Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55998

⸱

11 stycznia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Orthodontics, University of Connecticut Health Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia metody analizy zmian morfometrycznych i komórkowych w obrębie kłykcia żuchwy gryzoni.

Streszczenie

Staw skroniowo-żuchwowy (TMJ) ma zdolność adaptacji do bodźców zewnętrznych, a zmiany obciążenia mogą wpływać na położenie kłykci, jak również na strukturalne i komórkowe składniki chrząstki kłykciowej żuchwy (MCC). W tym manuskrypcie opisano metody analizy tych zmian oraz metodę zmiany obciążenia stawu skroniowo-żuchwowego u myszy (tj. kompresyjne statyczne obciążenie stawu skroniowo-żuchwowego). Przedstawiona tutaj ocena strukturalna jest prostym podejściem morfometrycznym, które wykorzystuje oprogramowanie Digimizer i jest wykonywane na zdjęciach rentgenowskich małych kości. Ponadto opisano analizę zmian komórkowych prowadzących do zmian w ekspresji kolagenu, przebudowie kości, podziale komórek i dystrybucji proteoglikanów w MCC. Wykazano również ilościowe oznaczanie tych zmian w przekrojach histologicznych - poprzez zliczanie dodatnich pikseli fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania do obrazowania oraz pomiar mapowania odległości i barwionego obszaru za pomocą Digimizera. Przedstawione tutaj metody nie ograniczają się do mysiego stawu skroniowo-żuchtniskowego, ale mogą być stosowane na dodatkowych kościach małych zwierząt doświadczalnych oraz w innych obszarach kostnienia śródchrzęstnego.

Wprowadzenie

Staw skroniowo-żuchwowy jest unikalnym stawem nośnym znajdującym się w okolicy twarzoczaszki i utworzonym z chrząstki włóknistej. MCC stawu skroniowo-żuchwowego jest niezbędny do funkcjonowania stawów, w tym nieskrępowanego ruchu żuchwy podczas mówienia i żucia, ale często dotykają go choroby zwyrodnieniowe, w tym choroba zwyrodnieniowa stawów1. Staw skroniowo-żuchwowy ma zdolność adaptacji do bodźców zewnętrznych i zmian obciążenia, co prowadzi do zmian strukturalnych i komórkowych w składnikach MCC2,3,4,5. Właściwości nośne MCC można wyjaśnić interakcjami między jego składnikami, w tym wodą, siecią kolagenową i gęsto upakowanymi proteoglikanami. MCC ma cztery odrębne strefy komórkowe, które wyrażają różne typy białek kolagenowych i niekolagenowych: 1) strefa powierzchowna lub stawowa; 2) strefa proliferacyjna, złożona z niezróżnicowanych komórek mezenchymalnych, która reaguje na zapotrzebowanie na obciążenie; 3) strefa przedprzeprzerosłaficzna, złożona z dojrzałych chondrocytów wykazujących ekspresję kolagenu typu 2; oraz 4) strefa przerostowa, region, w którym przerostowe chondrocyty wyrażające kolagen typu 10 umierają i ulegają zwapnieniu. Obszar niezmineralizowany jest bogaty w proteoglikany, które zapewniają odporność na siły ściskające6.

W strefie przerostowej MCC, gdzie następuje przejście od chondrogenezy do osteogenezy, następuje ciągła mineralizacja, gwarantując solidną strukturę mineralną kości podchrzęstnej kłykcia żuchwy7. Zmiany komórkowe w regionach niezmineralizowanych i zmineralizowanych ostatecznie prowadzą do zmian morfologicznych i strukturalnych w kłykciu żuchwy i żuchwie. Utrzymanie homeostazy wszystkich regionów komórkowych MCC i mineralizacja części podchrzęstnej są niezbędne dla zdrowia, nośności i integralności stawu skroniowo-żuchtwowego.

