX 10 Gal. Torba do przechowywania	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Potrzebne: 1
uderzenie Jeden impaktor stereotaktyczny dla CCI	Leica Biosystems	39463920	Potrzebne: 1
noniusz stereotaktyczny z ręcznym instrumentem stereotaktycznym Fine Drive dla małych zwierząt	Leica Biosystems	39463001	Potrzebne: 1