Method Article

Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy

DOI:

10.3791/55998

⸱

January 11th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Orthodontics, University of Connecticut Health Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt przedstawia metody analizy zmian morfometrycznych i komórkowych w obrębie kłykcia żuchwy gryzoni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staw skroniowo-żuchwowy (TMJ) ma zdolność adaptacji do bodźców zewnętrznych, a zmiany obciążenia mogą wpływać na położenie kłykci, jak również na strukturalne i komórkowe składniki chrząstki kłykciowej żuchwy (MCC). W tym manuskrypcie opisano metody analizy tych zmian oraz metodę zmiany obciążenia stawu skroniowo-żuchwowego u myszy (tj. kompresyjne statyczne obciążenie stawu skroniowo-żuchwowego). Przedstawiona tutaj ocena strukturalna jest prostym podejściem morfometrycznym, które wykorzystuje oprogramowanie Digimizer i jest wykonywane na zdjęciach rentgenowskich małych kości. Ponadto opisano analizę zmian komórkowych prowadzących do zmian w ekspresji kolagenu, przebudowie kości, podziale komórek i dystrybucji proteoglikanów w MCC. Wykazano również ilościowe oznaczanie tych zmian w przekrojach histologicznych - poprzez zliczanie dodatnich pikseli fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania do obrazowania oraz pomiar mapowania odległości i barwionego obszaru za pomocą Digimizera. Przedstawione tutaj metody nie ograniczają się do mysiego stawu skroniowo-żuchtniskowego, ale mogą być stosowane na dodatkowych kościach małych zwierząt doświadczalnych oraz w innych obszarach kostnienia śródchrzęstnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staw skroniowo-żuchwowy jest unikalnym stawem nośnym znajdującym się w okolicy twarzoczaszki i utworzonym z chrząstki włóknistej. MCC stawu skroniowo-żuchwowego jest niezbędny do funkcjonowania stawów, w tym nieskrępowanego ruchu żuchwy podczas mówienia i żucia, ale często dotykają go choroby zwyrodnieniowe, w tym choroba zwyrodnieniowa stawów1. Staw skroniowo-żuchwowy ma zdolność adaptacji do bodźców zewnętrznych i zmian obciążenia, co prowadzi do zmian strukturalnych i komórkowych w składnikach MCC2,3,4,5. Właściwości nośne MCC można wyjaśnić interakcjami między jego składnikami, w tym wodą, siecią kolagenową i gęsto upakowanymi proteoglikanami. MCC ma cztery odrębne strefy komórkowe, które wyrażają różne typy białek kolagenowych i niekolagenowych: 1) strefa powierzchowna lub stawowa; 2) strefa proliferacyjna, złożona z niezróżnicowanych komórek mezenchymalnych, która reaguje na zapotrzebowanie na obciążenie; 3) strefa przedprzeprzerosłaficzna, złożona z dojrzałych chondrocytów wykazujących ekspresję kolagenu typu 2; oraz 4) strefa przerostowa, region, w którym przerostowe chondrocyty wyrażające kolagen typu 10 umierają i ulegają zwapnieniu. Obszar niezmineralizowany jest bogaty w proteoglikany, które zapewniają odporność na siły ściskające6.

W strefie przerostowej MCC, gdzie następuje przejście od chondrogenezy do osteogenezy, następuje ciągła mineralizacja, gwarantując solidną strukturę mineralną kości podchrzęstnej kłykcia żuchwy7. Zmiany komórkowe w regionach niezmineralizowanych i zmineralizowanych ostatecznie prowadzą do zmian morfologicznych i strukturalnych w kłykciu żuchwy i żuchwie. Utrzymanie homeostazy wszystkich regionów komórkowych MCC i mineralizacja części podchrzęstnej są niezbędne dla zdrowia, nośności i integralności stawu skroniowo-żuchtwowego.

Model transgenicznej myszy z wieloma kolagenami (opisany przez Utreja et al.)8 jest doskonałym narzędziem do zrozumienia zmian w ekspresji kolagenu, ponieważ wszystkie transgeny ulegają ekspresji w MCC. W celu dogłębnej oceny histologicznej barwienia histologiczne stosuje się do badania osadzania się matrycy, mineralizacji, proliferacji komórek i apoptozy, a także ekspresji białek w różnych warstwach komórkowych MCC.