Model transgenicznej myszy z wieloma kolagenami (opisany przez Utreja et al.)8 jest doskonałym narzędziem do zrozumienia zmian w ekspresji kolagenu, ponieważ wszystkie transgeny ulegają ekspresji w MCC. W celu dogłębnej oceny histologicznej barwienia histologiczne stosuje się do badania osadzania się matrycy, mineralizacji, proliferacji komórek i apoptozy, a także ekspresji białek w różnych warstwach komórkowych MCC.

W tym manuskrypcie analizy histologiczne i morfometryczne są używane do oceny zmian komórkowych i strukturalnych w MCC i kości podchrzęstnej kłykcia żuchwy myszy. Ponadto opisano metodę kwantyfikacji komórek, służącą do analizy fluorescencyjnych obrazów histologicznych oraz do mapowania szkiełek mikroskopu świetlnego. Metoda kompresyjnego statycznego obciążenia stawu skroniowo-żuchwowego, która powoduje zmiany komórkowe i morfologiczne w MCC i kości podchrzęstnej9, jest również zilustrowana w celu walidacji naszych metod.

Opisane tutaj metody mogą być używane do określania zmian morfometrycznych i histologicznych w kłykciu żuchwy i żuchwie gryzoni lub do analizy innych regionów kostnienia śródchrzęstnego i morfologii dodatkowych zmineralizowanych tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Connecticut Health Center zatwierdził wszystkie procedury dotyczące zwierząt.

1. Statyczne obciążenie kompresyjne stawu skroniowo-żuchwowego: wymuszone otwarcie jamy ustnej

Uwaga: W eksperymentach opisanych w niniejszym manuskrypcie użyto czterotygodniowych myszy transgenicznych z reporterami fluorescencyjnymi dla kolagenu (Col2a1XCol10a1), udostępnionych przez dr. Davida Rowe (University of Connecticut) (n = 8; 4 samce i 4 samice). Transgen Col2a1 cyjanowy (niebieski) jest ekspresowany w komórkach strefy przedhipertroficznej MCC, natomiast komórki Col10a1 wiśniowe (czerwone) występują w obszarze hipertroficznym8 (Rysunek 1). Myszy podzielono w równych częściach na dwie grupy: 1) grupę obciążoną, w której myszy poddano statycznemu obciążeniu uciskowemu stawu skroniowo-żuchwowego (TMJ) (opisane w kroku 2) oraz 2) grupę kontrolną, w której myszy nie poddano żadnej interwencji.

Mikroskopia fluorescencyjna wyrostkażożka; markery Col10a1, Col2a1; analiza struktury tkanki.
Rysunek 1.Reprezentatywny przekrój strzałkowy kłykcia myszy z podwójnym fluorescencyjnym reporterem kolagenu (Col2a1XCol10a1). Skala = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Wykonaj sprężyny z drutów łukowych ze stopu beta-tytanu (0.017 x 0.025 in) (Rysunek 2A).
  2. Zanurz zwierzęta doświadczalne w znieczuleniu poprzez dostrzewną iniekcję mieszaniny ketaminy (90 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (13 mg/kg masy ciała).
  3. Delikatnie otwórz pyszczek myszy i wprowadź sprężyny, mocując pętle na siekaczach szczęki górnej i dolnej (Rysunek 2B i C).
  4. Wywołaj statyczne obciążenie kompresyjne stawu skroniowo-żuchwowego (TMJ), pozostawiając sprężyny na siekaczach znieczulonych myszy przez 1 h. Powtarzaj tę procedurę przez 5 dni.
  5. W celu analizy proliferacji komórek, wstrzyknij myszom dostrzewnie 5-etynyl-2'-deoksyurydynę (EdU; 30 mg/kg masy ciała) 2 dni oraz 1 dzień przed eutanazją.

Narzędzie badawcze w eksperymencie z użyciem rozwieraka stomatologicznego; przedstawiono schemat aparatu żuchwy szczura z obrazowaniem rentgenowskim.
Rycina 2. Statyczne obciążenie kompresyjne stawu skroniowo-żuchwowego: model z wymuszonym otwarciem jamy ustnej. (A) Sprężyna wykonana z drutu łukowego ze stopu beta-tytanu o przekroju 0,017 x 0,025. (B) Załadowano mysz ze sprężyną. (C) Radiografia myszy obciążonych i kontrolnych, wykazująca różnice w ułożeniu żuchwy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Disekcja i utrwalanie żuchwy

  1. Po zakończeniu procedur wymuszonego otwierania pyska poddać zwierzęta eksperymentalne eutanazji przy użyciu zatwierdzonej metody.
  2. Wypreparować żuchwy poprzez przecięcie przyczepów mięśniowych, unikając zdrapywania chrząstki wyrostka przyszykowatego.
  3. Umieścić oczyszczone żuchwy w 10% formalinie na 24 h w celu utrwalenia.
    Uwaga: Formalina jest substancją drażniącą; należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.

3. Obrazowanie rentgenowskie i pomiary morfometryczne

  1. Umieść żuchwy w płaskim pojemniku (np. szalce Petri 5 mm x 16 mm) i wykonaj radiografie próbek za pomocą szafowego systemu rentgenowskiego przy napięciu 26 kV przez 5 s.
    UWAGA: Przed zapisaniem obrazów umieść skalę.
  2. Wykonaj pomiary morfometryczne żuchew przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przed przystąpieniem do jakichkolwiek pomiarów użyj skali na radiografii, aby określić jednostkę. Krok ten jest istotny dla prawidłowego pomiaru struktur anatomicznych. Kliknij przycisk „Unit” (Rycina 3A).
  3. Wybierz punkty anatomiczne, korzystając z opcji „marker style 2” w oprogramowaniu do obrazowania (Rycina 3B). Aby zastosować metodę opisaną w niniejszej pracy, wybierz następujące punkty (Rycina 3B):
    1. Wybierz condylion (punkt 1), czyli najbardziej tylny punkt wyrostka stawowego żuchwy;
    2. Wybierz wyrostek sieczny (punkt 2);
    3. Wybierz najgłębszy punkt w wycięciu stawowym (punkt 3);
    4. Wybierz najgłębszy punkt wklęsłości gałęzi żuchwy (punkt 4);
    5. Wybierz najbardziej przedni punkt powierzchni stawowej wyrostka stawowego (punkt 5); oraz
    6. Wybierz najbardziej tylny punkt powierzchni stawowej wyrostka stawowego (punkt 6).
  4. Po wybraniu punktów anatomicznych wykonaj pomiary morfometryczne za pomocą narzędzia „length”, natomiast w przypadku długości głowy wyrostka stawowego użyj narzędzia „perpendicular line” od punktów (3) i (4) (Rycina 3C).
    1. Zmierz długość żuchwy, od condylion (1) do wyrostka siecznego (2).
    2. Zmierz długość głowy wyrostka stawowego – odległość prostopadłą od condylion (1) do linii prowadzonej od najgłębszego punktu w wycięciu stawowym (3) do najgłębszego punktu wklęsłości gałęzi żuchwy (4).
    3. Zmierz szerokość głowy wyrostka stawowego – odległość od najbardziej przedniego do najbardziej tylnego punktu powierzchni stawowej wyrostka stawowego (5 - 6).
    4. Skopiuj pomiary z „listy pomiarowej” (measurement list) znajdującej się po prawej stronie ekranu (Rycina 3C).

Analiza struktury kości w oprogramowaniu do obrazowania; schematy przedstawiające pomiary i adnotacje do badania.
Rysunek 3Przedstawienie pomiarów morfometrycznych żuchwy. (A) Należy użyć skali na radiogramie, aby wyznaczyć jednostkę (zakreśloną na czerwono, skala: 10 mm). (B) Wybierz punkty anatomiczne, korzystając z „marker style 2” (zaznaczonego czerwonym okręgiem). 1) Condylion; 2) Wyrostek siekaczy; 3) Najgłębszy punkt wycięcia sigmoidnego; 4) Najgłębszy punkt w wklęsłości gałęzi żuchwy; 5) Najbardziej przedni punkt powierzchni stawowej wyrostka kłykczastego; 6) Najbardziej tylny punkt powierzchni stawowej wyrostka kłykczastego. Pasek skali: 10 mm.(C) Wykonaj pomiary za pomocą narzędzi „length” (długość) i „perpendicular” (prostopadła) (zakreślonych na czerwono). Pomiary od punktu 1 do 2: długość żuchwy; od punktu 5 do 6: szerokość wyrostka kłapowatego; prostopadła od punktu 1 do 4–3: długość głowy wyrostka kłapowatego. Zapisz pomiary z „measurement list” (listy pomiarów). Pasek skali = 10 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