W tym manuskrypcie analizy histologiczne i morfometryczne są używane do oceny zmian komórkowych i strukturalnych w MCC i kości podchrzęstnej kłykcia żuchwy myszy. Ponadto opisano metodę kwantyfikacji komórek, służącą do analizy fluorescencyjnych obrazów histologicznych oraz do mapowania szkiełek mikroskopu świetlnego. Metoda kompresyjnego statycznego obciążenia stawu skroniowo-żuchwowego, która powoduje zmiany komórkowe i morfologiczne w MCC i kości podchrzęstnej9, jest również zilustrowana w celu walidacji naszych metod.

Opisane tutaj metody mogą być używane do określania zmian morfometrycznych i histologicznych w kłykciu żuchwy i żuchwie gryzoni lub do analizy innych regionów kostnienia śródchrzęstnego i morfologii dodatkowych zmineralizowanych tkanek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami Centrum Zdrowia Uniwersytetu Connecticut zatwierdził wszystkie procedury na zwierzętach.

1. Kompresyjne statyczne obciążenie stawu skroniowo-żuchwowego: usta wymuszone

Uwaga: Czterotygodniowe transgeniczne myszy wyposażone w fluorescencyjne reportery kolagenu (Col2a1XCol10a1), uprzejmie dostarczone przez dr Davida Rowe'a (University of Connecticut), zostały użyte do eksperymentów opisanych w tym manuskrypcie (n = 8; 4 samce i 4 samice). Cyjanowy (niebieski) transgen Col2a1 ulega ekspresji w komórkach w strefie przedhipertroficznej MCC, podczas gdy komórki wiśni Col10a1 (czerwone) są obecne w regionie przerostowym8 (Rysunek 1). Myszy podzielono równo na dwie grupy: 1) grupę obciążoną, w której myszy poddano kompresyjnemu statycznemu obciążeniu stawu skroniowo-żuchwowego (opisanemu w kroku 2) i 2) grupę kontrolną, w której myszy nie otrzymały żadnej interwencji.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Reprezentatywny strzałkowy kłykcia fluorescencyjnej myszy reporterowej z podwójnym kolagenem (Col2a1XCol10a1). Podziałka liniowa = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wyprodukuj sprężyny przy użyciu łuków ze stopu tytanu beta (0,017 x 0,025 cala) (Rysunek 2A).
  2. Znieczulić zwierzęta doświadczalne poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (90 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (13 mg/kg masy ciała).
  3. Delikatnie otwórz pysk myszy i włóż sprężyny, zaczepiając pętle w siekaczach szczęki i żuchwy (Rysunek 2B i C).
  4. Wywołaj kompresyjne obciążenie statyczne stawu skroniowo-żuchwowego, utrzymując sprężyny w siekaczach znieczulonych myszy przez 1 godzinę. Powtarzaj tę procedurę przez 5 dni.
  5. Wstrzyknąć myszom 5-etnylo-2'-deoksyurydynę (EdU; 30 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo w celu analizy proliferacji komórek 2 dni i 1 dzień przed eutanazją.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Ściskające statyczne obciążenie stawu skroniowo-żuchwowego: model wymuszonego otwarcia ust. (A) Sprężyna wykonana z łuku ze stopu tytanu beta o wymiarach 0,017 x 0,025. (B) Załadowana mysz ze sprężyną. (C) Zdjęcie rentgenowskie myszy obciążonych i kontrolnych wykazujące różnice w ustawieniu żuchwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Rozwarstwienie i unieruchomienie żuchwy

  1. Po zakończeniu procedur wymuszonego otwarcia ust poddać zwierzęta doświadczalne eutanazji zatwierdzoną metodą.
  2. Wypreparuj żuchwy, przecinając przyczep mięśniowy bez skrobania chrząstki kłykcia.
  3. Oczyszczone żuchwy umieścić w 10% formalinie na 24 godziny w celu utrwalenia.
    Uwaga: Formalina jest drażniąca; Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

3. Obrazowanie rentgenowskie i pomiary morfometryczne

  1. Umieścić żuchwy w płaskim pojemniku (np. szalce Petriego o wymiarach 55 mm x 16 mm) i wykonać zdjęcia rentgenowskie próbek za pomocą systemu rentgenowskiego w szafie pomiarowej pod napięciem 26 kV przez 5 s.
    UWAGA: Umieść pasek skali przed zapisaniem obrazów.
  2. Wykonaj pomiary morfometryczne żuchwy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów użyj skali na zdjęciu rentgenowskim, aby określić jednostkę. Ten krok jest ważny, aby prawidłowo zmierzyć struktury anatomiczne. Kliknij przycisk "Jednostka" (Rysunek 3A).
  3. Wybierz punkty anatomiczne za pomocą "stylu znacznika 2" w oprogramowaniu do obrazowania (Rysunek 3B). Aby postępować zgodnie z metodą opisaną w tym artykule, wybierz następujące punkty (Rysunek 3B):
    1. Wybierz kłykieć (punkt 1), najbardziej wysunięty do tyłu punkt kłykcia żuchwy;
    2. Wybierz wyrostek siekaczowy (punkt 2);
    3. Wybierz najgłębszy punkt w wycięciu esicy (punkt 3);
    4. Wybierz najgłębszy punkt we wklęsłości ramienia żuchwy (punkt 4);
    5. Wybrać najbardziej wysunięty do przodu punkt powierzchni stawowej kłykcia (punkt 5); oraz
    6. Wybierz najbardziej wysunięty do tyłu punkt powierzchni stawowej kłykcia (punkt 6).
  4. Po wybraniu punktów anatomicznych wykonaj pomiary morfometryczne za pomocą narzędzia "długość", natomiast dla długości głowy kłykcia użyj narzędzia "linia prostopadła" z punktów (3) i (4) (Rysunek 3C).
    1. Zmierz długość żuchwy, od kłykcia (1) do wyrostka siekacza (2).
    2. Zmierz długość główki kłykcia - prostopadłą odległość od kłykcia (1) do linii przebiegającej od najgłębszego punktu w wycięciu esicy (3) do najgłębszego punktu we wklęsłości ramienia żuchwy (4).
    3. Zmierz szerokość głowy kłykcia - odległość od najbardziej przedniego do najbardziej tylnego punktu powierzchni stawowej kłykcia (5 - 6).
    4. Skopiuj pomiary z "listy pomiarów" po prawej stronie ekranu (Rysunek 3C).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przedstawienie pomiarów morfometrycznych żuchwy. (A) Użyj podziałki na zdjęciu rentgenowskim, aby określić jednostkę (zakreślone na czerwono, podziałka skali: 10 mm). (B) Wybierz punkty anatomiczne za pomocą "stylu znacznika 2" (zakreślonego na czerwono). 1) Kłykcina; 2) Proces siekający; 3) Najgłębszy punkt w wycięciu esicy; 4) Najgłębszy punkt we wklęsłości ramusa żuchwy; 5) Najbardziej wysunięty punkt powierzchni stawowej kłykcia; 6) Najbardziej tylny punkt powierzchni stawowej kłykcia. Podziałka: 10 mm.(C) Pomiary należy wykonywać za pomocą narzędzi "długość" i "prostopadła" (zakreślone na czerwono). Pomiary od punktu 1 do 2: długość żuchwy; od punktu 5 do 6: szerokość kłykcia; Prostopadła od punktu 1 do 4 - 3: długość głowy kłykcia. Zapisz pomiary z "listy pomiarów". Podziałka liniowa = 10 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Osadzanie kłykci

UWAGA: Po wykonaniu zdjęć radiograficznych, żuchwy mogą zostać osadzone i podzielone na sekcje do analizy histologicznej.

  1. Umieść nieodwapnione żuchwy (które zostały ustalone w kroku 2.3) w 30% sacharozie w PBS na noc przed osadzeniem.
  2. Wypreparuj nadmiar tkanki miękkiej i ostrożnie przetnij kłykieć żuchwy.
  3. Wlej trochę żywicy do zatapiania (wystarczającą do pokrycia próbki) do jednorazowych plastikowych foremek i umieść środkową powierzchnię kłykcia na podstawie formy, ustawiając próbkę równolegle do dna formy.
  4. Zamocuj próbkę we właściwym miejscu za pomocą kawałka suchego lodu.
  5. Napełnij formę żywicą do zatapiania i umieść formę z utrwaloną próbką w zimnym 2-metylobutanie, który można wstępnie schłodzić w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C lub w suchym lodzie.
  6. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C lub -80 °C do momentu podzielenia na sekcje.