4. Zatapianie wyrostków

UWAGA: Po wykonaniu obrazów radiograficznych żuchwy można zatopić i pociąć w celu przeprowadzenia analizy histologicznej.

  1. Przed zatopieniem umieścić nieodwapione żuchwy (utrwalone w kroku 2.3) w 30% sacharozie w PBS na noc.
  2. Usunąć nadmiar tkanek miękkich i ostrożnie wyciąć wyrostek kątowy żuchwy.
  3. Nalać nieco żywicy do zatapiania (w ilości wystarczającej do przykrycia próbki) do jednorazowych form plastikowych i przyłożyć powierzchnię przyśrodkową wyrostka do podstawy formy, ustawiając próbkę równolegle do dna formy.
  4. Utrwalić okaz w odpowiednim miejscu za pomocą kawałka suchego lodu.
  5. Wypełnić formę żywicą do zatapiania i umieścić formę z utrwaloną próbką w zimnym 2-metylobutanie, który można schłodzić wcześniej w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C lub w suchym lodzie.
  6. Przechowywać okazy w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu wykonania sekcji.

5. Przecięcia strzałkowe wyrostka kątowego i przygotowanie preparatów

  1. Przygotować mrożone przekroje strzałkowe kłykcień (5 - 7 µm) i przenieść próbki na szkiełko, stosując metodę transferu taśmowego10,1.
  2. Przytwierdzić przekroje histologiczne przeniesione na taśmę, stosując metodę utwardzania promieniami UV10.

6. Barwienie histologiczne i obrazowanie mikroskopowe

Uwaga: Większość barwień histologicznych została wykonana zgodnie z opisem w sekcji histologicznej pracy Dyment et al10.