5. Cięcie kłykcia strzałkowego i przygotowanie slajdów

  1. Utwórz zamrożone przekroje strzałkowe kłykci (5 - 7 μm) i przenieś próbki na szkiełko za pomocą metody transferu taśmy10,11.
  2. Skrawki histologiczne przeniesione na taśmę należy przykleić metodą utwardzaną promieniami UV10.

6. Barwienie histologiczne i obrazowanie mikroskopowe

Uwaga: Większość barwienia histologicznego jest wykonywana zgodnie z opisem w sekcji histologicznej artykułu przez Dyment et al10.

  1. W przypadku skanowania linii bazowej pierwszym krokiem jest zobrazowanie transgenów Col2a1 i Col10a1, zgodnie z opisem Dyment et al10 .
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w 30% glicerolu i PBS. Wykonaj obrazowanie wyjściowe przekrojów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i odpowiednich filtrów.
  2. Wykonaj barwienie fluorescencyjną fosfatazą kwasową odporną na winian (TRAP).
    UWAGA: TRAP ulega ekspresji przez komórki krwiotwórcze, w tym komórki resorpujące kości, osteoklasty12. Celem tego barwnika jest analiza MCC i przebudowy kości podchrzęstnej.
    1. Usuń szkiełko nakrywkowe ze szkiełek, mocząc je w PBS. Umyj szkiełka w PBS trzy razy po 5 minut każde.
    2. Przygotować bufor TRAP 1 rozpuszczając bezwodny octan sodu (9,2 g) i dwuwodny L-winian sodu (11,4 g) w 1 l wody destylowanej. Doprowadzić pH do 4,2 za pomocą kwasu octowego i przechowywać bufor TRAP 1 w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować bufor TRAP 2 przez rozpuszczenie azotynu sodu (40 mg) w 1 ml wody destylowanej.
    4. Przygotować bufor substratowy TRAP (tuż przed barwieniem), mieszając 7,5 ml buforu 1 i 150 μl buforu 2. Nakładać ten roztwór (200 μl) na każde szkiełko podstawowe przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotować bufor reakcyjny TRAP, mieszając 1,840 ml buforu substratowego i 23 μl substratu fluorescencyjnego (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Podłoże fluorescencyjne generuje żółty sygnał fluorescencyjny dla aktywności TRAP.
    6. Usunąć nadmiar buforu substratu TRAP, delikatnie pipetując roztwór.
    7. Inkubować szkiełka z 200 μl buforu reakcyjnego TRAP przez 5 minut pod czarnym światłem żarówki źródła UV.
    8. Umyj szkiełka w PBS trzy razy po 5 minut każde.
    9. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w 30% glicerolu w PBS i wykonaj obrazowanie mikroskopowe10.
  3. Wykonaj barwienie proliferacji komórek.
    UWAGA: W tym teście zmodyfikowany analog tymidyny 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) jest włączany do nowo zsyntetyzowanego DNA: dzielące się komórki są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym.
    1. Po zobrazowaniu do TRAP usuń szkiełka nakrywkowe i umyj szkiełka w PBS trzy razy przez 5 minut każde. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu do proliferacji komórek 5-etynylo-2'-deoksyurydyny, aby wybarwić skrawki histologiczne.
    2. Przygotuj koktajl reakcyjny, dodając 430 μl buforu reakcyjnego 1X, 20 μl CuSO4, 1,2 μl barwnika fluorescencyjnego i 50 μl dodatku buforowego 1X (całkowita objętość 500 μL wystarcza na jedno szkiełko).
      UWAGA: Producent zaleca dodawanie składników w opisanej tutaj kolejności.
    3. Inkubuj szkiełka z przygotowanymi koktajlami przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    4. Umyj szkiełka w PBS trzy razy po 5 minut każde.
    5. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w 30% glicerolu w PBS z 1:1,000 DAPI.
      UWAGA: DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) to niebieskie fluorescencyjne barwienie jądrowe, które wiąże się z regionami bogatymi w AT w DNA.
  4. Wykonaj barwienie błękitem toluidyny (TB).
    UWAGA: Barwienie gruźlicą ujawnia rozkład proteoglikanów w MCC.
    1. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej, aby usunąć szkiełka nakrywkowe.
    2. Po usunięciu szkiełek nakrywkowych umyj szkiełka w wodzie destylowanej trzy razy przez 5 minut każde, aby całkowicie usunąć sole z PBS.
    3. Przygotować bufor roboczy TB, sporządzając roztwór A (rozpuścić 28,4 g dwuzasadowego fosforanu sodu w 1 l wody destylowanej) i roztwór B (rozpuścić 27,6 g jednozasadowego fosforanu sodu w 1 litrze wody destylowanej). Zmieszać 94,7 ml roztworu A z 5,3 ml roztworu B. Rozcieńczyć ten roztwór w stosunku 1:1 w wodzie destylowanej, aby uzyskać 200 ml 0,1 M buforu roboczego. Skorygować pH do 8,0, dodając wodorotlenek sodu, aż pH zostanie ustalone.
    4. Przygotuj 1% bulionu TB: wymieszaj 1 g TB w 100 ml wody destylowanej.
    5. Przygotować roztwór roboczy TB, mieszając 40 ml 0,1 M buforu roboczego w 3 ml 1% TB zapasu.
    6. Inkubować szkiełka w roztworze roboczym TB przez 14-17 s.
      UWAGA: Ta plama jest bardzo wrażliwa na czas; Może być konieczne dostosowanie czasu inkubacji, aby zapobiec nadmiernemu barwieniu.
    7. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej trzy razy przez 5 minut każde.
    8. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w 30% glicerolu w wodzie destylowanej. Wykonaj obrazowanie mikroskopem świetlnym10.
      UWAGA: Nie należy nakrywać szkiełek przebarwionych na gruźlicę glicerolem + PBS. PBS zmywa tego typu plamy.