  1. W celu wykonania skanowania bazowego pierwszym krokiem jest obrazowanie transgenów Col2a1 i Col10a1, zgodnie z opisem Dyment et al10 .
    1. Nałóż szkiełka cover-glass na preparaty w 30% glicerolu i PBS. Wykonaj obrazowanie bazowe sekcji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i odpowiednich filtrów.
  2. Wykonaj fluorescencyjne barwienie na fosfatazę kwasową odporną na tartraniany (TRAP).
    UWAGA: TRAP jest eksprymowana przez komórki hematopoetyczne, w tym przez osteoklasty – komórki resorbujące kość12. Celem tego barwienia jest analiza MCC i przebudowy kości podchrzęstnej.
    1. Zdejmij szkiełka cover-glass z preparatów, namaczając je w PBS. Przemyj preparaty w PBS trzy razy przez 5 min każdy.
    2. Przygotuj bufor TRAP 1, rozpuszczając bezwodny octan sodu (9,2 g) i dwuwodniany wodorotartran sodu (1,4 g) w 1 L wody destylowanej. Dostosuj pH do wartości 4,2 za pomocą kwasu octowego i przechowuj bufor TRAP 1 w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj bufor TRAP 2 poprzez świeże rozpuszczenie azotynu sodu (40 mg) w 1 mL wody destylowanej.
    4. Przygotuj bufor podłoża TRAP (bezpośrednio przed barwieniem), mieszając 7,5 mL buforu 1 i 150 µL buforu 2. Nanieś ten roztwór (20 µL) na każdy preparat na 10 min w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotuj bufor reakcyjny TRAP, mieszając 1,840 mL buforu podłoża i 23 µL fluorescencyjnego substratu (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Fluorescencyjny substrat generuje żółty sygnał fluorescencyjny w miejscu aktywności TRAP.
    6. Usuń nadmiar buforu podłoża TRAP, delikatnie odsysając roztwór pipetą.
    7. Inkubuj preparaty z 20 µL buforu reakcyjnego TRAP przez 5 min pod żarnikiem lampy UV (światło czarne).
    8. Przemyj preparaty w PBS trzy razy przez 5 min każdy.
    9. Nałóż szkiełka cover-glass na preparaty w 30% glicerolu w PBS i wykonaj obrazowanie mikroskopowe10.
  3. Wykonaj barwienie proliferacji komórek.
    UWAGA: W tym teście zmodyfikowany analog tymidyny, 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU), zostaje wbudowany w nowo syntetyzowane DNA: dzielące się komórki są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym.
    1. Po obrazowaniu TRAP zdejmij szkiełka cover-glass i przemyj preparaty w PBS trzy razy przez 5 min każdy. Postępuj zgodnie z instrukcją zestawu do badania proliferacji komórek 5-etynylo-2'-deoksyurydyną, aby zabarwić sekcje histologiczne.
    2. Przygotuj koktajl reakcyjny, dodając 430 µL buforu reakcyjnego 1X, 20 µL CuSO4, 1,2 µL barwnika fluorescencyjnego oraz 50 µL dodatku do buforu 1X (całkowita objętość 50 µL jest wystarczająca dla jednego preparatu).
      UWAGA: Producent zaleca dodawanie składników w opisanej tutaj kolejności.
    3. Inkubuj preparaty z przygotowanymi koktajlami przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.
    4. Przemyj preparaty w PBS trzy razy przez 5 min każdy.
    5. Nałóż szkiełka cover-glass na preparaty w 30% glicerolu w PBS z DAPI w stosunku 1:1 0.
      UWAGA: DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) jest niebieskim fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym, który wiąże się z regionami bogatymi w AT w DNA.
  4. Wykonaj barwienie błękitem toluidynowym (TB).
    UWAGA: Barwienie TB ujawnia rozkład proteoglikanów w MCC.
    1. Opłucz preparaty w wodzie destylowanej, aby usunąć szkiełka cover-glass.
    2. Po zdjęciu szkiełek cover-glass przemyj preparaty w wodzie destylowanej trzy razy przez 5 min każdy, aby całkowicie usunąć sole z PBS.
    3. Przygotuj bufor roboczy TB, sporządzając roztwór A (rozpuść 28,4 g fosforanu sodu dwuzasadowego w 1 L wody destylowanej) i roztwór B (rozpuść 27,6 g fosforanu sodu jednazasadowego w 1 L wody destylowanej). Wymieszaj 94,7 mL roztworu A z 5,3 mL roztworu B. Rozcieńcz ten roztwór 1:1 w wodzie destylowanej, aby otrzymać 20 mL 0,1 M buforu roboczego. Skoryguj pH do 8,0, dodając wodorotlenek sodu, aż pH zostanie ustalone.
    4. Przygotuj 1% roztwór zapasu TB: wymieszaj 1 g TB w 10 mL wody destylowanej.
    5. Przygotuj roboczy roztwór TB, mieszając 40 mL 0,1 M buforu roboczego z 3 mL 1% roztworu zapasu TB.
    6. Inkubuj preparaty w roboczym roztworze TB przez 14–17 s.
      UWAGA: To barwienie jest bardzo wrażliwe na czas; czas inkubacji może wymagać dostosowania, aby zapobiec nadmiernemu zabarwieniu.
    7. Przemyj preparaty w wodzie destylowanej trzy razy przez 5 min każdy.
    8. Nałóż szkiełka cover-glass na preparaty w 30% glicerolu w wodzie destylowanej. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu świetlnego10.
      UWAGA: Nie nakładaj szkiełek cover-glass na preparaty barwione TB w glicerolu + PBS. PBS wypłukuje ten rodzaj barwnika.