7. Fluorescencyjna kwantyfikacja histologiczna

  1. Przeprowadzić histologiczną kwantyfikację obrazów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Podstawową zasadą kwantyfikacji histologicznej w tej metodzie jest podzielenie liczby interesujących pikseli fluorescencyjnych przez całkowitą liczbę pikseli obszaru zainteresowania i pomnożenie otrzymanej liczby przez 100, co daje procent pikseli dodatnich w tym obszarze.
  2. Przeprowadzić kwantyfikację ekspresji Col10a1 w MCC strzałkowych odcinków kłykci.
    1. Podczas ilościowego oznaczania wszystkich typów komórek i barwień przy użyciu tej metody należy wybrać obszar, który ma zostać określony ilościowo. Otwórz obrazy histologiczne w oprogramowaniu do analizy obrazu i wybierz obszar za pomocą narzędzia "Lasso Tool (L)" ( Rysunek 4A). Na potrzeby opisanej tutaj analizy wybierz tylko region MCK. po wybraniu obszaru, całkowita liczba pikseli zostanie pokazana w polu "Histogram" na ekranie oprogramowania (Rysunek 4A). Zapisz liczbę pikseli w obszarze zainteresowania.
    2. Zaznacz czerwone piksele Col10a1 za pomocą narzędzia do próbkowania. Kliknij "Wybierz" na górnym panelu, a następnie "Zakres kolorów". Kliknij "narzędzie kroplomierza", wybierz przykładowy kolor dla interesującego piksela na obrazie i kliknij "OK". Wszystkie obszary dodatnie dla wybranego koloru piksela zostaną zaznaczone (Rysunek 4B). Skopiuj liczbę pikseli fluorescencyjnych (pokazaną w polu "Histogram" na ekranie) i wklej je do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego w celu analizy.
    3. Podziel liczbę pikseli fluorescencyjnych przez liczbę pikseli obszaru zainteresowania i pomnóż tę liczbę przez 100: piksele fluorescencyjne / piksele w obszarze zainteresowania * 100,
      UWAGA: Inne typy komórek, takie jak niebieski Col2a1, można określić ilościowo tą samą metodą, ale niebieskie piksele powinny być wybrane zamiast czerwonych pikseli Col10a1.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Reprezentacja kwantyfikacji transgenu Col10a1. (A) Wybierz interesujący Cię obszar za pomocą "Narzędzia Lasso" (L). W przypadku komórek Col10a1-dodatnich wybierz całą chrząstkę żuchwy. Zapisz liczbę pikseli z pola "histogram". (B) Wybierz interesujący Cię piksel, w tym przypadku czerwone fluorescencyjne piksele Col10a1. Należy pamiętać, że zostaną zaznaczone tylko czerwone piksele w obszarze zainteresowania. Zapisz liczbę czerwonych pikseli z pola "histogram". Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przeprowadzić kwantyfikację aktywności TRAP w MCC i kości podchrzęstnej.
    1. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 8.2, ale zamiast wybierać tylko obszar MCC, wybierz obszary chrząstki i kości podchrzęstnej (Rysunek 5A).
    2. Do analizy aktywności TRAP wybierz żółte piksele wygenerowane przez podłoże ELF97, zgodnie z opisem w kroku 8.2.2 (Rysunek 5B); skopiuj liczbę dodatnich pikseli i wklej je do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego w celu analizy.
    3. Uzyskaj procent pikseli dodatnich TRAP, dzieląc liczbę żółtych pikseli przez całkowitą liczbę pikseli w obszarze kości podchrzęstnej i mnożąc przez 100.