7. Fluorescencyjna analiza ilościowa histologiczna

  1. Przeprowadź ilościową analizę histologiczną obrazów fluorescencyjnych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (patrz na Tabela materiałów).
    UWAGA: Podstawową zasadą ilościowej analizy histologicznej w tej metodzie jest podzielenie liczby fluorescencyjnych pikseli obszaru zainteresowania przez całkowitą liczbę pikseli tego obszaru i pomnożenie otrzymanego wyniku przez 10, co pozwala wyznaczyć procentowy udział pikseli pozytywnych w danym regionie.
  2. Przeprowadź kwantyfikację ekspresji Col10a1 w MCC w przekrojach strzałkowych wyrostków kostnych.
    1. Podczas ilościowego oznaczania wszystkich typów komórek i barwień za pomocą tej metody, należy wybrać obszar poddawany analizie. Otwórz obrazy histologiczne w oprogramowaniu do analizy obrazu i zaznacz wybrany obszar, korzystając z „Narzędzia Lasso (L)” (Rysunek 4A). Do analizy opisanej w niniejszym tekście należy wybrać wyłącznie obszar MCC; po zaznaczeniu obszaru całkowita liczba pikseli zostanie wyświetlona w polu „Histogram” na ekranie oprogramowania (Rysunek 4A). Zapisz liczbę pikseli w obszarze zainteresowania.
    2. Wybierz czerwone piksele Col10a1 za pomocą narzędzia próbkowania. Kliknij „Select” (Zaznacz) na górnym panelu, a następnie „Color Range” (Zakres kolorów). Kliknij „narzędzie pipety”, wybierz próbkę koloru interesującego piksela na obrazie i kliknij „OK”. Wszystkie obszary wykazujące obecność wybranego koloru piksela zostaną zaznaczone (Rycina 4B). Skopiuj liczbę fluorescencyjnych pikseli (wyświetloną w polu „Histogram” na ekranie) i wklej ją do arkusza kalkulacyjnego lub programu statystycznego w celu przeprowadzenia analizy.
    3. Podziel liczbę fluorescencyjnych pikseli przez liczbę pikseli w obszarze zainteresowania, a następnie pomnóż otrzymany wynik przez 10: piksele fluorescencyjne / piksele w obszarze zainteresowania * 10.
      UWAGA: Inne typy komórek, takie jak niebieskie Col2a1, mogą być ilościowane tą samą metodą, jednak zamiast czerwonych pikseli Col10a1 należy wybrać piksele niebieskie.

Analiza obrazów mikroskopowych, regulacja histogramu, kanały kolorów, przetwarzanie danych naukowych.
Rysunek 4Reprezentacja ilościowego oznaczenia transgenu Col10a1. (A) Wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia „Lasso Tool” (L). W przypadku komórek wykazujących ekspresję Col10a1 zaznacz całą chrząstkę żuchwy. Zapisz liczbę pikseli z okna „histogram”. (B) Wybierz interesujące piksele, w tym przypadku czerwone fluorescencyjne piksele Col10a1. Należy pamiętać, że zostaną wybrane tylko czerwone piksele w obrębie obszaru zainteresowania. Zapisz liczbę czerwonych pikseli z okna „histogram”. Pasek skali = 200 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przeprowadź ilościową ocenę aktywności TRAP w MCC i kości podchrzestnej.
    1. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 8.2, ale zamiast wybierać tylko obszar MCC, zaznacz regiony chrząstki i kości podchrzestnej (Rysunek 5A).
    2. Aby przeanalizować aktywność TRAP, zaznacz żółte piksele wygenerowane przez substrat ELF97, zgodnie z opisem w kroku 8.2.2 (Rysunek 5B); skopiuj liczbę dodatnich pikseli, a następnie wklej je do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego w celu analizy.
    3. Oblicz procent pikseli TRAP-dodatnich, dzieląc liczbę żółtych pikseli przez całkowitą liczbę pikseli w regionie kości podchrzestnej i mnożąc wynik przez 10.