figure-protocol-5
Rysunek 5. Reprezentacja fluorescencyjnej kwantyfikacji TRAP. (A) Wybierz obszar zainteresowania (chrząstka żuchwowa i kość podchrzęstna) i zapisz liczbę pikseli tego obszaru. (B) Wybierz żółte piksele fluorescencyjne, reprezentujące aktywność TRAP. Zauważ, że wybrane zostaną tylko piksele dodatnie TRAP. Zapisz liczbę wybranych pikseli. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wykonaj kwantyfikację komórek EdU-dodatnich.
    1. Szkiełka barwione EdU są barwione przeciwstawnie za pomocą DAPI, więc zamiast zliczać całkowitą liczbę pikseli w obszarze zainteresowania, wybierz piksele dodatnie DAPI, aby obliczyć procent pikseli dodatnich EdU. Zaznacz obszar zainteresowania zgodnie z opisem w kroku 8.2, ale nie zapisuj całkowitej liczby pikseli. Wybierz niebieski piksel DAPI jako próbkowany kolor, zgodnie z opisem w kroku 8.2.2; skopiuj liczbę pikseli dodatnich DAPI (Rysunek 6A); i wklej je do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego w celu analizy.
    2. Następnie wybierz piksele dodatnie EdU (żółte piksele fluorescencyjne) i zapisz liczbę pikseli w polu "histogram" (Rysunek 6B).
    3. Oblicz procent pikseli EdU, dzieląc liczbę pikseli dodatnich EdU przez liczbę pikseli dodatnich DAPI i mnożąc otrzymaną liczbę przez 100.

figure-protocol-6
Rysunek 6. Reprezentacja kwantyfikacji EdU. (A) Wybierz obszar proliferacyjny MCC (zewnętrzna warstwa chrząstki). Wybierz opcję Piksele dodatnie DAPI i zapisz liczbę pikseli. (B) Wybierz piksele dodatnie EdU (żółte fluorescencyjne) i zapisz liczbę pikseli. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Kwantyfikacja grubości chrząstki i rozmieszczenia proteoglikanów

  1. Przeanalizuj grubość chrząstki (mapowanie odległości) i obszar zabarwiony na niebiesko toluidyną za pomocą oprogramowania Digimizer Image.
    UWAGA: Użyj paska skali na obrazie histologicznym, aby określić jednostkę (Rysunek 7A).
  2. Wykonaj pomiar mapowania odległości.
    UWAGA: Pomiar mapowania odległości zapewni grubość chrząstki na kłykciu żuchwy. W opisanej tutaj metodzie wybiera się pięć regionów MCC, co daje średnią całkowitej grubości MCC. Badacz może zdecydować się na pomiar trzech różnych regionów, a nawet jednego regionu w środku MCC.
    1. Za pomocą narzędzia "długość" zmierz długość chrząstki od zewnętrznej powierzchni do końca obszaru zabarwionego na niebiesko toluidyną (Rysunek 7B) w pięciu regionach lub w tylu miejscach, ile preferujesz.
    2. Skopiuj pomiary długości z "listy pomiarów"."
      UWAGA: Oprogramowanie udostępnia również średnią z pomiarów (Rysunek 7B).
  3. Zmierz obszar zabarwiony toluidyną na niebiesko.
    UWAGA: W pomiarze obszaru zabarwionego na niebiesko toluidyną zostanie uzyskany obszar proteoglikanów w MCC.
    1. Wybierz narzędzie "obszar" i obrysuj obszar zabarwiony na niebiesko toluidyną ( Rysunek 7C).
    2. Skopiuj pomiary powierzchni z "listy pomiarów".

figure-protocol-7
Rysunek 7: Przedstawienie ilościowe rozkładu proteoglikanów. (A) Użyj podziałki na obrazie histologicznym, aby określić jednostkę, klikając przycisk "jednostka" (zakreślony na czerwono, wybrana jednostka: 500 μm). (B) Zmierz grubość chrząstki w różnych miejscach za pomocą narzędzia "długość" (zakreślone na czerwono). Zapisz pomiary z "listy pomiarów" w prawym górnym panelu. Oprogramowanie udostępnia również "statystyki" w prawym dolnym panelu, dzięki czemu średnią i SD pomiarów można uzyskać bezpośrednio. (C) Zmierz obszar zabarwiony toluidyną na niebiesko za pomocą narzędzia "obszar" (zakreślonego na czerwono). Zakreśl obszar zainteresowania i zapisz pomiar z "listy pomiarów". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzono statystyki opisowe w celu zbadania rozkładu pomiarów morfometrycznych (długość żuchwy, długość kłykci, szerokość kłykci) oraz analiz histologicznych. Wyniki porównano między grupą obciążoną (tj. Myszy poddane obciążeniu ściskającemu sprężyną tytanową beta) a grupą kontrolną (tj. pasującymi myszami kontrolnymi, które nie otrzymały żadnej procedury). Statystycznie istotne różnice między średnimi określono za pomocą niesparowanego testu t, a wartość p <0,0...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy opisano metody pomiaru morfometrycznego i analizy komórkowej mysich kłykci żuchwy i żuchwy. Radiograficzne pomiary morfometryczne mogą być również wykorzystywane do analizy innych kości małych zwierząt doświadczalnych. Ponadto analiza komórkowa (kwantyfikacja komórek i mapowanie odległości chrząstki) nie ogranicza się do kłykcia żuchwy gryzonia, ale może być stosowana do ilościowego określania przekrojów histologicznych wielu tkanek.

Transgeniczne modele myszy z ekspresją reporterów f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Davidowi Rowe za uprzejme dostarczenie transgenicznych myszy oraz Li Chenowi za pomoc histologiczną.

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Dental & Craniofacial Research of the National Institutes of Health pod numerem nagrody K08DE025914 oraz przez American Association of Orthodontic Foundation dla Sumit Yadav.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
System radiograficzny MX20Faxitron X-Ray LLC 
Oprogramowanie Digimizer Image MedCalc
Żywica do zatapiania Shandon CryomatrixThermo Scientific6769006
Mikroskop ręczny Axio Imager Z1Carl Zeiss208562
żółte fluorescencyjne filtry białkowe  - FiltrChroma Technology Corp49003
- ECFPChroma Technology Corp49001
filtr białkowy czerwony fluorescencyjny - Cy5Chroma Technology Corp49009
octan sodu bezwodnySigma-AldrichS2889
dwuwodny winian sodu Sigma-Aldrich228729
azotyn sodu Podłoże Sigma-Aldrich237213
ELF97Thermo Fisher ScientificE6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCSkit Life TechnologiesC10339 zawiera EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydynę) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek)Thermo ScientificD1306
Fosforan sodu dwuzasadowy Sigma-AldrichS3264
Fosforan sodu jednozasadowy Sigma-Aldrich71505
Błękit toluidynowy O Sigma-AldrichT3260
Adobe Photoshop Adobe Systems Incorporated
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami (PBS)Research Products InternationalP32080-100T
CNA Beta III Bezniklowy łukOrtho Organizers, Inc.
Pryzmat GraphPad Oprogramowanie GraphPad, Inc.
Oprogramowanie białka cyjanowego EYFP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
  2. Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
  3. Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
  4. Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
  5. Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599(2016).
  6. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
  7. Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
  8. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  9. Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).
  10. Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468(2016).
  11. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
  12. Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mandibular Condyle AnalysisMorphometric MeasurementsHistological AnalysisCompressive TMJ LoadingCol10a1 ExpressionTRAP Activity QuantificationEDU StainingProteoglycan DistributionDigimizer SoftwareRadiograph Analysis

Related Articles