Analiza mikroskopowa z zastosowaniem fluorescencji; obrazy z histogramami; porównanie intensywności struktur komórkowych.
Rysunek 5Przedstawienie ilościowego oznaczenia fluorescencyjnego TRAP. (A) Wybierz obszar zainteresowania (chrząstkę żuchwy i kość podchrzęstną), a następnie zapisz liczbę pikseli w tym regionie. (B) Wybierz żółte fluorescencyjne piksele reprezentujące aktywność TRAP. Należy pamiętać, że wybrane zostaną tylko piksele pozytywne pod kątem TRAP. Zapisz liczbę wybranych pikseli. Pasek skali = 200 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Przeprowadź ilościowe oznaczenie komórek EdU-dodatnich.
    1. Preparaty barwione EdU poddano przeciwbarwieniu DAPI, dlatego zamiast zliczać całkowitą liczbę pikseli w obszarze zainteresowania, należy wybrać piksele DAPI-dodatnie, aby obliczyć procent pikseli EdU-dodatnich. Wyznacz obszar zainteresowania zgodnie z opisem w kroku 8.2, ale nie zapisuj całkowitej liczby pikseli. Wybierz niebieski piksel DAPI jako kolor próbkowania, zgodnie z opisem w kroku 8.2.2; skopiuj liczbę pikseli DAPI-dodatnich (Rysunek 6A) i wklej ją do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego w celu analizy.
    2. Następnie wybierz piksele EdU-dodatnie (żółte piksele fluorescencyjne) i zapisz liczbę pikseli w polu „histogram” (Rysunek 6B).
    3. Oblicz procent pikseli EdU, dzieląc liczbę pikseli EdU-dodatnich przez liczbę pikseli DAPI-dodatnich i mnożąc otrzymany wynik przez 10.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; niebieskie barwienie jąder komórkowych, żółta ekspresja białka; oprogramowanie analityczne.
Rycina 6Przedstawienie ilościowego oznaczenia EdU. (A) Wybierz obszar proliferacyjny MCC (zewnętrzną warstwę chrząstki). Wybierz piksele wybarwione DAPI i zapisz liczbę pikseli. (B) Wybierz piksele pozytywne pod kątem EdU (żółta fluorescencja) i zapisz liczbę pikseli. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

8. Ilościowe określanie grubości chrząstki i rozkładu proteoglikanów

  1. Przeanalizuj grubość chrząstki (mapowanie odległości) oraz obszar barwiony błękitem toluidyny za pomocą oprogramowania Digimizer Image.
    UWAGA: Użyj paska skali na obrazie histologicznym, aby określić jednostkę (Rysunek 7A).
  2. Wykonaj pomiar mapowania odległości.
    UWAGA: Pomiar mapowania odległości pozwoli określić grubość chrząstki w wyrostku przysuwniczym żuchwy. W opisanej tutaj metodzie wybiera się pięć obszarów MCC, co pozwala uzyskać średnią całkowitej grubości MCC. Badacz może zdecydować się na pomiar w trzech różnych obszarach lub nawet w jednym pojedynczym obszarze w środku MCC.
    1. Używając narzędzia „length” (długość), zmierz długość chrząstki od powierzchni zewnętrznej do końca obszaru barwionego błękitem toluidyny (Rysunek 7B) w pięciu obszarach lub w dowolnej liczbie preferowanych lokalizacji.
    2. Skopiuj pomiary długości z „measurement list” (listy pomiarów).
      UWAGA: Oprogramowanie dostarcza również średnią z pomiarów (Rysunek 7B).
  3. Zmierz obszar barwiony błękitem toluidyny.
    UWAGA: Pomiar obszaru barwionego błękitem toluidyny pozwoli uzyskać powierzchnię proteoglikanów w MCC.
    1. Wybierz narzędzie „area” (obszar) i obrysuj obszar barwiony błękitem toluidyny (Rysunek 7C).
    2. Skopiuj pomiary obszaru z „measurement list” (listy pomiarów).

Analiza histologiczna przekrojów tkankowych; obraz mikroskopowy; analiza struktury komórkowej do celów badawczych.
Rysunek 7Przedstawienie ilościowego oznaczenia rozkładu proteoglikanów. (A) Użyj paska skali na obrazie histologicznym, aby określić jednostkę, klikając przycisk „unit” (obwiedziony czerwonym kółkiem, wybrana jednostka: 500 µm). (B) Zmierz grubość chrząstki w różnych miejscach, korzystając z narzędzia „length” (zaznaczonego czerwoną obwódką). Zapisz wyniki pomiarów z „measurement list” w prawym górnym panelu. Oprogramowanie wyświetla również „statistics” w prawym dolnym panelu, co pozwala na bezpośrednie uzyskanie średniej oraz odchylenia standardowego (SD) z przeprowadzonych pomiarów. (C) Zmierz obszar zabarwiony błękitem toluidyny, korzystając z narzędzia „area” (zakreślonego na czerwono). Obrysuj interesujący obszar i zapisz pomiar z listy pomiarów („measurement list”). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono analizę statystyki opisowej w celu zbadania rozkładu pomiarów morfometrycznych (długość żuchwy, długość wyrostkażłazowego, szerokość wyrostkażłazowego) oraz analiz histologicznych. Wyniki porównano pomiędzy grupą obciążoną (t.j. myszami poddanymi obciążeniu kompresyjnemu za pomocą sprężyny z beta-tytanu) a grupą kontrolną (t.j. dobranymi myszami kontrolnymi, które nie przeszły żadnego zabiegu). Statystycznie istotne różnice między średnimi określono za pom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy opisano metody pomiaru morfometrycznego i analizy komórkowej mysich kłykci żuchwy i żuchwy. Radiograficzne pomiary morfometryczne mogą być również wykorzystywane do analizy innych kości małych zwierząt doświadczalnych. Ponadto analiza komórkowa (kwantyfikacja komórek i mapowanie odległości chrząstki) nie ogranicza się do kłykcia żuchwy gryzonia, ale może być stosowana do ilościowego określania przekrojów histologicznych wielu tkanek.

Transgeniczne modele myszy z ekspresją reporterów f...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Davidowi Rowe za uprzejme dostarczenie transgenicznych myszy oraz Li Chenowi za pomoc histologiczną.

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Dental & Craniofacial Research of the National Institutes of Health pod numerem nagrody K08DE025914 oraz przez American Association of Orthodontic Foundation dla Sumit Yadav.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System radiograficzny MX20Faxitron X-Ray LLC 
Oprogramowanie Digimizer Image MedCalc
Żywica do zatapiania Shandon CryomatrixThermo Scientific6769006
Mikroskop ręczny Axio Imager Z1Carl Zeiss208562
żółte fluorescencyjne filtry białkowe  - FiltrChroma Technology Corp49003
- ECFPChroma Technology Corp49001
filtr białkowy czerwony fluorescencyjny - Cy5Chroma Technology Corp49009
octan sodu bezwodnySigma-AldrichS2889
dwuwodny winian sodu Sigma-Aldrich228729
azotyn sodu Podłoże Sigma-Aldrich237213
ELF97Thermo Fisher ScientificE6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCSkit Life TechnologiesC10339 zawiera EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydynę) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek)Thermo ScientificD1306
Fosforan sodu dwuzasadowy Sigma-AldrichS3264
Fosforan sodu jednozasadowy Sigma-Aldrich71505
Błękit toluidynowy O Sigma-AldrichT3260
Adobe Photoshop Adobe Systems Incorporated
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami (PBS)Research Products InternationalP32080-100T
CNA Beta III Bezniklowy łukOrtho Organizers, Inc.
Pryzmat GraphPad Oprogramowanie GraphPad, Inc.
Oprogramowanie białka cyjanowego EYFP

Bibliografia

  1. LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
  2. Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
  3. Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
  4. Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
  5. Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599(2016).
  6. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
  7. Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
  8. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  9. Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).
  10. Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468(2016).
  11. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
  12. Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza wyrostka stawowego uchwypomiary morfometryczneanaliza histologicznaobci enie uciskowe stawu skroniowo uchwowegoekspresja Col10a1ilo ciowe oznaczenie aktywno ci TRAPbarwienie EDUrozk ad proteoglikan woprogramowanie Digimizeranaliza radiograficzna
Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.